Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Polarisering av M1- och M2-humana monocytbaserade celler och analys med flödescytometri vid mykobakterie tuberculosisinfektion

Published: September 18, 2020 doi: 10.3791/61807
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1, 1,4, 1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet, 2Infectious Diseases Division, International Centre for Diarrhoeal Disease Research, Bangladesh, 3Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet, 4Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

ERRATUM NOTICE

Summary

Detta protokoll ger en metod för att studera Mycobacterium tuberkulos infektion i mänskliga M1- eller M2-polariserade makrofager baserat på differentiering av perifert blod-monocyter till makrofagliknande celler som är infekterade med GFP-märkta virulent stam H37Rv, och analyseras med flöde cytometri med hjälp av en 10-färg panel inklusive uttryck av utvalda M1/M2 markörer.

Abstract

Mänskliga makrofager är primära värdceller av intracellulära Mycobacterium tuberkulos (Mtb) infektion och har därmed en central roll i immun kontroll av tuberkulos (TB). Vi har upprättat ett experimentellt protokoll för att följa immunpolarisering av myeloisk-härledda celler till M1 (klassiskt aktiverad) eller M2 (alternativt aktiverad) makrofagliknande celler genom bedömning med en 10-färgs flöde cytometri panel som möjliggör visualisering och djup karakterisering av grön-fluorescerande protein (GFP)-märkt Mtb i olika makrofager delmängder. Monocyter som erhållits från friska blodgivare polariserades till M1- eller M2-celler med hjälp av differentiering med granulocytmakrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) eller makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) följt av polarisering med IFN- γ respektive lipopolysackarid (LPS) respektive IL-4. Fullständigt polariserade M1- och M2-celler smittades med Mtb-GFP i 4 timmar innan fristående Mtb-infekterade makrofager färgades med flöde cytometri vid 4- eller 24-timmars post-infektion. Provförvärv utfördes med flödescytometri och data analyserades med hjälp av en programvara för flödescytometrianalys. Manuell gating samt dimensionalitet minskning med enhetlig grenrör approximation och projektion (UMAP) och fenograf analys utfördes. Detta protokoll resulterade i effektiv M1/M2 polarisering kännetecknas av förhöjda nivåer av CD64, CD86, TLR2, HLA-DR och CCR7 på oinfekterade M1 celler, medan oinfekterade M2 celler uppvisade en stark uppreglering av M2 fenotyp markörer CD163, CD200R, CD206 och CD80. M1-polariserade celler innehöll vanligtvis färre bakterier jämfört med M2-polariserade celler. Flera M1/M2 markörer var downregulated efter Mtb infektion, vilket tyder på att Mtb kan modulera makrofag polarisering. Dessutom konstaterades 24 olika cellkluster av olika storlekar vara unikt fördelade mellan M1 och M2 oinfekterade och Mtb-infekterade celler vid 24-timmars post-infektion. Detta M1/M2 flöde cytometri protokoll kan användas som ryggrad i Mtb-makrofag forskning och antas för särskilda behov inom olika forskningsområden.

Introduction

Makrofager är immunceller som bidrar avsevärt till regleringen av vävnad homeostas, inflammation, och sjukdom patologier. Som en viktig komponent i medfödd immunitet uttrycker cellernas monocyt-makrofag härstamning heterogena fenotyper som svar på ändrade miljösignaler, som återspeglar deras plasticitet och anpassning till olika anatomiska och immunologiska platser1. Beroende på tillväxtfaktorerna cytokiner och andra medlare som finns i mikromiljön, makrofager har kategoriserats i två stora reversibla populationer, var och en med en annan roll i bakteriell kontroll och clearance2:proinflammatoriska, klassiskt aktiverade M1-polariserade makrofager och antiinflammatoriska, alternativt aktiverade M2-polariserade makrofager som ursprungligen namngavs för att efterlikna T-hjälpare (Th) cellnomenklatur3. Denna gruppering av immunpolariserade makrofager anses ofta förenklad, eftersom makrofagaktivering och differentiering inte är linjär, men mer exakt illustrerad som ett kontinuum där varje befolkning har olika egenskaper och funktionella roller i resultatet av sjukdomsutveckling och progression4,5,6,7. Ändå finns det många experimentella fördelar med makrofagmodellen M1/M2 som kan användas inom flera olika forskningsområden.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) är orsaksmedlet för tuberkulos (TB) och har uppskattats infektera en person varje sekund och anses vara det mest dödliga enskilda smittämnet i världen (Global TB-rapport 2019). Eftersom luftvägarna är huvudvägen för Mtb-infektion är alveolära makrofager de föredragna värdcellerna som ska infekteras med Mtb och representerar både de primära barriärerna och den smittsamma reservoaren för Mtb i lungorna. Makrofagpolarisering som svar på olika stimuli har studerats utförligt underåren 7 och i de flesta av de publicerade verken, M1 polarisering av monocyt kulturer in vitro induceras av Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) tillsammans med IFN-γ och LPS8,9, medan M2 polarisering induceras med makrofag koloni stimulerande faktor (M-CSF) och IL-410,11. M1-makrofager är potenta effektorceller som förmedlar antimikrobiella svar mot intracellulära patogener och har en viktig roll i antitumörimmunitet12. M2 makrofager, å andra sidan, har en antiinflammatorisk funktion, hög fagocytisk kapacitet och är främst involverade i sårläkning och vävnadsreparation samt i parasitinfektioner12. M1-makrofager anses därför vara effektivare vid intracellulär kontroll av Mtb jämfört med M2-makrofager13. Men Mtb-bakterier har också potential att modulera makrofagpolarisering för att undergräva medfödd immunitet14,15,16,17.

Medan det är vanligt att generera makrofager från differentiering av monocyter som erhållits från perifertblod 18,kan makrofager också genereras från inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)19 eller från benmärgs-härledda makrofager från möss20,21. Dessa är genomförbara tekniker för att studera primära makrofagceller som erhållits från monocyt/makrofag stamceller som kommer att föröka sig och differentiera till en homogen population av mogna makrofag-liknande celler. Dessa protokoll ger dock sällan fördjupad kunskap om fenotyp och funktion hos de erhållna cellerna eller redovisar den naturliga heterogenitet som observerats bland makrofager som erhållits in vivo. Eftersom Mtb är en strikt mänsklig patogen finns det också en fördel att studera Mtb i humaniserade modellsystem. Flödescytometri är en kraftfull teknik som erbjuder möjligheten att bedöma flera fenotypiska och funktionella egenskaper hos enstaka celler i suspension22, något som kan vara ganska utmanande med vidhäftande celler som makrofager som också är kända för att vara autofluorescerande23,24. Förutom kemisk avlossning av fast vidhäftande makrofager kan Mtb-infektion utgöra en betydande stressfaktor för cellerna som lägger till en annan nivå av komplexitet i flödescytometriska analyser av Mtb-infekterade makrofager.

I detta experimentella protokoll har vi använt en tidigare etablerad human makrofag infektion modell baserat på immun polarisering av primära perifera-blod-monocyt-härledda celler som är infekterade med virulent laboratorium Mtb stam H37Rv, och analyseras med flöde cytometri med hjälp av en 10-färg panel inklusive uttryck av utvalda M1 och M2markörer 25. Detta protokoll ger en effektiv och reproducerbar metod för att studera svar på Mtb infektion i M1 eller M2 polariserade monocyt-härledda makrofager. Dessutom tillåter användningen av flödescytometri på vidhäftande Mtb-infekterade makrofager oss att studera en mängd olika ytmarkörer associerade med konventionella M1- och M2-makrofager och deras longitudinella svar på Mtb-infektion. Viktigt är att detta protokoll lätt kan antas för undersökningar av infektioner med andra patogener, i antitumörstudier eller i studier av inflammatoriska tillstånd, för läkemedelsscreening etc. och kan också utnyttjas för bedömning av M1/M2 makrofagpolarisering i kliniska prover hos människa.

Protocol

Humant perifert blod från friska anonyma blodgivare erhölls från blodbanken på Karolinska Universitetssjukhuset i Huddinge (etiskt godkännande Dnr 2010/603-31/4). Alla experimentella steg med levande virulent Mtb utfördes vid Laboratoriet Biosafety Level-3 (BSL-3) vid Folkhälsomyndigheten (FOHM), Solna.

1. Beredning av medier, buffertar och bakteriekulturer

OBS: Information om alla reagenser och förbrukningsvaror finns i materialförteckningen.

  1. RPMI komplett medium: Tillägg RPMI 1640 med 1 mM natrium pyruvat, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES och 10% värmeinaktiverade fetala nötkreatur serum (FBS). Undvik antibiotika i cellkulturmediet när du arbetar med Mtb-infektion.
  2. Serumfritt RPMI-medium: Tillägg RPMI 1640 med 1 mM natrium pyruvat, 2 mM L-glutamin och 10 mM HEPES.
  3. Tvättbuffert: Förbered fosfatbuffertens saltlösning (PBS) som innehåller 0,05 % (v/v) interpolering-80.
  4. FACS-buffert: Förbered PBS som innehåller 2,5% (v/v) FBS och 0,5 mM EDTA.
  5. Fixeringsbuffert: Förbered PBS som innehåller 4% formaldehyd till PBS. Se till att den är nylagad före användning, t.ex. blandad från en stamlösning på 37% formaldehyd.
  6. Permeabiliseringsbuffert: Tillsätt 0,1% natriumcitrat och 0,1% Triton X-100 till avjoniserat vatten.
  7. Tvättbuffert (för immunofluorescens): Förbered PBS som innehåller 0,1% BSA och 0,1% interpolering-20.
  8. Blockeringsbuffert: Förbered PBS som innehåller 0,1% BSA och 10% normalt getserum (NGS) till PBS.
  9. Färgningsbuffert (för immunofluorescens): Förbered PBS som innehåller 0,1% BSA till PBS.
  10. TB komplett medium: Komplettera Middle Brook 7H9 buljong med 0,05% (v/v) Tween-80, 0,5% (v/v) glycerol, kanamycin (20 μg/mL), 10% (v/v) Middlebrook oljesyra, albumin, dextros och katalas anrikning (Middlebrook OADC Anrikning).
  11. Bakteriekulturer: Använd den vanliga virulenta Mtb-laboratoriestammen, H37Rv, som utgör ett uttryck för grönt fluorescerande protein (GFP), för infektion av monocytbaserade celler. Denna Mtb stam bär en pFPV2 plasmid som innehåller en gen kodning GFP, samt en gen för kanamycin resistens. Antibiotikaresistensen möjliggör kontinuerligt urval av plasmid-uttryckande bakterier i kulturer som innehåller kanamycin. Förvara bakterier i tbc komplett medium och 70% glycerol (1:1 utspädning) vid -80 °C.

2. Perifer blod mononukleär cell isolering från buffy rockar

OBS: Utför allt arbete med humant blod (potentiellt smittsamt) inuti ett biosäkerhetsskåp av klass II. Inaktivera restblodprodukter med desinfektionsmedel i 15 minuter innan kasseras. Blod erhölls från friska frivilliga i detta fall. Detta in vitro makrofag differentiering protokoll inrättades för att inkludera 10 x 106 isolerade PBMCs/donor/well. Från varje donator innehåller en buffy coat ca 50 ml av en koncentrerad leukocyt suspension som härrör från helblod, som normalt ger 500-800 x 106 PBMCs från vilka cirka 10% eller 50-80 x 106 monocyter kan hämtas.

  1. Ladda 15 ml buffy coat blod ovanpå 15 ml densitet gradient medium beredd i 50 ml rör. Lägg långsamt över blod ovanpå densitetsgradientskiktet genom att luta pipettspetsen mot rörväggen.
  2. Snurra rören med 600 x g i 25 min vid rumstemperatur (RT) med 0 acceleration och 0 retardation.
    OBS: Stäng locken försiktigt före centrifugering och kontrollera alltid rörhållarna för potentiellt spill efter centrifugation.
  3. Ta bort det övre plasmaskiktet med en steril Pasteur-pipett och samla därefter försiktigt det mononukleära cellskiktet i ett nytt 50 ml-rör med en steril Pasteur-pipett. Tillsätt serumfritt RPMI-medium till PBMC-pelleten för att få en slutlig volym på 50 ml. Blanda försiktigt genom att vända röret några gånger före centrifugering vid 500 x g i 5 min på RT.
  4. Kassera supernaten försiktigt och återanvänd cellpelleten genom att vända botten av röret i fingrarna.
  5. För att avlägsna densitetsgradientmediets kontaminering från PBMCs, tvätta cellerna 2-3 gånger med serumfri RPMI för att få en slutlig volym på 50 ml. Centrifugera vid 500 x g i 5 min vid RT. Tvätta tills cellens supernatant blir transparent.
  6. Kassera supernatanten och återanvänd cellerna i 20 ml serumfritt RPMI-medium.
  7. Räkna cellerna genom trypanblå färgning, manuellt med hjälp av en hemocytometer eller med hjälp av en automatiserad cellräknare. Späd cellupphängningen i trypanblått i 1:2 eller 1:10 utspädning genom att blanda cell-trypanblå provet i en 96 brunnsplatta t.ex. 50 μL + 50 μL (för hemocytometerräkning) eller 10 μL + 10 μL (för automatiserad cellräkning) och räkna cellerna för att erhålla antalet levande celler/ml.
    VARNING: Trypanblått är giftigt och måste kasseras i ett separat kemiskt avfall.

3. Differentiering och polarisering av monocytbaserade celler

OBS: För differentiering och polarisering av monocyt-härledda celler följdes ett protokoll som vi tidigare upprättat för M0, M1-liknande och M2-liknande celler samt helt M1 och M2 polariserade celler25. För enkelhetens skull beskrivs endast helt polariserade makrofager M1 och M2 här.

  1. Använd plast vidhäftning för isolering av monocyter. Kort sagt, sådd nyligen isolerade PBMCs i en 6-brunns odlingsplatta vid en lämplig koncentration, t.ex. 10 x 106 PBMCs/ brunn i 2 ml serumfritt RPMI-medium och inkubera vid 37 °C och 5% CO2.
  2. Efter 2–3 timmar, ta bort de icke-vidhäftande cellerna med en pipett och tvätta brunnarna 3 gånger med 1 ml serumfritt medium. De bifogade cellerna är monocyter och består av cirka 10% av de totala PBMCs som läggs till brunnen, dvs 106 monocyter som hämtas från 10 x 106 PBMCs som tillsätts per brunn.
  3. För makrofag differentiering, förbered en arbetslösning som innehåller 50 ng/mL GM-CSF eller M-CSF för M1 respektive M2 makrofagpolarisering, tillagd i 2 ml RPMI komplett medium per brunn. Odla cellerna i en 5% CO2 inkubator i 37 °C i 3 dagar.
  4. På dag 3, ta bort 1 ml av cellkulturmediet noggrant från det övre lagret av varje brunn och komplettera cellkulturerna med 1 ml färskt RPMI komplett medium som innehåller dubbelkoncentrationen av M-CSF eller GM-CSF för att erhålla 50 ng/ml slutlig koncentration i brunnarna. Lägg till tillväxtfaktorerna i en färdig arbetslösning på 100 ng/ml/brunn.
  5. På dagen 6, lägg till olika stimuli för de sista 18-20 h cell differentiering för att få helt polariserad och mogen M1 (interferon-γ; IFN-γ och lipopolysackarid. LPS (E. coli O55:B5)) eller M2 (interleukin 4; IL-4) makrofager. För M1-polarisering, förbered IFN-γ och LPS i RPMI komplett medium och tillsätt 50 μL per brunn för att erhålla en slutlig koncentration på 50 ng/mL IFN-γ och 10 ng/mL LPS i cellkulturerna. För M2-polarisering, förbered IL-4 i RPMI komplett medium och tillsätt 50 μL per brunn för att få en slutlig koncentration på 20 ng/ml i cellkulturerna.
  6. För differentiering av M0 polariserade makrofager, stimulera cellerna med endast M-CSF, utan ytterligare cytokiner (som ger en M2-liknande fenotyp)25.
  7. Kontrollera morfologin hos monocyt-härledda cellkulturer regelbundet med lätt mikroskopi för att säkerställa att mindre monocyter differentieras till större makrofagliknande celler. Övervaka också potentiella morfologiska skillnader mellan M1- och M2-polariseringen, dvs. långsträckta och sträckta M1-celler jämfört med M2-celler med en mer rundad form25.
  8. På dagen 7, överför plattorna med monocyt-härledda celler till ett BSL-3 laboratorium för infektion med virulent Mtb.

4. Förberedelse av Mtb-kulturer

OBS: Följande steg måste utföras i en BSL-3-anläggning. För allt arbete med virulent Mtb, använd skyddskläder, andningsskydd och etanolresistenta handskar.

  1. Tina en injektionsflaska med 1 ml bakteriell alikvot och blanda med 9 ml TB komplett medium (1:10 utspädning) i ett 50 ml filtrerat lockrör. Odla suspensionen i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
  2. Efter 24 timmar, snurra bakteriesuspensionen på 2 300 x g i 10 minuter och häll försiktigt av mediet. Återanvänd bakteriepelleten med 15–20 ml färskt tbc komplett medium i ett nytt 50 ml filtrerat kapsyrekulturrör och inkubera vid 37 °C och 5 % CO2. Blanda de sedimenterbara bakterierna i röret var 2–3:e dag för att upprätthålla en homogen näringstillförsel för alla bakterieceller.
  3. Efter 7–10 dagar, blanda bakteriefjädringen ordentligt genom att pipetting upp och ner innan du överför till ett 50 mL skruvlocksrör.
  4. Tillsätt 35–40 ml steril tvättbuffert till 50 ml-röret och snurra bakteriesuspensionen vid 2 300 x g i 10 minuter. Upprepa tvättstegen en gång. Återanvänd bakteriepelleten i 1 ml serumfritt RPMI-medium genom att pipettera med en mikropipett.
  5. Tillsätt ytterligare 9 ml serumfritt RPMI-medium och sonikera bakteriesuspensionen i ett biosäkerhetsskåp av klass II i 5 minuter vid 37 °C för att störa bakterieklumparna. Doppa röret upprepade gånger (3–4 gånger) i vattenbadsljuddatorn för att säkerställa maximal störning av bakterieklumpar. Mät den optiska densiteten (OD) på 1 ml bakteriell suspension vid 600 nm våglängd med hjälp av en spektrofotometer placerad inuti biosäkerhetsskåpet. Använd serumfritt RPMI-medium för att ställa in referensen.
  6. Beräkna antalet kolonibildande enheter (CFU) med hjälp av formeln: (OD+0.155)/0.161 = Y, och Y x 107= Y x 106 CFU/ml, t.ex. ett OD-värde 0,32 ger en bakteriekoncentration på (0,32 + 0,155)/0,161 = 2,95, 2,95 x 107= 29,5 x 106 CFU/ml.

5. Mtb infektion av monocyt-härledda celler

OBS: Följande steg måste utföras i en BSL-3-anläggning.

  1. Återanvänd bakteriepelleten i serumfritt RPMI-medium i ett nytt sterilt 50 ml-rör och justera den slutliga bakteriekoncentrationen till cirka 5 x 106 CFU/ml.
  2. Ta bort cellkulturmediet från 6 brunnsplattan(erna) som innehåller monocytbaserade celler. Tillsätt 1 ml serumfritt RPMI-medium till varje brunn. Tillsätt 1 ml bakteriesuspension per brunn för att få en multiplicitet av infektion (MOI) 5:1, dvs. 5 x 106 CFU per 106 makrofager i 2 ml/brunn och inkubera plattorna i 4 timmar i 37 °C och 5 % CO2.
  3. Efter infektion, tvätta cellerna 3 gånger med 1 ml steril tvättbuffert för att ta bort extracellulära bakterier. Luta plattan och ta försiktigt bort hela tvättbufferten från hörnen. Återanvänd de Mtb-infekterade monocyt-härledda cellerna i 2 ml RPMI komplett medium utan antibiotika och fortsätt att flöda cytometri färgning eller inkubera cellerna för ytterligare 24 h (eller andra tidpunkter) före flöde cytometri.

6. Flöde cytometri färgning av Mtb-infekterade monocyt-härledda celler

OBS: Följande steg måste utföras i en BSL-3-anläggning. Flöde cytometri färgning kunde utföras i en 96-brunn platta istället för rör.

  1. Lossa de Mtb-infekterade cellerna (och oinfekterade kontroller) från brunnarna i 6 brunnsplattan(erna) genom inkubation med 1 ml FACS-buffert per brunn i minst 30 min vid 37 °C och 5 % CO2.
  2. Försiktigt pipett upp och ner några gånger för att säkerställa att cellerna lossnar. Bekräfta om möjligt cellavlossning med mikroskopi. Överför cellfjädringen från varje brunn till ett skruvbespapprat mikrocentrifugrör och snurra rören på 200 x g i 5 minuter. Kassera supernaten försiktigt genom pipetting.
  3. Tvätta cellpelleten i varje rör två gånger med FACS-buffert och snurra cellerna vid 200 x g i 5 min.
  4. Färga cellerna (ca 0,5 x 106 till 1 x 106 celler/rör) med cirka 50 μL cocktail av fluorokromkonjugerade antimänskliga antikroppar inklusive TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5) (Tabell 1) i kombination med livsduglighetsfärg Zombie-UV i 30 min vid 4 °C (kylskåp) i mörker.
  5. Tvätta de färgade cellerna två gånger med 400 μL FACS-buffert och snurra cellerna vid 200 x g i 5 minuter.
  6. Fixera de färgade cellerna med 200 μL fixeringsbuffert (nyberedd) i 30 minuter vid RT i mörker för att säkerställa fullständig inaktivering av mykobakterier.
  7. Tvätta cellerna två gånger med 400 μL FACS-buffert och snurra vid 200 x g i 5 minuter för att ta bort överskott av fixbuffert.
  8. Återanvänd de fasta cellerna i 400 μL FACS-buffert och överför proverna till nya 1 ml mikrocentrifugrör innan de tas ut ur BSL-3-laboratoriet för flödescytometri i BSL-2. Förvara de färgade cellerna i +4 °C tills provförvärvet sker.
    OBS: Spraya rören med 70% etanol innan du tar ut dem ur BSL-3-laboratoriet. Formaldehyd är giftig (cancerframkallande) och måste hanteras i ett biosäkerhetsskåp av klass II. Kassera formaldehydavfall i ett separat kemiskt avfall.

7. Flödescytetrisk datainsamling och analys av Mtb-infekterade monocytbaserade celler

OBS: Steg 7.1–7.2 ska utföras före den flödescytometrifärgning som beskrivs ovan. För att undvika problem med cellklumpning och dissociation av tandemfärgämnen efter cellfixering utförs provförvärv av både Mtb-infekterade och oinfekterade celler inom 4-10 timmar efter primär antikroppsfärgning.

  1. Före den flödescytometrifärgning som beskrivs ovan, kompensera den fluorescerande signalen för varje fluorokromkonjugerad antikropp som anges i färgningspanelen (tabell 1) med hjälp av kompensationspärlor (både positiva och negativa).
  2. Titrera antikroppsutspädningen för färgning av mänskliga makrofager för att få den optimala signalen för varje fluorokrom.
  3. Använd obefläckade celler för att bestämma nivån på bakgrundsfluorescensen som krävs för att ställa in grinden för den negativa cellpopulationen så att de färgade cellerna kan visualiseras (makrofager är mycket auto fluorescerande).
  4. Införskaffa minst 50 000 celler/prov i flödescytometern med hjälp av rekommenderad programvara för datainsamling.
  5. Exportera förvärvsfilerna från flödescytometern i flödescytometristandard (FCS) format 3.1.
  6. Analysera FCS-filerna i programvara för flödescytometrianalys.
  7. Gate makrofager enligt deras framåt- och sidospridning (FSC och SSC) egenskaper och utesluta döda celler genom levande / död cell gating med hjälp av Zombie-UV livskraft färgämne.
  8. Visualisera H37Rv-GFP-infekterade makrofager i FITC-kanalen.
  9. Identifiera frekvensen av positivt färgade celler och geometrisk genomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) för alla markörer (tabell 1).

8. Immunofluorescensfärgning av Mtb-infekterade monocyt-härledda celler

OBS: Mtb-infektion måste utföras i en BSL-3-anläggning.

  1. För immunostaining, frö 2 x 105 PBMCs/brunn i 500 μL serumfritt RPMI-medium i 8 brunnskammarbilder för att erhålla 2 x 104 monocyter/brunn. Efter differentiering och M1/M2 polarisering av monocyter, fortsätt med Mtb infektion som beskrivs ovan. Fixera bilderna efter 24 h Mtb-infektion med fixeringsbuffert i 30 min. Fasta diabilder förvaras i frysen vid -20 °C tills ytterligare analyser.
  2. Tvätta de monocytbaserade cellerna två gånger med 200 μL PBS i 10 minuter vardera.
  3. Permeabilisera cellerna med 200 μL permeabiliseringsbuffert i 5 minuter vid RT.
  4. Tvätta cellerna 3 gånger med 200 μL PBS i 5 minuter vardera.
  5. Tvätta cellerna två gånger med 200 μL tvättbuffert i 5 minuter vardera.
  6. Blockera icke-specifik bindning med 200 μL blockeringsbuffert i 30 min vid RT.
  7. Späd de primära antikropparna 1:100 i färgningsbufferten och inkubera M1-cellerna med en okonjugerad CD64-antikropp (Klon: 10,1) och M2-cellerna med en okonjugerad CD163-antikropp (polyklonal) i 2 timmar vid RT.
  8. Tvätta sedan cellerna 3 gånger med 200 μL tvättbuffert i 10 minuter vardera.
  9. Späd ut de fluorescerande märkta sekundära antikropparna 1:1 000 i färgbuffert och inkubera M1-cellerna med en antimus IgG-Alexa Fluor 594 och M2-cellerna med en antikanin IgG-Alexa Fluor 594 för 1 timme på RT.
  10. Tvätta cellerna 3 gånger med 200 μL tvättbuffert i 10 minuter vardera.
  11. Ta bort kammargallret och tillsätt ~20 μL DAPI-monteringsmedium i varje brunn och sätt ett 1,5 mm täckslip på varje bild.
  12. Försegla täcket med ett lager nagellack.
  13. Skaffa bilder med ett konfokalt mikroskop med lasrar som avger vid 486 nm för excitation av GFP (grön kanal), 402 nm för DAPI (blå) respektive 560 nm för sekundär antikropp (röd).

Representative Results

En schematisk illustration av cytokinstimuleringar som används för polarisering av monocytbaserade celler till M0 (M2-liknande celler), M1 (helpolariserade M1-celler) och M2 (helt polariserade M2-celler) presenteras i figur 1A, medan representativa bilder av M0-, M1- och M2-cellkulturer samt M1-kulturer dag 0, 3 och 7 visas i figur 1B. Oinfekterade M0-celler användes för att demonstrera den grundläggande gatingstrategin (figur 2A). Ursprungligen, myeloiska celler (~ 85%) var gated enligt deras framåt spridning (FSC) och sida spridning (SSC) egenskaper inklusive de större cellerna med hög granularitet och exklusive de små skräp med en låg SSC och FSC som finns längst ner vänstra hörnet av punktområdet. I det andra området definierades dubbelgångare (dvs. cellklumpar) som att de hade en ökad yta men liknande höjd jämfört med enstaka celler och uteslöts från ytterligare analys. Därför inkluderades endast celler som stod i proportion mellan FSC-området och FSC-höjd (enstaka celler) inuti den sneda formporten. Därefter användes Zombie-UV-livskraftsfärgen som fläckar de cytoplasmiska proteinerna inuti de döda cellerna för att utesluta de döda cellerna från efterföljande analys. Som förväntat var livskraftiga oinfekterade M0-celler negativa för Mtb-GFP uttryck visualiseras i FITC-kanalen.

Därefter tillämpade vi samma gating strategi på oinfekterade samt Mtb-infekterade M1 och M2 makrofager vid 4 timmar efter infektion (Figur 2B, C). Två delpopulationer upptäcktes i FCS/SSC grinden av oinfekterade M1 polariserade makrofager. en population med mindre storlek (FCS) och högre granularitet (SSC) och den andra populationen med större storlek och lägre granularitet (figur 2B), medan huvudporten för oinfekterade M2-celler föreföll mer homogen (figur 2C). Både M1- och M2 monocytbaserade celler uppvisade en vertikal övergång till högre granularitet och minskad cellstorlek vid Mtb-infektion, vilket kan återspegla en ökad komplexitet inuti cellerna som orsakas av upptag av intracellulära Mtb-bakterier (figur 2B,C). Dessutom visade livskraftsfläcken en förbättrad celldöd (17-22%) bland de Mtb-infekterade M1- och M2-cellerna vid en MOI på 5, jämfört med oinfekterade M0-celler (99%) (Figur 2A-C)eller oinfekterade M1- och M2-celler (data visas inte). Representativa data visade att Mtb-GFP-uttrycket (dvs. Mtb-smittsamheten) var betydligt högre i M2 (77% GFP-positiva celler) jämfört med M1-celler (19% GFP-positiva celler) efter 4 timmars infektion (figur 2B, C). Efter 24 timmars infektion var Mtb-GFP uttryck 43% och 85% i M1 och M2 celler respektive, vilket tyder på att M1 celler hade en relativt högre ökning av GFP-uttryck från 4-24 timmar efter Mtb infektion jämfört med M2 celler, 126% jämfört med 10,4% ökning av GFP-uttryck i M1 och M2 celler från 4-24 timmar, respektive.

För att karakterisera effekten av M1/M2-polarisering i oinfekterade monocyt-härledda celler användes punktdiagram för att identifiera M1-celler som var dubbelpositiva för CD64- och CD86-celler (CD64+CD86+) och M2-celler som var dubbelpositiva för CD163 och CD200R (CD163+CD200R+; Figur 3A,B). Urvalet av M1/M2-markörer gjordes främst baserat på resultaten från vårt tidigare arbete25 men också från andrastudier 26,27,28,29. Kvadranterna för de färgade cellerna sattes med motsvarande grindar för obefläckade M1/M2-celler (figur 3A). Ingen av dessa markörer uttrycks uteslutande av M1- eller M2-celler, men andelen positiva celler samt ytuttryckets intensitet är annorlunda. Detta var särskilt tydligt från M1-fläcken där cirka 95% av M1-cellerna och 79% av M2-cellerna var CD64+CD86+, men färgningsintensiteten var betydligt högre i M1-delmängden (Figur 3A). Medan 27 % av M1-cellerna var positiva för CD2-markören CD200R var endast 1 % positiva för CD163, vilket gav 0,5 % CD163+CD200R+ M1-celler jämfört med 63 % CD163+CD200R+ M2-celler (figur 3A). Efter 4 timmar av Mtb infektion observerades en ökning av frekvensen av CD200R+ celler i Mtb-GFP-positiva M1 polariserade celler (16%), medan CD163-uttryck minskades i M2 celler (Figur 3B). Värmekartan visar en hög intensitet av GFP-uttryck i CD163+CD200R+ M2-celler, men även i delmängden CD64+CD86+ M2 jämfört med motsvarande M1-cellsundermängder (figur 3B). Sammantaget visualiseras också skiftet i uttrycket för respektive M1- och M2-markörer i histogrammen i figur 3C. Dessutom visualiserades Mtb-GFP-bakterier också i CD64+ M1-celler och i CD163+ M2-celler genom konfokal mikroskopi, vilket stödde ett förbättrat intracellulärt upptag och/eller tillväxt av Mtb inuti M2 jämfört med M1-celler (Figur 3D).

För att verifiera resultaten av den manuella gating, tillämpade vi dimensionalitetsreduktion med hjälp av Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). UMAP-analys visade att Mtb-infektion i 4 timmar inte var tillräcklig för att påverka polariseringen av makrofager, i motsats till 24 timmars infektion, vilket resulterade i tydligt separerade kluster av M1 och M2 oinfekterade och infekterade celler (Figur 4A). Oinfekterade M1-makrofager visade högre uttryck för CD64-, CD86-, TLR2-, HLA-DR- och CCR7 jämfört med M2-makrofager, medan oinfekterade M2-celler uppvisade en stark uppreglering av M2 fenotypmarkörerna CD163, CD200R, CD206 och CD80(figur 4B,C). I överenskommelsen till den manuella gatingen orsakade Mtb infektion efter 24 timmar en tydlig nedreglering av CD163, CD200R och CD206 på M2 celler och uppreglering av CD86 och HLA-DR på M1 celler (Figur 4B, C), vilket tyder på att Mtb kan modulera makrofag polarisering. I den efterföljande fenografianalysen (figur 4D-F) identifierades 24 olika kluster av olika storlekar som var unikt fördelade mellan de Oinfekterade och Mtb-infekterade cellerna M1 och Mtb, vilket illustreras i UMAP-diagrammen(figur 4D),cirkeldiagram(figur 4E)och värmekartor(figur 4F). Sammantaget visar dessa resultat lovande effektivitet i detta protokoll för att generera fenotypiskt och funktionellt olika M1 och M2 polariserade celler in vitro som moduleras ytterligare av Mtb infektion.

Figure 1
Figur 1: Schematisk illustration av in vitro-differentiering och polarisering av mänskliga myeloiska celler. (A) M0 (M2-liknande), M1 (klassiskt aktiverade) och M2 (alternativt aktiverade) celler avbildas. Monocyter som erhållits från friska blodgivare polariserades med olika cytokiner som beskrivs i protokollet och infekteras med den GFP-märkta Mtb-stammen, H37Rv, i 4 timmar före analys med 10-färgs flöde cytometri. M1-polariserade celler innehåller vanligtvis färre bakterier jämfört med M2-polariserade celler. (B) Mikroskopiska bilder av helt polariserade, oinfekterade M0-, M1- och M2-celler i 6-brunnsplattorna dag 7 och representativa bilder av M1-cell differentiering från monocyter vid dag 0, 3 och 7. Förstoring är 20x (övre panelen) och 10x (nedre panelen). Observera att M1-cellerna är mer långsträckta och sträckta jämfört med de mer rundade M0- och M2-cellerna (övre panelen). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Gating strategi för differentiellt polariserade myeloisk-härledda celler. Representativa punktdiagram som visar(A)FSC-egenskaper (Forward scatter) och sidospridningsegenskaper (SSC) för oinfekterade M0-makrofager. FSC-A/FSC-H-tomten visar manuell gating av enstaka celler som står i proportion till yta och höjd. Levande cell gate exkluderade celler som var positiva för Zombie-UV (livskraft färgämne). Intracellulära Mtb upptäcktes av GFP-uttryck i levande celler som observerats i FITC-kanalen. B)Gating av M1 och (C) M2 makrofager som visar FCS/SSC prick tomter av både i oinfekterade celler och Mtb-infekterade celler 4 h och 24 h post-infektion. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Effekten av polariseringsprotokollet in vitro M1/M2. Representativa punktdiagram och kvadrantgating som visar delmängdsfrekvenser för M1- och M2-polariserade celler med CD64 och CD86 (M1) eller CD163 och CD200R (M2) i( A) ouppnämda och färgade oinfekterade celler och (B) Mtb-infekterade färgade celler 4 h efter infektion. Punktdiagramna i (B) illustrerar fluorescensintensiteten hos GFP-uttryck (värmekarta) i M1- och M2-polariserade makrofager som erhållits från olika delportar. (C) Geometriskt medelvärde av fluorescensintensitet (MFI) visas i histogram från en representativ donator efter 4 h Mtb- infektion. MFI-värdena i oinfekterade M1-celler (ljusblå) och M2-celler (ljuslila) presenteras i den övre panelen och Mtb-infekterade M1-celler (djupblå) och M2-celler (djuplila) presenteras i den nedre panelen. (D) Representativa konfokala bilder av oinfekterade och Mtb-infekterade M1- och M2-polariserade celler visas. M1 och M2 celler var färgas för CD64 och CD163 uttryck, respektive med hjälp av immunofluorescens. Positiv ytfärgning visas i rött och GFP-uttryck intracellulära bakterier visas i grönt. DAPI-färgade kärnor visas i blå färg. Skala – 10 μm. Förstoringen av bilder till höger är 350x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Dimensionalitetsreduktion med enhetlig grenrörs approximation och projektion (UMAP) och fenografianalys av oinfekterade och Mtb-infekterade M1- och M2-celler. (A) UMAP, skapad genom att sammanfoga 11000 levande celler från oinfekterade och Mtb-infekterade M1- och M2-cellkulturer från två representativa blodgivare, 4 h (vänster grafer) eller 24 h (höger grafer) efter infektion. Värmekartan för GFP-uttryck (nedre panelen) anger oinfekterade och Mtb-infekterade celler. (B-C) MFI för markörer uttryckta i oinfekterade och Mtb-infekterade M1- och M2-celler 24 timmar efter infektion, som visas som(B)värmekarta eller(C)stapeldiagram. - Jaghar inte tid med dethär. Fenografianalys identifierade 24 kluster som är differentiellt fördelade mellan de oinfekterade och Mtb-infekterade M1- och M2-kulturerna. Kluster 8–13 är unika i oinfekterade M1-celler, kluster 1–7 är unika i Mtb-infekterade M1-celler, kluster 20–24 är unika i oinfekterade M2-celler och kluster 14–19 är unika i Mtb-infekterade M2-celler. MFI för varje markör i varje fenografkluster visas i (F). Data presenteras som oinfekterade M1 -celler (ljusblå) och M2-celler (ljuslila) och Mtb-infekterade M1-celler (djupblå) och M2-celler (djuplila). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Tabell 1: Förteckning över antikroppar som används för flödescytometri.

Laser Filter Fluorokrom Fenotyp Funktion Klon Katalognr Företag
639 670/30 AF647 TLR2 (TLR2) Patogen erkännande receptor TL2.1 309714 BioLegend (olika)
639 780/60 APC-Cy7 (på 1997) CD206 (cd206) Mannosreceptor 15-2 321120 BioLegend (olika)
405 610/20 BV605 (BV605) CD163 (cd163) Scavenger receptor GHI/61 (engelska) 333616 BioLegend (olika)
405 670/30 BV650 (BV650) CD80 (cd80) Medstimulerande molekyl 2D10 (på 2D10) 305227 BioLegend (olika)
405 710/50 BV711 (BV711) CCR7 (ccr7) Kemokinreceptor G043H7 (på 043H7) 353228 BioLegend (olika)
405 780/60 BV785 (BV785) CD86 (cd86) Medstimulerande molekyl IT2.2 (på 2,2) 305442 BioLegend (olika)
488 530/30 GFP (GFP) Mtb Intracellulära bakterier
561 586/15 Pe CD200R (cd200R) Hämmande receptor OX-108 329306 BioLegend (olika)
561 620/14 PE/BLÄNDNING 594 CD64 (cd64) Fc gamma receptor-I av IgG 10.1 305032 BioLegend (olika)
561 661/20 PE-Cy5 (PC5) HLA-DR (på))hla-dr MHC klass II-molekyl L243 (på andra) 307608 BioLegend (olika)
355 450/50 BUV395 (buv395) Livsduglighet färgämne Levande/död cellmarkör Zombie UV 423108 Invitrogen

Discussion

Detta experimentella protokoll beskriver effektiv polarisering av myeloisk-härledda celler till M1 eller M2 fenotyper inklusive bedömning med en 10-färg flöde cytometri panel som tillåter visualisering och djup karakterisering av GFP-märkta Mtb i olika makrofager delmängder. Även om TB är en gammal mänsklig sjukdom, finns det för närvarande ingen gyllene standardmodell för att studera Mtb-makrofag interaktioner, och flerfärgsflöde cytometri av makrofager kan vara komplicerat jämfört med analyser av lymfocyt svar. Få tillgängliga protokoll för in vitro-differentiering av mänskliga monocyter till makrofager ger djup kunskap om vilken typ av makrofager som genereras. Ett grundläggande protokoll för makrofagpolarisering och flödescytometrisk bedömning av makrofagaktivering med hjälp av en solid panel av markörer kan sannolikt underlätta sådan karakterisering och erbjuda möjligheter att utforska ytterligare funktioner i polariserade celler som behandlas under olika förhållanden. Detta inbegriper analyser av celler odlade in vitro samt analyser av celler in vivo i kliniska prover, dvs. både PBMC och encelliga suspensioner från kroppsvätskor (dvs. bronkolalveolär lavage) eller homogeniserad vävnad. Differentiering och/eller aktiveringsstatus för monocyter och makrofager från patienter kan därför vara relaterade till sjukdomsutfall. Expansion av CD16+CD163+ monocyter i perifert blod har rapporterats hos lung TB patienter30. En ökad frekvens av CD163+ celler upptäcktes också i den inflammerade huden hos atopisk dermatit patienter31. På samma sätt har CD206+ M2-liknande makrofager visat sig hämma spridning och differentiering av celler i mikromiljön av adipocytvävnad32 och berikas i benmärgsprover från patienter med akut myeloisk leukemi (AML)29. Ett förhöjt förhållande mellan CD64 (M1) och CD163 (M2) celler i helblod av patienter med artros konstaterades vara associerad med sjukdomens svårighetsgrad33. En annan studie använde CD86 (M1) och CD163 (M2) för att visa att höga M1 uttryck i vävnad korrelerade till sämre resultat i en undergrupp av maligna hjärntumörer34.

Det finns flera betydande fördelar med detta experimentella M1/M2 flöde cytometri protokoll. Denna modell ger möjlighet att studera medfödda immunsvar på virulent Mtb-infektion och kan utvecklas för att innehålla studier av adaptiva immunsvar genom att lägga till autologa T-celler tillsammans med M1- eller M2-makrofager vid blandade lymfocytreaktioner (MLR). Protokollet är också lämpligt för läkemedelsscreening och testning av olika immunmodulerande och antimikrobiella föreningar. Här har vi tidigare studerat effekterna av D-vitamin och histondeacetylashämmaren fenylbutyrat på myeloisk-härledda celler efter Mtb-infektion25,35. M1/M2 flöde cytometri kan också användas för att bedöma makrofat aktivering efter konditionering med cell kultur supernatants eller patientens plasma. Medan in vivo-studier av TB-saminfektion med HIV eller helminths eller TB- diabetes samsjuklighet kan vara utmanande, kan den mindre komplexa M1/ M2-modellen underlätta studier av samsjuklighet in vitro. På samma sätt kan protokollet utnyttjas för överföringsstudier för att undersöka cellernas Mtb-smittsamhet eller för att undersöka fagocytisk såväl som antigenpresentationskapacitet hos enskilda M1/M2-celler. M1/M2 flöde cytometri är också attraktivt för användning i biomarkör och vaccin studier, att följa sjukdom prognos under behandling och att testa terapier som riktar sig mot myeloisk-härledda celler. Viktigt är att ett antal olika metoder kan tillämpas parallellt med flödescytometri för samtidig bedömning av makrofagpolariseringsfenotyper och funktionella svar med konfokal mikroskopi (figur 3D), PCR i realtid, western blot, multiplex analyser och ELISA av lösliga faktorer i kulturen supernatant samt bedömning av intracellulär bakteriell smittsamhet och tillväxt med GFP-uttryck (flöde cytometri och confocal mikroskopi) och koloni bildas enheter (CFU). Infektion av M1- eller M2-celler med Mtb-GFP-bakterier möjliggör också sortering av de oinfekterade och Mtb-infekterade cellerna från samma prov för encellig RNA-sekvenseringsanalys.

Det beskrivna protokollet har också vissa begränsningar, inklusive både tekniska och vetenskapliga nackdelar. Nackdelen med monocyt-härledda makrofager från mänskliga blodgivare är att donatorvariationen ofta är hög och det faktum att cellerna inte polariseras i den fysiologiska miljön hos mänskliga vävnader. Stor variation i M1/M2 polariseringseffekt eller Mtb-smittsamhet mellan givare kan leda till problem med både intra- och interexperimentala variationer, låg statistisk effekt och ett behov av att inkludera många givare för att få tillförlitliga resultat. Dessutom resulterar plast vidhäftning av monocyter från PBMCs i ett givarberoende antal monocyter/brunn som så småningom kan ge en godtycklig MOI som kan påverka makrofag polarisering och cell livskraft efter Mtb infektion. Kritiska steg i protokollet innebär korrekt tvättning för att förhindra att andra celltyper förorenar cellkulturerna som också kan påverka makrofagpolariseringen. Medan en för låg MOI kan efterlikna latent TB-infektion, kommer en för hög MOI att döda cellerna, vilket belyser vikten av att använda en lämplig MOI. Dessutom kan det vara svårt att hämta fast vidhäftande celler vid lossning, vilket kan resultera i en partisk representation av vissa makrofager delmängder som används för flöde cytometri analyser. Ett avgörande steg i flödescytometrianalysen innebär korrekt användning av pärlor kompensationsmatris och negativa kontroller såsom osedda celler eller FMO (Fluorescence Minus One) kontroller för att säkerställa korrekt manuell gating.

En annan begränsning innebär polarisering av monocyter som härrör från blod och inte från den lokala vävnadsmiljön. Kännetecknet för mänsklig tbc är bildandet av granulom i Mtb-infekterade vävnader och därför bör immunopathology i TB företrädesvis studeras på den lokala vävnadsplatsen. Monocyter rekryteras dock till lungan från perifert blod vid inflammation/infektion, där celler kan differentiera sig i makrofager i närvaro av inflammatoriska cytokiner som GM-CSF12. Viktigt, i den fysiologiska miljön av vävnad in vivo, det finns sannolikt en stor heterogenitet av makrofag polarisering inklusive en blandning och olika förhållanden av olika M1- och M2-liknande makrofag populationer som bidrar till ödet för TB infektion36. Vi har tidigare utvecklat en human organotypisk lungvävnadsmodell som möjliggör 3D-studier av makrofagmedierad granulombildning i TB37. Det kan vara intressant att utnyttja det nuvarande M1/M2 polarisering protokollet i kombination med lungvävnadsmodellen för att ytterligare studera TB granulom bildas, effector funktioner och M1/M2 förhållandet i experimentell vävnad.

Detta M1/M2 flödecytometry protokoll kan lätt anpassas för att inkludera en utökad panel av myeloiska markörer som är användbara för bedömning av funktioner som är associerade med hämmande såväl som inflammatoriska svar. Det finns ett stort forskningsintresse för hämmande immunkontrollmolekyler som PD-1, SIRP-α, IDO och arginaser som kan modulera makrofagsvar38. I detta sammanhang kan polarisering av myeloiska celler också innebära andra stimuli som främjar immunregulatoriska makrofager (Mreg) eller myeloisk-härledda suppressorceller (MDSC) som har visat sig vara inblandade i flera sjukdomar inklusive TB38. Mer avancerade flöde cytometri paneler av M1/M2/Mreg makrofag delmängder kan också omfatta intracellulär färgning av cytokiner/chemokiner IL-1β, TNF-α, IL-10 och MCP-1 eller andra lösliga faktorer eller effektor molekyler såsom inducible kväveoxid (iNOS) och antimikrobiella peptider. Detta kan förbättra möjligheterna att studera polyfunktionella makrofag svar, liknande vad som har beskrivits utförligt för T celler39.

För närvarande kan flöde cytometri färgning paneler innehålla upp till 30-40 färger, vilket ger möjlighet att immunophenotype flera cell delmängder och molekyler samtidigt. Den grundläggande experimentella uppsättningen av detta M1/M2 flöde cytometri protokoll kan användas som en ryggrad som är kompatibel med de flesta gamla samt nya flöde cytometrar och kan byggas på och skräddarsys enligt individuella behov inklusive de utmaningar som arbetet med virulent Mtb i en BSL-3-miljö innebär. Numera finns dimensionalitetsreduktionstekniker som UMAP tillgängliga i de nya versionerna av flödescytometriprogramvara, vilket möjliggör analys av ett stort antal parametrar som genereras i encelliga studier som är avgörande för förbättrad visualisering och tolkning av högdimensionella data40. De ständiga tekniska förbättringarna i flöde cytometri kommer sannolikt att fortsätta under de kommande åren inklusive kombinationen av multi-parametrisk fenotypning tillsammans med moderna cell sortering kapacitet, där detta protokoll kan visa sig användbart i flera makrofag baserade Mtb infektion analyser.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar våra kollegor på Folkhälsomyndigheten, Matilda Svensson och Solomon Ghebremichael för hjälp i BSL-3-laboratoriet.

Detta arbete stöddes av anslag från Hjärt- och Lungfonden (HLF) (2019-0299 och 2019-0302 till SB), Vetenskapsrådet (VR) (2014-02592, 2019-01744 och 2019-04720 till SB), Stiftelsen för förebyggande av antibiotikaresistens (Resist), Karolinska Institutets stiftelser och KID to SB (partiell finansiering av forskarutbildning för Marco Loreti) från Karolinska Institutet. ML fick stöd från Barncancerfonden (TJ2018-0128 och PR2019-0100).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-well chamber slides Lab-Tek 154534
BD Comp bead plus BD 560497
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
DAPI Mounting media Vector Laboratories H-1200-10
EDTA (0.5 M) Karolinska University hospital, Huddinge N/A
Falcon 6-well Flat Bottom plates Corning Life Sciences 353046
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Glycerol (70%) Karolinska University hospital, Huddinge N/A
GM-CSF Peprotech 300-03
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody Invitrogen R37121 Secondary antibody for CD64
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody Invitrogen A-11037 Secondary antibody for CD163
HEPES GE Healthcare Life Sciences SH30237.01
IFN-γ Peprotech 300-02
IL-4 Peprotech 200-04
L-Glutamine GE Healthcare Life Sciences SH30034.01
LPS (Escherichia coli O55:B5) Sigma-Aldrich L6529
Lymphoprep Alere Technologies AS 11508545
M-CSF Peprotech 300-25
Middle Brook 7H10 agar plates Karolinska University hospital, Huddinge N/A
Middle Brook 7H9 media Karolinska University hospital, Huddinge N/A
Mouse anti-human CD64 primary antibody Bio-Rad MCA756G Clone: 10.1
Na-pyruvate GE Healthcare Life Sciences SH300239.01
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121
Rabbit anti-human CD163 primary antibody GeneTex GTX81526 Polyclonal
RPMI 1640 Life Technologies Corporation SH30096.01
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
TubeSpin bioreactor tubes TPP Techno Plastic Products AG 87050
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Tween-80 Sigma-Aldrich P4780

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  2. Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. Macrophage polarization in health and disease. Scientific World Journal. 11, 2391-2402 (2011).
  3. Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. Journal of Immunology. 164 (12), 6166-6173 (2000).
  4. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000 Prime Reports. 6, 13 (2014).
  5. Atri, C., Guerfali, F. Z., Laouini, D. Role of human macrophage polarization in inflammation during infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2018).
  6. Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
  7. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  8. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. Journal of Immunology. 178 (8), 5245-5252 (2007).
  9. Nathan, C. F., Murray, H. W., Wiebe, M. E., Rubin, B. Y. Identification of interferon-gamma as the lymphokine that activates human macrophage oxidative metabolism and antimicrobial activity. Journal of Experimental Medicine. 158 (3), 670-689 (1983).
  10. Leidi, M., et al. M2 macrophages phagocytose rituximab-opsonized leukemic targets more efficiently than m1 cells in vitro. Journal of Immunology. 182 (7), 4415-4422 (2009).
  11. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: a marker of alternative immunologic macrophage activation. Journal of Experimental Medicine. 176 (1), 287-292 (1992).
  12. Italiani, P., Boraschi, D. From Monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Frontiers in Immunology. 5, 514 (2014).
  13. Verreck, F. A., et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (13), 4560-4565 (2004).
  14. Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 88 (1), 159-168 (2010).
  15. Refai, A., Gritli, S., Barbouche, M. R., Essafi, M. Mycobacterium tuberculosis virulent factor ESAT-6 drives macrophage differentiation toward the pro-inflammatory M1 phenotype and subsequently switches it to the anti-inflammatory M2 phenotype. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 327 (2018).
  16. Kahnert, A., et al. Alternative activation deprives macrophages of a coordinated defense program to Mycobacterium tuberculosis. European Journal of Immunology. 36 (3), 631-647 (2006).
  17. Marino, S., et al. Macrophage polarization drives granuloma outcome during Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 83 (1), 324-338 (2015).
  18. Erbel, C., et al. An in vitro model to study heterogeneity of human macrophage differentiation and polarization. Journal of Visualized Experiments. (76), e50332 (2013).
  19. Lee, C. Z. W., Kozaki, T., Ginhoux, F. Publisher Correction: Studying tissue macrophages in vitro: are iPSC-derived cells the answer. Nature Reviews Immunology. 18 (11), 726 (2018).
  20. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (76), e50323 (2013).
  21. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
  22. McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  23. Njoroge, J. M., et al. Characterization of viable autofluorescent macrophages among cultured peripheral blood mononuclear cells. Cytometry. 44 (1), 38-44 (2001).
  24. Li, F., et al. Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).
  25. Rao Muvva, J., Parasa, V. R., Lerm, M., Svensson, M., Brighenti, S. Polarization of human monocyte-derived cells with vitamin D promotes control of Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Immunology. 10, 3157 (2019).
  26. Tarique, A. A., et al. functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
  27. Hristodorov, D., et al. Targeting CD64 mediates elimination of M1 but not M2 macrophages in vitro and in cutaneous inflammation in mice and patient biopsies. MAbs. 7 (5), 853-862 (2015).
  28. Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
  29. Xu, Z. J., et al. The M2 macrophage marker CD206: a novel prognostic indicator for acute myeloid leukemia. Oncoimmunology. 9 (1), 1683347 (2020).
  30. Liu, Q., et al. Differential expression and predictive value of monocyte scavenger receptor CD163 in populations with different tuberculosis infection statuses. BMC Infectious Diseases. 19 (1), 1006 (2019).
  31. Sugaya, M., et al. Association of the numbers of CD163(+) cells in lesional skin and serum levels of soluble CD163 with disease progression of cutaneous T cell lymphoma. Journal of Dermatological Science. 68 (1), 45-51 (2012).
  32. Nawaz, A., et al. CD206(+) M2-like macrophages regulate systemic glucose metabolism by inhibiting proliferation of adipocyte progenitors. Nature Communications. 8 (1), 286 (2017).
  33. Liu, B., Zhang, M., Zhao, J., Zheng, M., Yang, H. Imbalance of M1/M2 macrophages is linked to severity level of knee osteoarthritis. Experimental and Therapeutic Medicine. 16 (6), 5009-5014 (2018).
  34. Lee, C., et al. M1 macrophage recruitment correlates with worse outcome in SHH Medulloblastomas. BMC Cancer. 18 (1), 535 (2018).
  35. Rekha, R. S., et al. Phenylbutyrate induces LL-37-dependent autophagy and intracellular killing of Mycobacterium tuberculosis in human macrophages. Autophagy. 11 (9), 1688-1699 (2015).
  36. Mattila, J. T., et al. Microenvironments in tuberculous granulomas are delineated by distinct populations of macrophage subsets and expression of nitric oxide synthase and arginase isoforms. Journal of Immunology. 191 (2), 773-784 (2013).
  37. Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection. Journal of Visualized Experiments. (104), e53084 (2015).
  38. Brighenti, S., Joosten, S. A. Friends and foes of tuberculosis: modulation of protective immunity. Journal of Internal Medicine. , 12778 (2018).
  39. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Good cell, bad cell: flow cytometry reveals T-cell subsets important in HIV disease. Cytometry Part A. 77 (7), 614-622 (2010).
  40. Becht, E., et al. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP. Nature Biotechnology. 37, 38-44 (2019).

Tags

Denna månad i JoVE Nummer 163 makrofag människa polarisering M1/M2 Mycobacterium tuberculosis infektion immunsvar flödescytometri

Erratum

Formal Correction: Erratum: Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection
Posted by JoVE Editors on 10/14/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. Author and affiliation information was updated.

The author and affiliation information was updated from:

Akhirunnesa Mily1, Sadaf Kalsum1, Marco Giulio Loreti1, Rokeya Sultana Rekha2, Jagadeeswara Rao Muvva1, Magda Lourda1,3, Susanna Brighenti1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet 
2Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet 
3Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

to:

Akhirunnesa Mily1,2, Sadaf Kalsum1, Marco Giulio Loreti1, Rokeya Sultana Rekha3, Jagadeeswara Rao Muvva1, Magda Lourda1,4, Susanna Brighenti1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet 
2Infectious Diseases Division, International Centre for Diarrhoeal Disease Research, Bangladesh
3Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet 
4Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

Polarisering av M1- och M2-humana monocytbaserade celler och analys med flödescytometri vid <em>mykobakterie tuberculosisinfektion</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mily, A., Kalsum, S., Loreti, M. G., … More

Mily, A., Kalsum, S., Loreti, M. G., Rekha, R. S., Muvva, J. R., Lourda, M., Brighenti, S. Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. J. Vis. Exp. (163), e61807, doi:10.3791/61807 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter