Summary
טכניקה זו מאפשרת הכנה מהירה ופשוטה של סעיף שרין בגודל זרע כולו לתצפית וניתוח של תאים, גרגרי ענבן, וגופים חלבון באזורים שונים של הזרע.
Abstract
מורפולוגיה, גודל וכמות של תאים, גרגרי ענבן וגופים חלבון בזרע לקבוע את המשקל ואיכות הזרע. הם שונים באופן משמעותי בין אזורים שונים של זרעים. על מנת להציג את המורפולוגיות של תאים, גרגרי איתילן וגופים חלבון בבירור, וכמותית לנתח את הפרמטרים המורפולוגיה שלהם במדויק, המקטע בגודל כל הזרעים נדרש. למרות כל הזרע בגודל פרפין סעיף יכול לחקור את ההצטברות של חומרי אחסון בזרעים, קשה מאוד לנתח כמותית את הפרמטרים מורפולוגיה של תאים וחומרי אחסון בשל הרזולוציה הנמוכה של הסעיף העבה. סעיף שרף דק יש ברזולוציה גבוהה, אבל שיטת מקטע שרף שגרתי אינו מתאים להכין את החלק בגודל הזרע כולו של זרעים בוגרים עם נפח גדול ותוכן עעמלן גבוה. במחקר זה, אנו מציגים שיטת מקטע יבש פשוטה להכנת סעיף שבין בגודל זרע כולו. הטכניקה יכולה להכין את הצלב ואת האורך בגודל זרעים של פיתוח, בוגר, נבט, וזרעים מבושלים מוטבע שרף לבן LR, אפילו עבור זרעים גדולים עם תוכן עעמלן גבוה. החלק בגודל זרע כולו יכול להיות מוכתם עם מבהיר פלורסנט 28, יוד, ו Coomassie כחול מבריק R250 כדי להציג באופן ספציפי את המורפולוגיה של תאים, גרגרי עילן, וגופים חלבון בבירור, בהתאמה. ניתן לנתח את התמונה שהושגה גם באופן כמותי כדי להראות את הפרמטרים המורפולוגיה של תאים, גרגרי איתילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע.
Introduction
זרעי צמחים מכילים חומרי אחסון כגון עילן וחלבון ומספקים אנרגיה ותזונה לאנשים. הצורה, הגודל והכמות של תא וחומרי אחסון קובעים את המשקל והאיכות של הזרע. התאים וחומרי האחסון באזורים שונים של זרעים יש מורפולוגיות שונות באופן משמעותי, במיוחד עבור כמה גידולי דגנים עמילוס גבוה עם עיכוב של עמילן הסתעפות אנזים IIb1,2,3. לכן, חשוב מאוד לחקור את המורחולוגיות של תאים וחומרי אחסון באזורים שונים של זרעים.
פרפין קטע היא שיטה טובה כדי להכין את כל הזרע בגודל סעיף יכול להציג את מבנה הרקמה של הזרע ואת הצטברות של חומר אחסון באזורים שונים של זרע4,5,6. עם זאת, סעיפים פרפין בדרך כלל יש 6-8 μm עובי עם רזולוציה נמוכה; לכן, קשה מאוד להתבונן בבירור ולנתח באופן כמותי את המורפולוגיה של תא וחומרי אחסון. מקטעים שרין בדרך כלל יש 1-2 μm עובי ברזולוציה גבוהה והם מתאימים מאוד להתבונן ולנתח את המורפולוגיה של תא וחומריאחסון 7. עם זאת, שיטת ניתוח שרין שגרתית מתקשה להכין את המקטע בגודל זרע כולו, במיוחד עבור זרעים עם נפח גדול ותוכן איתן גבוה; לפיכך, אין דרך להתבונן ולנתח את המורפולוגיה של תאים וחומרי אחסון באזורים שונים של הזרע. שרף לבן LR הוא שרף אקרילי ומציג צמיגות נמוכה וחחללות חזקה, המוביל יישומים טובים שלה בהכנת סעיף שרף של זרעים, במיוחד עבור גרעינים בוגרים דגנים עם נפח גדול ותוכן איתילן גבוה. בנוסף, המדגם מוטבע LR לבן שסוף ניתן להכתים בקלות עם צבעים כימיים רבים כדי להציג בבירור את המורפולוגיה של תאים וחומרי אחסון תחת אור או מיקרוסקופפלורסנט 7. בעיתון הקודם שלנו, דיווחנו על שיטת מקטע יבש להכנת חלקים בגודל זרע של גרעיני דגנים בוגרים מוטבע שרף לבן LR. השיטה יכולה גם להכין את החלק בגודל זרע של פיתוח, נביטה ומבושלת גרעין דגנים8. הסעיף שהתקבל בגודל זרע כולו יש יישומים רבים תצפית מיקרומורפולוגיה וניתוח, במיוחד עבור צפייה ברורה וניתוח כמותי של הבדלי מורפולוגיה של תא וחומרי אחסון באזורים שונים שלזרע 8,9.
טכניקה זו מתאימה לחוקרים שרוצים לבחון את מבנה המיקרו של רקמות ואת הצורה והגודל של תאים, גרגרי איתילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע באמצעות מיקרוסקופ אור. ניתן לנתח את התמונות של חלקים בגודל זרעים שלמים המוכתמים במיוחד עבור תאים מוצגים, גרגרי איתילן וגופים חלבון על ידי תוכנת ניתוח מורפולוגיה כדי למדוד באופן כמותי את הפרמטרים המורפולוגיה של תאים, גרגרי איתילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע. על מנת להדגים את הישימות הטכנית ויישומי סעיף בגודל זרעים שלמים, חקרנו את הזרעים הבוגרים של תירס ואונס זרעי שמן ואת הגרעינים המתפתחים, נבט, ומבושל של אורז במחקר זה. הפרוטוקול מכיל ארבעה תהליכים. כאן, אנו משתמשים בליבת תירס בוגרת, שהיא הקשה ביותר בהכנת המקטעים בגודל כל הזרע בשל נפח גדול ותוכן מעילן גבוה, כדגימה כדי להציג את התהליכים צעד אחר צעד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת זרע מוטבע שרף (איור 1)
- לתקן שישה גרעינים תירס בוגר ב 10 מ"ל של 2.5% גלוטרלדה פוספט אגירה (0.1 M, pH7.2) ב 4 ° C עבור 48 שעות. החוקרים יכולים לבחור תערובות קיבעון אחרות, ריכוזים קיבעון, ותנאי קיבעון על פי מטרות המחקר שלהם וסוגי רקמות.
- להוציא את הגרעינים ולחתוך אותם לאורך או transversally ל 2-3 מ"מ עובי באמצעות להב חד דו צדדי, ולתקן אותם ב 10 מ"ל של 2.5% גלוטרלדה פוספט אגירהייד (0.1 M, pH 7.2) שוב במשך 48 שעות.
- לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 10 מ"ל של 0.1 M פוספט מאגר (pH 7.2) במשך 30 דקות בכל פעם.
- מייבשים את הדגימות בהגדלת הציונים של תמיסת אתנול (10 מ"ל) מ-30% ל-50%, 70%, 90% פעם אחת ו-100% שלוש פעמים במשך 30 דקות בכל פעם.
- לחדור את הדגימות ב 10 מ"ל הגדלת ציונים של פתרון LR לבן שרפים מדולל עם אתנול מ 25% כדי 50%, 75% פעם אחת, ו 100% פעמיים ב 4 ° C עבור 12 שעות בכל פעם.
- הכינו את הדומיות לדגימות לפני ההטיה. להוסיף 0.25 מ"ל של 100% LR לבן שף לתוך צינור צנטריפוגה 2 מ"ל, ופולימר אותו ב 60 ° C עבור 48 שעות.
- ברציפות להוסיף שרף לבן LR טהור (0.5 מ"ל) ואת הדגימה הסתננה לתוך צינור צנטריפוגה עם ה-Pedestal. מיישרים את הדגימות עם המחט האנטומית, וממירים אותן ב-60 מעלות צלזיוס בתנור למשך 48 שעות.
2. מקטע יבש להכנת חלק בגודל זרע שלם (איור 1)
- להוציא את הגרעינים מוטבעים מצינור הצנטריפוגה ולחתוך את שרף עודף סביב המדגם באמצעות להב חד.
- מהדק את בלוק הברסין במחזיק המדגם של אולטרה מיקרוטומי (EM UC7), ולקצץ את את השנין המיותר על פני השטח של המדגם וסביב הדגימה עם להב.
- ללטש את פני השטח של המדגם דק עם סכין זכוכית עד שניתן יהיה לגבש קטע שלם.
- לשים וו נחושת קטן על 2 מ"מ מעל קצה הלהב לפני חיתוך ולחתוך את הדגימה לתוך סעיף 2 μm. התפקיד של הוו הוא למנוע את התלתל כלפי מעלה של המקטע.
- שים את הוו מתחת למקטע כדי לתמוך בו כאשר המקטע הופך ארוך.
- מוסיפים 100 μL של מים על מגלשה לא מטופלת, ומעבירים בזהירות את החלק המלא והבלתי שבור למים עם הפינצטה.
- על מנת להחליק את החלק המקומט, מחממים ויבשים את הדגימה על שולחן השיטח ב-50 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- אם המקטע מתפורר או דמעות, להאריך את הזמן עבור כל חדירה של שריון של המדגם מ 12 שעות כדי 24 שעות או 48 שעות.
- אם בחלק יש כמה קווים מקבילים לסכין, מהדק את בלוק הדגימה בחוזקה. אם בחלק יש כמה קווים אנכיים לסכין, אנא השתמש בסכין חדשה.
3. הכתמה והתבוננות בסעיף
הערה: על מנת לבחון את מבנה הרקמות ומורפולוגיה של תאים, גרגרי עילן, וגופים חלבון, להכתים את החלקים עם כתמים ספציפיים על פי מטרת המחקר. כאן, אנו משתמשים במבהיר פלורסנט 28, תמיסת יוד, ו- R250 כחול מבריק Coomassie כדי להכתים את קירות התא, גרגרי עילן, וגופים חלבון, בהתאמה.
- להתבוננות מורפולוגיה של תאים, להכתים את המקטע עם 40 מ"ל של 0.1% (w / v) מבהיר פלורסנט 28 פתרון מים בצנצנת כתמים זכוכית קומפקטית 70 מ"ל ב 45 ° C במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותו עם מים זורמים במשך 5 דקות. צפה וצלם את החלק תחת מיקרוסקופ פלואורסציטי מצויד במצלמת CCD.
- להתבוננות מורפולוגיה של גרגרי עען, להכתים את המקטע עם 40 μL של תמיסת יוד (0.07% (w /v) I2 ו 0.14% (w / v) KI ב 25% (v /v) גליקרול עבור 1 דקות, ולכסות את המדגם המכיל פתרון יוד עם כיסוי. הצג וצלם את הדגימה תחת מיקרוסקופ אור המצויד במצלמת CCD.
- להתבוננות מורפולוגיה של גופים חלבון, לטבול את המקטע עם 40 מ"ל של 10% (v /v) חומצה אצטית בצנצנת ויטראז' קומפקטית 70 מ"ל במשך 10 דקות ב 45 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להכתים אותו ב 40 מ"ל של 1% (w / v) Coomassie כחול מבריק R250 ב 25% (v / v) isopropanol ו 10% (v / v) חומצה אצטית במשך 15 דקות ב 45 ° C. שוטפים את החלקים המוכתמים במים זורמים במשך 5 דקות, וייבאשו. צפה וצלם את החלק תחת מיקרוסקופ אור מצויד במצלמת CCD.
4. ניתוח כמותי של פרמטרים מורפולוגיים
- תהליך וכמותי לנתח את התמונות המצולם עבור אזור, ציר ארוך / קצר, מעוגל של תאים, גרגרי מעילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע באמצעות תוכנת ניתוח מורפולוגיה (Image-Pro פלוס 6.0 תוכנה) בעקבות ההליכים של Zhao etal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטת מקטע יבש פשוטה להשגת מקטע בגודל זרע שלם
אנו מקימים שיטת מקטע יבש פשוט להכנת קטע בגודל זרע שלם של זרע מוטבע LR-לבן שף(איור 1). השיטה יכולה להכין מקטעים טרנסוורסאליים ואורך בגודל זרע שלם בעובי של 2 μm(איור 2-5, דמות משלימה 1-4). לדוגמה, הזרע הבוגר של אונס זרעי שמן ניתן לתדרך ולאורך(איור 2). עבור גידולי דגנים, הגרעינים הבוגרים שלהם מלאים גרגרי איתן, מה שמוביל לכך שקשה מאוד להכין את החלק בגודל כל הזרעים. באמצעות הטכניקה הנוכחית, חלקים טרנסוורסאליים ואורך בגודל זרע של תירס בוגר עם נפח גדול יכוללהיות גם מוכן (איור 4,דמות משלימה 1). בנוסף, ניתן לחקור את הקרנל המתפתח (דמות משלימה 2),הקרנל הנבט (דמות משלימה 3),וגרעין מבושל (דמות משלימה 4) של אורז בשיטה.
יישומים של המקטע בגודל כל הזרע
התבוננות במבנה הרקמות של הזרע
ניתן להשתמש בחלק בגודל זרע כולו כדי לבחון את מבנה הרקמה של הזרעים. לדוגמה, העובר של אונס זרעי שמן מורכב רדיק, hypocotyl, plumule, ושני cotyledons. הקוטיילונים הפנימיים והחוץיים כפופים לשניים, עוטפים את ההיפוקוטיל והרדיקל והופך את העובר כדורי(איור 2א,ג). החלקים האורך והטרנסוורסיאלי בגודל של עובר שלם מוכתמים בספראנין הציגו בבירור את הרדיק, היפוקוטיל, קוטיילדון הפנימי והקוטילדון(איור 2B,D). החלק האורך בגודל עובר של אונס זרעי שמן מוכן בצורה קשה יותר מאשר החלק הטרנסוורסאלי. לכן, החלקים הטרנסוורסלים של העוברים נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את המיקרומורפולוגיה של עובריםבהפניות 5,10.
מורפולוגיה וניתוח תאים באזורים שונים של זרעים
ניתן להשתמש במקטע בגודל זרע כולו כדי להתבונן ולנתח את המורפולוגיה של תאים באזורים שונים של זרעים. לדוגמה, החלקים הטרנסוורסיביים בגודל עובר של אונס זרעי שמן היו מוכתמים בהבהרה פלואורסצנטית 28, וקירות התא היו מוכתמיםבמיוחד (איור 3א). המיקרומורפולוגיה של תאים בכל אזור של העובר יכול להיות מוצג בבירור בהגדלה גבוהה (איור 3B, C). הרדיק מורכב מאפידרם, קליפת המוח ורקמות כלי דם. תאי האפידרמיס הממוקמים בשכבה החיצונית ביותר של רדיק היו מלבניים ומסודרים באופן רדיאלי. תאי parenchyma קליפתיים היו עגולים בצורה וגדול בגודל. כמה רווחים נפרדים נצפו בין תאים קליפתיים. התאים הקליפתיים אורגנו בשכבות מבפנים החוצה(איור 3B). תאי האפידרמיס של קוילדון היו מרובעים והיה להם נפח קטן. לא היו הבדלים משמעותיים בצורה ובגודל של תאים אפידרמיסים בין משטחים פנימיים ופנימיים של cotyledons הפנימי והחוץ. כמה צילינדרים כלי דם היו מפוזרים באמצע רקמות mesophyll של cotyledons הפנימי והחוץ. תאי parenchyma mesophyll היו גדולים באופן משמעותי מאשר תאי האפידרמיס ותאי צילינדר כלי דם בקוטלידון. תאי parenchyma mesophyll הראו סידור palisading טיפוסי באזור הפנימי של cotyledon והאזור החוץ של cotyledon הפנימי(איור 3C). תאי parenchyma היו מורפולוגיות שונות באופן משמעותי באזורים שונים של העובר. על מנת לחשוף את ההבדלים שלהם במורפולוגיה, אזורים 1, 2, 3, 4 ו-5 נבחרו ברקמה הקליפתית הרדיקלה, באזור הפנימי של קוילדון הפנימי, באזור החוץ של קוילדון הפנימי, באזור הפנימי של קוילדון החוצה, ובחוץ האזור של קוטילדון החוצה, בהתאמה(איור 3B,C). הפרמטרים המורפולוגיה של תאי parenchyma ב 5 האזורים לעיל נותחו כמותית באמצעות תוכנת ניתוח מורפולוגיה(טבלה משלימה 1). האזור, אורך ציר ארוך, אורך ציר קצר, ועובי של תאי parenchyma הראו כמה הבדלים באזורים שונים של עוברים.
התאים בא אנדוספרם היו מלאים בחלבון ועענון ואחסון. באמצעות מקטע שף בגודל זרע כולו, קל בהתבוננות וניתוח התאים באזורים שונים של אנדוספרם. לדוגמה, מורפולוגיה של תאים בכל אזור של אנדוספרם תירס ניתן לראות בבירור לאחר המקטעים הרוחביים בגודל זרע כולו היו מוכתמים עם מבהיר פלורסנט 28. ההיקפיות, האמצע, והמרכזי באותו ליבה הציגו צורות וגדלים שונים באופן משמעותי של תאים(איור משלים 1). על מנת לנתח באופן כמותי את הפרמטרים המורפולוגיה של תאים באזורים שונים של אנדוספרם, התמונות של אזורים נותחו באמצעות תוכנת ניתוח מורפולוגיה; הפרמטרים המורפולוגיה של תאים מוצגים בטבלה משלימה 2. לתאי אנדוספרם באזור 1 היה האזור הקטן ביותר מבין ארבעה אזורים, אלה באזור 2 היו גדולים יותר מאלה באזור 3, אך קטנים יותר מאלה באזור 4.
מורפולוגיה וניתוח גרגרי ענבן באזורים שונים של זרעים
הזרעים הבוגרים מרוב משאבי הצמח, במיוחד עבור גידולי דגנים, מכילים תכולת עילן גבוהה. מורפולוגיה גרגיר וגודל של ענבן יש השפעות חשובות על תכונות איתן ולשחק תפקיד באיכות הזרע. ניתן להכתים את סעיף הזרעים של הזרעים בתמיסת יוד כדי להציג את המורפולוגיה של גרגרי עילן באזורים שונים של זרעים. לדוגמה, החלקים הרוחביים והאורך בגודל של זרעים שלמים של תירס הוכנו בהצלחה. החלקים המוכתמים ביוד הציגו את המורפולוגיה של עילן (איור 4). על מנת להראות את המורפולוגיה של גרגיר עעמלן באזורים שונים של אנדוספרם, ארבעת האזורים ותשעה אזורים נבחרו במקטעים הרוחביים והאורך בגודל זרעים שלמים, בהתאמה(איור 4). גרגרי העעילן באזורים שונים הראו מורפולוגיה שונה באופן משמעותי, גודל וכמות בתאי אנדוספרם. עבור קטע רוחב, אזור 1 היו גרגרי עימלן כדוריים, אזור 2 היו גרגרים מצולעים, גרגרי עיען בשני האזורים 3 ו 4 היו כדוריים. עבור קטע אורכי, גרגרי עען עם צורה מצולע באזורים 1, 4, 5, ו 8 היו גדולים יותר מאלה עם צורה כדורית באזורים 3, 7, ו 9, וכמה גרגרי עען מורכבים נצפו באזורים 2 ו 6.
הניתוח הכמותי של פרמטרים מורפולוגיים של גרגרי עימלן בארבעה אזורים של סעיף טרנסברסל הוצג בטבלה משלימה 3. גרגרי תערם באזור 1 היו בגודל הקטן ביותר, אלה באזור 2 היו בגודל הגדול ביותר, ואלה באזור 3 היו גדולים יותר מאשר באזור 4.
מיקרומורפולוגיה וניתוח של גופי חלבון באזורים שונים של זרעים
ניתן להשתמש בחלק בגודל זרעים מלאים עם חלבון אחסון גבוה כדי להפוך ולנתח את המורפולוגיה של גופי חלבון באזורים שונים של זרעים. לדוגמה, החלק הטרנסוורסל של העובר של אונס זרעי שמן היה מוכתם בכחול מבריק Coomassie R250, וחלבון האחסון היה מוכתם כחול(איור 5). ההתפלגות המרחבית של חלבון אחסון בעובר ניתן לצפות בבירור בהגדלה הנמוכה (איור 5A). חלבון אחסון קיים בגופי חלבון. בהגדלה גבוהה, גוף החלבון הציג מטריצה הטרוגנית עם כמה גרגרים שחורים וכמה מבנה שקוף לא מודבק(איור 5B). לגופים החלבונים בזרע יש שלושה סוגים: הסוג הראשון מורכב מטריצת חלבון הומוגנית ואין לו הכללות, הסוג השני מכיל גבישים כדוריים, והסוג השלישי מכיל גבישים כדוריים וpseudocrystals11. הגבישים כדוריים בגוף החלבון מורכבים מפיטט וממלחים לא אוגניים אחרים, שאינם מוכתמים. גבישים כדוריים אלה הם שחורים בשל כך שהאור לא יכול לעבור דרכם תחת מיקרוסקופ. בנוסף, הגביש הכדורי הוא שביר וקשה לחדור על ידי חומר קיבעון וההטמיה. בעת ביצוע המקטע, הגבישים כדוריים לפעמים פרצו, וכתוצאה מכך חלל שקוף בתוך גוף החלבון11. גוף החלבון של עובר אונס זרעי שמן הכיל גבישים ספרואידיים על פי המיקרומורפולוגיה שלו (איור 5B). על מנת לחקור את ההתפלגות המרחבית של גופי החלבון בעובר, נבחרו חמישה אזורים בחלק בגודל העובר כולו, כדי לייצג את הרקמה הקליפתית הרדיקלה, האזור הפנימי של קוטילדון הפנימי, האזור החוץ של קוילדון הפנימי, האזור הפנימי של קוטילדון החוץ, והאזור החוץי שלקוטולדון (איור 5A, C-G). גופי החלבון בכל אזורי העובר היו כדוריים, אליפסואידים ולא סדירים בצורתם(איור 5C-G).
ניתוח כמותי של גופים חלבון בתאי parenchyma שכב הראשון והשני קרוב האפידרמיס בחמשת האזורים שנבחרו לעיל מוצגים בטבלה משלימה 4. לאזור גוף החלבון היה הבדל קל בין חמשת האזורים הנבחרים. העיקות של גוף החלבון הייתה נמוכה משמעותית באזור החוץ של קוילדון מאשר בארבעת האזורים האחרים, מה שמצביע על כך שגוף החלבון בקוטילדון החוץ היה קרוב לכדור. מספר ואינדקס האזור של גוף חלבון בתא היו גבוהים באופן משמעותי בתא parenchyma רדיק מאשר בתא parenchyma cotyledon(טבלה משלימה 4).
איור 1: הכנת מקטע חצי-רין בגודל זרע כולו באמצעות שיטת מקטע יבש. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: מבנה רקמות של העובר בזרע בוגר של שמן זרעי אונס מגוון Huashuang 5. מורפולוגיהשל העובר. (ב)מבנה רקמות של קטע בגודל עובר שלם אורכי. (ג)מורפולוגיה של סעיף עובר כולו טרנסוורסל. (ד)מבנה רקמות של חלק עוברי רוחבי בגודל שלם. החלקים היו מוכתמים בספראנין. ה', היפוקוטיל; IC, קוילדון פנימי; או.סי, קוילדון החוצה; ר', רדיק. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מורפולוגיה של תאים בעובר של שמן זרעי אונס מגוון Huashuang 5. (א)קטע עובר שלם טרנסוורסל מוכתם בהבהרה פלורסנט 28. (ב)התעצם אזור B in (A), המציג את מורפולוגיה התא ואת מבנה הרקמות של רדיק. (ג)ההגדלה של אזור C in (A), המציג את המורפולוגיה של התא ואת מבנה הרקמות של קוטלדון הפנימי וההחוצה. סרגל קנה מידה = 500 μm עבור (A) ו 100 μm עבור (B, C). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: מורפולוגיה של גרגרי עילן בגרעין בוגר של זן תירס Zheng 58. החלקים הטרנסוורסלים (A)והאורך(B)היו מוכתמים בתמיסת יוד, וההגדלה האזורית שלהם מציגה את המורפולוגיה של גרגרי עעמלן באזורים שונים של אנדוספרם. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ עבור מקטע בגודל זרע שלם ו- 20 μm עבור ההגדלה האזורית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: מורפולוגיה של גופים חלבון בעובר של שמן אונס מגוון Huashuang 5. (א)קטע טרנסברסל בגודל עובר שלם מוכתם בכחול מבריק Coomassie R250. (ב)התהגבירות של גופי החלבון, המציגים את המבנה הזעיר שלהם. (ג-ג)מהאתה עושה? ההגדלה של אזור C-G in (A), המציגה את המורפולוגיה של גוף החלבון ברדיק(C),האזור הפנימי של קוטילדון הפנימי(D),האזור התחתון של קוטלדון הפנימי(E),האזור הפנימי של קוטילדון(F),האזור הפנימי של קוטילדון הפנימי (G). סרגל קנה מידה = 500 μm עבור (A), 5 μm עבור (B) ו- 50 μm עבור (C-G). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
משלים זה איור 1: מורפולוגיה של תאים בנרל בוגר של זן תירס Zheng 58. החלק הטרנסוורסי בגודל זרעים שלמים היה מוכתם בהבהרה פלורסנט 28, וההתעצמות האזורית שלו (1-4) מציגה את המורפולוגיה של תאי אנדוספרם באזורים שונים של אנדוספרם. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ עבור מקטע בגודל זרע שלם ו- 100 μm עבור ההגדלה האזורית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
משלים זה איור 2: מורפולוגיה של פיתוח גרעין של אורז מגוון 9311. החלקים הטרנסוורסיים בגודל זרעים שלמים בימים שונים לאחר הפריחה (DAF) היו מוכתמים עם תמיסת ספראנין O ויוד. סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
דמות משלימה 3: מורפולוגיה של גרעין נביט של אורז מגוון Te-qing. הסעיף בגודל כל הזרע האורך ב 8 ימים לאחר imbibition היה מוצלב עם חומצה תקופתית-שיף וכחול טולואידין O, ואת ההגדלות האזוריות שלה להציג את השינויים מורפולוגיה של אנדוספרם באזורים שונים של זרע. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
משלים זה איור 4: המורפולוגיה של הקרנל המבושל של אורז מגוון Te-qing. החלק הטרנסוורסי בגודל זרעים שלמים היה מוכתם בתמיסת יוד, וההתעצמות שלו באזור החוץ, האמצעי והפנימי מציגים את השינויים המורפולוגיים של גרגרי עילן בזרע במהלך תהליך הבישול למשך 0, 10, 20 ו-30 דקות. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: פרמטרים מורפולוגיה של תאים באזורים שונים של עובר אונס זרעי שמןאנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
a הנתונים הם אמצעי ± תקן (n = 3), והערכים באותה עמודה עם אותיות שונות שונים באופן משמעותי (p < 0.05).
ב. האזורים מוצגים באות 3B, C.
ג LAL: אורך ציר ארוך; SAL: אורך ציר קצר; מעוגל: (היקף 2)/(4×π× האזור).
טבלה משלימה 2: פרמטרים מורפולוגיה של תאים באזורים שונים של אנדוספרם תירסאנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
a משמעות הנתונים היא ± תקן (n = 3). הערכים באותה עמודה עם אותיות שונות שונים באופן משמעותי(p < 0.05).
ב. האזורים מוצגים בחלק הטרנסוורסל של ליבת תירס באיור משלים 1.
ג LAL: אורך ציר ארוך; SAL: אורך ציר קצר; מעוגל: (היקף 2)/(4×π× האזור).
טבלה משלימה 3: פרמטרים מורפולוגיה של גרגרי עילן באזורים שונים של אנדוספרם תירסa אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
a משמעות הנתונים היא ± תקן (n = 3). הערכים באותה עמודה עם אותיות שונות שונים באופן משמעותי(p < 0.05).
ב. האזורים מוצגים בחלק הטרנסוורסל של ליבת תירס באיור 4A.
ג LAL: אורך ציר ארוך; SAL: אורך ציר קצר; מעוגל: (היקף 2)/(4×π× האזור).
טבלה משלימה 4: פרמטרים מורפולוגיה של גופים חלבון באזורים שונים של עובר אונס זרעי שמןאנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
a הנתונים הם אמצעי ± תקן (n = 3), והערכים באותה עמודה עם אותיות שונות שונים באופן משמעותי (p < 0.05).
ב. האזורים מוצגים באות 5.
ג מעוגל: (היקף 2)/(4×π× האזור); מדד האזור הוא יחס האזור של חלבון גוף לתא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הזרעים הם המשאב המתחדש החשוב ביותר למזון, מספוא וחומר גלם תעשייתי, והם עשירים בחומרי אחסון כגון תעילן וחלבון. המורפולוגיה והכמות של תאים והתוכן והתצורה של חומרי אחסון משפיעים על המשקל והאיכות שלזרעים 7,12. למרות טכנולוגיית סטריאוטיפ וניתוח תמונה יכול למדוד את הגודל והכמות של תאים באזור רקמות, הם חסרים במעבדות רבות. מקטעי הפרפין והברף מעניקים תמונה דו-ממדית (דו-ממדית), המובילה בשום אופן בניתוח הגודל והכמות האמיתיים של התאים. עם זאת, התאים נחתכים באופן אקראי בכל המטוסים שלהם, הגודל הממוצע של תאים רבים (מעל 100) מלפחות שלושה חלקים שונים של אזור הרקמה יכול לשקף את הפרמטרים מורפולוגיה 2D (אורך, רוחב, ואזור) של תאים, ואת היחס של האזור הנבחר כדי לומר אזור התא יכול לשקף את כמות התאים. לכן, חשוב מאוד בצפייה situ וניתוח מורפולוגיה של תאים וחומרי אחסון באזורים שונים של זרע. סעיף הפרפין הוא המתאים ביותר להכנת החלק בגודל זרע כולו, במיוחד עבור זרעים בגודל גדול7. עם זאת, התאים מלאים בחומרי אחסון עם פיתוח זרעים, מה שמוביל לכך שקשה מאוד להשיג את החלק הטוב בגודל זרעים מזרעים מתפתחים מאוחרים וזרעים בוגרים. בנוסף, סעיף פרפין עבה מדי כדי להציג את המורפולוגיה בבירור, והוא מתאים רק לחקור את מבנה הרקמה של זרע7.
סעיף שרפ זה דק, והוא יכול להציג את המורפולוגיה של תאים, גרגרי תעילן, וגופים חלבוןבבירור 7. עם זאת, שף שגרתי אינו מתאים למקטע בגודל זרע כולו. הטכניקה המוצגת כאן מייצגת גישה מהירה, פשוטה ונלהבת לקראת הכנת חלקים טרנסוורסליים ואורך בגודל זרעים שלמים של זרעים בוגרים מוטבעים שרף לצפייה מורפולוגיה של תאים, גרגרי עמלן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע באמצעות מיקרוסקופית אור (איור 2-5, איור משלים 1). בנוסף, הטכניקה יכולה גם להכין את החלק של פיתוח, נביטה, וזרעים מבושלים כדי situ לחקור את השינויים מורפולוגיה של תאים, עילן, וחלבון גופים באזורים שונים של זרע.
יתרון ברור נוסף שטכניקה זו מספקת הוא היישום של מקטעים בגודל זרע שלם. בעידן החדש של פנומיקה וחילוף חומרים, חשוב למדוד באופן כמותי את הפרמטרים המורפולוגיה של תאים, גרגרי מעילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרעים. הטכניקה החדשה, בשילוב עם תוכנת ניתוח מורפולוגיה, מאפשרת לחוקר לנתח באופן כמותי את הפרמטרים המורפולוגיים של תאים, גרגרי איתילן וגופים חלבון באזורים שונים של זרעים(טבלה משלימה 1-4).
למרות שיטת הניתוח היבש הנוכחי יכול להכין בהצלחה את סעיף שרין בגודל כל הזרע, יש לו כמה מגבלות וחסרונות. עבור סעיף פרפין, ניתן להסיר את הפרפין בקלות מהמקטע; אבל עבור סעיף שף, אין אפשרות להסיר את הסעיף את המקטע, המוביל לדגימה הצמח מוטבע ברשף. לכן, בהשוואה לסעיף פרפין, סעיף הנוכחי בגודל זרעים אינו מתאים לבצע את ההיסטוכימיה והאימונואיסטוכימיה. בנוסף, שיטת מקטע שרין שגרתי יכול לחתוך דגימות לתוך 0.5-2 μm חלק מקטעים בשל בלוק מדגם עם נפח קטן. אבל שיטת הניתוח היבש הנוכחי קשה להכין את החלקים חלקים עם עובי פחות מ 2 μm, במיוחד עבור זרעים בוגרים עם נפח גדול ותוכן מעוילן גבוה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המימון סופק על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32071927), פרויקט הכשרונות של אוניברסיטת יאנגז'ואו ופיתוח התוכנית האקדמית העדיפות של מוסדות להשכלה גבוהה ג'יאנגסו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
- Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
- Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
- Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).
- Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
- Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8 (2020).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
- Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
- Lott, J. N. A.
- Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).
