Summary
Этот метод позволяет быстро и просто подготовить раздел смолы размером с цельное семя для наблюдения и анализа клеток, крахмала гранул и белковых тел в различных регионах семян.
Abstract
Морфология, размер и количество клеток, крахмала гранул и белковых тел в семени определяют вес и качество семян. Они существенно отличаются между различными регионами семян. Для того, чтобы четко просмотреть морфологии клеток, крахмальных гранул и белковых тел и количественно проанализировать их параметры морфологии, необходим раздел размером с цельное семя. Хотя цельносовый парафиновый раздел может исследовать накопление материалов хранения в семенах, очень трудно количественно проанализировать параметры морфологии клеток и материалов хранения из-за низкого разрешения толстого сечения. Тонкий раздел смолы имеет высокое разрешение, но обычный метод секции смолы не подходит для подготовки цельного семенного размера раздела зрелых семян с большим объемом и высоким содержанием крахмала. В этом исследовании мы представляем простой сухой метод сечения для подготовки раздела смолы размером с семя. Техника может подготовить крест и продольные цельного семени размера разделов развивающихся, зрелых, проросли, и приготовленные семена, встроенные в LR белой смолы, даже для больших семян с высоким содержанием крахмала. Раздел размером с семя может быть окрашен флуоресцентным осветлением 28, йодом и Кумасси блестящим синим R250, чтобы конкретно проявлять морфологию клеток, крахмала гранул и белковых тел четко, соответственно. Полученное изображение также может быть проанализировано количественно, чтобы показать параметры морфологии клеток, крахмала гранул и белковых тел в различных регионах семян.
Introduction
Семена растений содержат материалы хранения, такие как крахмал и белок, и обеспечивают энергию и питание для людей. Форма, размер и количество клеточных и складских материалов определяют вес и качество семян. Клетки и материалы хранения в разных регионах семян имеют значительно разные морфологии, особенно для некоторых высокоамилозы зерновых культур с ингибированием фермента ветвления крахмала IIb1,2,3. Поэтому очень важно исследовать морфологии клеток и материалов хранения в разных регионах семян.
Парафин раздел является хорошим методом для подготовки цельного семенного размера раздела и может проявлять структуру тканей семян и накопление материала хранения в различныхрегионах семян 4,5,6. Тем не менее, парафиновые секции обычно имеют толщину 6-8 мкм с низким разрешением; таким образом, очень трудно четко наблюдать и количественно анализировать морфологию клеточных и складских материалов. Секции смолы обычно имеют толщину 1-2 мкм и высокое разрешение и очень подходят для наблюдения и анализа морфологии клеточных и складскихматериалов 7. Тем не менее, обычный метод секции смолы имеет трудности в подготовке цельного семенного размера раздела, особенно для семян с большим объемом и высоким содержанием крахмала; таким образом, нет никакого способа наблюдать и анализировать морфологию клеток и материалов хранения в различных регионах семян. LR Белая смола акриловой смолы и проявляет низкую вязкость и сильную проницаемость, что приводит к его хорошее применение в подготовке смолы разделе семян, особенно для зерновых зрелых ядер с большим объемом и высоким содержанием крахмала. Кроме того, образец, встроенный в LR Белая смола может быть легко окрашены со многими химическими красителями, чтобы четко проявлять морфологию клеток и материалов хранения под светом или флуоресцентныммикроскопом 7. В нашей предыдущей работе мы сообщали о сухом методе секции для подготовки секций размером с цельное семя зрелых зерновых ядер, встроенных в LR White resin. Метод может также подготовить цельносадового размера раздел развивающихся, проростых и приготовленных зерновых ядра8. Полученный раздел размером с цельное семя имеет много применений в микроморфологии наблюдения и анализа, особенно для четкого просмотра и количественного анализа морфологических различий клеток и материалов хранения в различных регионахсемян 8,9.
Этот метод подходит для исследователей, которые хотят наблюдать микроструктуры ткани и формы и размера клеток, крахмала гранулы, и белковых тел в различных регионах семян с помощью светового микроскопа. Изображения секций размером с цельное семя, окрашенных специально для экспонирования клеток, крахмальных гранул и белковых тел, могут быть проанализированы программным обеспечением для анализа морфологии для количественного измерения параметров морфологии клеток, крахмальных гранул и белковых тел в различных регионах семян. Для того, чтобы продемонстрировать техническую применимость и цельного семени размера раздела приложений, мы исследовали зрелые семена кукурузы и масличного рапса и развивающихся, проросли, и приготовленные ядра риса в этом исследовании. Протокол содержит четыре процесса. Здесь мы используем зрелое ядро кукурузы, которое является наиболее трудным в подготовке целых семян размера разделов из-за большого объема и высокого содержания крахмала, в качестве образца для выставки процессов шаг за шагом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка семян, встроенных в смолу (рисунок 1)
- Зафиксите шесть зрелых ядер кукурузы в 10 мл 2,5% фосфатного буфера глутаралдегида (0,1 М, рН7,2) при 4 градусов по Цельсию на 48 ч. Исследователя могут выбрать другие фиксаторные смеси, фиксаторные концентрации, и условия фиксации согласно их целям исследования и типам ткани.
- Выньте ядра и нарежьте их продольно или поперечно до толщины 2-3 мм с помощью резкого двухстороннего лезвия, и зафиксните их в 10 мл 2,5% фосфатно-буферного глутаралдегида (0,1 м, рН 7,2) снова на 48 ч.
- Мыть образцы три раза с 10 мл 0,1 М фосфат буфера (рН 7,2) в течение 30 минут каждый раз.
- Обезвоживаемые образцы в высших сортах этанола aqueous раствор (10 мл) от 30% до 50%, 70%, 90% один раз, и 100% три раза в течение 30 минут каждый раз.
- Проникнуть образцов в 10 мл увеличения классов LR Белая смола раствор разбавлен этанолом от 25% до 50%, 75% один раз, и 100% дважды при 4 кк на 12 ч каждый раз.
- Подготовь пьедесталы для образцов перед встраиванием. Добавьте 0,25 мл 100% белой смолы LR в 2-метровую центрифугу и полимеризируйте ее при 60 градусах Цельсия за 48 ч.
- Последовательно добавляйте чистую белую смолу LR (0,5 мл) и проникший образец в центрифугу с пьедесталом. Выпрямите образцы анатомической иглой и полимеризируйте их при температуре 60 градусов по Цельсию в духовке на 48 ч.
2. Сухая секция для подготовки раздела размером с цельное семя(рисунок 1)
- Выньте встроенные ядра из центрифуги трубки и вырезать избыток смолы вокруг образца с помощью острого лезвия.
- Зажим блока смолы в образце держателя ультрамикротома (EM UC7), и обрезать излишние смолы на поверхности образца и вокруг образца с лезвием.
- Польский поверхности образца мелко со стеклянным ножом, пока полный раздел может быть сформирован.
- Положите небольшой медный крюк около 2 мм над краем лезвия перед резки и вырезать образец в 2 мкм разделе. Роль крючка заключается в том, чтобы избежать керлинга вверх по секции.
- Положите крючок под раздел, чтобы поддержать его, когда раздел становится длинным.
- Добавьте 100 мл воды на необработавую горку и тщательно перенесите полный и непрерывный участок в воду с помощью пинцета.
- Для того, чтобы сгладить морщинистую секцию, нагрейте и высушите образец на уплощающий стол при температуре 50 градусов по Цельсию на ночь.
- Если секция рушится или слезы, продлить время для каждого проникновения смолы образца от 12 ч до 24 ч или 48 ч.
- Если секция имеет несколько линий параллельно ножу, зажим образца блок плотно. Если секция имеет некоторые линии вертикальной к ножу, пожалуйста, используйте новый нож.
3. Окрашивание и наблюдение за разделом
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы наблюдать структуру тканей и морфологии клеток, крахмала гранулы, и белковые тела, пятно разделов с конкретными пятнами в соответствии с целью исследования. Здесь мы используем флуоресцентные осветления 28, раствор йода, и Coomassie блестящий синий R250, чтобы испачкать клеточные стенки, крахмал гранулы, и белковые тела, соответственно.
- Для наблюдения за морфологией клеток, пятно раздела с 40 мл 0,1% (ж / в) флуоресцентные ярче 28 aqueous раствор в 70 мл компактного стекла окрашивания банку при 45 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а затем промыть его проточной водой в течение 5 минут. Наблюдайте и фотографуйте раздел под флуоресцентным микроскопом, оснащенным камерой CCD.
- Для наблюдения за морфологией крахмала гранулы, пятно разделе с 40 йл йодного раствора (0,07% (w/v) I2 и 0,14% (w/v) KI в 25% (v/v) глицерол) в течение 1 мин, и покрыть образец, содержащий раствор йода с крышкой. Просмотр и фотографирование образца под световым микроскопом, оснащенным камерой CCD.
- Для наблюдения за морфологией белковых тел погрузите секцию с 40 мл 10% (v/v) уксусной кислоты в компактную стеклянную банку для окрашивания 70 мл в течение 10 мин при 45 градусах Цельсия, а затем испачкать его в 40 мл 1% (w/v) Coomassie блестящий синий R250 в 25% (v/v) изопропанол и 10% (v/v) уксусной кислоты в течение 15 мин при 45 градусов по Цельсию. Вымойте окрашенные секции проточной водой в течение 5 минут, и высушить его. Наблюдайте и фотографуйте раздел под световым микроскопом, оснащенным камерой CCD.
4. Количественный анализ параметров морфологии
- Обработать и количественно проанализировать сфотографированные изображения для области, длинной/короткой оси и округливости клеток, крахмала гранул и белковых тел в различных регионах семян с помощью программного обеспечения для анализа морфологии (Image-Pro Plus 6.0 программное обеспечение) после процедур Чжао идр. 9 точно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Простой сухой метод секции для получения раздела размером с цельное семя
Мы устанавливаем простой сухой метод секции для подготовки цельного семенного размера раздела семян, встроенных в LR-белую смолу(рисунок 1). Метод может подготовить поперечные и продольные цельносовые секции размером с семя толщиной 2 мкм(рисунок 2-5, Дополнительный рисунок 1-4). Например, зрелое семя рапса масляного семени может быть поперечно и продольно(рисунок 2). Для зерновых культур, их зрелые ядра полны крахмала гранулы, что приводит к этому очень трудно в подготовке цельного семени размера раздела. Используя нынешнюю технику, можно было бы также подготовить поперечные и продольные секции зрелой кукурузы размером с цельное семя с большим объемом(рисунок 4, Дополнительный рисунок 1). Кроме того, с помощью метода можно изукомить развиваемое ядро (дополнительный рисунок2),проросное ядро (дополнительная цифра3)и приготовленное ядро (дополнительная цифра4)риса.
Применение раздела размером с цельное семя
Наблюдение за структурой тканей семян
Раздел размером с семя можно использовать для наблюдения за структурой тканей семян. Например, эмбрион масляного рапса состоит из радикула, гипокотиля, слива и двух котилендонов. Внутренние и внешние котилендоны согнуты пополам, обернув гипокотил и радикул и сделав эмбрион сферическим(рисунок 2A,C). Продольные и поперечные секции размером с цельный эмбрион, окрашенные сафранином, явно продемонстрировали радикул, гипокотил, внутренний котилендон и внешний котилендон(рисунок 2B,D). Продольная секция рапса масляного сеяного размера размером с цельном эмбриона готовится сложнее, чем поперечная секция. Поэтому поперечные участки эмбрионов широко используются для исследования микроморфологии эмбрионов вссылках 5,10.
Морфология и анализ клеток в разных регионах семян
Раздел размером с цельное семя может быть использован для наблюдения и анализа морфологии клеток в различных областях семян. Например, поперечные цельнобрийные секции масляного рапса были окрашены флуоресцентным осветлением 28, а клеточные стенки были окрашены специально(рисунок 3A). Микроморфология клеток в любых областях эмбриона может быть четко отображена при высоком увеличении(рисунок 3B,C). Радикул состоит из эпидерма, коры головного мозга и сосудистой ткани. Эпидермальные клетки, расположенные во внешнем слое радикула, были прямоугольными и радиально расположены. Клетки кортикальной паренхимы были круглыми по форме и большими по размеру. Между корковыми клетками наблюдались определенные пространства. Корковые клетки были расположены слоями изнутри на улицу(рисунок 3B). Эпидермальные клетки котилендона были квадратными и имели небольшой объем. Существенных различий в форме и размере эпидермальных клеток между внешними и внутренними поверхностями внутренних и внешних котилендонов не было. Некоторые сосудистые цилиндры были разбросаны в середине мезофилловых тканей внутренних и внешних котилендонов. Мезофилл паренхима клетки были значительно больше, чем эпидермальные клетки и сосудистые клетки цилиндров в котилендоне. Мезофилл паренхима клетки показали типичный palisading расположение во внутренней области внешнего котилендона и внешней области внутреннего котилендона (Рисунок 3C). Клетки паренхимы имели значительно различную морфологию в разных регионах эмбриона. Для того, чтобы выявить их различия в морфологии, регионы 1, 2, 3, 4 и 5 были выбраны в радикуле корковой ткани, внутренней области внутреннего котилендона, внешней области внутреннего котилендона, внутренней области внешнего котилендона, соответственно (Рисунок 3B, C). Параметры морфологии паренхимных клеток в вышеуказанных 5 регионах были количественно проанализированы с помощью программного обеспечения для анализаморфологии (Дополнительная таблица 1). Область, длинная длина оси, короткая длина оси и округость паренхимных клеток показали некоторые различия в различных областях эмбрионов.
Клетки в эндосперме были полны крахмала и белка хранения. Используя раздел смолы размером с семя, легко наблюдать и анализировать клетки в разных областях эндосперма. Например, морфологию клеток в любых регионах эндосперма кукурузы можно было хорошо рассматривать после того, как поперечные секции размером с цельное семя были окрашены флуоресцентным осветлением 28. Периферийные, средние и центральные эндоспермы в одном и том же ядре продемонстрировали значительно разные формы иразмеры клеток (дополнительная цифра 1). Для количественного анализа параметров морфологии клеток в различных областях эндосперма были проанализированы изображения регионов с помощью программного обеспечения для анализа морфологии; параметры морфологии клеток представлены в дополнительной таблице 2. Ячейки эндосперма в регионе 1 имеют малую площадь среди четырех регионов, в регионе 2 - больше, чем в регионе 3, но меньше, чем в регионе 4.
Морфология и анализ крахмальных гранул в различных регионах семян
Зрелые семена большинства растительных ресурсов, особенно зерновых культур, содержат высокое содержание крахмала. Морфология гранул и размер крахмала имеют важное влияние на свойства крахмала и играют определенную роль в качестве семян. Раздел семян смолы может быть окрашен раствором йода, чтобы продемонстрировали морфологию крахмала гранул в различных регионах семян. Например, были успешно подготовлены поперечные и продольные секции кукурузы размером с цельные семена. Разделы, окрашенные йодом, продемонстрировали морфологию крахмала(рисунок 4). Для того, чтобы показать морфологию крахмала гранулы в различных регионах эндосперма, четыре региона и девять регионов были выбраны в поперечных и продольных цельных семян размера разделов, соответственно (Рисунок 4). Гранулы крахмала в разных регионах показали значительно разную морфологию, размер и количество в эндоспермовых клетках. Для поперечного сечения область 1 имела сферические гранулы крахмала, область 2 имела многоугольные гранулы, а гранулы крахмала в обоих регионах 3 и 4 были сферическими. Для продольной секции гранулы крахмала с полигональной формой в регионах 1, 4, 5 и 8 были больше, чем гранулы со сферической формой в регионах 3, 7 и 9, а некоторые сложные гранулы крахмала наблюдались в регионах 2 и 6.
Количественный анализ морфологических параметров гранул крахмала в четырех регионах поперечного сечения был показан в дополнительной таблице 3. Крахмал гранулы в регионе 1 был самый маленький размер, те, в регионе 2 был самый большой размер, и те, в регионе 3 были больше, чем в регионе 4.
Микроморфология и анализ белковых тел в различных регионах семян
Раздел размером с семя с высоким содержанием белка хранения может быть использован для аверса и анализа морфологии белковых тел в различных регионах семян. Например, поперечная секция эмбриона масляного рапса была окрашена в блестящий синий R250 Кумасси, а белок хранения был окрашен в синий цвет(рисунок 5). Пространственное распределение белка хранения в эмбрионе можно было четко наблюдать при низком увеличении(рисунок 5A). Белок хранения присутствует в белковых телах. При высоком увеличении, белковое тело выставлены неоднородной матрицы с некоторыми черными гранулами и некоторые неокрашиваемые прозрачной структуры (Рисунок 5B). Белковые тела в семени имеют три типа: первый тип состоит из однородной белковой матрицы и не имеет включений, второй тип содержит шаровые кристаллы, а третий тип содержит шаровые кристаллы и псевдокристаллы11. Шаровые кристаллы в белковом организме состоят из фитата и других неорганических солей, которые не окрашены. Эти шаровые кристаллы черные из-за того, что свет не может пройти через них под микроскопом. Кроме того, сферический кристалл является хрупким и трудно проникнуть в фиксатор и встраивания агента. При создании секции, сферические кристаллы иногда вспыхивали, в результате чего прозрачная полость внутри белкового тела11. Белковое тело эмбриона масляного рапса содержало сфероидальные кристаллы в соответствии с его микроморфологией(рисунок 5B). Для того, чтобы исследовать пространственное распределение белковых тел в эмбрионе, пять регионов в секции размером с весь эмбрион были выбраны для представления радикула корковой ткани, внутренней области внутреннего котилендона, внешней области внутреннего котилендона, внутренней области внешнего котилендона и внешней области внешнего котилендона(рисунок 5A,C-G). Белковые тела во всех областях эмбриона были сферическими, эллипсоидными и нерегулярными по форме(рисунок 5C-G).
Количественный анализ белковых тел в первой и второй лежал паренхимных клеток близко к эпидермису в вышеуказанных пяти регионах представлены в дополнительной таблице 4. Область белкового тела имела небольшую разницу между выбранными пятью регионами. Округлость белкового тела была значительно ниже во внешней области внешнего котилендона, чем в других четырех регионах, что указывает на то, что белковое тело во внешнем котилендоне было близко к сфере. Индекс количества и площади белкового тела в клетке был значительно выше в клетке паронхимы радикула, чем в клетке котилендон паренхима(Дополнительная таблица 4).
Рисунок 1: Подготовка раздела из смолы размером с цельное семя с использованием метода сухого сечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Ткань структуры эмбриона в зрелых семян масляного рапса разнообразие Huashuang 5. (A)Морфология эмбриона. (B)Ткань структуры продольного цельно-эмбрион размера раздела. (C)Морфология поперечного раздела размером с цельный эмбрион. (D)Ткань структуры поперечного цельно-эмбрион размера раздела. Секции были окрашены сафранином. H, гипокотил; IC, внутренний котилендон; OC, внешний котилендон; R, радикл. Масштабная планка 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Морфология клеток в эмбрионе сорта масляного рапса Huashuang 5. (A)Поперечная секция размером с цельномо эмбрион, окрашенная флуоресцентным осветлением 28. (B) Усиление области B в ( A ), показываяморфологииклеток и структуры тканей радикула. (C) Усиление региона C в ( A ), показываяморфологииклеток и структуры тканей внутреннего и внешнего котилендона. Шкала бар 500 мкм для ()и 100 мкм для (B, C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Морфология крахмала гранулы в зрелом ядре сорта кукурузы Чжэн 58. Поперечные (A)и продольные(B)секции цельного семенного размера были окрашены раствором йода, а их региональные усиления демонстрируют морфологию гранул крахмала в различных регионах эндосперма. Масштабная планка 1 мм для секции размером с цельное семя и 20 мкм для региональных усилений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Морфология белковых тел в эмбрионе сорта масляного рапса Huashuang 5. (A) Поперечный цельнобритного размера раздел окрашены Кумасси блестящий синий R250. (B)Усиление белковых тел, показывающее их микроструктуру. (C-G) Усиление региона C-G в (A), показывая морфологию белкового тела в радикуле(C), внутренняя область внутреннего котилендона(D), внешняя область внутреннего котилендона (E), внутренняя область внешнегокотилендона( F ), внешняя область внутреннего котилендона (G). Шкала бар 500 мкм для (A), 5 мкм для (B) и 50 мкм для (C-G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная Рисунок 1: Морфология клеток в зрелом ядре сорта кукурузы Чжэн 58. Поперечная секция размером с цельное семя была окрашена флуоресцентным осветлением 28, а ее региональные усиления (1-4) демонстрируют морфологию эндоспермовых клеток в различных областях эндосперма. Масштабная планка 1 мм для секции размером с цельное семя и 100 мкм для региональных усилений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная Рисунок 2: Морфология развивающегося ядра сорта риса 9311. Поперечные секции размером с цельное семя в разные дни после цветения (DAF) были противоядием с сафранином O и раствором йода. Масштабная планка 0,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная цифра 3: Морфология проростого ядра сорта риса Те-Цин. Продольное цельносное сечение размером с семя через 8 дней после впитывания было противоядие с периодическими кислотно-шиффа и толуидина синий O, и его региональные усиления демонстрируют изменения морфологии эндосперма в различных регионах семян. Масштабная планка 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная Рисунок 4: Морфология приготовленного ядра сорта риса Те-Цин. Поперечный раздел размером с цельное семя был окрашен раствором йода, а его внешнее, среднее и внутреннее усиление региона демонстрируют морфологические изменения гранул крахмала в семени во время процесса приготовления пищи в течение 0, 10, 20 и 30 минут. Масштабная планка 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 1: Параметры морфологии клеток в различных регионах эмбриона масляного рапсаПожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
a Данные означают ± отклонений(n No 3), а значения в одной колонке с разными буквами существенно отличаются(p lt; 0.05).
б Регионы показаны на рисунке 3B,C.
c LAL: длинная длина оси; SAL: короткая длина оси; Округлая: (периметр 2)/(4×π×area).
Дополнительная таблица 2: Параметры морфологии клеток в различных регионах эндосперма кукурузыПожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
a Данные ± отклонений(n No 3). Значения в одной колонке с разными буквами существенноотличаются (p lt; 0.05).
б Регионы показаны в поперечном разделе ядра кукурузы на дополнительном рисунке 1.
c LAL: длинная длина оси; SAL: короткая длина оси; Округлая: (периметр 2)/(4×π×area).
Дополнительная таблица 3: Морфология параметры крахмала гранулы в различных регионах эндосперм кукурузы Пожалуйста,нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
a Данные ± отклонений(n No 3). Значения в одной колонке с разными буквами существенноотличаются (p lt; 0.05).
б Регионы показаны в поперечном разделе ядра кукурузы на рисунке 4A.
c LAL: длинная длина оси; SAL: короткая длина оси; Округлая: (периметр 2)/(4×π×area).
Дополнительная таблица 4: Морфологические параметры белковых тел в различных регионах эмбриона масляного рапсаПожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
a Данные означают ± отклонений(n No 3), а значения в одной колонке с разными буквами существенно отличаются(p lt; 0.05).
б Регионы показаны на рисунке 5.
c Округлая: (периметр 2)/(4×π×area); Индекс области – это отношение белка к клетке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Семена являются наиболее важным возобновляемым ресурсом для производства продовольствия, кормов и промышленного сырья и богаты такими материалами хранения, как крахмал и белок. Морфология и количество клеток, содержание и конфигурация материалов для хранения влияют на вес и качествосемян 7,12. Хотя технология стереологии и анализа изображений может измерять размер и количество клеток в области тканей, их не хватает во многих лабораториях. Парафин и смолы разделы дают двумерную (2D) картину, что ни в какой мере в анализе истинного размера и количества клеток. Тем не менее, клетки вырезать случайным образом на их любой плоскости, средний размер многих клеток (более 100) из по крайней мере трех различных разделов ткани области может отражать 2D морфологии параметров (длина, ширина и площадь) клеток, и соотношение выбранной области области означает площадь клетки может отражать количество клеток. Поэтому очень важно для просмотра и анализа морфологии клеток и материалов хранения в разных регионах семян. Парафин раздел является наиболее подходящим для подготовки цельного семени размера раздела, особенно для больших размеров семян7. Тем не менее, клетки полны материалов для хранения семян развития, что приводит к этому очень трудно в получении хорошего цельного семенного размера раздел из позднего развивающихся семян и зрелых семян. Кроме того, парафин раздел слишком толстый, чтобы проявлять морфологию четко, и подходит только для изучения структуры тканей семян7.
Раздел смолы тонкий, и может exhibit морфология клеток, гранул крахмала, и тел протеина ясно7. Тем не менее, обычная смола не подходит для секции размером с цельное семя. Техника, представленная здесь представляет собой быстрый, простой и острый подход к подготовке поперечных и продольных цельных семян размера разделов зрелых семян, встроенных в смолу для просмотра морфологии клеток, крахмала гранулы, и белковых тел в различных регионах семян с использованием световой микроскопии(рисунок 2-5,Дополнительныйрисунок 1). Кроме того, техника может также подготовить раздел развивающихся, проросли, и приготовленные семена на месте исследовать изменения морфологии клеток, крахмала и белковых тел в различных регионах семян.
Другим явным преимуществом, которое предоставляет этот метод, является применение секций размером с цельное семя. В новую эру феномики и метаболомики важно количественно измерить параметры морфологии клеток, гранул крахмала и белковых тел в различных регионах семян. Новая методика, в сочетании с программным обеспечением морфологического анализа, позволяет исследователю количественно анализировать параметры морфологии клеток, гранул крахмала и белковых тел в различных регионах семян(Дополнительная таблица 1-4).
Хотя нынешний сухой метод секции может успешно подготовить раздел смолы размером с семя, он имеет некоторые ограничения и недостатки. Для парафиновой секции парафин можно легко удалить из секции; но для секции смолы смола не может быть удалена из секции, что приводит к образцу растения, встроенного в смолу. Поэтому, по сравнению с парафиновой секцией, нынешняя секция смолы размером с цельное семя не подходит для проведения гистохимии и иммуногистохимии. Кроме того, обычный метод секции смолы может разрезать образцы на 0,5-2 мкм гладких секций из-за образца блока с небольшим объемом. Но нынешний сухой метод секции трудно подготовить гладкие секции с толщиной менее 2 мкм, особенно для зрелых семян с большим объемом и высоким содержанием крахмала.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Финансирование было предоставлено Национальным фондом естественных наук Китая (32071927), проектом талантов Университета Янчжоу и приоритетной академической программой развития высших учебных заведений Цзянсу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
- Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
- Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
- Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).
- Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
- Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8 (2020).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
- Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
- Lott, J. N. A.
- Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).
