Summary
Denne teknikken muliggjør rask og enkel fremstilling av harpikseksjon i full frøstørrelse for observasjon og analyse av celler, stivelsesgranulat og proteinlegemer i forskjellige regioner av frøet.
Abstract
Morfologien, størrelsen og mengden celler, stivelsesgranulat og proteinlegemer i frø bestemmer vekten og kvaliteten på frøet. De er betydelig forskjellige blant forskjellige regioner av frø. For å se morfologiene til celler, stivelse granulat og proteinlegemer tydelig, og kvantitativt analysere deres morfologi parametere nøyaktig, er hele frø-størrelse delen nødvendig. Selv om parafinseksjonen i hele frøstørrelse kan undersøke akkumulering av lagringsmaterialer i frø, er det svært vanskelig å kvantitativt analysere morfologiparametrene til celler og lagringsmaterialer på grunn av den lave oppløsningen av den tykke delen. Den tynne harpiksdelen har høy oppløsning, men den rutinemessige harpiksseksjonsmetoden er ikke egnet til å forberede hele frøse delen av modne frø med stort volum og høyt stivelsesinnhold. I denne studien presenterer vi en enkel tørr snittingsmetode for å forberede harpiksseksjonen i hele frøstørrelse. Teknikken kan forberede korset og langsgående hele frø-størrelse deler av utvikling, moden, spiret, og kokte frø innebygd i LR Hvit harpiks, selv for store frø med høyt stivelsesinnhold. Hele frøse delen kan farges med fluorescerende lysningsmiddel 28, jod og Coomassie strålende blå R250 for å spesifikt vise morfologien til celler, stivelsesgranulat og proteinlegemer klart, henholdsvis. Bildet som er oppnådd, kan også analyseres kvantitativt for å vise morfologiparametrene til celler, stivelsesgranulat og proteinlegemer i forskjellige frøregioner.
Introduction
Plantefrø inneholder lagringsmaterialer som stivelse og protein og gir energi og ernæring til mennesker. Formen, størrelsen og mengden celle- og lagringsmaterialer bestemmer vekten og kvaliteten på frøet. Cellene og lagringsmaterialene i forskjellige frøregioner har betydelig forskjellige morfologier, spesielt for noen høy-amylose kornavlinger med hemming av stivelsesenzym IIb1,2,3. Derfor er det svært viktig å undersøke morfologiene til celler og lagringsmaterialer i forskjellige områder av frø.
Parafinseksjon er en god metode for å forberede hele frøse delen og kan vise vevsstrukturen av frø og akkumulering av lagringsmateriale i forskjelligeregioner av frø 4,5,6. Parafinseksjonene har imidlertid vanligvis 6-8 μm tykkelse med lav oppløsning; Dermed er det svært vanskelig å tydelig observere og kvantitativt analysere morfologien til celle- og lagringsmaterialer. Harpiksseksjonene har vanligvis 1-2 μm tykkelse og høy oppløsning og er svært egnet til å observere og analysere morfologien til celle- og lagringsmaterialer7. Imidlertid har den rutinemessige harpiksseksjonsmetoden problemer med å forberede hele frøse delen, spesielt for frø med stort volum og høyt stivelsesinnhold; dermed er det ingen måte å observere og analysere morfologien til celler og lagringsmaterialer i forskjellige regioner av frøet. LR Hvit harpiks er en akrylharpiks og viser lav viskositet og sterk permeabilitet, noe som fører til gode applikasjoner i å forberede harpiksdelen av frø, spesielt for korn modne kjerner med stort volum og høyt stivelsesinnhold. I tillegg kan prøven innebygd i LR Hvit harpiks lett farges med mange kjemiske fargestoffer for å tydelig vise morfologi av celler og lagringsmaterialer under lys eller fluorescerende mikroskop7. I vårt forrige papir har vi rapportert en tørr snittingsmetode for å forberede de hele frøsestore delene av modne kornkjerner innebygd i LR White harpiks. Metoden kan også forberede hele frøse delen av utvikling, spiret og kokt kornkjerne8. Den oppnådde hele delen har mange anvendelser i mikromorfologiobservasjon og analyse, spesielt for tydelig visning og kvantitativt analyse av morfologiforskjellene av celle- og lagringsmaterialer i forskjellige regioner av frø8,9.
Denne teknikken er egnet for forskere som ønsker å observere mikrostrukturen av vev og form og størrelse på celler, stivelse granulat, og protein organer i ulike områder av frø ved hjelp av lys mikroskop. Bildene av helfrøstørrelsesseksjoner farget spesielt for å vise celler, stivelsesgranulat og proteinlegemer kan analyseres av morfologianalyseprogramvare for å kvantitativt måle morfologiparametrene til celler, stivelsesgranulat og proteinlegemer i forskjellige frøregioner. For å demonstrere den tekniske anvendeligheten og hele størrelsesseksjonsapplikasjonene, har vi undersøkt de modne frøene av mais og oljefrøvoldtekt og de utviklende, spirete og kokte kjernene av ris i denne studien. Protokollen inneholder fire prosesser. Her bruker vi moden maiskjerne, som er den vanskeligste i å forberede de hele frøseksjonene på grunn av det store volumet og høyt stivelsesinnhold, som et eksempel for å vise prosessene trinnvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tilberedning av harpiks-innebygd frø (figur 1)
- Løs seks mais modne kjerner i 10 ml 2,5% fosfatbufret glutaraldehyd (0,1 M, pH7,2) ved 4 °C i 48 timer. Forskerne kan velge andre fikseringsblandinger, fikseringskonsentrasjoner og fikseringsforhold i henhold til deres forskningsmål og vevstyper.
- Ta ut kjernene og skjær dem langsgående eller tverrgående til 2-3 mm tykkelse ved hjelp av et skarpt dobbeltsidig blad, og fest dem i 10 ml 2,5% fosfatbufret glutaraldehyd (0,1 M, pH 7,2) igjen i 48 timer.
- Vask prøvene tre ganger med 10 ml fosfatbuffer (pH 7,2) i 30 min hver gang.
- Dehydrere prøvene i økende karakterer av etanol vandig løsning (10 ml) fra 30% til 50%, 70%, 90% en gang, og 100% tre ganger i 30 min hver gang.
- Infiltrer prøvene i 10 ml som øker gradene av LR Hvit harpiksoppløsning fortynnet med etanol fra 25 % til 50 %, 75 % én gang og 100 % to ganger ved 4 °C i 12 timer hver gang.
- Forbered pidestallene for prøver før innebygging. Tilsett 0,25 ml 100 % LR hvit harpiks i et 2 ml sentrifugerør, og polymeriser det ved 60 °C i 48 timer.
- Tilsett den rene LR White-harpiksen (0,5 ml) og den infiltrerte prøven i sentrifugerøret med pidestall. Rett prøvene med den anatomiske nålen, og polymeriser dem ved 60 °C i en ovn i 48 timer.
2. Tørr snitting for tilberedning av helfrøstørrelse (figur 1)
- Ta ut de innebygde kjernene fra sentrifugerøret og kutt ut overflødig harpiks rundt prøven ved hjelp av et skarpt blad.
- Klem fast harpiksblokken i prøveholderen av ultramikrotom (EM UC7), og trim av overflødig harpiks på overflaten av prøven og rundt prøven med et blad.
- Poler overflaten av prøven fint med en glasskniv til en komplett seksjon kan dannes.
- Sett en liten kobberkrok ca. 2 mm over bladkanten før du skjærer og skjærer prøven i en 2 μm seksjon. Krokens rolle er å unngå krølling oppover av seksjonen.
- Sett kroken under seksjonen for å støtte den når seksjonen blir lang.
- Tilsett 100 μL vann på en ubehandlet sklie, og overfør forsiktig hele og ubrutte delen til vannet med pinsettene.
- For å glatte ut den rynkete delen, varme og tørk prøven på flatebordet ved 50 °C over natten.
- Hvis avsnittet smuldrer eller tårer, forlenge tiden for hver harpiks infiltrasjon av prøven fra 12 t til 24 t eller 48 h.
- Hvis seksjonen har noen linjer parallelt med kniven, må du klemme prøveblokken tett. Hvis seksjonen har noen linjer vertikalt til kniven, vennligst bruk en ny kniv.
3. Farging og observasjon av avsnittet
MERK: For å observere vevsstrukturen og morfologien til celler, stivelsesgranulat og proteinlegemer, beis seksjonene med spesifikke flekker i henhold til formålet med forskningen. Her bruker vi fluorescerende brightener 28, jodløsning og Coomassie strålende blå R250 for å flekke celleveggene, stivelsesgranulat og proteinlegemer.
- For å observere morfologien til celler, flekk avsnittet med 40 ml 0,1% (w / v) fluorescerende lysstoff 28 vandig løsning i en 70 ml kompakt glassfrukke ved 45 ° C i 10 min, og skyll den deretter med rennende vann i 5 min. Ta hensyn til og fotografer avsnittet under et fluorescensmikroskop utstyrt med et CCD-kamera.
- For å observere morfologien til stivelsesgranulat, beis avsnittet med 40 μL jodoppløsning (0,07 % (w/v) I2 og 0,14 % (w/v) KI i 25 % (v/v) glyserol) i 1 min, og dekk prøven som inneholder jodoppløsning med en dekkslipp. Vis og fotografer prøven under et lett mikroskop utstyrt med et CCD-kamera.
- For å observere morfologien til proteinlegemer, senk avsnittet med 40 ml 10 % (v/v) eddiksyre i en 70 ml kompakt glassfrukke i 10 min ved 45 °C, og deretter flekker den i 40 ml på 1% (w / v) Coomassie strålende blå R250 i 25% (v / v) isopropanol og 10% (v / v) eddiksyre i 15 min ved 45 °C. Vask de beisede seksjonene med rennende vann i 5 min, og tørk den. Vær oppmerksom på og fotografer avsnittet under et lett mikroskop utstyrt med et CCD-kamera.
4. Kvantitativ analyse av morfologiparametere
- Behandle og kvantitativt analysere de fotograferte bildene for område, lang / kort akse og rundhet av celler, stivelse granulat og protein organer i ulike regioner av frø ved hjelp av morfologi analyse programvare (Image-Pro Plus 6.0 programvare) etter prosedyrene til Zhao et al.9 nøyaktig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enkel tørr snitting metode for å oppnå en hel-frø-størrelse seksjon
Vi etablerer en enkel tørr snittingsmetode for å forberede en helfrøstørrelsesdel av frø innebygd i LR-hvit harpiks (figur 1). Metoden kan forberede tverrgående og langsgående helfrø-størrelse seksjoner med tykkelse på 2 μm (Figur 2-5, Supplerende figur 1-4). For eksempler kan det modne frøet av oljefrøvoldtekt seksjoneres transversalt og langsgående (figur 2). For kornavlinger er deres modne kjerner fulle av stivelsesgranulat, noe som fører til at det er svært vanskelig å forberede hele frøse delen. Ved hjelp av den nåværende teknikken kan de tverrgående og langsgående helfrøseksjonene av moden mais med stort volum også tilberedes (figur 4, supplerende figur 1). I tillegg kan den utviklende kjernen (Supplerende figur 2), spiret kjerne (Supplerende figur 3) og kokt kjerne (Supplerende figur 4) ris undersøkes ved hjelp av metoden.
Anvendelser av hele frø-sized delen
Observasjon av vevsstruktur av frø
Hele frøse delen kan brukes til å observere vevsstrukturen av frø. For eksempler består embryoet av oljeseed voldtekt av radikkel, hypocotyl, plumule og to cotyledons. De indre og ytre cotyledons er bøyd i to, innpakning hypocotyl og radicle og gjør embryoet sfærisk (Figur 2A,C). Langsgående og tverrgående hele embryo-størrelse seksjoner farget med safranin tydelig utstilt radikkel, hypocotyl, indre cotyledon, og ytre cotyledon (Figur 2B, D). Den langsgående hele embryo-delen av oljeseed voldtekt er utarbeidet vanskeligere enn tverrgående delen. Derfor er de tverrgående delene av embryoer mye brukt til å undersøke mikromorfologien til embryoer i referanser5,10.
Morfologi og analyse av celler i ulike områder av frø
Hele frøse delen kan brukes til å observere og analysere morfologien til celler i forskjellige frøområder. For eksempel ble de tverrgående hele embryo-store delene av oljeseed voldtekt farget med fluorescerende lysere 28, og celleveggene ble farget spesielt (Figur 3A). Mikromorfologien til celler i alle områder av embryo kan tydelig vises ved høy forstørrelse (figur 3B, C). Radikkelen består av epiderm, cortex og vaskulært vev. De epidermale cellene som ligger i det ytterste laget av radikkel var rektangulære og radialt arrangert. De kortikale parenchymacellene var runde i form og store i størrelse. Noen forskjellige rom ble observert mellom kortikale celler. De kortikale cellene ble arrangert i lag fra innsiden til utsiden (figur 3B). De epidermale cellene i cotyledon var firkantet og hadde lite volum. Det var ingen signifikante forskjeller i form og størrelse på epidermale celler blant ytre og indre overflater av indre og ytre cotyledons. Noen vaskulære sylindere ble spredt i midten av mesophyll vev av indre og ytre cotyledons. Mesophyll parenchyma cellene var betydelig større enn epidermal celler og vaskulære sylinderceller i cotyledon. Mesophyll parenchyma cellene viste en typisk palisading arrangement i den indre regionen av ytre cotyledon og den ytre regionen av indre cotyledon (Figur 3C). Parenchymacellene hadde signifikant forskjellige morfologier i forskjellige embryoregioner. For å avsløre sine forskjeller i morfologi, regioner 1, 2, 3, 4 og 5 ble valgt i radicle kortikale vev, indre regionen av indre cotyledon, ytre region av indre cotyledon, indre region av ytre cotyledon, og ytre regionen av ytre cotyledon, henholdsvis (Figur 3B, C). Morfologiparametrene til parenchymacellene i de ovennevnte 5 regionene ble kvantitativt analysert ved hjelp av morfologianalyseprogramvare (Supplerende tabell 1). Området, lang akselengde, kort akselengde og rundhet av parenchymaceller viste noen forskjeller i forskjellige områder av embryoer.
Cellene i endsperm var fulle av stivelse og lagringsprotein. Ved hjelp av harpikssdelen i hele frøstørrelse er det enkelt å observere og analysere cellene i forskjellige regioner av endperm. For eksempel kan morfologien til celler i alle områder av mais endperm ses tydelig etter at tverrgående helfrøstørrelsesseksjoner ble farget med fluorescerende lysningsmiddel 28. Perifere, midtre og sentrale endspermer i samme kjerne viste signifikant forskjellige former og størrelser av celler (Supplerende figur 1). For å kvantitativt analysere morfologiparametrene til celler i forskjellige regioner av endsperm, ble bildene av regioner analysert ved hjelp av morfologianalyseprogramvare; morfologiparametrene for celler er presentert i supplerende tabell 2. Endpermcellene i region 1 hadde det minste området blant fire regioner, de i region 2 var større enn de i region 3, men mindre enn de i region 4.
Morfologi og analyse av stivelse granulat i ulike regioner av frø
De modne frøene fra de fleste planteressurser, spesielt for kornavlinger, inneholder høyt stivelsesinnhold. Granulatmorfologien og størrelsen på stivelse har viktige effekter på stivelsesegenskaper og spiller en rolle i kvaliteten på frøet. Harpiksdelen av frø kan farges med jodløsning for å vise morfologien til stivelsesgranulat i forskjellige frøregioner. For eksempel ble de tverrgående og langsgående helfrøstoriene av mais forberedt med hell. Seksjonene farget med jod viste morfologien til stivelse (figur 4). For å vise morfologien til stivelse granulat i ulike regioner av endperm, ble de fire regionene og ni regionene valgt i tverrgående og langsgående helfrø-størrelse seksjoner, henholdsvis (figur 4). Stivelse granulat i forskjellige regioner viste betydelig forskjellig morfologi, størrelse og mengde i endsperm celler. For tverrgående seksjon hadde region 1 sfærisk stivelse granulat, region 2 hadde polygonal granulat, og stivelse granulat i begge regioner 3 og 4 var sfæriske. For langsgående seksjon var stivelsesgranulat med polygonal form i region 1, 4, 5 og 8 større enn de med sfærisk form i region 3, 7 og 9, og noen sammensatte stivelsesgranulat ble observert i region 2 og 6.
Den kvantitative analysen av morfologiske parametere av stivelsesgranulat i fire regioner med tverrgående seksjon ble vist i supplerende tabell 3. Stivelsesgranulat i region 1 hadde den minste størrelsen, de i region 2 hadde størst størrelse, og de i region 3 var større enn i region 4.
Mikromorfologi og analyse av proteinlegemer i ulike områder av frø
Hele frøse delen med høylagringsprotein kan brukes til å forside og analysere morfologien til proteinlegemer i forskjellige frøområder. For eksempel ble den tverrgående delen av embryo av oljeseed voldtekt farget med Coomassie strålende blå R250, og lagringsproteinet var farget blått (figur 5). Den romlige fordelingen av lagringsprotein i embryoet kan tydelig observeres ved lav forstørrelse (figur 5A). Lagringsprotein er tilstede i proteinlegemer. Ved høy forstørrelse viste proteinkroppen en heterogen matrise med noen svarte granulater og noen uopphetede gjennomsiktige struktur (figur 5B). Proteinlegemene i frø har tre typer: den første typen består av en homogen proteinmatrise og har ingen inneslutninger, den andre typen inneholder kulekrystaller, og den tredje typen inneholder kulekrystaller og pseudokrystaller11. De kulekrystkrysene i proteinkroppen består av fytat og andre uorganiske salter, som ikke er farget. Disse kulekrystkrysene er svarte på grunn av at lyset ikke kan passere gjennom dem under mikroskop. I tillegg er den sfæriske krystallen skjør og vanskelig å bli penetrert av fikseringsmiddelet og innebyggingsmiddelet. Når du gjør delen, bryter de sfæriske krystallene noen ganger ut, noe som resulterer i et gjennomsiktig hulrom inne iproteinkroppen 11. Proteinkroppen av oljeseede voldtektembryo inneholdt sfæroide krystaller i henhold til mikromorfologien (figur 5B). For å undersøke den romlige fordelingen av proteinlegemer i embryoet, ble fem regioner i hele embryo-delen valgt for å representere radikkelkortikale vev, indre region av indre cotyledon, ytre region av indre cotyledon, indre region av ytre cotyledon, og ytre region av ytre cotyledon (Figur 5A,C-G). Proteinlegemene i alle embryoregioner var sfæriske, ellipsoide og uregelmessige i form (figur 5C-G).
Kvantitativ analyse av proteinlegemer i første og andre lå parenchymaceller nær epidermis i de ovennevnte valgte fem regionene er presentert i supplerende tabell 4. Proteinkroppen hadde liten forskjell blant de utvalgte fem regionene. Rundheten av protein kroppen var betydelig lavere i den ytre regionen av ytre cotyledon enn i de andre fire regionene, noe som indikerer protein kroppen i ytre cotyledon var nær sfære. Antall og arealindeks for proteinkroppen i celle var signifikant høyere i radikkelparenchymacellen enn i cotyledon parenchymacellen (tilleggstabell 4).
Figur 1: Tilberedning av harpikseksjon i full størrelse ved hjelp av tørr snittingsmetode. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vev struktur av embryo i modne frø av oljefrø voldtekt variasjon Huashuang 5. (A) Morfologi av embryo. (B)Vevsstruktur av langsgående hel-embryo-størrelse seksjon. (C)Morfologi av tverrgående hele embryo-størrelse seksjon. (D)Vevstruktur av tverrgående hele embryo-størrelse seksjon. Seksjonene var farget med safranin. H, hypocotyl; IC, indre cotyledon; OC, ytre cotyledon; R, radicle. Skala bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Morfologi av celler i embryo av oljeseed voldtekt variasjon Huashuang 5. (A)Tverrgående hele embryo-størrelse seksjon farget med fluorescerende lysningsmiddel 28. (B) Forsterkning av region B i (A), som viser cellemorfologi og vevsstruktur av radikkel. (C) Forsterkning av region C i (A), som viser cellemorfologi og vev struktur av indre og ytre cotyledon. Vektstangen = 500 μm for (A) og 100 μm for (B,C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Morfologi av stivelse granulat i moden kjerne av mais variasjon Zheng 58. Tverrgående (A) og langsgående (B) helfrø-størrelse seksjoner ble farget med jod løsning, og deres regionale forsterkninger viser morfologi av stivelse granulat i ulike regioner av endsperm. Skala bar = 1 mm for hel-frø-størrelse seksjon og 20 μm for regionale forsterkninger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Morfologi av proteinlegemer i embryo av oljeseed voldtekt variasjon Huashuang 5. (A)Transversal hel-embryo-størrelse seksjon farget med Coomassie strålende blå R250. (B)Forsterkning av proteinlegemer, som viser deres mikrostruktur. (C-G) Forsterkning av region C-G i (A), som viser morfologien til proteinkroppen i radikkel (C), indre region av indre cotyledon (D), ytre region av indre cotyledon (E), indre region av ytre cotyledon (F), ytre region av indre cotyledon (G). Vektstangen = 500 μm for (A), 5 μm for (B) og 50 μm for (C-G). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende Figur 1: Morfologi av celler i moden kjerne av mais variasjon Zheng 58. Den tverrgående hele delen av hele frøstørrelse ble farget med fluorescerende lysningsmiddel 28, og dens regionale forsterkninger (1-4) viser morfologien til endpermceller i forskjellige regioner av endperm. Skala bar = 1 mm for hel-frø-størrelse seksjon og 100 μm for regionale forsterkninger. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Figur 2: Morfologi for å utvikle kjernen av ris variasjon 9311. De tverrgående helseedeseksjonene på forskjellige dager etter blomstring (DAF) ble motvirket med safranin O og jodløsning. Scale bar = 0,5 mm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Morfologi av spiret kjerne av ris variasjon Te-qing. Den langsgående hele delen av hele frøstørrelse klokken 8 dager etter imbibition ble motvirket med periodisk syre-Schiff og toluidinblå O, og dens regionale forsterkninger viser morfologiendringer av endsperm i forskjellige regioner av frø. Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Figur 4: Morfologien til kokt kjerne av rissortet Te-qing. Den tverrgående hele delen av hele frøstørrelse ble farget med jodløsning, og dens ytre, midtre og indre regionforsterkninger viser morfologiendringene av stivelsesgranulat i frø under matlagingsprosessen i 0, 10, 20 og 30 min. Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell 1: Morfologi parametere av celler i ulike regioner av oljeseed voldtekt embryoa Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
a. Dataene betyr at ± standardavvik (n = 3), og verdiene i samme kolonne med forskjellige bokstaver er betydelig forskjellige (p < 0,05).
B (andre) Regionene er vist i figur 3B,C.
c (andre) LAL: lang akselengde; SAL: kort akselengde; Rundhet: (omkrets 2)/(4×π×område).
Tilleggstabell 2: Morfologi parametere av celler i forskjellige regioner av mais endperma Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
a. Data betyr ± standardavvik (n = 3). Verdier i samme kolonne med forskjellige bokstaver er betydelig forskjellige (p < 0,05).
B (andre) Regionene er vist i tverrgående del av maiskjernen i supplerende figur 1.
c (andre) LAL: lang akselengde; SAL: kort akselengde; Rundhet: (omkrets 2)/(4×π×område).
Tilleggstabell 3: Morfologi parametere av stivelse granulat i ulike regioner av mais endosperma Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
a. Data betyr ± standardavvik (n = 3). Verdier i samme kolonne med forskjellige bokstaver er betydelig forskjellige (p < 0,05).
B (andre) Regionene vises i tverrgående del av maiskjernen i figur 4A.
c (andre) LAL: lang akselengde; SAL: kort akselengde; Rundhet: (omkrets 2)/(4×π×område).
Tilleggstabell 4: Morfologi parametere av protein organer i ulike regioner av oljeseed voldtekt embryoa Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
a. Dataene betyr at ± standardavvik (n = 3), og verdiene i samme kolonne med forskjellige bokstaver er betydelig forskjellige (p < 0,05).
B (andre) Områdene vises i figur 5.
c (andre) Rundhet: (omkrets 2)/(4×π×område); Områdeindeks er arealet forholdet mellom proteinkropp og celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Frøene er den viktigste fornybare ressursen for mat, fôr og industrielt råstoff, og er rike på lagringsmaterialer som stivelse og protein. Morfologien og mengden celler og innholdet og konfigurasjonen av lagringsmaterialer påvirker vekten og kvaliteten påfrøene 7,12. Selv om stereologi og bildeanalyseteknologi kan måle størrelsen og mengden celler i et vevsområde, mangler de i mange laboratorier. Parafin- og harpiksseksjonene gir et todimensjonalt (2D) bilde, noe som fører til ingen måte å analysere den sanne størrelsen og mengden celler på. Cellene kuttes imidlertid tilfeldig på sine fly, gjennomsnittsstørrelsen på mange celler (over 100) fra minst tre forskjellige deler av vevsområdet kan gjenspeile 2D morfologiparametrene (lengde, bredde og område) av celler, og forholdet mellom det valgte regionområdet til gjennomsnittlig celleområde kan gjenspeile mengden celler. Derfor er det svært viktig for in situ visning og analyse av morfologi av celler og lagringsmaterialer i forskjellige områder av frø. Parafinseksjonen er den mest egnet for å forberede hele frøse delen, spesielt for store frø7. Cellene er imidlertid fulle av lagringsmaterialer med frøutvikling, noe som fører til at det er svært vanskelig å oppnå den gode hele frøse delen fra sent utvikling av frø og modne frø. I tillegg er parafinseksjonen for tykk til å vise morfologien tydelig, og er bare egnet for å undersøke vevsstrukturen til frø7.
Harpiksseksjonen er tynn, og kan vise morfologien til celler, stivelsesgranulat og proteinlegemer tydelig7. Den rutinemessige harpiksen er imidlertid ikke egnet for helfrøstørrelse. Teknikken som presenteres her representerer en rask, enkel og ivrig tilnærming til å forberede tverrgående og langsgående helfrø-størrelse deler av modne frø innebygd i harpiks for å se morfologi av celler, stivelse granulat, og protein organer i ulike regioner av frø ved hjelp av lys mikroskopi (Figur 2-5, Supplerende figur 1). I tillegg kan teknikken også forberede den delen av å utvikle, spiret og kokte frø for å in situ undersøke morfologiendringene av celle-, stivelses- og proteinlegemer i forskjellige frøregioner.
En annen klar fordel som denne teknikken gir er anvendelsen av helfrøstørrelse seksjoner. I den nye epoken med fennomi og metabolomikk er det viktig å kvantitativt måle morfologiparametrene til celler, stivelsesgranulat og proteinlegemer i forskjellige frøregioner. Den nye teknikken, sammen med morfologianalyseprogramvare, gjør det mulig for forskeren å kvantitativt analysere morfologiparametrene til celler, stivelsesgranulat og proteinlegemer i forskjellige frøregioner (Supplerende tabell 1-4).
Selv om den nåværende tørre snittingsmetoden med hell kan forberede harpikssdelen i hele frøstørrelse, har den noen begrensninger og mangler. For parafinseksjonen kan parafinen enkelt fjernes fra seksjonen; men for harpiksdelen kan ikke harpiksen fjernes fra seksjonen, noe som fører til planteprøven innebygd i harpiks. Derfor, sammenlignet med parafinseksjonen, er den nåværende harpikseksjonen i full størrelse ikke egnet til å utføre histokjemi og immunohistochemistry. I tillegg kan den rutinemessige harpiksseksjonsmetoden kutte prøver i 0,5-2 μm glatte seksjoner på grunn av prøveblokken med lite volum. Men den nåværende tørre snittingsmetoden er vanskelig å forberede de glatte seksjonene med tykkelse mindre enn 2 μm, spesielt for modne frø med stort volum og høyt stivelsesinnhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Finansieringen ble gitt av National Natural Science Foundation of China (32071927), Talent Project of Yangzhou University og Priority Academic Program Development av Jiangsu Higher Education Institutions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
- Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
- Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
- Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).
- Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
- Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8 (2020).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
- Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
- Lott, J. N. A.
- Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).
