Summary
Esta técnica permite a preparação rápida e simples da seção de resina de tamanho inteiro para a observação e análise de células, grânulos de amido e corpos proteicos em diferentes regiões da semente.
Abstract
A morfologia, o tamanho e a quantidade de células, grânulos de amido e corpos proteicos em sementes determinam o peso e a qualidade das sementes. São significativamente diferentes entre diferentes regiões de sementes. Para ver as morfologias das células, grânulos de amido e corpos proteicos de forma clara, e analisar quantitativamente seus parâmetros de morfologia com precisão, a seção do tamanho de sementes é necessária. Embora a seção de parafina de todo o tamanho de sementes possa investigar o acúmulo de materiais de armazenamento em sementes, é muito difícil analisar quantitativamente os parâmetros de morfologia das células e materiais de armazenamento devido à baixa resolução da seção espessa. A seção de resina fina tem alta resolução, mas o método de secção de resina de rotina não é adequado para preparar a seção em tamanho inteiro de sementes maduras com um grande volume e alto teor de amido. Neste estudo, apresentamos um método simples de secção seca para preparar a seção de resina de todo o tamanho das sementes. A técnica pode preparar as seções de tamanho integral transversal e longitudinal de sementes em desenvolvimento, maduras, germinadas e cozidas embutidas na resina branca LR, mesmo para sementes grandes com alto teor de amido. A seção de tamanho inteiro pode ser manchada com brilho fluorescente 28, iodo e R250 azul brilhante Coomassie para exibir especificamente a morfologia de células, grânulos de amido e corpos proteicos claramente, respectivamente. A imagem obtida também pode ser analisada quantitativamente para mostrar os parâmetros de morfologia das células, grânulos de amido e corpos proteicos em diferentes regiões de sementes.
Introduction
As sementes vegetais contêm materiais de armazenamento, como amido e proteína, e fornecem energia e nutrição para as pessoas. A forma, o tamanho e a quantidade de materiais de célula e armazenamento determinam o peso e a qualidade das sementes. As células e materiais de armazenamento em diferentes regiões de sementes possuem morfologias significativamente diferentes, especialmente para algumas culturas de cereais de alta amilolose com inibição da enzima de ramificação de amido IIb1,2,3. Por isso, é muito importante investigar as morfologias das células e materiais de armazenamento em diferentes regiões de sementes.
A secção de parafina é um bom método para preparar a seção de todo o tamanho das sementes e pode exibir a estrutura tecidual das sementes e o acúmulo de material de armazenamento em diferentes regiões de sementes4,5,6. No entanto, as seções de parafina geralmente têm 6-8 μm de espessura com baixa resolução; assim, é muito difícil observar e analisar quantitativamente a morfologia dos materiais celulares e de armazenamento. As seções de resina geralmente têm 1-2 μm de espessura e alta resolução e são muito adequadas para observar e analisar a morfologia dos materiais celulares e de armazenamento7. No entanto, o método rotineiro de secção de resina tem dificuldade em preparar a seção de todo o tamanho das sementes, especialmente para sementes com grande volume e alto teor de amido; assim, não há como observar e analisar a morfologia das células e materiais de armazenamento em diferentes regiões da semente. A resina branca LR é uma resina acrílica e exibe baixa viscosidade e forte permeabilidade, levando a suas boas aplicações na preparação da seção de resina de sementes, especialmente para grãos maduros de cereais com grande volume e alto teor de amido. Além disso, a amostra embutida na resina branca LR pode ser manchada facilmente com muitos corantes químicos para exibir claramente a morfologia das células e materiais de armazenamento sob microscópio leve ou fluorescente7. Em nosso artigo anterior, relatamos um método de secção seca para preparar as seções de tamanho inteiro de grãos de cereais maduros embutidos em resina branca LR. O método também pode preparar a seção de tamanho inteiro do kernel de cereais em desenvolvimento, germinado e cozido8. A seção de todo o tamanho obtido possui muitas aplicações na observação e análise de micromorfologia, especialmente para visualização clara e análise quantitativa das diferenças de morfologia dos materiais celulares e de armazenamento em diferentes regiões da semente8,9.
Esta técnica é apropriada para pesquisadores que desejam observar a microestrutura do tecido e a forma e o tamanho das células, grânulos de amido e corpos proteicos em diferentes regiões de sementes usando microscópio leve. As imagens de seções de tamanho inteiro manchadas especificamente para exposição de células, grânulos de amido e corpos proteicos podem ser analisadas por software de análise de morfologia para medir quantitativamente os parâmetros de morfologia das células, grânulos de amido e corpos proteicos em diferentes regiões da semente. Para demonstrar a aplicabilidade técnica e as aplicações de seção de todo o tamanho das sementes, investigamos as sementes maduras do estupro de milho e oleosa e os grãos de arroz em desenvolvimento, germinados e cozidos neste estudo. O protocolo contém quatro processos. Aqui, usamos o kernel de milho maduro, que é o mais difícil na preparação das seções de todo o tamanho das sementes devido ao grande volume e alto teor de amido, como uma amostra para exibir os processos passo a passo.
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Protocol
1. Preparação de sementes incorporadas à resina (Figura 1)
- Fixar seis grãos maduros de milho em 10 mL de glutaraldeído tamponado de fosfato de 2,5% (0,1 M, pH7.2) a 4 °C por 48 h. Os pesquisadores podem escolher outras misturas fixas, concentrações fixas e condições de fixação de acordo com seus objetivos de pesquisa e tipos de tecidos.
- Tire os grãos e corte-os longitudinalmente ou transversalmente até 2-3 mm de espessura usando uma lâmina afiada de dupla lateridade, e fixá-los em 10 mL de 2,5% de glutaraldeído tampão-fosfato (0,1 M, pH 7.2) novamente por 48 h.
- Lave as amostras três vezes com 10 mL de tampão fosfato de 0,1 M (pH 7,2) por 30 minutos todas as vezes.
- Desidratar as amostras no aumento dos graus de solução aquosa do etanol (10 mL) de 30% para 50%, 70%, 90% uma vez e 100% três vezes por 30 minutos todas as vezes.
- Infiltrar-se nas amostras em 10 mL aumentando os graus de solução de resina LR White diluída com etanol de 25% para 50%, 75% uma vez e 100% duas vezes a 4 °C por 12 h todas as vezes.
- Prepare os pedestais para amostras antes de incorporar. Adicione 0,25 mL de resina branca 100% LR em um tubo centrífuga de 2 mL e polimerize-a a 60 °C por 48 h.
- Adicione sucessivamente a resina branca LR pura (0,5 mL) e a amostra infiltrada no tubo centrífuga com um pedestal. Endireitar as amostras com a agulha anatômica e polimerizá-las a 60 °C em forno por 48 h.
2. Seccional seca para preparação de seção de tamanho inteiro(Figura 1)
- Retire os grãos embutidos do tubo centrífuga e corte o excesso de resina ao redor da amostra usando uma lâmina afiada.
- Fixar o bloco de resina no suporte de amostra de ultramicrotome (EM UC7), e cortar a resina supérflua na superfície da amostra e ao redor da amostra com uma lâmina.
- Polir a superfície da amostra finamente com uma faca de vidro até que uma seção completa possa ser formada.
- Coloque um pequeno gancho de cobre cerca de 2 mm acima da borda da lâmina antes de cortar e corte a amostra em uma seção de 2 μm. O papel do gancho é evitar o curling para cima da seção.
- Coloque o gancho sob a seção para apoiá-lo quando a seção ficar longa.
- Adicione 100 μL de água em um slide não tratado e transfira cuidadosamente a seção completa e ininterrupta para a água com a pinça.
- Para suavizar a seção enrugada, aqueça e seque a amostra na mesa de achatamento a 50 °C durante a noite.
- Se a seção desmoronar ou chorar, estenda o tempo para cada infiltração de resina da amostra de 12h a 24 h ou 48 h.
- Se a seção tiver algumas linhas paralelas à faca, aperte firmemente o bloco de amostra. Se a seção tiver algumas linhas verticais para a faca, por favor, use uma faca nova.
3. Coloração e observação da seção
NOTA: Para observar a estrutura tecidual e a morfologia das células, grânulos de amido e corpos proteicos, colori as seções com manchas específicas de acordo com o propósito da pesquisa. Aqui, usamos o iluminador fluorescente 28, solução de iodo e R250 azul brilhante Coomassie para manchar as paredes celulares, grânulos de amido e corpos proteicos, respectivamente.
- Para observar a morfologia das células, colori a seção com 40 mL de 0,1% (w/v) de brilho fluorescente 28 solução aquosa em um frasco de coloração de vidro compacto de 70 mL a 45 °C por 10 minutos e, em seguida, enxágüe-a com água corrente por 5 min. Observe e fotografe a seção sob um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera CCD.
- Para observar a morfologia dos grânulos de amido, colorique a seção com 40 μL de solução de iodo (0,07% (w/v) I2 e 0,14% (w/v) KI em 25% (v/v) glicerol) por 1 min, e cubra a amostra contendo solução de iodo com um tapa de cobertura. Veja e fotografe a amostra sob um microscópio leve equipado com uma câmera CCD.
- Para observar a morfologia dos corpos proteicos, mergulhe a seção com 40 mL de ácido acético de 10% (v/v) em um frasco de coloração de vidro compacto de 70 mL por 10 min a 45 °C, e, em seguida, manchá-lo em 40 mL de 1% (w/v) Coomassie azul brilhante R250 em 25% (v/v) isopropanol e 10% (v/v) ácido acético por 15 min a 45 °C. Lave as seções manchadas com água corrente por 5 minutos e seque-as. Observe e fotografe a seção sob um microscópio leve equipado com uma câmera CCD.
4. Análise quantitativa dos parâmetros de morfologia
- Processar e analisar quantitativamente as imagens fotografadas para área, eixo longo/curto e arredondamento de células, grânulos de amido e corpos proteicos em diferentes regiões de sementes usando software de análise de morfologia (software Image-Pro Plus 6.0) seguindo exatamente os procedimentos de Zhao et al.9.
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Representative Results
Método simples de secção seca para obter uma seção de tamanho de sementes inteira
Estabelecemos um método simples de secção seca para preparar uma seção de sementes em tamanho inteiro embutida em resina LR-branca(Figura 1). O método pode preparar seções transversais e longitudinais de todo o tamanho com espessura de 2 μm(Figura 2-5, Figura Suplementar 1-4). Por exemplo, a semente madura do estupro da oleosa pode ser seccionada transversalmente e longitudinalmente(Figura 2). Para as culturas de cereais, seus grãos maduros estão cheios de grânulos de amido, levando a isso é muito difícil na preparação da seção de todo o tamanho das sementes. Utilizando a técnica atual, também poderiam ser preparadas as seções transversais e longitudinal de milho maduro com grande volume (Figura 4, Figura Suplementar 1). Além disso, o kernel em desenvolvimento (Figura Suplementar 2),o kernel germinado(Figura Suplementar 3)e o grão cozido(Figura Suplementar 4) do arroz podem ser investigados utilizando o método.
Aplicações da seção de todo o tamanho das sementes
Observação da estrutura tecidual da semente
A seção de tamanho inteiro pode ser usada para observar a estrutura tecidual das sementes. Por exemplo, o embrião de estupro de oleosa consiste em radículo, hipocóte, plumule e dois cotilledons. Os cotilados internos e externos são dobrados ao meio, envolvendo o hipocóte e o radículo e tornando o embrião esférico(Figura 2A,C). As seções longitudinais e transversais de todo o tamanho de embriões manchadas com safranin exibiram claramente o radículo, hipocótil, cotyledon interno e cotyledon externo(Figura 2B,D). A seção longitudinal de estupro de oleosa é preparada com mais dificuldade do que a seção transversal. Portanto, as seções transversais dos embriões são amplamente utilizadas para investigar a micromorfologia dos embriões nas referências5,10.
Morfologia e análise de células em diferentes regiões de sementes
A seção de todo o tamanho das sementes pode ser usada para observar e analisar a morfologia das células em diferentes regiões de sementes. Por exemplo, as seções transversais de estupro de obturação de embriões foram manchadas com brilho fluorescente 28, e as paredes celulares foram manchadas especificamente(Figura 3A). A micromorfologia das células em qualquer região do embrião pode ser claramente exibida em alta ampliação(Figura 3B,C). O radículo consiste em epiderme, córtex e tecidos vasculares. As células epidérmicas localizadas na camada mais externa do radículo eram retangulares e radialmente organizadas. As células de parenchyma cortical eram redondas em forma e grandes em tamanho. Alguns espaços distintos foram observados entre células corticais. As células corticais foram dispostas em camadas de dentro para fora(Figura 3B). As células epidérmicas de cotilledon eram quadradas e tinham pequeno volume. Não houve diferenças significativas na forma e tamanho das células epidérmicas entre superfícies externas e internas de cotilledons internos e externos. Alguns cilindros vasculares foram espalhados no meio de tecidos mesofídicos de cotilledons internos e externos. As células de mesophyll parenchyma eram significativamente maiores que as células epidérmicas e as células do cilindro vascular no cotilledon. As células de mesophyll parenchyma mostraram um arranjo típico de paliçamento na região interna do cotyledon externo e na região externa do cotyledon interno(Figura 3C). As células parenchyma tinham morfologias significativamente diferentes em diferentes regiões do embrião. Para revelar suas diferenças na morfologia, foram escolhidas as regiões 1, 2, 3, 4 e 5 no tecido cortical radículo, região interna do cotyledon interno, região externa do cotyledon interno, região interna do cotyledon externo e região externa do cotyledon externo,respectivamente (Figura 3B,C). Os parâmetros de morfologia das células parenchyma nas 5 regiões acima foram analisados quantitativamente por meio do software de análise da morfologia (Tabela Suplementar 1). A área, comprimento de eixo longo, comprimento curto do eixo e arredondamento de células parenchyma mostraram algumas diferenças em diferentes regiões de embriões.
As células em endosperma estavam cheias de amido e proteína de armazenamento. Usando a seção de resina do tamanho inteiro, é fácil observar e analisar as células em diferentes regiões do endosperma. Por exemplo, a morfologia das células em qualquer região do endosperma de milho poderia ser vista claramente depois que as seções transversais de todo o tamanho de sementes foram manchadas com brilho fluorescente 28. Os endospermos periféricos, médios e centrais no mesmo núcleo apresentaram formas e tamanhos de células significativamente diferentes(Figura Suplementar 1). Para analisar quantitativamente os parâmetros de morfologia das células em diferentes regiões do endosperm, as imagens das regiões foram analisadas utilizando-se software de análise de morfologia; os parâmetros de morfologia das células são apresentados na Tabela Suplementar 2. As células endosperma na região 1 apresentaram a menor área entre quatro regiões, aquelas na região 2 eram maiores que as da região 3, mas menores que as da região 4.
Morfologia e análise de grânulos de amido em diferentes regiões de sementes
As sementes maduras da maioria dos recursos vegetais, especialmente para as culturas de cereais, contêm alto teor de amido. A morfologia do grânulo e o tamanho do amido têm efeitos importantes sobre as propriedades do amido e desempenham um papel na qualidade das sementes. A seção de resina da semente pode ser manchada com solução de iodo para exibir a morfologia de grânulos de amido em diferentes regiões de sementes. Por exemplo, as seções transversais e longitudinal de milho foram preparadas com sucesso. As seções manchadas com iodo apresentaram a morfologia do amido (Figura 4). Para mostrar a morfologia do grânulo de amido em diferentes regiões do endosperma, foram escolhidas as quatro regiões e nove regiões nas seções transversal e longitudinal de todo o tamanho de sementes,respectivamente (Figura 4). Os grânulos de amido em diferentes regiões apresentaram morfologia, tamanho e quantidade significativamente diferentes nas células endosperma. Para a seção transversal, a região 1 tinha grânulos esféricos de amido, a região 2 tinha grânulos poligonais e grânulos de amido nas duas regiões 3 e 4 eram esféricos. Para seção longitudinal, os grânulos de amido com forma poligonal nas regiões 1, 4, 5 e 8 eram maiores do que aqueles com forma esférica nas regiões 3, 7 e 9, e alguns amidos compostos foram observados nas regiões 2 e 6.
A análise quantitativa dos parâmetros morfológicos dos grânulos de amido em quatro regiões da seção transversal foi mostrada na Tabela Suplementar 3. Os grânulos de amido na região 1 tinham o menor tamanho, os da região 2 tinham o maior tamanho, e os da região 3 eram maiores do que na região 4.
Micromorfologia e análise de corpos proteicos em diferentes regiões de sementes
A seção de tamanho inteiro com proteína de alto armazenamento pode ser usada para obversar e analisar a morfologia de corpos proteicos em diferentes regiões de sementes. Por exemplo, a seção transversal do embrião de estupro da oleosa foi manchada com Coomassie azul brilhante R250, e a proteína de armazenamento estava manchada de azul(Figura 5). A distribuição espacial da proteína de armazenamento no embrião pôde ser claramente observada na baixa ampliação(Figura 5A). A proteína de armazenamento está presente em corpos proteicos. Na alta ampliação, o corpo proteico exibiu uma matriz heterogênea com alguns grânulos pretos e alguma estrutura transparente não manchada(Figura 5B). Os corpos proteicos em sementes possuem três tipos: o primeiro tipo consiste em uma matriz proteica homogênea e não tem inclusões, o segundo tipo contém cristais globulares, e o terceiro tipo contém cristais globulares e pseudocristais11. Os cristais globulares no corpo proteico são compostos de fito e outros sais inorgânicos, que não estão manchados. Estes cristais globulares são pretos devido ao que a luz não pode passar por eles sob microscópio. Além disso, o cristal esférico é frágil e difícil de ser penetrado pelo agente fixador e incorporador. Ao fazer a seção, os cristais esféricos às vezes estouram, resultando em uma cavidade transparente dentro do corpoproteico 11. O corpo proteico do embrião de estupro da oleosa continha cristais esferoidais de acordo com sua micromorfologia (Figura 5B). Para investigar a distribuição espacial de corpos proteicos no embrião, foram escolhidas cinco regiões da seção de todo o embrião para representar o tecido cortical radículo, região interna de cotyledon interno, região externa do cotilledon interno, região interna do cotyledon externo e região externa do cotyledon externo (Figura 5A, C-G). Os corpos proteicos em todas as regiões do embrião eram esféricos, elipsoidais e irregulares em forma(Figura 5C-G).
A análise quantitativa dos corpos proteicos no primeiro e segundo leigos de parenchyma próximos à epiderme nas cinco regiões acima escolhidas são apresentadas na Tabela Suplementar 4. A área do corpo proteico apresentou pequena diferença entre as cinco regiões escolhidas. A arredondamento do corpo proteico foi significativamente menor na região externa do cotyledon externo do que nas outras quatro regiões, indicando que o corpo proteico em cotilledon externo estava perto da esfera. O número e o índice de área do corpo proteico nas células foram significativamente maiores na célula de radicle parenchyma do que na célula de cotilledon parenchyma(Tabela Suplementar 4).
Figura 1: Preparação da seção semi-tina de resina de tamanho inteiro utilizando método de secção seca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estrutura tecidual de embrião em sementes maduras da variedade de estupro de oleatosas Huashuang 5. (A)Morfologia do embrião. (B) Estrutura tecidual da seção longitudinal do tamanho de embriões. (C) Morfologia da seção transversal do tamanho de embriões. (D) Estrutura tecidual da seção transversal do tamanho de embriões. As seções estavam manchadas com safranin. H, hipocotyl; IC, cotyledon interior; OC, cotyledon exterior; R, radículo. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Morfologia de células em embrião da variedade de estupro de oleatosas Huashuang 5. (A) Seção transversal de embrião integral manchada com iluminador fluorescente 28. (B) Amplificação da região B em (A), mostrando a morfologia celular e estrutura tecidual do radículo. (C) Amplificação da região C em (A), mostrando a morfologia celular e estrutura tecidual de cotilledon interno e externo. Barra de escala = 500 μm para (A) e 100 μm para (B,C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Morfologia de grânulos de amido em grão maduro de variedade de milho Zheng 58. As seções transversais (A) e longitudinal(B)de tamanho inteiro foram manchadas com solução de iodo, e suas amplificações regionais exibem a morfologia de grânulos de amido em diferentes regiões do endosperma. Barra de escala = 1 mm para seção de tamanho inteiro e 20 μm para amplificações regionais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Morfologia de corpos proteicos em embrião da variedade de estupro de oleatosa Huashuang 5. (A) Seção transversal de embrião inteiro manchada com Coomassie azul brilhante R250. (B) Amplificação de corpos proteicos, mostrando sua microestrutura. (C-G) Amplificação da região C-G em (A),mostrando a morfologia do corpo proteico em radículo(C),região interna de cotilledon interno(D),região externa do cotilledon interno(E),região interna do cotilledon externo(F),região externa do cotilledon interno(G). Barra de escala = 500 μm para (A), 5 μm para (B) e 50 μm para (C-G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 1: Morfologia das células em grão maduro da variedade de milho Zheng 58. A seção transversal de todo o tamanho de sementes foi manchada com brilho fluorescente 28, e suas amplificações regionais (1-4) exibem a morfologia de células endosperma em diferentes regiões de endosperma. Barra de escala = 1 mm para seção de tamanho inteiro e 100 μm para amplificações regionais. Clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar Figura 2: Morfologia do desenvolvimento do grão de arroz variedade 9311. As seções transversais de todo o tamanho de sementes em diferentes dias após a floração (DAF) foram contra-colonizadas com safranin O e solução de iodo. Barra de escala = 0,5 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 3: Morfologia do grão germinado da variedade de arroz Te-qing. A seção longitudinal de todo o tamanho de sementes em 8 dias após a imbibição foi contra-realizada com ácido periódico-Schiff e toluidina azul O, e suas amplificações regionais exibem as mudanças de morfologia do endosperma em diferentes regiões de sementes. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar Figura 4: A morfologia do grão cozido da variedade de arroz Te-qing. A seção transversal de todo o tamanho de sementes foi manchada com solução de iodo, e suas amplificações externas, médias e internas da região exibem as alterações morfológicas de grânulos de amido em sementes durante o processo de cozimento por 0, 10, 20 e 30 min. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 1: Parâmetros de morfologia de células em diferentes regiões do embrião de estupro da oleosaa Por favor clique aqui para baixar esta tabela.
um Os dados são ± desvios padrão (n = 3), e os valores na mesma coluna com letras diferentes são significativamente diferentes(p < 0,05).
b As regiões são mostradas na Figura 3B(C).
c LAL: comprimento longo do eixo; SAL: comprimento curto do eixo; Arredondamento: (perímetro 2)/(4×π×ararea).
Tabela Suplementar 2: Parâmetros de morfologia de células em diferentes regiões do endosperm de milhoa Clique aqui para baixar esta tabela.
um Os dados são ± desvios padrão(n = 3). Valores na mesma coluna com letras diferentes são significativamente diferentes (p < 0,05).
b As regiões são mostradas na seção transversal do grão de milho na Figura Suplementar 1.
c LAL: comprimento longo do eixo; SAL: comprimento curto do eixo; Arredondamento: (perímetro 2)/(4×π×ararea).
Tabela Suplementar 3: Parâmetros de morfologia de grânulos de amidoem diferentes regiões do endosperm de milhopor favor clique aqui para baixar esta tabela.
um Os dados são ± desvios padrão(n = 3). Valores na mesma coluna com letras diferentes são significativamente diferentes (p < 0,05).
b As regiões são mostradas na seção transversal do grão de milho na Figura 4A.
c LAL: comprimento longo do eixo; SAL: comprimento curto do eixo; Arredondamento: (perímetro 2)/(4×π×ararea).
Tabela Suplementar 4: Parâmetros de morfologia de corpos proteicos em diferentes regiões do embrião de estupro da oleosaa Por favor clique aqui para baixar esta tabela.
um Os dados são ± desvios padrão (n = 3), e os valores na mesma coluna com letras diferentes são significativamente diferentes(p < 0,05).
b As regiões são mostradas na Figura 5.
c Arredondamento: (perímetro 2)/(4×π×ara); O índice de área é a razão da área de proteína corpo a célula.
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Discussion
As sementes são o recurso renovável mais importante para alimentos, forragem e matéria-prima industrial, e são ricas em materiais de armazenamento, como amido e proteína. A morfologia e a quantidade de células e o conteúdo e configuração dos materiais de armazenamento afetam o peso e a qualidade das sementes7,12. Embora a tecnologia de estereologia e análise de imagem possa medir o tamanho e a quantidade de células em uma região de tecido, elas estão em falta em muitos laboratórios. As seções de parafina e resina dão uma imagem bidimensional (2D), não levando a nenhuma maneira de analisar o tamanho e a quantidade verdadeiras das células. No entanto, as células são cortadas aleatoriamente em seus planos, o tamanho médio de muitas células (acima de 100) de pelo menos três seções diferentes da região do tecido pode refletir os parâmetros de morfologia 2D (comprimento, largura e área) das células, e a razão da área da região escolhida para a área celular média pode refletir a quantidade de células. Por isso, é muito importante para a visualização in situ e análise da morfologia das células e materiais de armazenamento em diferentes regiões de sementes. A seção de parafina é a mais adequada para o preparo da seção de tamanho inteiro, especialmente para sementes de grande porte7. No entanto, as células estão cheias de materiais de armazenamento com desenvolvimento de sementes, levando a isso é muito difícil obter a boa seção de todo o tamanho de sementes a partir de sementes em desenvolvimento tardio e sementes maduras. Além disso, a seção de parafina é muito grossa para exibir claramente a morfologia, e só é adequada para investigar a estrutura tecidual da semente7.
A seção de resina é fina, e pode exibir a morfologia de células, grânulos de amido e corpos proteicos claramente7. No entanto, a resina de rotina não é adequada para seção de tamanho inteiro. A técnica aqui apresentada representa uma abordagem rápida, simples e aguçada para preparar seções transversais e longitudinais de sementes maduras embutidas em resina para visualização da morfologia de células, grânulos de amido e corpos proteicos em diferentes regiões de sementes usando microscopia leve(Figura 2-5,FiguraSuplementar 1). Além disso, a técnica também pode preparar a seção de sementes desenvolvidas, germinadas e cozidas para in situ investigar as mudanças de morfologia de corpos celulares, amido e proteínas em diferentes regiões de sementes.
Outra vantagem distinta que essa técnica proporciona é a aplicação de seções de tamanho inteiro. Na nova era da fenômica e metabolômica, é importante medir quantitativamente os parâmetros de morfologia das células, grânulos de amido e corpos proteicos em diferentes regiões de sementes. A nova técnica, em conjunto com o software de análise da morfologia, permite ao pesquisador analisar quantitativamente os parâmetros de morfologia das células, grânulos de amido e corpos proteicos em diferentes regiões da semente (Tabela Suplementar 1-4).
Embora o presente método de secção seca possa preparar com sucesso a seção de resina de todo o tamanho das sementes, ele tem algumas limitações e deficiências. Para a seção de parafina, a parafina pode ser removida facilmente da seção; mas para a seção de resina, a resina não pode ser removida da seção, levando à amostra da planta embutida na resina. Portanto, em comparação com a seção de parafina, a atual seção de resina de todo o tamanho da semente não é adequada para realizar a histoquímica e a imunohistoquímica. Além disso, o método de secção de resina de rotina pode cortar amostras em seções lisas de 0,5-2 μm devido ao bloco amostral com pequeno volume. Mas o presente método de secção seca é difícil de preparar as seções lisas com espessura inferior a 2 μm, especialmente para sementes maduras com grande volume e alto teor de amido.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O financiamento foi fornecido pela National Natural Science Foundation of China (32071927), pelo Projeto de Talentos da Universidade de Yangzhou e pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento de Instituições de Ensino Superior de Jiangsu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
- Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
- Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
- Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).
- Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
- Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8 (2020).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
- Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
- Lott, J. N. A.
- Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).
