Summary
Bu teknik, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin gözlem ve analizi için tam tohum büyüklüğünde reçine bölümünün hızlı ve basit hazırlanmasına olanak sağlar.
Abstract
Tohumun morfolojisi, büyüklüğü ve miktarı, nişasta granülleri ve tohumdaki protein kütleleri tohumun ağırlığını ve kalitesini belirler. Onlar tohum farklı bölgeler arasında önemli ölçüde farklıdır. Hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin morfolojilerini net bir şekilde görebilmek ve morfoloji parametrelerini nicel olarak doğru analiz edebilmek için tohum büyüklüğünde ki tüm bölüme ihtiyaç vardır. Tohum büyüklüğündeki parafin bölümü tohumlardaki depolama malzemelerinin birikimini araştırabilse de, kalın bölümün düşük çözünürlüğü nedeniyle hücrelerin ve depolama malzemelerinin morfoloji parametrelerini nicel olarak analiz etmek çok zordur. İnce rezorin bölümü yüksek çözünürlüğe sahiptir, ancak rutin rezorin kesit yöntemi büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriği ile olgun tohumların tam tohum büyüklüğünde bölümünü hazırlamak için uygun değildir. Bu çalışmada, tohum büyüklüğündeki reişin hazırlanması için basit bir kuru kesit yöntemi sayılmiyoruz. Bu teknik, lr beyaz reçine gömülü, olgun, çimlenmiş ve pişmiş tohumlar, yüksek nişasta içeriği ile büyük tohumlar için bile, çapraz ve uzunlamasına tam tohum ölçekli bölümleri hazırlayabilir. Tüm tohum büyüklüğündeki bölüm floresan parlatıcı 28, iyot ve Coomassie parlak mavi R250 ile özellikle hücrelerin morfolojisi sergilemek için, nişasta granülleri, ve protein organları açıkça, sırasıyla. Elde edilen görüntü, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin morfoloji parametrelerini göstermek için nicel olarak analiz edilebilir.
Introduction
Bitki tohumları nişasta ve protein gibi depolama malzemeleri içerir ve insanlar için enerji ve beslenme sağlar. Hücre ve depolama malzemelerinin şekli, boyutu ve miktarı tohumun ağırlığını ve kalitesini belirler. Tohum farklı bölgelerde hücreleri ve depolama malzemeleri önemli ölçüde farklı morfolojileri var, özellikle nişasta dallanma enzimIIbinhibisyonu ile bazı yüksek amylose tahıl bitkileriiçin,2,3. Bu nedenle, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin ve depolama malzemelerinin morfolojilerinin araştırılması çok önemlidir.
Parafin kesiti tüm tohum büyüklüğündeki bölümü hazırlamak için iyi bir yöntemdir ve tohumun dokuyapısını ve tohum4,5,6farklı bölgelerde depolama malzemesi birikimini sergileyebilir. Ancak, parafin kesitleri genellikle düşük çözünürlükte 6-8 μm kalınlığa sahiptir; bu nedenle hücre ve depolama malzemelerinin morfolojisini net bir şekilde gözlemlemek ve nicel olarak analiz etmek çok zordur. Rezorin kesitleri genellikle 1-2 μm kalınlığında ve yüksek çözünürlüğe sahiptir ve hücre ve depolama malzemelerinin morfolojisini gözlemlemek ve analiz etmek için çok uygundur7. Ancak, rutin rezorin kesit yöntemi, özellikle büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriği ne olursa olsun tohumlar için tüm tohum büyüklüğündeki bölümü hazırlamakta güçlük çekmiştir; bu nedenle, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin ve depolama malzemelerinin morfolojisini gözlemlemenin ve analiz etmenin bir yolu yoktur. LR Beyaz reçin bir akrilik reçine ve düşük viskozite ve güçlü geçirgenlik sergiler, tohumların reçine bölümünü n hazırlanmasında iyi uygulamalara yol açan, özellikle büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriği ile tahıl olgun çekirdekleri için. Buna ek olarak, LR Beyaz reçine gömülü örnek açıkça ışık veya floresan mikroskop altında hücrelerin ve depolama malzemelerinin morfolojisi sergilemek için birçok kimyasal boyalar ile kolayca lekeli olabilir7. Bir önceki yazımızda, LR White reçine gömülü olgun tahıl çekirdeklerinin tohum büyüklüğündeki bölümlerini hazırlamak için kuru bir kesit yöntemi bildirmiştik. Yöntem aynı zamanda gelişmekte olan, çimlenmiş ve pişmiş tahıl çekirdeği8tam tohum büyüklüğünde bölüm hazırlayabilirsiniz. Elde edilen tam tohum büyüklüğündeki bölüm mikromorfoloji gözlem ve analizinde, özellikle tohum8,9'unfarklı bölgelerindeki hücre ve depolama malzemelerinin morfoloji farklılıklarının net bir şekilde görüntülenmesi ve nicel olarak analiz edilebilmiştir.
Bu teknik, ışığın mikroskobu kullanılarak tohumun farklı bölgelerindeki doku ların mikro yapısını ve hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin şekil ve büyüklüğünü gözlemlemek isteyen araştırmacılar için uygundur. Özellikle hücreler, nişasta granülleri ve protein cisimleri sergilemek için boyanmış tam tohum büyüklüğündeki bölümlerin görüntüleri, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin morfoloji parametrelerini nicel olarak ölçmek için morfoloji analiz yazılımı ile analiz edilebilir. Teknik uygulanabilirliği ve tam tohum büyüklüğündeki kesit uygulamalarını göstermek amacıyla, bu çalışmada mısır ve yağlı tohum tecavüzünün olgun tohumlarını ve gelişen, çimlenmiş ve pişmiş pirinç çekirdeklerini araştırdık. Protokol dört işlem içerir. Burada, büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriği nedeniyle tohum büyüklüğündeki bölümlerin hazırlanmasında en zor olan olgun mısır çekirdeğini, süreçleri adım adım sergilemek için örnek olarak kullanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rezorin gömülü tohumunun hazırlanması (Şekil 1)
- 10 mL'de altı mısır olgun çekirdeğini %2,5 fosfat tamponlu glutaraldehit (0,1 M, pH7,2) 4 °C'de 48 saat boyunca sabitler. Araştırmacılar araştırma amaçlarına ve doku tiplerine göre diğer fiksatif karışımları, fiksatif konsantrasyonları ve fiksasyon koşullarını seçebilirler.
- Çekirdekleri çıkarVe keskin bir çift taraflı bıçak kullanarak 2-3 mm kalınlığında uzunlamasına veya transversyel dilimleyin ve 10 mL 2,5% fosfat-tamponlu glutdehit (0.1 M, pH 7.2) tekrar 48 saat için düzeltin.
- Numuneleri her seferinde 30 dakika boyunca 0,1 M fosfat tamponu (pH 7,2) ile üç kez yıkayın.
- Etanol sulu çözelti (10 mL) artan sınıflarda numuneleri %30'dan %50'ye, %70'ten %90'a ve 30 dakika boyunca üç kez dehydrate.
- Etanol ile seyreltilmiş LR White rezorin çözeltisinin 10 mL artırıcı kalitelerinde numunelere sızın ve her seferinde 12 saat boyunca 4 °C'de %75 ve %100 iki kez 12 saat.
- Gömmeden önce kaideleri numuneler için hazırlayın. 2 mL santrifüj tüpüne 0,25 mL %100 LR Beyaz reçine ekleyin ve 60 °C'de 48 saat polimerize edin.
- Art arda saf LR Beyaz reçine (0,5 mL) ve bir kaide ile santrifüj tüpü içine sızmış örnek ekleyin. Örnekleri anatomik iğne ile düzleştirin ve 60 °C'de bir fırında 48 saat polimerize edin.
2. Tam tohum büyüklüğünde kesit hazırlamak için kuru kesitler (Şekil 1)
- Santrifüj tüpünden gömülü çekirdekleri alın ve keskin bir bıçak kullanarak numunenin etrafındaki fazla reçineyi kesin.
- Resenin bloğunu ultramikrotom (EM UC7) numune tutucusuna kelepçele ve numunenin yüzeyinde ve numunenin etrafında ki gereksiz rezoriyi bir bıçakla kırpın.
- Tam bir bölüm oluşturulana kadar numunenin yüzeyini cam bir bıçakla ince ince parlata.
- Kesmeden önce bıçak kenarının yaklaşık 2 mm üzerine küçük bir bakır kanca koyun ve numuneyi 2 μm'lik bir keserek kesin. Kancanın rolü, bölümün yukarı doğru kıvrılmasını önlemektir.
- Bölüm uzun olduğunda onu desteklemek için bölümün altına kancayı koyun.
- Önceden işlenmemiş bir kaydıra 100°L su ekleyin ve tamamlanmış ve kırılmamış bölümü cımbızla suya dikkatlice aktarın.
- Buruşuk bölümü yumuşatmak için numuneyi bir gecede 50 °C'de düzleme masasında ısıtın ve kurutun.
- Bölüm parçalanırsa veya yırtılırsa, numunenin her reçine infiltrasyonu için süreyi 12 saatten 24 saat veya 48 saate kadar uzatın.
- Bölüm, bıçağa paralel bazı çizgilere sahipse, numune bloğunu sıkıca kenetleyin. Bölümde bıçak için dikey bazı çizgiler varsa, yeni bir bıçak kullanın.
3. Bölümün boyanma ve gözlemi
NOT: Hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin doku yapısını ve morfolojisini gözlemlemek için, araştırmanın amacına göre kesitleri belirli lekelerle lekeler. Burada, hücre duvarlarını, nişasta granüllerini ve protein cisimlerini lekelemek için floresan parlatıcı 28, iyot çözeltisi ve Coomassie parlak mavi R250 kullanıyoruz.
- Hücrelerin morfolojisini gözlemlemek için, 40 mL'lik floresan parlatıcı 28 sulu çözeltideki 40 mL'lik floresan parlatıcı 28 sulu çözeltiyi 45 °C'de 10 dakika boyunca akan suyla durulayın ve 5 dakika boyunca akan suyla durulayın. CCD kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobu altındaki bölümü gözlemleyin ve fotoğrafladı.
- Nişasta granüllerinin morfolojisini gözlemlemek için, 1 dk boyunca %25 (v/v) gliserolde %40 07 (w/v) I2 ve %0,14 (w/v) KI ile kesiti boylayın ve iyot solüsyonu içeren numuneyi coverslip ile kapatın. Örneği CCD kamera ile donatılmış bir ışık mikroskobu altında görüntüleyin ve fotoğrafla.
- Protein cisimlerinin morfolojisini gözlemlemek için, 45 °C'de 10 dakika boyunca 70 mL kompakt cam boyama kavanozunda %10 (v/v) asetik asit ile bölümü 40 mL'lik bir asit le batırın ve 40 mL'lik coomassie parlak mavi R250%25 (v/v) izopropanol ve %10 (v/v) asetik asit le 15 dk 45 C5'te boyandın. Lekeli bölümleri 5 dk akan su ile yıkayın ve kurutun. CcD kamera ile donatılmış bir ışık mikroskobu altında bölümü gözlemleyin ve fotoğrafla.
4. Morfoloji parametrelerinin nicel analizi
- Zhao ve ark.9 prosedürlerini takip eden morfoloji analiz yazılımı (Image-Pro Plus 6.0 yazılımı) kullanarak, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin alanı, uzun/kısa ekseni ve yuvarlaklığı için fotoğraflanan görüntüleri işleme ve nicel olarak analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tam tohum büyüklüğünde bir kesit elde etmek için basit kuru kesit yöntemi
LR-beyaz rezorna gömülü tohumun tam tohum büyüklüğünde bir bölümünü hazırlamak için basit bir kuru kesit yöntemi oluşturduk (Şekil 1). Bu yöntem transversal ve boylamsal tam tohum büyüklüğünde 2 μm kalınlığında kesitler hazırlayabilir(Şekil 2-5, EkŞekil 1-4). Örneğin, yağlı tohum tecavüz olgun tohum transversally ve longitudinally kesitli olabilir(Şekil 2). Tahıl bitkileri için, onların olgun çekirdekleri nişasta granülleri dolu, bu tüm tohum büyüklüğünde bölüm hazırlanmasında çok zor olduğunu lider. Bu teknik kullanılarak, büyük hacimli olgun mısırın transversal ve boylamsal tam tohum büyüklüğünde bölümleri de hazırlanabilir(Şekil 4, Ek Şekil 1). Buna ek olarak, gelişmekte olan çekirdek(Ek Şekil 2), çimlenmiş çekirdek (Ek Şekil 3), ve pişmiş çekirdek ( Ek Şekil4) pirinç yöntemi kullanılarak araştırılabilir.
Tüm tohum büyüklüğündeki bölümün uygulamaları
Tohumun doku yapısının gözlemi
Tohum büyüklüğündeki tüm bölüm tohumların doku yapısını gözlemlemek için kullanılabilir. Örneğin, yağlı tohum tecavüz embriyosu radicle, hipokotil, dolgun ve iki cotyledonoluşur. İç ve dış kotyledonlar ikiye bükülür, hipokotil ve rakülleri sarmalar ve embriyoküresel hale getirirler (Şekil 2A,C). Safranin ile boyanmış uzunlamasına ve transversal tam embriyo boyutlu bölümleri açıkça radicle, hipokotil, iç kotoyledon ve dış kotoyledon(Şekil 2B, D)sergiledi. Yağlı tohum tecavüzuzun tam embriyo boyutlu bölümü transversal bölümdaha zor hazırlanır. Bu nedenle, embriyoların transversal bölümleri yaygın referanslarembriyolarınmikromorfolojisi araştırmak için kullanılır 5,10.
Tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin morfolojisi ve analizi
Tohum büyüklüğündeki tüm bu bölüm, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin morfolojisini gözlemlemek ve analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, yağlı tohum tecavüzün transversal tam embriyo boyutlu bölümleri floresan parlatıcı 28 ile boyanmış ve hücre duvarları özellikle boyanmıştı(Şekil 3A). Embriyonun herhangi bir bölgesinde hücrelerin mikromorfolojisi yüksek büyütmede açıkça gösterilebilir (Şekil 3B,C). Rakül epiderm oluşur, korteks, ve vasküler dokular. Radicle'nin en dış tabakasında bulunan epidermal hücreler dikdörtgen ve radyal olarak düzenlenmiştir. Kortikal parankim hücreleri yuvarlak ve boyutu büyüktü. Kortikal hücreler arasında bazı ayrı boşluklar gözlendi. Kortikal hücreler içeriden dışarıya katmanlar halinde düzenlenmiştir(Şekil 3B). Cotyledon epidermal hücreleri kare ve küçük hacimli idi. İç ve dış kotoyledonların dış ve iç yüzeyleri arasında epidermal hücrelerin şekli ve büyüklüğü açısından anlamlı bir fark yoktu. Bazı vasküler silindirler iç ve dış kotoyledonların mezofil dokularının ortasına serpildi. Mezofil parankim hücreleri cotyledon'daki epidermal hücrelerden ve vasküler silindir hücrelerinden önemli ölçüde daha büyüktü. Mezofil parankim hücreleri dış kotoyledon iç bölgesinde ve iç kotoyledonun dış bölgesinde tipik bir palisading düzenlemesi gösterdi (Şekil 3C). Parankim hücrelerinin embriyonun farklı bölgelerinde önemli ölçüde farklı morfolojileri vardı. Morfolojideki farklılıklarını ortaya çıkarmak için radicle kortikal doku, iç kotoyledon iç bölgesi, iç kotoyledon dış bölgesi, dış kotoyledon iç bölgesi ve dış kotoyledon dış bölgesi sırasıyla (Şekil 3B,C) seçilmiştir. Yukarıdaki 5 bölgede bulunan parankim hücrelerinin morfoloji parametreleri morfoloji analiz yazılımı kullanılarak kantitatif olarak analiz edilmiştir(Ek Tablo 1). Parankim hücrelerinin alanı, uzun eksen uzunluğu, kısa eksen uzunluğu ve yuvarlaklığı embriyoların farklı bölgelerinde bazı farklılıklar göstermiştir.
Endospermdeki hücreler nişasta ve depolama proteini ile doluydu. Tüm tohum büyüklüğündeki rezorin bölümünü kullanarak, endospermin farklı bölgelerindeki hücreleri gözlemlemek ve analiz etmek kolaydır. Örneğin, mısır endosperminin herhangi bir bölgesindeki hücrelerin morfolojisi, transversal tam tohum büyüklüğündeki kesitler floresan parlatıcı 28 ile boyandıktan sonra net bir şekilde görülebilir. Aynı çekirdekteki periferik, orta ve santral endospermler hücrelerin önemli ölçüde farklı şekil ve boyutlarını sergilediler(Ek Şekil 1). Endospermin farklı bölgelerindeki hücrelerin morfoloji parametrelerini nicel olarak analiz edebilmek için, bölgelerin görüntüleri morfoloji analiz yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir; hücrelerin morfoloji parametreleri Ek Tablo 2'desunulmuştur. Bölge 1'deki endosperm hücreleri dört bölge arasında en küçük alana sahipti, bölge 2'dekiler bölge 3'tekilerden daha büyüktü, ancak bölge 4'tekilerden daha küçüktü.
Tohumun farklı bölgelerinde nişasta granüllerinin morfolojisi ve analizi
Özellikle tahıl ürünleri için çoğu bitki kaynağından gelen olgun tohumlar yüksek nişasta içeriği içerir. Granül morfolojisi ve nişasta nın büyüklüğü nişasta özellikleri üzerinde önemli etkilere sahiptir ve tohum kalitesinde rol oynar. Tohumun rezorin bölümü, nişasta granüllerinin tohumun farklı bölgelerindeki morfolojisini sergilemek için iyot çözeltisi ile boyanabilir. Örneğin, mısırın transversal ve boylamsal tam tohum büyüklüğündeki bölümleri başarıyla hazırlanmıştır. İyot ile boyanmış kesitler nişasta morfolojisini sergilemiş (Şekil 4). Endospermin farklı bölgelerinde nişasta granülünün morfolojisini göstermek için transversal ve uzunlamasına tam tohum büyüklüğündeki kesitlerde sırasıyla dört bölge ve dokuz bölge seçilmiştir (Şekil 4). Farklı bölgelerdeki nişasta granülleri endosperm hücrelerinde önemli ölçüde farklı morfoloji, boyut ve miktar gösterdi. Transversal kesitte, bölge 1'de küresel nişasta granülleri, 2. Uzunlamasına kesitte, 1, 4, 5 ve 8 numaralı bölgelerde poligonal şekilli nişasta granülleri 3, 7 ve 9 bölgelerinde küresel şekilli olanlara göre daha büyük, bazı bileşik nişasta granülleri ise 2 ve 6.
Transversal kesitin dört bölgesinde nişasta granüllerinin morfolojik parametrelerinin kantitatif analizi Ek Tablo 3'tegösterilmiştir . 1. bölgedeki nişasta granülleri en küçük boyuta, 2.
Tohumun farklı bölgelerindeki protein kütlelerinin mikromorfolojisi ve analizi
Yüksek depolama proteini ile tam tohum büyüklüğünde bölüm, tohumun farklı bölgelerindeki protein kütlelerinin morfolojisini analiz etmek ve örmek için kullanılabilir. Örneğin, yağlı tohum tecavüz embriyonun transversal bölümü Coomassie parlak mavi R250 ile lekelenmiş ve depolama proteini mavi ye boyanmıştı(Şekil 5). Embriyodaki depolama proteininin mekansal dağılımı düşük büyütmede açıkça gözlemlenebilir(Şekil 5A). Depolama proteini protein cisimlerinde bulunur. Yüksek büyütme de, protein gövdesi bazı siyah granüller ve bazı lekesiz şeffaf yapısı ile heterojen bir matris sergiledi(Şekil 5B). Tohumdaki protein gövdelerinin üç tipi vardır: birinci tip homojen protein matrisinden oluşur ve dahil etmez, ikinci tip küresel kristaller içerir, üçüncü tip ise küresel kristaller ve psödokristaller11içerir. Protein gövdesindeki küresel kristaller, lekeli olmayan fitat ve diğer inorganik tuzlardan oluşur. Bu küresel kristaller ışığın mikroskop altında niçin geçememesi nedeniyle siyahır. Buna ek olarak, küresel kristal kırılgan ve fiksatif ve katıştırma maddesi tarafından nüfuz edilmesi zordur. Bölümü yaparken, küresel kristaller bazen dışarı patlama, protein vücut içinde şeffaf bir boşluk sonuçlanan11. Yağlı tohum tecavüz embriyoprotein gövdesi mikromorfolojisine göre küresel kristaller içeriyordu(Şekil 5B). Embriyodaki protein kütlelerinin mekansal dağılımını araştırmak için, tam embriyo büyüklüğündeki bölümdeki beş bölge, radicle kortikal dokuyu, iç kotoledon iç bölgesini, iç kotyledon dış bölgesini, dış kotolüdon iç bölgesini ve dış kotyledon dış bölgesini temsil etmek üzere seçilmiştir (Şekil 5A,C-G). Embriyonun tüm bölgelerindeki protein cisimleri küresel, elipsoidal ve düzensiz şekilliidi(Şekil 5C-G).
Yukarıdaki seçilen beş bölgede epidermise yakın birinci ve ikinci yatan parankim hücrelerinde protein kuruluşlarının nicel analizi Ek Tablo 4'tesunulmuştur. Protein gövdesinin alanı seçilen beş bölge arasında küçük bir fark vardı. Protein gövdesinin yuvarlaklığı dış kotoyledin dış bölgesinde diğer dört bölgeye göre anlamlı olarak daha düşüktü, dış kotoyledondaki protein gövdesi küreye yakın olduğunu gösteriyordu. Hücredeki protein gövdesinin sayısı ve alan indeksi rakülli parankim hücresinde cotyledon parankim hücresine göre anlamlı olarak yüksekti(Ek Tablo 4).
Şekil 1: Kuru kesit yöntemi ile tam tohum büyüklüğünde reçine yarı ince kesitinin hazırlanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yağlı tohum tecavüz çeşitli Huashuang 5 olgun tohum embriyo doku yapısı. (A) Embriyomorfolojisi. (B) Uzunlamasına tam boyutlu bölümün doku yapısı. (C) Transversal tam embriyo büyüklüğündeki bölümün morfolojisi. (D) Transversal tam embriyo büyüklüğündeki bölümün doku yapısı. Bölümler safranin ile boyanmıştı. H, hipokotil; IC, iç kotoyledon; OC, dış kotoyledon; R, radicle. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yağlı tohum tecavüz çeşitli Huashuang 5 embriyo hücrelerinin morfolojisi. (A) Floresan parlatıcı 28 ile boyanmış transversal tam embriyo büyüklüğünde kesit. (B) Radicle'nin hücre morfolojisini ve doku yapısını gösteren B in(A)bölgesinin amplifikasyonu. (C) İç ve dış kotoyledin hücre morfolojisini ve doku yapısını gösteren C in (A)bölgesinin amplifikasyonu. Ölçek çubuğu = 500 μm için (A) ve 100 μm için (B,C). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mısır çeşidi zheng 58 olgun çekirdek nişasta granülmorfolojisi. Transversal (A) ve boylamsal (B)bütün tohum büyüklüğündeki kesitler iyot çözeltisi ile boyanmışve bölgesel amplifikasyonlar endospermin farklı bölgelerinde nişasta granüllerinin morfolojisini sergilemektedir. Ölçek çubuğu = Tam tohum büyüklüğünde bölüm için 1 mm ve bölgesel amplifikasyonlar için 20 m. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yağlı tohum tecavüz çeşitli Huashuang 5 embriyo protein organlarının morfolojisi. (A) Transversal tam embriyo büyüklüğünde bölüm Coomassie parlak mavi R250 ile boyanmış. (B) Protein kütlelerinin amplifikasyonu, mikro yapılarını gösterir. (C-G) C-G in(A)bölgesinin amplifikasyonu , radicle protein gövdesinin morfolojisini gösteren (C), iç kotoyledonun iç bölgesi (D), iç kotoyledonun dış bölgesi (E), dış kotyledonun iç bölgesi (F), iç kotyledondış bölgesi (G). Ölçek çubuğu = 500 μm için (A), 5 μm için (B) ve 50 μm için (C-G). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Madde Şekil 1: Mısır çeşidi zheng 58 olgun çekirdek hücrelerinin morfolojisi. Transversal tam tohum büyüklüğündeki kesit floresan parlatıcı 28 ile boyanmıştır ve bölgesel amplifikasyonları (1-4) endospermin farklı bölgelerindeki endosperm hücrelerinin morfolojisini sergilemektedir. Ölçek çubuğu = tam tohum büyüklüğünde bölüm için 1 mm ve bölgesel amplifikasyonlar için 100 m. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Madde Şekil 2: Pirinç çeşidini 9311 çekirdek geliştirme morfolojisi. Çiçeklendikten sonra farklı günlerde transversal tam tohum büyüklüğünde ki kesitler (DAF) safranin O ve iyot çözeltisi ile karşılandı. Ölçek çubuğu = 0,5 mm. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: Pirinç çeşidini te-qing çimlenmiş çekirdek morfolojisi. Imbibition sonra 8 gün uzunlamasına tam tohum büyüklüğünde bölüm periyodik asit-Schiff ve toluidin mavi O ile counterstained oldu, ve bölgesel amplifikasyonlar tohum farklı bölgelerde endosperm morfoloji değişiklikleri sergiler. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Madde Şekil 4: Pirinç çeşidiTe pişmiş çekirdeğin morfolojisi Te-qing. Transversal tam tohum büyüklüğündeki kesit iyot çözeltisi ile boyanmıştır ve dış, orta ve iç bölge amplifikasyonları 0, 10, 20 ve 30 dk.'lık pişirme işlemi sırasında tohumdaki nişasta granüllerinin morfoloji değişikliklerini sergiler. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Tablo 1: Yağlı tohum tecavüz embriyo farklı bölgelerde hücrelerin morfoloji parametreleribu tabloyu indirmek için tıklayınız.
bir Veriler standart sapmalar(n = 3) ± anlamına gelir ve aynı sütundaki farklı harflerle değerler önemli ölçüde farklıdır(p < 0.05).
b Bölgeler Şekil 3B,C'degösterilmiştir.
c LAL: uzun eksen uzunluğu; SAL: kısa eksen uzunluğu; Yuvarlaklık: (çevre 2)/(4×π×alan).
Ek Tablo 2: Mısır ın farklı bölgelerindeki hücrelerin morfoloji parametreleriendosperm a Bu tabloyu indirmek için tıklayınız.
bir Veri standart sapmalar(n = 3) ± anlamına gelir. Farklı harflerle aynı sütundaki değerler önemli ölçüde farklıdır(p < 0.05).
b Bölgeler, Ek Şekil 1'demısır çekirdeğinin transversal bölümünde gösterilmiştir.
c LAL: uzun eksen uzunluğu; SAL: kısa eksen uzunluğu; Yuvarlaklık: (çevre 2)/(4×π×alan).
Ek Tablo 3: Mısır endosperm farklı bölgelerde nişasta granüllerinin morfoloji parametreleria Bu tabloyu indirmek için tıklayınız.
bir Veri standart sapmalar(n = 3) ± anlamına gelir. Farklı harflerle aynı sütundaki değerler önemli ölçüde farklıdır(p < 0.05).
b Bölgeler Şekil 4A'damısır çekirdeğinin transversal bölümünde gösterilmiştir.
c LAL: uzun eksen uzunluğu; SAL: kısa eksen uzunluğu; Yuvarlaklık: (çevre 2)/(4×π×alan).
Ek Tablo 4: Yağlı tohum tecavüz embriyo farklı bölgelerde protein organlarının morfoloji parametreleribu tabloyu indirmek için tıklayınız.
bir Veriler standart sapmalar(n = 3) ± anlamına gelir ve aynı sütundaki farklı harflerle değerler önemli ölçüde farklıdır(p < 0.05).
b Bölgeler Şekil 5'tegösterilmiştir.
c Yuvarlaklık: (çevre 2)/(4×π×alan); Alan indeksi protein gövdesinin hücreye oranıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tohumlar gıda, yem ve endüstriyel hammadde için en önemli yenilenebilir kaynak, ve nişasta ve protein gibi depolama malzemeleri açısından zengindir. Hücrelerin morfolojisi ve miktarı ile depolama malzemelerinin içeriği ve konfigürasyonu tohumların ağırlığını ve kalitesini etkiler7,12. Stereoloji ve görüntü analizi teknolojisi bir doku bölgesindeki hücrelerin boyutunu ve miktarını ölçebilse de, pek çok laboratuvarda eksiktir. Parafin ve rezorin bölümleri iki boyutlu (2D) bir resim vererek, hücrelerin gerçek boyutunu ve miktarını analiz etmenin hiçbir yolunu vermez. Ancak, hücreler herhangi bir düzlemde rasgele kesilir, doku bölgesinin en az üç farklı bölümünden birçok hücrenin ortalama boyutu (100'den fazla) hücrelerin 2B morfoloji parametrelerini (uzunluk, genişlik ve alan) yansıtabilir ve seçilen bölge alanının hücre alanının hücre miktarını yansıtabileceği anlamına oranı yansıtabilir. Bu nedenle, tohum farklı bölgelerde hücre ve depolama malzemelerinin morfolojisi yerinde görüntüleme ve analiz için çok önemlidir. Parafin bölümü, özellikle büyük boyutlu tohumlar için tam tohum büyüklüğünde bölüm hazırlamak için en uygun7. Ancak, hücreler tohum gelişimi ile depolama malzemeleri dolu, geç gelişen tohum ve olgun tohumlar iyi tam tohum büyüklüğünde bölüm elde etmek çok zor olduğunu yol açan. Buna ek olarak, parafin bölümü morfolojisini açıkça sergilemek için çok kalın, ve sadece tohum doku yapısını araştırmak için uygundur7.
Rekros bölümü ince ve hücrelerin morfolojisi sergileyebilir, nişasta granülleri, ve protein organları açıkça7. Ancak, rutin reşin tam tohum büyüklüğünde bölüm için uygun değildir. Burada sunulan teknik, kanaate gömülü olgun tohumların transversal ve boylamsal tam tohum büyüklüğündeki bölümlerinin hazırlanmasına yönelik hızlı, basit ve keskin bir yaklaşımı temsil eder ve ışığın mikroskobu kullanılarak tohumun farklı bölgelerindeki nişasta granülleri ve protein gövdelerinin morfolojisini görüntülemek için(Şekil 2-5,EkŞekil 1). Buna ek olarak, teknik aynı zamanda gelişmekte olan, çimlenmiş ve pişmiş tohumlar bölümünü yerinde hücre, nişasta ve protein cisimlerinin farklı tohum bölgelerindeki morfoloji değişikliklerini araştırmak için hazırlayabilir.
Bu tekniğin sağladığı bir diğer belirgin avantaj da tam tohum boyutunda bölümlerin uygulanmasıdır. Fenomik ve metabolomik yeni dönemde, kantitatif tohumfarklı bölgelerde hücrelerin, nişasta granülleri ve protein organlarının morfoloji parametrelerini ölçmek için önemlidir. Yeni teknik, morfoloji analiz yazılımı ile birlikte, araştırmacı kantitatif hücre, nişasta granülleri ve protein organları nın tohum farklı bölgelerde morfoloji parametrelerini analiz sağlar(Ek Tablo 1-4).
Mevcut kuru kesit yöntemi tüm tohum büyüklüğündeki reçine bölümünü başarıyla hazırlayabilse de, bazı sınırlamaları ve eksiklikleri vardır. Parafin bölümü için, parafin bölümden kolayca çıkarılabilir; ancak rezorin bölümü için rezorin bölümden çıkarılamaz ve rezorna gömülü bitki örneğine yol açan bir bölüm. Bu nedenle, parafin bölümü ile karşılaştırıldığında, mevcut tam tohum büyüklüğünde rezorin bölümü histokimya ve immünohistokimya yürütmek için uygun değildir. Buna ek olarak, rutin rezorin kesit yöntemi küçük hacimli numune bloğu nedeniyle örnekleri 0,5-2 μm pürüzsüz kesebilir. Ancak mevcut kuru kesit yöntemi, özellikle büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriğine sahip olgun tohumlar için, kalınlığı 2 μm'den az olan pürüzsüz kesitleri hazırlamak zordur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Finansman Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32071927), Yangzhou Üniversitesi Yetenek Projesi ve Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
- Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
- Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
- Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).
- Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
- Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8 (2020).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
- Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
- Lott, J. N. A. Protein bodies in seeds. Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).
- Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).
