Summary
Här presenteras ett protokoll för en fluorescensavbildningsmetod, multiplex immunofluorescerande cell-baserad detektion av DNA, RNA och protein (MICDDRP), en metod som kan samtidig fluorescens encellsvisualisering av viralt protein och nukleinsyror av olika typ och stränghet. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på ett brett spektrum av system.
Abstract
Att fånga de dynamiska replikerings- och monteringsprocesserna för virus har hindrats av bristen på robusta in situ-hybridiseringstekniker (ISH) som möjliggör känslig och samtidig märkning av viral nukleinsyra och protein. Konventionella DNA-fluorescens in situ hybridiseringsmetoder (FISH) är ofta inte kompatibla med immunfärgning. Vi har därför utvecklat en avbildningsmetod, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), som möjliggör samtidig encellsvisualisering av DNA, RNA och protein. Jämfört med konventionell DNA FISH använder micddrp grenad DNA (bDNA) ISH-teknik, vilket dramatiskt förbättrar oligonukleotidsondkänsligheten och detektionen. Små modifieringar av MICDDRP möjliggör avbildning av virala proteiner samtidigt med nukleinsyror (RNA eller DNA) med olika stränghet. Vi har tillämpat dessa protokoll för att studera livscyklerna för flera virala patogener, inklusive humant immunbristvirus (HIV)-1, humant T-lymfotropt virus (HTLV)-1, hepatit B-virus (HBV), hepatit C-virus (HCV), Zika-virus (ZKV) och influensa A-virus (IAV). Vi visade att vi effektivt kan märka virala nukleinsyror och proteiner över ett brett spektrum av virus. Dessa studier kan ge oss förbättrad mekanistisk förståelse av flera virala system och dessutom fungera som en mall för tillämpning av multiplexerad fluorescensavbildning av DNA, RNA och protein över ett brett spektrum av cellulära system.
Introduction
Medan tusentals kommersiella antikroppar är tillgängliga för att specifikt märka proteiner via konventionella immunfärgningsmetoder, och medan fusionsproteiner kan konstrueras med fotooptimerade fluorescerande taggar för att spåra flera proteiner i ett prov1, är mikroskopisk visualisering av protein ofta inte kompatibel med konventionell DNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH)2 . Tekniska begränsningar i samtidig visualisering av DNA, RNA och protein med hjälp av fluorescensbaserade metoder har hindrat fördjupad förståelse av virusreplikation. Spårning av både viral nukleinsyra och protein under infektionsförloppet gör det möjligt för virologer att visualisera grundläggande processer som ligger under virusreplikation och montering 3,4,5,6.
Vi har utvecklat en avbildningsmetod, multiplex immunofluorescent cell-baserad detektion av DNA, RNA och Protein (MICDDRP)3, som använder grenat DNA (bDNA) in situ-teknik för att förbättra känsligheten för nukleinsyradetektering 7,8,9 . Dessutom använder denna metod parade sonder för förbättrad specificitet. bDNA-sekvensspecifika sonder använder förgreningsförförstärkare och förstärkar-DNA för att producera en intensiv och lokaliserad signal, vilket förbättrar tidigare hybridiseringsmetoder som förlitade sig på att rikta in sig på upprepade regioner i DNA9. Infekterade celler i ett kliniskt sammanhang innehåller ofta inte rikligt med viralt genetiskt material, vilket ger en vara för en känslig metod för fluorescerande nukleinsyradetektering i diagnostiska miljöer. Kommersialiseringen av bDNA-teknik genom tillvägagångssätt som RNAscope7 och ViewRNA10 har fyllt denna nisch. Känsligheten hos bDNA-fluorescensavbildning har också viktig nytta i cellbiologi, vilket möjliggör detektion av knappa nukleinsyraarter i cellodlingsmodeller. Den stora förbättringen av känsligheten gör bDNA-baserade avbildningsmetoder lämpliga för att studera virus. En potentiell brist är dock att dessa metoder fokuserar på att visualisera RNA eller RNA och protein. Alla replikerande celler och många virus har DNA-genom eller bildar DNA under sin replikationscykel, vilket gör metoder som kan avbilda både RNA och DNA, såväl som protein, mycket önskvärda.
I MICDDRP-protokollet utför vi bDNA FISH för detektion av viral nukleinsyra med hjälp av RNAscope-metoden, med modifieringar7. En av de viktigaste modifieringarna av detta protokoll är optimering av proteasbehandling efter kemisk fixering. Proteasbehandling underlättar avlägsnande av proteiner bundna till nukleinsyra för att förbättra sondhybridiseringseffektiviteten. Protasbehandling följs av inkubation med grenade oligonukleotidsonder. Efter applicering av bDNA-sond tvättas prover och inkuberas därefter med signalförförstärkare och förstärkar-DNA. Multiplexerad in situ-hybridisering (ISH), märkning av flera genmål, kräver målprober med olika färgkanaler för spektraldifferentiering7. Inkubation med DNA-förstärkare följs av immunofluorescens (IF).
bDNA ISH ger förbättringar av signal-till-brus genom förstärkning av målspecifika signaler, med en minskning till bakgrundsbrus från icke-specifika hybridiseringshändelser 7,11. Målprober är utformade med hjälp av program som är allmänt tillgängliga och som förutsäger sannolikheten för icke-specifika hybridiseringshändelser, samt beräknar smälttemperatur (Tm) för sondmålhybriden 7,11. Målprober innehåller en 18- till 25-basregion som kompletterar mål-DNA / RNA-sekvensen, en distanssekvens och en 14-bas svanssekvens. Ett par målprober, var och en med en distinkt svanssekvens, hybridiseras till ett målområde (som sträcker sig över ~ 50 baser). De två svanssekvenserna bildar ett hybridiseringsställe för förförstärkarproberna, som innehåller 20 bindningsställen för förstärkarsonderna, som dessutom innehåller 20 bindningsställen för etikettsonden. Som ett exempel riktas en kilobas (kb) region på nukleinsyramolekylen av 20 sondpar, vilket skapar en molekylär ställning för sekventiell hybridisering med förförstärkaren, förstärkaren och etikettsonden. Detta kan således leda till ett teoretiskt utbyte på 8000 fluorescerande etiketter per nukleinsyramolekyl, vilket möjliggör detektion av enskilda molekyler och stora förbättringar jämfört med konventionella FISH-metoder7 (se figur 1A för schematisk för bDNA-signalförstärkning). Om du vill ställa in sonder för multiplexerad ISH måste varje målsond finnas i en annan färgkanal (C1, C2 eller C3). Dessa målprober med olika färgkanaler har distinkta 14-bassvanssekvenser. Dessa svanssekvenser kommer att binda distinkta signalförstärkare med olika fluorescerande sonder, vilket möjliggör enkel spektral differentiering över flera mål. I det presenterade protokollet, tabell 4 i steg 9, ges ytterligare information om fluorescerande märkning av målprober. Dessutom ger figur 2 och figur 3 exempel på hur vi valde lämplig förstärkare 4-FL (A, B eller C) (fluorescerande sond och det sista hybridiseringssteget) för att uppnå specifik fluorescerande märkning av flera virala nukleinsyramål efter HIV-1- och HTLV-1-infektioner.
Vi har demonstrerat flera tillämpningar av samtidig fluorescensvisualisering av RNA, DNA och proteiner och observerat kritiska stadier av virusreplikation med hög spatiotemporal upplösning 3,4,5. Till exempel har samtidig encellsvisualisering av viralt RNA, cytoplasmatiskt och nukleärt DNA och protein gjort det möjligt för oss att visualisera viktiga händelser under HIV-1-infektion, inklusive följande RNA-innehållande kärnor i cytoplasman före kärninträde och integration av proviralt DNA3. Dessutom har vi tillämpat MICDDRP för att karakterisera effekterna av värdfaktorer och läkemedelsbehandling på virusinfektion och replikation 4,5. I Ukah et al., spårade vi reaktivering av HIV-1-transkription i latenscellmodeller behandlade med olika latens-reverserande medel för att visualisera HIV-transkription och latensomvandling4. Dessutom kan MICDDRP tillåta oss att visualisera fenotypiska förändringar associerade med antiviral hämning som tillskrivs småmolekylbehandling eller värdfaktorbegränsning. Som ett bevis på konceptet för robustheten och den breda tillämpligheten av vårt tillvägagångssätt har vi visat att vi kan använda modifieringar av vårt protokoll för att effektivt märka viral nukleinsyra för att följa infektion inte bara i humant immunbristvirus (HIV) -1, utan också humant T-lymfotropt virus (HTLV) -1, hepatit B-virus (HBV), hepatit C-virus (HCV), Zikavirus (ZIKV) och influensa A-virus (IAV). Eftersom HIV-1-livscykeln består av både viralt DNA och RNA-arter har vi utfört majoriteten av vår optimering av MICDDRP efter HIV-1-replikationskinetik. Men dessutom har vi visat att vi kan spåra syntes av olika virala RNA-transkript av endera eller båda sense (+) och antisense (-) stränglighet i virus som ZIKV, IAV, HBV och HCV för att övervaka viral transkription och replikation 3,4,5,6. Studierna syftar till att förbättra den mekanistiska förståelsen av flera virala processer och fungera som en riktlinje för att implementera denna fluorescensavbildningsteknik till ett brett spektrum av cellulära modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fröceller (suspension vs. vidhäftande celler) på täckglas eller kammarglas (protokoll som presenteras använder täckblad).
- Sädning av suspensionsceller
- Förbered poly-D-lysin (PDL) belagda täckglas (underlättar vidhäftning av suspensionsceller till täckglas) genom att först inkubera täckglas i etanol (EtOH) i 5 minuter (steriliserar täckglas och tar bort eventuella rester). Tvätta sedan 2x i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innan du inkuberar täckglas i PDL (20 μg/ml) i 30 minuter (min) vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort PDL och tvätta 2x i PBS. Pelletsceller (tidigare infekterade/behandlade baserat på önskade avbildningsförhållanden) och återsuspendera 106celler i 50 μL PBS. Spot 50 μL celler på glas (PDL-belagd) och inkubera vid RT i 30 min.
- Sädning av vidhäftande celler
- Odlingsceller på steril täckskiva placerad i 6-brunnsskål och infekterar celler med viruspartiklar eller behandlar med förening av intresse. Låt cellerna nå 50-70% sammanflöde före provberedning för avbildningsexperiment.
2. Cellulär fixering: För att bevara cellulär morfologi för fluorescensavbildningsstudier
OBS: Förvara 4% PFA och PBS vid RT i minst 30 minuter före cellulär fixering.
- Aspirera cellmediet, tvätta celler på täckglas 3x i PBS och fixa celler i 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 min. Aspirera PFA och tvätta celler i PBS 2x.
OBS: Celler kan nu dehydreras och lagras om experimenten vill återuppta experimentet på ett annat datum. Fasta celler kan dehydreras i EtOH före lagring.- Ta bort PBS efter tvätt efter cellulär fixering och ersätt med 500 μL 50% EtOH (v / v i vatten). Inkubera vid RT i 5 min.
- Ta bort 50% EtOH och ersätt med 500 μL 70% EtOH. Inkubera vid RT i 5 min.
- Ta bort 70% EtOH och ersätt med 500 μL 100% EtOH. Inkubera vid RT i 5 min.
- Ta bort 100% EtOH och ersätt med färsk 100% EtOH.
OBS: Uttorkade celler kan förvaras vid -20 °C i 6 månader. Försegla plattor med tejp eller parafilm före förvaring för att förhindra avdunstning av EtOH. - Rehydrera celler för att gå vidare till multiplexerad fluorescensmärkning av celler / virus.
- Ta bort 100% EtOH och ersätt med 500 μL 70% EtOH. Inkubera vid RT i 2 min.
OBS: Låt inte cellerna torka ut när som helst. Använd alltid tillräckligt med lösning för att sänka ner alla celler. - Ta bort 70% EtOH och ersätt med 500 μL 50% EtOH. Inkubera vid RT i 2 min.
- Ta bort 50% EtOH och ersätt med 1x PBS.
OBS: Förbered proteasutspädning, hybridiseringsprober och tvättbuffert före proteasbehandling (steg 4) och applicering av målsond (steg 5). Specifika instruktioner för beredning av reagens presenteras i början av respektive steg.
| Reagenser | Övriga noteringar |
| Proteas lösning | Förbered dig i 1X PBS |
| Måloligonukletodiesond(er) | Späd i hybridiseringsbuffert |
| Tvätta buffert | Tvättar enligt målhybridiseringsstegen |
| Hybridisering buffert | Recept som presenteras i tabell 3 |
Tabell 1: Viktiga reagenser i MICDDRP-protokollet.
3. Cellpermeabilisering: Ökar åtkomsten till cellen och cellulära organeller för inträde av stora molekyler (antikroppar, nukleinsyrahybridiseringsprober)
- Ta bort 1x PBS efter cellulär fixering eller rehydrering och ersätt med 500 μL 0,1% (v / v) Tween-20 i 1x PBS. Inkubera vid RT i 10 min. Byt ut en efter en. Tvätta en gång med 500 μL 1x PBS och tillsätt färsk 1x PBS.
4. Coverslip immobilisering på glasskiva och proteasbehandling för att avlägsna nukleinsyrabindande proteiner från fast viral / cellulär nukleinsyra för att förbättra hybridiseringseffektiviteten
OBS: Förbered den utspädda Protease III -lösningen (se detaljer om reagens i materialtabellen) under cellulär permeabilisering. Låt proteas nå RT i 10 min före permeabilisering.
- Placera en liten droppe nagellack på en steriliserad glasskiva. Torka ryggen (sida utan cellskikt) och placera kanten på täckglaset på nagellacksdroppen, med sidan med de vidhäftade cellerna uppåt. Tillsätt några droppar PBS på den immobiliserade täckglaset för att förhindra torkning.
- Rita en cirkel (cirka 3 mm från täckglaset) runt omkretsen av täckglaset som nu fästs på bilden med hydrofob barriärpenna (vattenavvisande penna som håller reagenser lokaliserade på celler).
- Späd proteas III i 1x PBS (100 μl/täckglas).
OBS: Proteaskoncentrationen kan behöva justeras beroende på skillnader i celltyper, sonder eller målnukleinsyra genom empirisk optimering (se diskussion). För den mest effektiva RNA/DNA-märkningen över olika virussystem hade vi framgång med följande utspädningar som presenteras i tabell 2 nedan med utspädningar från (1 till 2)-(1 till 15) (proteas till 1x PBS).
| Sondmål | Proteasutspädning i 1X PBS (proteas III till 1X PBS) |
| HIV-1 DNA / RNA | 1 till 5 |
| HTLV-1 DNA/RNA | 1 till 5 |
| HBV pgRNA och totalt HBV-RNA | 1 till 15 |
| IAV-RNA | 1 till 15 |
| ZIKV RNA | 1 till 2 |
Tabell 2: Protease III-utspädningar i PBS för viral nukleinsyrahybridisering.
- Dekantera 1x PBS på täckglaset efter immobilisering och applicera den utspädda protesen III.
- Inkubera i en fuktad ugn vid 40 °C i 15 min.
- Dekantproteaslösning och nedsänkningsglas i 1x PBS. Agitera med en gungskål i 2 min vid RT. Upprepa tvätten med nya 1x PBS.
- För endast DNA-detektion, tvätta proverna tre gånger med nukleasfritt vatten i 2 minuter vardera, följt av inkubation med 5 mg/ml RNas A utspätt i PBS i 30 min vid 37 °C.
- Dekantera RNase En lösning och tvätta 3x i 2 min med ultrarent vatten. Fortsätt med ISH för målsond(er).
OBS: Hybridiseringsbuffert förbättrar vDNA-detektion utan att påverka vRNA-färgningseffektiviteten för de presenterade resultaten (representativa resultat). Späd DNA-kanal 1 (C1) sonder 1: 1 med hybridiseringssond. Späd RNA C2- och C3-sonder i hybridiseringsbuffert. De C2- och C3-sonder som används i våra avbildningsstudier finns i 50X-lösningar (1:50; målsond till hybridiseringsbuffert).
- Förbered hybridiseringsbuffert i nukleasfritt vatten enligt steg-för-steg-proceduren nedan:
- Tillsätt 700 μl nukleasfritt vatten i ett 15 ml rör, 300 μl 50 % (vikt/volym (w/v)) dextransulfat, 300 μl 5 M NaCl, 125 μL 200 mM natriumcitrat (pH 6,2) och 375 mg (pulver) etylenkarbonat.
- Blanda väl med en virvel för att lösa upp etylenkarbonat (se till att allt pulver är upplöst och klar lösning).
- Tillsätt 25 μl 10 % (volym/volym (v/v)) Tween-20 och tillräckligt med nukleasfritt vatten för att slutföra 2,5 ml (2x lösning).
OBS: Receptet för den presenterade hybridiseringsbufferten finns i tabell 3 nedan. Lösningen är stabil i en vecka. Se till att Tween-20 tvättmedel blandas tillräckligt, samtidigt som du är noga med att förhindra bubblande lösning.
| Reagens | Lagerkoncentration | Ytterligare anmärkningar |
| Nukleasfritt vatten | NA | |
| Dextran sulfat | 50 % (vikt/volym) | Mycket viskös |
| Koksalt | 5 miljoner | |
| Natriumcitrat (pH 6,2) | 200 mM | Förvaras vid 4 °C |
| Etylenkarbonat | NA | Pulver |
| Tween-20 | 10 % (v/v) |
Tabell 3: Hybridiseringsbuffertförteckning över reagenser.
5. Inkubation med DNA / RNA-målhybridiseringsprober: Måloligonukleotidprober binder till regioner av intresse, vilket skapar en molekylär ställning för förförstärkare, förstärkare och fluorescerande sonder att binda.
OBS: Värm DNA / RNA-sonder vid 40 ° C i 10 minuter (under cellpermeabilisering) och svalna till RT i minst 10 minuter, om ingen RNase-behandling ingår. Om RNas-behandling eller ytterligare provbehandling behövs före målsondhybridisering, varma sonder i enlighet därmed. Snurra ner C2- och C3-sonder efter uppvärmning och späd i hybridiseringsbuffert. Efter utspädning kan C2- och C3-sonder värmas kort. Varm 50x tvättbuffert (se materialtabell för mer information) vid 40 °C i 10-20 min och späd till 1x i molekylärbiologiskt vatten.
- Inkubera 200 μl av hybridiseringsbufferten vid 67 °C i 10 minuter före tillsats av hybridiseringssonder. Späd sond i hybridiseringsbuffert (recept listat i tabell 2). Tillsätt 50 μl/täckglas.
- Inkubera i fuktad ugn vid 40 °C i 2 timmar (h). Dekantera sonder och nedsänkta bilder i 1x tvättbuffert. Agitera genom att gunga skålen i 2 min vid RT. Upprepa tvätten med ny 1x tvättbuffert.
6. Förstärkare (Amp) 1-FL Hybridisering: Tillsats av förförstärkare som är komplementär till svanssekvensen för mål-DNA / RNA-sonderna (steg 5)
OBS: Förstärkare bör vara på RT före användning. Få ut varje enskild förstärkare ur kylen 30 min före användning och låt stå på bänken vid RT.
- Ta bort glidbanor från 1x tvättbuffert och knacka / absorbera för att ta bort överflödig vätska.
- Tillsätt 1 droppe Amp 1-FL på täckglaset. Inkubera i fuktad ugn vid 40 °C i 30 min.
- Dekantera Amp 1-FL och sänk ner i 1x tvättbuffert. Agitera genom att gunga skålen 2 min vid RT. Upprepa tvätten med ny 1x tvättbuffert.
7. Amp 2-FL Hybridisering: Inkubation med signalförstärkare med kognatigenkänningssekvens till förförstärkare (Amp 1-FL)
- Ta bort glidbanor från 1x tvättbuffert och knacka / absorbera för att ta bort överflödig vätska.
- Tillsätt 1 droppe Amp 2-FL på täckglaset. Inkubera i fuktad ugn vid 40 °C i 15 min.
- Dekantera Amp 2-FL och sänk ner i 1x tvättbuffert. Agitera genom att gunga skålen 2 min vid RT. Upprepa tvätten med ny 1x tvättbuffert.
8. Amp 3-FL Hybridisering: Inkubation med andra signalförstärkare
- Ta bort glidbanor från 1x tvättbuffert och knacka / absorbera för att ta bort överflödig vätska.
- Tillsätt 1 droppe Amp 3-FL på täckglaset. Inkubera i fuktad ugn vid 40 °C i 30 min.
- Dekantera Amp 3-FL och sänk ner i 1x tvättbuffert. Agitera genom att gunga skålen 2 min vid RT. Upprepa tvätten med ny 1x tvättbuffert.
9. Amp 4-FL Hybridisering: Fluorescerande etikett och slutligt hybridiseringssteg
OBS: Se först tabell 4 för att välja lämplig Amp 4 (A, B eller C) - FL baserat på kanalerna för målsonden/målsonden. Bedöm vad Amp 4-FL behövs för att märka DNA / RNA av intresse. Ett exempel ges i tabellen nedan:
| A | B | C | |
| DNA-kanal 1 (C1) | 488 | 550 | 550 |
| DNA/RNA-kanal 2 (C2) | 550 | 488 | 647 |
| RNA-kanal 3 (C3) | 647 | 647 | 488 |
Tabell 4: Val av ampere 4 (A, B eller C)-FL fluorescerande sond för multiplexerad ISH.
OBS: För multiplexerad FISK (flera mål) är det viktigt att välja rätt Amp 4 (A, B eller C) - FL för att korrekt märka ditt mål av intresse. Målprober (steg 5) har olika färgkanaler (C1, C2 eller C3), som dikterar deras respektive fluorescerande etikett (Alexa 488, Atto 550 eller Alexa 647), baserat på den valda Amp 4-FL. Exempel på att välja fluoroforkombinationer för multiplexerad avbildning finns i legenderna i figur 2 och figur 3. Som ett ytterligare exempel kommer urval av Amp 4B-FL selektivt att märka DNA C1-sonder med Atto 550- och RNA C3-sonder med Alexa 647.
- Ta bort glidbanor från 1x tvättbuffert och knacka / absorbera för att ta bort överflödig vätska.
- Tillsätt 1 droppe Amp 4-FL på täckglaset. Inkubera i fuktad ugn vid 40 °C i 15 min.
OBS: Efter steg 9.2, håll proverna täckta, skyddade från ljuset. - Dekantera Amp 4-FL och sänk ner i 1x tvättbuffert. Agitera genom att gunga skålen i 2 min vid RT. Upprepa tvätten med ny 1x tvättbuffert. Tvätta med 1x PBS (2 min) och förvara i PBS.
10. Proteinimmunfärgning: Att märka protein (er) av intresse
- Dekantera PBS och tillsätt 200 μL blockerande buffert (1% w / v BSA, 10% v / v FBS i PBS med 0,1% v / v Tween-20 (PBST)) till täckglaset. Inkubera 1 h vid RT.
- Dekantblockera buffert och applicera 200 μl primär antikropp utspädd i PBST + 1% w/v BSA. Inkubera 1 h vid RT.
- Tvätta rutschkanan två gånger med PBST i 10 min vid RT med skakning.
- Applicera valfri sekundär antikropp i 1 h vid RT i PBST + 1% w/v BSA.
- Tvätta rutschkanan med PBST i 10 min vid RT med skakning.
11. Kärnfärgning: Motfärgningskärnor efter immunfärgning
- Dekantera PBST och applicera DAPI eller kärnfläck efter eget val i 1 min vid RT.
- Tvätta bilden två gånger med PBS i 10 min vid RT med skakning.
12. Montering
- Placera 1 droppe antifidlösning (t.ex. förläng guld) på ny steril glasskiva (Rengör först bilden med EtOH och låt torka för att säkerställa att inga rester finns på glas). Med samma spets sprider du antifidlösningsdroppen för att täcka ett område ungefär lika stort som täckglaset.
OBS: Antifade-lösningen är mycket viskös och kan vara svår att pipettera. Att skära av spetsen från en 200 μL spets före pipettering kan mildra dessa problem. - Ta bort täckglas med cellprov från bilden och sänk ner i PBS för att ta bort kvarvarande nagellack på baksidan med pincett och PBS. Torra tångar och baksidan av täckglaset med en Kimwipe.
- Försiktigt inbäddat täckglas i droppen av antifadlösning, placera provsidan (sida med cellskikt) av täckglas på droppe).
- Låt proverna torka över natten.
13. Bildbehandling
- Bild med ett epifluorescerande mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett schema över MICDDRP visas i figur 1. Märkning av DNA och RNA följs av immunfärgning. Användningen av förgreningsförstärkare ökar signalen, vilket möjliggör detektering av enstaka nukleinsyramolekyler.
Bild 1: Schematisk bild av MICDDRP och steg-för-steg-arbetsflöde. (A) bDNA-signalen förstärks via förgreningsförstärkare och förstärkar-DNA för att förbättra detektionen av viralt DNA (1) och RNA-arter (2). Oligonukleotidprober hybridiseras i par (ZZ i schematisk) till mål av intresse, vilket skapar en byggnadsställning för förförstärkare (Amp 1-FL, steg 6 i protokollet), förstärkare (Amp 2- & 3-FL) och fluorescerande sonder (Amp 4, steg 9 i protokollet). Se tabell 4 för att välja lämplig Amp 4 (A, B eller C) -FL för multiplexerad ISH. Märkning av nukleinsyra följs av immunfärgningsproteiner av intresse (3). (B) Tretton huvudsteg i MICDDRP-protokollet med uppskattning av tidslängden för respektive steg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tillämpning av MICDDRP för att studera förloppet av HIV-1-infektion har varit ett användbart verktyg för att spåra viral replikationskinetik i primära celler. Som ett bevis på konceptet för denna procedur märks HIV-1 DNA, RNA och protein samtidigt och visualiseras mikroskopiskt på encellsnivå (figur 2). Två HIV-1 DNA-genom visualiseras i en enda cell, eftersom de aktivt transkriberar viralt RNA (vRNA). vRNA har exporterats genom kärnporkomplexet och viralt protein syntetiseras i cytoplasman.
Figur 2: MICDDRP för primära mononukleära blodceller (PMBC) infekterade med HIV-1. PMBC infekterade med HIV-1 (NL4.3) vid en mångfald av infektion (MOI) på 2. Cellerna fixerades 48 timmar efter infektion (hpi). (A) HIV-1 bDNA FISH-sond (märkt med ATTO 550; röd i figur). Denna avsökning hybridiserar till mallen (3'<—5') vDNA-sträng för att förhindra överhörning med känsla (+) vRNA. (B) Unspliced HIV-1 RNA (märkt med Alexa 647; grön i figur). HIV-1 vRNA-sonden hybridiserar till virala transkript transkriberade i 5'->3' orientering. (C) Immunfärgning av HIV-1 kapsid (p24) protein (sekundär antikropp konjugerad till Alexa 488; vit i figur). (D) Sammanfogad bild. Skalstrecket representerar 5 μm. Kärnor färgades med DAPI (blå). För att märka HIV-1 DNA (DNA C1-sond) med ATTO 550 respektive HIV-1 RNA (RNA C3-sond) med Alexa 647 inkuberades prover med Amp 4-FL 'B' (Se tabell 4 i protokollet för att välja lämpliga kanalfärger för hybridiseringsprober). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Dessutom har vi utfört dual viral DNA (vDNA) och vRNA-färgning för att följa HTLV-1-infektion. För optimering av nukleinsyramärkningen följde vi nära vDNA / VRNA-färgningsproceduren som utvecklats för multiplexerad fluorescensavbildning av HIV-infektion. Vi har visat att vi specifikt kan märka HTLV-1 DNA och RNA samtidigt.
Figur 3: Samtidig märkning av HTLV-1 vDNA och vRNA i MT-2-celler. (A) HTLV-1 vDNA (märkt med ATTO 550; röd i figur) (B) Unspliced HTLV-1 sense (+) RNA (RNA C2-sond & märkt med Alexa 488; grön i figur)). (C) HTLV-1 HBZ antisense (-) vRNA (RNA C3-sond & (märkt med Alexa 647; vit i figur)). (D) Sammanfogad bild. Skalstrecket representerar 20 μm. Kärnor färgades med DAPI (blå). Amp 4-FL 'B' användes (se tabell 4 i protokollet) för att uppnå multiplexerad märkning av HTLV-1 ('+' & '-') RNA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kontrollera experiment för att bedöma målsondens specificitet och bakgrund. Specificiteten hos HIV-1- och HTLV-1-målsonder bedömdes efter infektion i lymfocytiska cellinjer (oinfekterade Jurkat T-celler, HTLV-1-infekterade celler (MT2) och HIV-1-infekterade celler (H9111B)). Skalstänger representerar 10 μm. (A) Celler behandlades med HTLV-1 RNA-sonder. (B) Celler behandlades med HIV-1 (+) RNA-sond (C-D). Ytterligare demonstration av specificiteten hos HTLV-1-sonder utan korsreaktivitet med HIV-1. Vita pilar i figur 4C betecknar HTLV-1 DNA (rött). (E-F). vRNA-färgning (grön) +/- RNas-behandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att verifiera hybridiseringsprobernas specificitet och för att bedöma hur ISH-märkningsmetoden påverkar proteinfärgningseffektiviteten och den övergripande bakgrunden, utför vi kritiska kontroller för att säkerställa högsta nivå av noggrannhet och reproducerbarhet för experimenten. Som ett exempel, i figur 4A-D, verifierar vi specificiteten hos våra HIV-1 och HTLV-1 vDNA- och vRNA-sonder, eftersom vi visar mycket liten eller ingen korsreaktivitet mellan sonduppsättningarna över de två virusen. Trots märkning av två retrovirus med potential för sondkorsreaktivitet är HIV-1-sonderna endast specifika för HIV-1-genetiskt material och inte HTLV-1. Samma trend gäller för HTLV-1-sonderna. Dessutom visar vi i figur 4F att vi kan eliminera vRNA-färgning om vi RNas-behandlar våra celler under provberedningen. För att bedöma möjligheten att dämpa proteinfärgningseffektiviteten på grund av ISH (proteasbehandling (steg 4 i protokoll och figur 1B) och hybridiseringsförhållanden, vilket kan leda till ablation av epitopigenkänning eller ökad bakgrundssignal, visar vi att proteinfärgningseffektiviteten för kärnfläckmarkören, sc-35, är jämförbar med konventionella IF-metoder och immunfärgning under MICDDRP-protokollet. I det konventionella IF-protokollet permeabiliserades cellerna med 0,1% Triton X-100 i 15 minuter, snarare än permeabilisering med 0,1% Tween-20 i 10 minuter, vilket används i MICDDRP-protokollet (steg 3 i protokoll och arbetsflöde i figur 1B). Proteinfärgning över båda tillstånden (IF vs. MICDDRP) producerade en signal flera storleksordningar större än kontrollen (MICDDRP utan primär antikropp), vilket ytterligare visar den låga bakgrunden som genereras efter detta protokoll och bevarande av proteinepitoper för effektiv immunfärgning. Bildkvantifiering av genomsnittlig integrerad fluorescensintensitet för sc-35-signal per cell (figur 5E) utfördes som tidigare beskrivits3. För alla visade bildresultat säkerställde vi sond- och antikroppsspecificitet, samt bedömde eventuella störningar eller högre bakgrundsbrus än normalt som tillskrivs vår ISH-metod.
Figur 5: Jämförelse av proteinfärgningseffektivitet efter konventionell IF jämfört med MICDDRP. Det cellulära proteinet, sc-35, en biomarkör för kärnspeckles, immunbesudlades i Jurkat T-celler. Alla skalstänger representerar 10 μm. (A) Oinfekterade Jurkat T-celler genomgick MICDDRP-protokollet och behandlades med HIV-1 DNA / RNA-hybridiseringsprober som används i figur 2 & figur 4 ovan. Under immunfärgning tillsattes ingen primär antikropp. (B). Oinfekterade Jurkat T-celler genomgick konventionell IF, märkning sc-35 (vit). Cellerna permeabiliserades med 0,1% Triton X-100 i 15 minuter. (C). MICDDRP utfördes på HIV-infekterade Jurkat T-celler. vRNA är märkt grönt, vDNA är rött och sc-35 är vitt. (D). Närbild av vRNA, vDNA och proteinmärkning (sc-35) i HIV-infekterade celler. (E) Kvantifiering av genomsnittlig integrerad fluorescenssignal per cell i sc-35 under olika immunfärgningsförhållanden. Y-axeln är på en logaritmisk skala. Den streckade linjen representerar bakgrundssignalen från oinfekterade celler som genomgick MICDDRP-protokollet där ingen primär antikropp tillsattes. Ingen signifikant skillnad i signal efter MICDDRP jämfört med konventionell IF. Över 500 celler provtogs för kvantifiering för att nå respektive tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Denna metod kan också tillämpas för att studera RNA-virus som kan eller inte kan inkludera DNA-mallar för viral replikation. Till exempel kan strängspecifika bDNA-sonder utformas för att övervaka uttryck av känsla (+) eller antisense (-) sträng-RNA och olika vRNA-arter i virus som HBV, HCV, IAV och ZIKV. Visualiseringen av olika RNA-arter under infektionsförloppet kan ge insikt i replikationskinetiken hos olika virussystem.
Efter tidsförloppet för HBV-infektion kan vi se att mängden HBV-pre-genomiskt RNA (pgRNA) och totalt HBV-RNA ökar som en funktion av tiden. Dessutom immunstämde vi samtidigt en cellulär värdfaktor, MOV10 (figur 6).
Bild 6: HBV. Tidsförlopp för HBV-infektion av 3E8-celler. Celler infekterades med 300 HBV-genom per cell. Viral replikation visas vid tre tidpunkter (24, 48 och 72 hpi). pgRNA (märkt med ATTO 550; rött i figur), totalt HBV-RNA (märkt med Alexa 647; grönt i figur) och MOV10 (sekundär antikropp konjugerad till Alexa 488; vit i figur). Kärnor är färgade med DAPI i blått. Skalfältet på sammanslagna bilder representerar 10 μm. hpi, timmar efter infektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Avbildning utfördes via konfokalmikroskopi med hjälp av ett 60x oljedoppningsmål. Våglängderna för excitations- / emissionsbandpass som används för att upptäcka DAPI, Alexa 488, ATTO 550 och Alexa 647 var inställda på 405/420-480, 488/505-550, 550/560-610 respektive 647/655-705 nm (figur 7, figur 8 respektive figur 9).
Figur 7: Tidsförlopp för HCV-infektion av Huh-7.5.1-celler. Huh-7.5.1-celler infekterades med hepatit C-virus (HCV) Jc1 / Gluc2A vid en MOI på 0,5. Vid de angivna tidsintervallen fixerades cellerna och sonderades sekventiellt för känsla (+) vRNA, antisense (-) vRNA och NS5A (HCV-protein). Kärnor färgades med DAPI. Representativa sammanslagna bilder från varje tidpunkt, som visar (+) RNA i grönt (märkt med Alexa 647) (-) RNA i rött (märkt med Atto 555), NS5A i vitt (sekundär get anti-mus konjugerad till Alexa 488) och kärnor i blått. Skalstänger representerar 10 μm. De nedre bilderna förstoras utklippta från motsvarande tidpunkt. HPI, timmar efter infektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Strängspecifik bDNA FISH och immunfärgning av A549-celler infekterade med influensa A-virus. A549-celler infekterade med PR8 Flu A-virus fixerades och undersöktes för (A) IAV-nukleoprotein (NP) RNA (märkt med Alexa 488; grönt i figur) och (B) IAV-polymerasprotein (PB1) (sekundär get-antimus Atto 550; röd i figur) och kärnor färgades med DAPI (blå). (C) Sammanfogad bild. Skalstrecket representerar 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Strängspecifik bDNA FISH i zikavirusinfekterade celler (ZIKV). Vero-celler infekterades med ZIKV vid en MOI på 0,1. Cellerna fixerades till 48 hpi. (A) Celler färgades samtidigt för känsla (+) vRNA (märkt med Alexa 488; grön i figur) och antisense (-) vRNA (märkt med Atto 550; röd i figur). Kärnor färgades med DAPI. I (A) betecknar den vita rutan ett område med både (+) och (-) vRNA. Insatserna presenterar en närbild av (+) vRNA (grönt) och de knappare (-) vRNA-arterna (röd). (B) känsla (+) vRNA (grön). (C) antisens (-) vRNA (röd). Skalstrecket i (A) representerar 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samtidig visualisering av RNA, DNA och protein kräver ofta omfattande optimering. Två vanliga metoder är 5-etynyl-2-deoxiuridin (EdU) märkning och DNA FISH. EdU-märkning har tillämpats för att visualisera viralt DNA och protein samtidigt, eftersom EdU införlivas i begynnande DNA och därefter märks med azidinnehållande fluorescerande färgämnen via klickkemi. EdU-märkning kan således användas för att övervaka infödd virusreplikationskinetik av DNA-virus eller virus med DNA-mallar för replikering12. En brist med EdU-märkning är dock att i delande celler kommer det replikerande genomet att införliva EdU, vilket genererar hög bakgrund och förvirrande bildanalys. DNA FISH kan kringgå dessa problem genom att direkt hybridisera en nukleinsyrasond till respektive mål oavsett cellcykel. Konventionell FISH förlitade sig emellertid ofta på höga temperaturer för att uppnå effektiv sondhybridisering, vilket hindrar immunfärgning eller till och med samtidig RNA-färgning13. MICDDRP kan potentiellt kringgå dessa problem och tillhandahålla robust samtidig fluorescerande märkning av DNA, RNA och protein i en mängd olika cellulära system.
Även om vi har visat att vi kan märka protein och nukleinsyra samtidigt med vårt MICDDRP-protokoll, behövdes optimering i olika system. Den första stora parametern som vi var tvungna att optimera var proteasbehandling. Vi varierade proteas III-koncentrationen över förhållandena. Optimering av proteasbehandling var empirisk, eftersom vi använde olika utspädningar för att bedöma vad som gav den största hybridiseringseffektiviteten, utan att kompromissa med immunfärgningseffektiviteten. Lämpliga kontroller utfördes sida vid sida för att bedöma sondspecificitet och förändringar i proteinfärgningseffektiviteten som tillskrivs proteasbehandling. Nästa stora parametrar som behövde optimeras var sonddesign och sondhybridisering.
Korrekt utformning av infångnings- och förstärkarprober är avgörande för att uppnå känsligheten och specificiteten hos bDNA-tekniken. Programvarupaket som förutsäger sannolikheten för icke-specifika hybridiseringshändelser är tillgängliga för att förbättra sonddesignen 7,11. bDNA-sonder med tillhörande förförstärkare, förstärkare och fluorescerande etikettprober kan nu köpas kommersiellt för att säkerställa kompatibilitet med bDNA-bildsatser. Användare kan förse tillverkare med sekvensinformation (~ 300-1000 baspar) för målregionen (erna) i form av en fasta-fil (textbaserat format för att representera nukleotidsekvens). Målprober genereras med > 90% sekvenshomologi till den medföljande sekvensen.
För DNA-märkning har vi funnit att utspädning av sonderna i hybridiseringsbufferten som beskrivs i steg 5 i protokollet förbättrar DNA-hybridiseringen. Vid märkning av både DNA och RNA kan RNA-sonden spädas ut i hybridiseringsbufferten. DNA-märkning i frånvaro av RNas kan inte utesluta möjligheten att den observerade nukleinsyran innefattar RNA av den riktade strängningen. Temperaturen kan också behöva justeras för att förbättra hybridiseringseffektiviteten. Ökande temperatur kan påverka proteinfärgningseffektiviteten, eftersom ökade temperaturer kan främja proteindenaturering, vilket ablerar epitopigenkänning av den primära antikroppen. I våra presenterade representativa data har vi utfört ISH vid 40 °C.
Jämfört med konventionell DNA FISH ger micddrp en förbättrad procedur för att samtidigt märka DNA, RNA och protein för att visualisera via fluorescensmikroskopi. En potentiell begränsning är att valet av sond kan påverka effektiviteten av hybridisering och förmågan att kvantitativt jämföra data mellan sonder. Detta protokoll har varit effektivt över olika cellulära och virala system i våra händer med endast mindre optimering som behövs under olika förhållanden. De senaste högprofilerade publikationerna har använt vårt tillvägagångssätt för att studera HIV-integrationsplatsval14 och HIV-omvänd transkriptionskinetik15. Framtida tillämpningar av MICDDRP kan inkludera visualisering av virala nukleinsyror samtidigt med nukleinsyrasekvenser av specifika cellulära gener och cellulära proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes helt eller delvis av National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 och U54 AI150472). Vi tackar Dr. Raymond F. Schinazi och Sadie Amichai för att tillhandahålla celler infekterade med influensa A-virus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
- Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
- Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
- Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
- Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
- Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
- Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).
