Summary
ここで紹介するのは、蛍光イメージングアプローチのためのプロトコルであり、DNA、RNA、およびpロテイン(MICDDRP)の究極の蛍光immuno蛍光c ellベースのデテクションであり、異なるタイプおよび鎖数のウイルスタンパク質および核酸の同時蛍光単一細胞可視化を可能にする方法である。このアプローチは、さまざまなシステムに適用できます。
Abstract
ウイルスの動的な複製および組み立てプロセスのキャプチャは、ウイルスの核酸とタンパク質の高感度かつ同時標識を可能にする堅牢なin situハイブリダイゼーション(ISH)技術の欠如によって妨げられてきました。従来のDNA蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法は、多くの場合、免疫染色に適合しません。そこで、DNA、RNA、タンパク質のシングルセル同時可視化を可能にするイメージングアプローチMICDDRP(DNA、R NA、PROTEINの究極の蛍光cELベースのデテクション)を開発しました。従来のDNA FISHと比較して、MICDDRPは分岐DNA(bDNA)ISH技術を利用しており、オリゴヌクレオチドプローブの感度と検出を劇的に向上させます。MICDDRPの小さな修飾により、異なる鎖の核酸(RNAまたはDNA)と同時にウイルスタンパク質のイメージングが可能になります。これらのプロトコルを適用して、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)-1、ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)-1、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、ジカウイルス(ZKV)、インフルエンザAウイルス(IAV)など、複数のウイルス病原体のライフサイクルを研究しています。私たちは、さまざまなウイルスのウイルス核酸とタンパク質を効率的に標識できることを実証しました。これらの研究は、複数のウイルスシステムの機構的理解を向上させることができ、さらに、幅広い細胞系にわたるDNA、RNA、およびタンパク質のマルチプレックス蛍光イメージングのアプリケーションのためのテンプレートとして役立ちます。
Introduction
従来の免疫染色法でタンパク質を特異的に標識するために何千もの市販抗体が利用可能であり、融合タンパク質はサンプル中の複数のタンパク質を追跡するために光最適化蛍光タグで操作できますが1、タンパク質の顕微鏡的可視化は、従来のDNA蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)2と互換性がないことがよくあります。.蛍光ベースのアプローチを使用したDNA、RNA、およびタンパク質の同時視覚化の技術的限界は、ウイルス複製の深い理解を妨げてきました。感染の過程でウイルス核酸とタンパク質の両方を追跡することで、ウイルス学者はウイルスの複製と組み立ての根底にある基本的なプロセスを視覚化することができます3,4,5,6。
我々は、D NA、RNA、およびPロテイン(MICDDRP)3の究極の蛍光イメージングアプローチを開発し、分岐DNA(bDNA)をin situ技術を利用して核酸検出の感度を向上させました7,8,9。.さらに、この方法では、特異性を高めるためにペアプローブを利用します。bDNA配列特異的プローブは、分岐プリアンプおよびアンプDNAを使用して強烈で局在的なシグナルを生成し、DNAの反復領域を標的とすることに依存していた以前のハイブリダイゼーション法を改良します9。臨床現場での感染細胞は、ウイルス遺伝物質を豊富に含まないことが多く、診断現場での蛍光核酸検出のための高感度な方法のための商品を提供します。RNAスコープ7やViewRNA10などのアプローチによるbDNA技術の商業化は、このニッチを埋めました。bDNA蛍光イメージングの感度は、細胞生物学においても重要な有用性を有し、細胞培養モデルにおける希少な核酸種の検出を可能にします。感度の大幅な向上により、bDNAベースのイメージング法はウイルスの研究に適しています。ただし、潜在的な欠点は、これらの方法がRNAまたはRNAとタンパク質の視覚化に重点を置いていることです。すべての複製細胞と多くのウイルスは、複製サイクル中にDNAゲノムを持っているか、DNAを形成するため、RNAとDNAの両方、およびタンパク質をイメージングできる方法が非常に望まれています。
MICDDRPプロトコルでは、RNAスコープ法を使用してウイルス核酸を検出するためのbDNA FISHを実行し、修正7を行います。このプロトコルの主な変更の1つは、化学的固定後のプロテアーゼ処理の最適化です。プロテアーゼ処理は、核酸に結合したタンパク質の除去を容易にし、プローブハイブリダイゼーション効率を向上させます。プロテアーゼ処理に続いて、分岐オリゴヌクレオチドプローブとのインキュベーションを行います。bDNAプローブの適用後、サンプルを洗浄し、シグナルプリアンプおよびアンプDNAとともにインキュベートします。マルチプレックスin situハイブリダイゼーション(ISH)、複数の遺伝子標的の標識には、スペクトル分化のために異なるカラーチャネルを有するターゲットプローブが必要である7。DNAアンプによるインキュベーションの後に免疫蛍光(IF)が続きます。
bDNA ISHは、非特異的ハイブリダイゼーションイベントからのバックグラウンドノイズを低減しながら、標的特異的シグナルの増幅によってシグナル対ノイズの改善をもたらします7,11。ターゲットプローブは、非特異的ハイブリダイゼーション事象の確率を予測するとともに、プローブ−ターゲットハイブリッド7、11の融解温度(Tm)を計算する公に入手可能なソフトウェアプログラムを用いて設計される。ターゲットプローブは、ターゲットDNA/RNA配列に相補的な18〜25塩基の領域、スペーサー配列、および14塩基のテール配列を含む。それぞれ異なるテール配列を持つ一対のターゲットプローブは、標的領域(~50塩基に及ぶ)にハイブリダイズします。2つのテール配列は、プレアンププローブのためのハイブリダイゼーション部位を形成し、これは、増幅器プローブのための20の結合部位を含み、さらに、ラベルプローブのための20の結合部位を含む。一例として、核酸分子上の1キロ塩基(kb)領域を20個のプローブ対で標的とし、プリアンプ、アンプ、およびラベルプローブとのシーケンシャルハイブリダイゼーションのための分子足場を作成します。したがって、これにより、核酸分子あたり8000個の蛍光標識の理論収率が得られ、単一分子の検出が可能になり、従来のFISHアプローチ7(bDNAシグナル増幅の概略図については図1Aを参照)よりも大幅に改善されます。多重化ISH用のプローブを設定するには、各ターゲットプローブが異なるカラーチャンネル(C1、C2、またはC3)にある必要があります。異なるカラーチャンネルを持つこれらのターゲットプローブは、異なる14塩基のテールシーケンスを持っています。これらのテール配列は、異なるシグナル増幅器を異なる蛍光プローブと結合させるため、複数のターゲット間でのスペクトル微分が容易になります。提示されたプロトコルにおいて、ステップ9の表4は、標的プローブを蛍光標識することに関するさらなる情報を提供する。さらに、図2および図3は、HIV-1およびHTLV-1感染後に複数のウイルス核酸標的の特異的蛍光標識を達成するために、適切なAmplifier 4-FL(A、B、またはC)(蛍光プローブおよび最終ハイブリダイゼーションステップ)をどのように選択したかの例を示しています。
RNA、DNA、タンパク質の同時蛍光可視化のいくつかのアプリケーションを実証し、ウイルス複製の重要な段階を高い時空間分解能で観察しました3,4,5。例えば、ウイルスRNA、細胞質および核DNA、およびタンパク質の同時単一細胞可視化により、核侵入前の細胞質内のコアを含むRNAの追跡やプロウイルスDNA3の統合など、HIV-1感染中の重要なイベントを視覚化することができました。さらに、ウイルス感染と複製に対する宿主因子と薬物治療の効果を特徴付けるためにMICDDRPを適用しました4,5。Ukahらでは、HIV転写と潜時反転を視覚化するために、さまざまな潜伏反転剤で処理された潜伏細胞モデルにおけるHIV-1転写の再活性化を追跡しました4。さらに、MICDDRPにより、低分子処理や宿主因子の制限に起因する抗ウイルス阻害に関連する表現型の変化を視覚化することができます。私たちのアプローチの堅牢性と幅広い適用性の概念実証として、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)-1だけでなく、ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)-1、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)にも感染を追跡するためにウイルス核酸を効率的に標識するためにプロトコルの変更を使用できることを実証しました。 ジカウイルス(ZIKV)、およびインフルエンザAウイルス(IAV)。HIV-1のライフサイクルはウイルスDNAとRNA種の両方で構成されているため、HIV-1複製動態に続いてMICDDRPの最適化の大部分を実行しました。しかし、それに加えて、ZIKV、IAV、HBV、HCVなどのウイルスにおけるセンス(+)およびアンチセンス(-)鎖のいずれかまたは両方の異なるウイルスRNA転写物の合成を追跡して、ウイルスの転写と複製をモニターできることを実証しました3,4,5,6。この研究は、いくつかのウイルスプロセスの機構的理解を向上させ、この蛍光イメージング技術を幅広い細胞モデルに実装するためのガイドラインとして機能することを目的としています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.カバーガラスまたはチャンバースライド上のシード細胞(懸濁細胞 と 接着細胞)(提示されたプロトコルはカバースリップを使用します)。
- 浮遊細胞の播種
- 最初にカバースリップをエタノール(EtOH)中で5分間インキュベートすることにより、ポリ-D-リジン(PDL)コーティングされたカバーガラスを準備します(カバーガラスを滅菌し、残留物を除去します)。次に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄してから、カバーガラスをPDL(20 μg/mL)で室温(RT)で30分間(分)インキュベートします。
- PDLを取り外し、PBSで2回洗浄します。細胞をペレット化し(以前に感染/所望のイメージング条件に基づいて処理)、106細胞を50 μLのPBSに再懸濁します。50 μLの細胞をガラス(PDLコーティング)上にスポットし、RTで30分間インキュベートします。
- 接着細胞の播種
- 6ウェルディッシュに入れた滅菌カバーガラスで細胞を培養し、細胞をウイルス粒子で感染させるか、目的の化合物で処理します。イメージング実験用のサンプル調製の前に、細胞が50〜70%のコンフルエンシーに達するようにします。
2.細胞固定:蛍光イメージング研究のための細胞形態の保存
注意: 細胞固定の前に、4%PFAおよびPBSを少なくとも30分間RTに保ちます。
- 細胞培地を吸引し、カバーガラスで細胞をPBSで3回洗浄し、細胞を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で30分間固定します。PFAを吸引し、PBSで細胞を2倍洗浄します。
注:実験者が別の日に実験を再開したい場合、細胞を脱水して保存できるようになりました。固定された細胞は、保存前にEtOH中で脱水することができる。- 細胞固定後の洗浄後にPBSを除去し、500 μLの50%EtOH(水中v/v)と交換します。RTで5分間インキュベートします。
- 50%EtOHを除去し、500 μLの70%EtOHと交換します。RTで5分間インキュベートします。
- 70%のEtOHを除去し、500 μLの100%EtOHと交換します。RTで5分間インキュベートします。
- 100%EtOHを取り除き、新しい100%EtOHと交換します。
注:脱水細胞は-20°Cで6か月間保存できます。EtOHの蒸発を防ぐために、保管前にテープまたはパラフィルムでプレートを密封してください。 - 細胞をリハイドレートして、細胞/ウイルスのマルチプレックス蛍光標識に移行します。
- 100%EtOHを除去し、500 μLの70%EtOHと交換します。RTで2分間インキュベートします。
注意: 細胞を乾燥させないでください。すべてのセルを水没させるのに十分な溶液を常に使用してください。 - 70%EtOHを除去し、500 μLの50%EtOHと交換します。RTで2分間インキュベートします。
- 50%のEtOHを取り除き、1x PBSと交換します。
注:プロテアーゼ処理(ステップ4)およびターゲットプローブ塗布(ステップ5)の前に、プロテアーゼ希釈、ハイブリダイゼーションプローブ、および洗浄バッファーを準備してください。試薬調製に関する具体的な指示は、各ステップの冒頭に示されています。
| 試薬 | その他情報 |
| プロテアーゼ溶液 | 1X PBSで準備する |
| ターゲットオリゴヌクルトーディープローブ | ハイブリダイゼーションバッファーで希釈 |
| 洗浄バッファー | ターゲットハイブリダイゼーションステップに続く洗浄 |
| ハイブリダイゼーションバッファー | 表3に示すレシピ |
表1:MICDDRPプロトコルの主要な試薬。
3.細胞透過処理:大きな分子(抗体、核酸ハイブリダイゼーションプローブ)の侵入のための細胞および細胞小器官へのアクセスを増加させます
- 細胞固定または再水和後に1x PBSを除去し、1x PBS中の0.1%(v/v)Tween-20の500 μLと交換します。RTで10分間インキュベートします。1つずつ交換してください。500 μLの1x PBSで1回洗浄し、新鮮な1x PBSを追加します。
4. スライドガラスへのカバーガラス固定化と、固定されたウイルス/細胞核酸から核酸結合タンパク質を除去してハイブリダイゼーション効率を向上させるプロテアーゼ処理
注:細胞透過処理中に希釈されたプロテアーゼIII( 材料の表の試薬の詳細を参照)溶液を調製します。透過処理前にプロテアーゼを10分間RTに到達させます。
- 滅菌したスライドガラスの上に少量のマニキュアを置きます。背中(細胞層のない側)を乾かし、カバーガラスの端をマニキュア液滴の上に置き、接着した細胞のある側を上に向けてください。乾燥を防ぐために、固定されたカバーガラスにPBSを数滴加えます。
- スライドに接着したカバーガラスの周囲に、疎水性バリアペン(試薬を細胞に局在させる撥水ペン)を使用して、カバーガラスの周囲に円(カバーガラスから約3 mm離して)を描きます。
- プロテアーゼIIIを1x PBS(100 μL/カバーガラス)で希釈します。
注:プロテアーゼ濃度は、経験的最適化により、細胞の種類、プローブ、または標的核酸の違いに応じて調整する必要がある場合があります(「説明」を参照 )。異なるウイルス系にわたる最も効率的なRNA/DNA標識のために、以下の表2に示す希釈液で、(1〜 2 )〜(1〜15)の範囲の希釈(プロテアーゼから1x PBS)で成功しました。
| プローブターゲット | 1X PBSでのプロテアーゼ希釈(プロテアーゼIIIから1X PBS) |
| HIV-1 DNA/RNA | 1 から 5 |
| HTLV-1 DNA/RNA | 1 から 5 |
| HBV pgRNA および総 HBV RNA | 1 から 15 |
| IAV RNA | 1 から 15 |
| ジクヴRNA細胞 | 1 から 2 |
表2:ウイルス核酸ハイブリダイゼーションのためのPBS中のプロテアーゼIII希釈。
- 固定化後のカバーガラスに1x PBSをデカントし、希釈したプロテアーゼIIIを適用します。
- 40°Cの加湿オーブンで15分間インキュベートします。
- プロテアーゼ溶液をデカントし、スライドを1x PBSに沈めます。RTで2分間ロッキングディッシュで攪拌し、新しい1xPBSで洗浄を繰り返します。
- DNA検出 のみ を行うには、サンプルをヌクレアーゼフリー水で3回2分間洗浄した後、PBSで希釈した5 mg/mL RNase Aで37°Cで30分間インキュベートします。
- RNase A溶液をデカントし、超純水で2分間3回洗浄します。ターゲットプローブのISHに進みます。
注:ハイブリダイゼーションバッファーは、提示された結果のvRNA染色効率に影響を与えることなくvDNA検出を改善します(代表的な結果)。DNAチャンネル1(C1)プローブをハイブリダイゼーションプローブで1:1に希釈します。RNA C2およびC3プローブをハイブリダイゼーションバッファーで希釈します。イメージング研究で使用したC2およびC3プローブは、50X溶液(1:50、ターゲットプローブからハイブリダイゼーションバッファー ) に入っています。
- 以下の手順に従って、ヌクレアーゼフリー水中でハイブリダイゼーションバッファーを調製します。
- 15 mLチューブに、700 μLのヌクレアーゼ自由水、300 μLの50%(重量/容量(w/v))デキストラン硫酸、300 μLの5 M NaCl、125 μLの200 mMクエン酸ナトリウム(pH 6.2)、および375 mg(粉末)のエチレンカーボネートを加えます。
- 渦を使用してよく混合し、エチレンカーボネートを溶解します(すべての粉末が溶解し、透明な溶液であることを確認してください)。
- 25 μLの10%(容量/容量(v/v))Tween-20と、2.5 mL(2x溶液)を完成させるのに十分なヌクレアーゼフリー水を加えます。
注:提示されたハイブリダイゼーションバッファーのレシピは、以下の 表3 に記載されています。解決策は一週間安定しています。Tween-20洗剤を十分に混合し、溶液の泡立ちを防ぐように注意してください。
| 試薬 | 在庫濃度 | 追記 |
| ヌクレアーゼフリー水 | 該当なし | |
| デキストラン硫酸塩 | 50% (有価) | 非常に粘性が高い |
| 塩化ナトリウム | 5メートル | |
| クエン酸ナトリウム(pH 6.2) | 200ミリメートル | 4°Cで保存 |
| エチレンカーボネート | 該当なし | 粉 |
| トゥイーン-20 | 10% (V/V) |
表3:試薬のハイブリダイゼーションバッファーリスト。
5. DNA/RNAターゲットハイブリダイゼーションプローブとのインキュベーション:ターゲットオリゴヌクレオチドプローブは目的の領域に結合し、プリアンプ、アンプ、および蛍光プローブが結合するための分子足場を作成します。
注:DNA/RNAプローブを40°Cで10分間温め(細胞透過処理中)、RNase処理が含まれていない場合はRTまで少なくとも10分間冷却します。ターゲットプローブハイブリダイゼーションの前にRNase処理またはさらなるサンプル処理が必要な場合は、それに応じてプローブを温めます。加温後にC2およびC3プローブをスピンダウンし、ハイブリダイゼーションバッファーで希釈します。希釈後、C2およびC3プローブを短時間温めることができます。50倍の洗浄バッファー(詳細については 材料の表 を参照)を40°Cで10〜20分間温め、分子生物学グレードの水で1倍に希釈します。
- ハイブリダイゼーションプローブを添加する前に、200 μLのハイブリダイゼーションバッファーを67°Cで10分間インキュベートします。ハイブリダイゼーションバッファー中でプローブを希釈する(表 2に列挙するレシピ)。50 μL/カバーガラスを追加します。
- 加湿オーブンで40°Cで2時間(h)インキュベートします。プローブをデカントし、スライドを1倍の洗浄バッファーに沈めます。RTで2分間ロッキングディッシュで攪拌し、新しい1x洗浄バッファーで洗浄を繰り返します。
6. アンプ(Amp)1-FLハイブリダイゼーション:ターゲットDNA/RNAプローブのテール配列に相補的なプリアンプの追加(ステップ5)
注意: アンプは使用前にRTになっている必要があります。使用の30分前に冷蔵庫から個々のアンプを取り出し、RTのベンチに置いておきます。
- 1x洗浄バッファーからスライドを取り出し、タップ/吸収して余分な液体を取り除きます。
- カバーガラスにAmp 1-FLを1滴加えます。加湿オーブンで40°Cで30分間インキュベートします。
- アンプ1-FLをデカントし、1x洗浄バッファーに浸します。RTで2分間ロッキングディッシュで攪拌し、新しい1x洗浄バッファーで洗浄を繰り返します。
7. アンプ2-FLハイブリダイゼーション:同族認識シーケンスを備えた信号アンプとプリアンプ(Amp 1-FL)とのインキュベーション
- 1x洗浄バッファーからスライドを取り出し、タップ/吸収して余分な液体を取り除きます。
- カバーガラスにAmp 2-FLを1滴加えます。加湿オーブンで40°Cで15分間インキュベートします。
- アンプ2-FLをデカントし、1x洗浄バッファーに浸します。RTで2分間ロッキングディッシュで攪拌し、新しい1x洗浄バッファーで洗浄を繰り返します。
8. アンプ3-FLハイブリダイゼーション:2番目の信号増幅器とのインキュベーション
- 1x洗浄バッファーからスライドを取り出し、タップ/吸収して余分な液体を取り除きます。
- カバーガラスにAmp 3-FLを1滴加えます。加湿オーブンで40°Cで30分間インキュベートします。
- アンプ3-FLをデカントし、1x洗浄バッファーに浸します。RTで2分間ロッキングディッシュで攪拌し、新しい1x洗浄バッファーで洗浄を繰り返します。
9. Amp 4-FLハイブリダイゼーション:蛍光標識と最終ハイブリダイゼーションステップ
注:まず、表4を参照して、ターゲットプローブのチャンネルに基づいて適切なアンプ4(A、B、またはC)-FLを選択してください。目的のDNA/RNAを標識するために必要なAmp 4-FLを評価します。以下の表に例を示します。
| ある | B | C | |
| DNA チャネル 1 (C1) | 488 | 550 | 550 |
| DNA/RNA チャンネル 2 (C2) | 550 | 488 | 647 |
| RNAチャネル3(C3) | 647 | 647 | 488 |
表4:マルチプレックスISH用のAmp 4(A、B、またはC)-FL蛍光プローブの選択。
注意: マルチプレックスFISH(複数のターゲット)の場合、適切なアンプ4(A、B、またはC)-FLを選択することは、目的のターゲットに適切にラベルを付けるために重要です。ターゲットプローブ(ステップ5)には異なるカラーチャンネル(C1、C2、またはC3)があり、選択したAmp 4-FLに基づいて、それぞれの蛍光標識(Alexa 488、Atto 550、またはAlexa 647)を決定します。マルチプレックスイメージング用の蛍光色素の組み合わせを選択する例は、図 2 および 図3の凡例に記載されています。追加の例として、Amp 4B-FLを選択すると、DNA C1プローブをAtto 550で、RNA C3プローブをAlexa 647で選択的に標識します。
- 1x洗浄バッファーからスライドを取り出し、タップ/吸収して余分な液体を取り除きます。
- カバーガラスにAmp 4-FLを1滴加えます。加湿オーブンで40°Cで15分間インキュベートします。
注意: 手順9.2に続いて、サンプルを覆い、光から保護してください。 - アンプ4-FLをデカントし、1x洗浄バッファーに沈めます。RTで2分間ロッキングディッシュで攪拌し、新しい1x洗浄バッファーで洗浄を繰り返します。1x PBS(2分)で洗浄し、PBSに保管します。
10. タンパク質免疫染色:目的のタンパク質を標識するため
- PBSをデカントし、200 μLのブロッキングバッファー(1% w/v BSA、0.1% v/v Tween-20(PBST)を含むPBS中の10% v/v FBS)をカバーガラスに追加します。RTで1時間インキュベートします。
- ブロッキングバッファーをデカントし、PBST + 1% w/v BSAで希釈した200 μLの一次抗体を適用します。RTで1時間インキュベートします。
- スライドをPBSTで2回、RTで10分間振とうしながら洗浄します。
- 選択した二次抗体をPBST + 1% w/v BSA中のRTで1時間塗布します。
- スライドをPBSTで10分間、振とうしながらRTで洗います。
11.核染色:免疫染色後の対比染色核
- PBSTをデカントし、選択したDAPIまたは核染色剤をRTで1分間塗布します。
- スライドをPBSで2回、RTで10分間振とうしながら洗います。
12.取り付け
- 退色防止液(金の延長など)を1滴新しい滅菌ガラススライドに置きます(まず、スライドをEtOHできれいにし、乾かしてガラスに残留物がないことを確認します)。同じチップで、退色防止液滴を広げて、カバーガラスとほぼ同じサイズの領域をカバーします。
注意: 退色防止液は非常に粘性があり、ピペットで固定するのが難しい場合があります。ピペッティングの前に200 μLのチップを切断すると、これらの問題を軽減できる場合があります。 - スライドから細胞サンプルの入ったカバーガラスを取り除き、PBSに浸して、鉗子とPBSを使用して背面の残りのマニキュアを取り除きます。キムワイプを使用して鉗子とカバーガラスの裏側を乾かします。
- 退色防止液のドロップにカバーガラスを静かに埋め込み、カバーガラスのサンプル側(細胞層のある側)をドロップに置きます。
- サンプルを一晩乾燥させます。
13. イメージング
- エピ蛍光顕微鏡による画像。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MICDDRP の回路図を 図 1 に示します。DNAおよびRNAの標識に続いて免疫染色を行う。分岐増幅器を使用するとシグナルが増加し、単一の核酸分子の検出が可能になります。
図1:MICDDRPの概略図とステップバイステップのワークフロー。 (a)bDNAシグナルは、分岐プリアンプおよびアンプDNAを介して増幅され、ウイルスDNA(1)およびRNA種(2)の検出を強化する。オリゴヌクレオチドプローブは、目的のターゲットにペア(回路図ではZZ)でハイブリダイズされ、プリアンプ(Amp 1-FL、プロトコルのステップ6)、アンプ(Amp 2-および3-FL)、および蛍光プローブ(プロトコルのアンプ4、ステップ9)の足場を作成します。マルチプレクスISHに適したアンプ4(A、B、またはC)-FLを選択するには、表4を参照してください。核酸の標識に続いて、目的のタンパク質を免疫染色する(3)。(B)MICDDRPプロトコルの13の主要なステップと、各ステップの持続時間の推定。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
HIV-1感染の経過を研究するためのMICDDRPの応用は、初代細胞におけるウイルス複製動態を追跡する上で有用なツールとなっています。この手順の概念実証として、HIV-1 DNA、RNA、およびタンパク質を同時に標識し、単一細胞レベルで顕微鏡的に視覚化します(図2)。2つのHIV-1 DNAゲノムは、ウイルスRNA(vRNA)を積極的に転写しているため、1つの細胞で視覚化されます。vRNAは核孔複合体を介して輸出され、ウイルスタンパク質は細胞質で合成されます。
図2:HIV-1に感染した初代血液単核球(PMBC)のMICDDRP。 HIV-1(NL4.3)に感染したPMBCは、感染の多重度(MOI)が2です。細胞は感染後48時間(hpi)に固定した。(A)HIV-1 bDNA FISHプローブ(ATTO 550で標識、図中赤色)。このプローブは、センス(+)vRNAとのクロストークを防ぐために、テンプレート(3'<-5')vDNA鎖にハイブリダイズします。(B)スプライスされていないHIV-1 RNA(Alexa 647で標識、図の緑色)。HIV-1 vRNAプローブは、5'->3'方向に転写されたウイルス転写物にハイブリダイズします。(C)HIV-1キャプシド(p24)タンパク質の免疫染色(Alexa 488に結合した二次抗体、図の白)。(D)マージされた画像。スケールバーは5μmを表す。核はDAPI(青色)で染色した。HIV-1 DNA(DNA C1プローブ)をATTO 550で、HIV-1 RNA(RNA C3プローブ)をAlexa 647でそれぞれ標識するために、サンプルをAmp 4-FL 'B'でインキュベートしました(ハイブリダイゼーションプローブの適切なチャンネルカラーを選択するには、プロトコルの表4を参照してください)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
さらに、HTLV-1感染を追跡するために、二重ウイルスDNA(vDNA)およびvRNA染色を実施しました。核酸標識の最適化のために、HIV感染のマルチプレックス蛍光イメージング用に開発されたvDNA/VRNA染色手順を厳守しました。HTLV-1のDNAとRNAを同時に特異的に標識できることを実証しました。
図3:MT-2細胞におけるHTLV-1 vDNAとvRNAの同時標識。 (A) HTLV-1 vDNA (ATTO 550で標識、図中赤) (B) 非スプライスHTLV-1センス(+) RNA(RNA C2プローブおよびAlexa 488で標識、図中緑))。(C)HTLV-1 HBZアンチセンス(-)vRNA(RNA C3プローブおよび(Alexa 647で標識;図の白))。(D)マージされた画像。スケールバーは20μmを表す。核はDAPI(青色)で染色した。AMP 4-FL 'B'を使用して(プロトコルの表4を参照)、HTLV-1 ('+' & '-') RNAのマルチプレックス標識を達成しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ターゲットプローブの特異性とバックグラウンドを評価するための対照実験。 HIV-1およびHTLV-1標的プローブの特異性を、リンパ球細胞株(非感染ジャーカットT細胞、HTLV-1感染細胞(MT2)、およびHIV-1感染細胞(H9111B))への感染後に評価した。スケールバーは10μmを表す。 (a)細胞をHTLV-1 RNAプローブで処理した。(B)細胞をHIV-1(+)RNAプローブ(C-D)で処理した。HIV-1との交差反応性のないHTLV-1プローブの特異性のさらなる実証。 図4C 中の白矢印はHTLV-1 DNA(赤色)を示す。(E-F)。vRNA染色(緑色)+/-RNase処理。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ハイブリダイゼーションプローブの特異性を検証し、ISH標識法がタンパク質染色効率と全体的なバックグラウンドにどのように影響するかを評価するために、実験の最高レベルの厳密さと再現性を確保するための重要な制御を実行します。例として、 図4A-Dでは、HIV-1およびHTLV-1 vDNAおよびvRNAプローブの特異性を検証していますが、2つのウイルス間でプローブセット間の交差反応性はほとんどまたはまったく見られません。プローブの交差反応性の可能性がある2つのレトロウイルスが標識されているにもかかわらず、HIV-1プローブはHIV-1遺伝物質 にのみ 特異的であり、HTLV-1には特異的ではありません。HTLV-1プローブについても同じ傾向が見られます。さらに、 図4Fでは、サンプル調製中に細胞をRNase処理すると、vRNA染色を排除できることを示しています。エピトープ認識のアブレーションまたはバックグラウンドシグナルの増加につながる可能性のあるISH(プロテアーゼ処理(プロトコル& 図1Bのステップ4)およびハイブリダイゼーション条件によるタンパク質染色効率の減弱の可能性を評価するために、核スペックルマーカーsc-35のタンパク質染色効率が、従来のIFアプローチおよびMICDDRPプロトコル中の免疫染色で同等であることを実証します。従来のIFプロトコルでは、MICDDRPプロトコルで使用されている0.1%Tween-20で10分間の透過処理ではなく、細胞を0.1%Triton X-100で15分間透過処理しました( 図1Bのプロトコルとワークフローのステップ3)。両方の条件(IF 対 MICDDRP)にわたるタンパク質染色は、対照(一次抗体なしのMICDDRP)よりも数桁大きいシグナルを生成し、このプロトコルに従って生成されたバックグラウンドが低く、効率的な免疫染色のためのタンパク質エピトープの保存をさらに実証しました。細胞当たりのsc−35シグナルの平均積分蛍光強度の画像定量化(図5E)は、前述のように行った3。示されたすべてのイメージング結果について、プローブと抗体の特異性を確認し、ISHアプローチに起因する可能性のある摂動または通常よりも高いバックグラウンドノイズを評価しました。
図5:従来のIFとMICDDRP後のタンパク質染色効率の比較。核スペックルのバイオマーカーである細胞タンパク質sc-35を、Jurkat T細胞で免疫染色しました。すべてのスケールバーは10μmを表します。 (A)感染していないジャーカットT細胞はMICDDRPプロトコルを受け、上記の図2および図4で使用したHIV-1 DNA/RNAハイブリダイゼーションプローブで処理した。免疫染色の際、一次抗体は添加しなかった。非感染ジャーカットT細胞は、従来のIFを受け、sc-35(白色)を標識した。細胞を0.1%Triton X−100で15分間透過処理した。MICDDRPは、HIVに感染したジャーカットT細胞に対して実施された。vRNAは緑色、vDNAは赤色、sc-35は白色と標識されています。HIV感染細胞におけるvRNA、vDNA、およびタンパク質標識(sc-35)のクローズアップ。(E)異なる免疫染色条件にわたるsc-35の細胞あたりの平均集積蛍光シグナルの定量化。Y 軸は対数スケールです。点線は、一次抗体を添加していないMICDDRPプロトコルを受けた非感染細胞からのバックグラウンドシグナルを表しています。MICDDRP後のシグナルと従来のIFに有意差はありません。500を超える細胞をサンプリングして、それぞれの条件に到達するための定量化を行いました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
この方法は、ウイルス複製用のDNAテンプレートを含む場合と含まない場合があるRNAウイルスの研究にも適用できます。例えば、鎖特異的bDNAプローブは、HBV、HCV、IAV、ZIKVなどのウイルスにおけるセンス(+)鎖またはアンチセンス(-)鎖RNAおよび異なるvRNA種の発現をモニターするように設計することができる。感染の過程でさまざまなRNA種を可視化することで、さまざまなウイルス系の複製動態に関する洞察を得ることができます。
HBV感染の時間経過をたどると、HBV前ゲノムRNA(pgRNA)と総HBV RNAの量が時間の関数として増加することがわかります。また、同時に細胞宿主因子MOV10を免疫染色しました(図6)。
図6:HBV。3E8細胞のHBV感染の経時変化。細胞は、細胞当たり300個のHBVゲノムを感染させた。ウイルス複製は、3つの時点(24、48、および72 hpi)で示されます。pgRNA(ATTO 550標識、図は赤)、総HBV RNA(Alexa 647標識、図は緑)、およびMOV10(Alexa 488に結合した二次抗体、図は白)。核は青色のDAPIで染色されています。マージされた画像のスケールバーは、感染後10 μmのhpiを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
イメージングは、60倍の油浸対物レンズを用いた共焦点顕微鏡 で 行った。DAPI、Alexa 488、ATTO 550、およびAlexa 647の検出に使用される励起/発光バンドパス波長は、それぞれ405 / 420-480、488 / 505-550、550 / 560-610、および647 / 655-705 nmに設定されました(図7、図 8 、 および図9)。
図7:Huh-7.5.1細胞のHCV感染の経時変化。 Huh-7.5.1細胞は、0.5のMOIでC型肝炎ウイルス(HCV)Jc1 / Gluc2Aに感染しました。示された時間間隔で、細胞を固定し、センス(+)vRNA、アンチセンス(-)vRNAおよびNS5A(HCVタンパク質)について順次プローブした。核はDAPIで染色した。各時点からの代表的なマージ画像で、緑色(+)RNA(Alexa 647で標識)、赤色(-)RNA(Atto 555で標識)、白色のNS5A(Alexa 488に結合した二次ヤギ抗マウス)、および青色の核を示す。スケールバーは10μmを表す。下の画像は、対応する時点から拡大切り取られています。HPI、感染後数時間。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:A型インフルエンザウイルスに感染したA549細胞の鎖特異的bDNA FISHおよび免疫染色。 PR8インフルエンザAウイルスに感染したA549細胞を固定し、(A)IAV核タンパク質(NP)RNA(Alexa 488で標識、図の緑)、および(B)IAVポリメラーゼタンパク質(PB1)(二次ヤギ抗マウスAtto 550、図の赤)および核をDAPI(青)で染色した。(C)マージされた画像。スケールバーは10μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:ジカウイルス(ZIKV)感染細胞における鎖特異的bDNA FISH。 ベロ細胞は、0.1のMOIでZIKVに感染しました。細胞は48hpiに固定した。(A)細胞は、センス(+)vRNA(Alexa 488で標識、図の緑)およびアンチセンス(-)vRNA(Atto 550で標識、図の赤色)について同時に染色した。核はDAPIで染色した。(A)において、白枠は(+)および(-)vRNAの両方を有する領域を示す。挿入図は、(+)vRNA(緑)と希少(-)vRNA種(赤)のクローズアップを示します。(b)センス(+)vRNA(緑色)。(c)アンチセンス(-)vRNA(赤色)。(A)中のスケールバーは10μmを表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA、DNA、タンパク質を同時に可視化するには、多くの場合、広範な最適化が必要です。一般的に使用される2つの方法は、5-エチニル-2-デオキシウリジン(EdU)標識とDNA FISHです。EdUは新生DNAに組み込まれ、その後クリックケミストリー を介して アジド含有蛍光色素で標識されるため、EdU標識はウイルスDNAとタンパク質を同時に視覚化するために適用されています。したがって、EdU標識は、DNAウイルスまたは複製のためのDNAテンプレートを有するウイルスのネイティブウイルス複製動態をモニターするために使用することができる12。ただし、EdU標識の欠点は、細胞を分割する際に、複製ゲノムにEdUが組み込まれ、高いバックグラウンドと交絡画像分析を生成することです。DNA FISHは、細胞周期に関係なく、核酸プローブをそれぞれのターゲットに直接ハイブリダイズさせることで、これらの問題を回避できます。しかし、従来のFISHは、効率的なプローブハイブリダイゼーションを達成するために高温に依存することが多く、免疫染色や同時RNA染色さえも妨げていました13。MICDDRPは、さまざまな細胞系にわたってDNA、RNA、およびタンパク質の堅牢な同時蛍光標識を提供することで、これらの問題を回避できる可能性があります。
MICDDRPプロトコルを使用してタンパク質と核酸を同時に標識できることを実証しましたが、異なるシステム間での最適化が必要でした。最適化しなければならなかった最初の主要なパラメータは、プロテアーゼ処理でした。条件にわたってプロテアーゼIII濃度を変化させた。プロテアーゼ処理の最適化は経験的であり、免疫染色効率を損なうことなく、さまざまな希釈を使用して最大のハイブリダイゼーション効率をもたらすものを評価しました。適切なコントロールを並べて実施し、プローブの特異性およびプロテアーゼ処理に起因するタンパク質染色効率の変化を評価しました。最適化が必要な次の主要なパラメータは、プローブ設計とプローブハイブリダイゼーションでした。
キャプチャプローブとアンププローブの適切な設計は、bDNA技術の感度と特異性を達成するために重要です。非特異的ハイブリダイゼーション事象の確率を予測するソフトウェアパッケージは、プローブ設計を改善するために利用可能である7、11。bDNAイメージングキットとの互換性を確保するために、bDNAプローブと付属のプリアンプ、アンプ、および蛍光標識プローブを市販品として購入できるようになりました。ユーザーは、ターゲット領域の配列情報(~300-1000塩基対)をfastaファイル(ヌクレオチド配列を表すためのテキストベースの形式)の形式でメーカーに提供できます。標的プローブは、供給された配列に対して>90%の配列相同性を有するように生成される。
DNA標識に関して、我々は、プロトコルのステップ5に記載されるハイブリダイゼーションバッファー中でプローブを希釈すると、DNAハイブリダイゼーションが改善されることを見出した。DNAおよびRNAの両方を標識する場合、RNAプローブをハイブリダイゼーションバッファーで希釈することができる。RNaseの非存在下でのDNA標識は、観察された核酸が標的鎖のRNAを含む可能性を排除することはできない。ハイブリダイゼーション効率を改善するために温度を調整する必要がある場合もあります。温度の上昇はタンパク質変性を促進し、一次抗体のエピトープ認識を切除する可能性があるため、温度の上昇はタンパク質染色効率に影響を与える可能性があります。提示した代表データでは、40°CでISHを実行しました。
従来のDNA FISHと比較して、MICDDRPは、DNA、RNA、およびタンパク質を同時に標識して蛍光顕微鏡 で 視覚化するための改善された手順を提供します。潜在的な制限は、プローブの選択がハイブリダイゼーションの効率およびプローブ間のデータを定量的に比較する能力に影響を与える可能性があることである。このプロトコルは、私たちの手にあるさまざまな細胞およびウイルスシステムで効果的であり、さまざまな条件で必要な最適化はわずかです。最近の注目を集める出版物は、HIV統合部位選択14 およびHIV逆転写動態15を研究するために私たちのアプローチを利用しています。MICDDRPの将来のアプリケーションには、特定の細胞遺伝子および細胞タンパク質の核酸配列と同時にウイルス核酸の可視化が含まれる可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、米国国立衛生研究所(R01 AI121315、R01 AI146017、R01 AI148382、R01 AI120860、R37 AI076119、およびU54 AI150472)によって全体的または部分的に支援されました。A型インフルエンザウイルスに感染した細胞を提供してくれたレイモンド・F・シナジ博士とサディ・アミチャイ博士に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
- Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
- Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
- Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
- Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
- Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
- Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).
