Summary
Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.
Abstract
Virüslerin dinamik replikasyon ve montaj süreçlerini yakalamak, viral nükleik asit ve proteinin hassas ve eşzamanlı olarak etiketlenmesini sağlayan sağlam in situ hibridizasyon (ISH) teknolojilerinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Konvansiyonel DNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) yöntemleri genellikle immün boyama ile uyumlu değildir. Bu nedenle, DNA, RNA ve proteinin eşzamanlı tek hücreli görselleştirmesini sağlayan MICDDRP (MULTIPLEX IMMUNOFLUORESCENT CELL-BASED D ETECTION OF DNA, RNA ve protein) adlı bir görüntüleme yaklaşımı geliştirdik. Geleneksel DNA FISH'lerle karşılaştırıldığında, micddrp, oligonükleotid probu duyarlılığını ve tespitini önemli ölçüde artıran dallanmış DNA (bDNA) ISH teknolojisini kullanır. MICDDRP'nin küçük modifikasyonları, viral proteinlerin farklı sarmallara sahip nükleik asitlerle (RNA veya DNA) eşzamanlı olarak görüntülenmesini sağlar. Bu protokolleri, insan immün yetmezlik virüsü (HIV)-1, insan T-lenfotropik virüsü (HTLV)-1, hepatit B virüsü (HBV), hepatit C virüsü (HCV), Zika virüsü (ZKV) ve influenza A virüsü (IAV) dahil olmak üzere çoklu viral patojenlerin yaşam döngülerini incelemek için uyguladık. Viral nükleik asitleri ve proteinleri çeşitli virüslerde etkili bir şekilde etiketleyebileceğimizi gösterdik. Bu çalışmalar bize çoklu viral sistemlerin gelişmiş mekanik anlayışını sağlayabilir ve ek olarak, DNA, RNA ve proteinin çok katlı floresan görüntülemesinin geniş bir hücresel sistem spektrumunda uygulanması için bir şablon görevi görebilir.
Introduction
Geleneksel immün boyama yaklaşımlarıyla proteinleri spesifik olarak etiketlemek için binlerce ticari antikor mevcut olsa da ve füzyon proteinleri, bir örnek1'deki birden fazla proteini izlemek için foto-optimize floresan etiketlerle tasarlanabilirken, proteinin mikroskobik görselleştirilmesi genellikle geleneksel DNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH) ile uyumlu değildir2 . Floresan tabanlı yaklaşımlar kullanılarak DNA, RNA ve proteinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesindeki teknik sınırlamalar, virüs replikasyonunun derinlemesine anlaşılmasını engellemiştir. Enfeksiyon sırasında hem viral nükleik asidin hem de proteinin izlenmesi, virologların virüs replikasyonu ve montajı 3,4,5,6'nın altında yatan temel süreçleri görselleştirmelerini sağlar.
Nükleik asit tespitinin duyarlılığını artırmak için dallanmış DNA (bDNA) in situ teknolojisini kullanan DNA, RNA ve Protein'in (MICDDRP)3'ün multiplex immunofloresan cell tabanlı detection'u adlı bir görüntüleme yaklaşımı geliştirdik 7,8,9 . Ek olarak, bu yöntem gelişmiş özgüllük için eşleştirilmiş problar kullanır. bDNA dizisine özgü problar, yoğun ve lokalize bir sinyal üretmek için dallanma preamplifikatörü ve amplifikatör DNA'larını kullanır ve DNA9'da tekrarlanan bölgeleri hedeflemeye dayanan önceki hibridizasyon yöntemlerini geliştirir. Klinik bağlamda enfekte olmuş hücreler genellikle bol miktarda viral genetik materyal içermez ve tanısal ortamlarda floresan nükleik asit tespiti için hassas bir yöntem için bir emtia sağlar. bDNA teknolojisinin RNAscope7 ve ViewRNA10 gibi yaklaşımlarla ticarileştirilmesi bu nişi doldurmuştur. bDNA floresan görüntülemenin duyarlılığı, hücre kültürü modellerinde kıt nükleik asit türlerinin tespit edilmesine izin veren hücre biyolojisinde de önemli bir faydaya sahiptir. Duyarlılığın büyük ölçüde artması, bDNA tabanlı görüntüleme yöntemlerini virüsleri incelemek için uygun hale getirir. Bununla birlikte, potansiyel bir eksiklik, bu yöntemlerin RNA veya RNA ve proteini görselleştirmeye odaklanmasıdır. Tüm çoğalan hücreler ve birçok virüs, DNA genomlarına sahiptir veya replikasyon döngüleri sırasında DNA oluşturur, bu da hem RNA hem de DNA'yı ve proteini görüntüleyebilen yöntemleri oldukça arzu edilir hale getirir.
MICDDRP protokolünde, RNAscope yöntemini kullanarak viral nükleik asidin tespiti için bDNA FISH'imodifikasyonlar 7 ile gerçekleştiriyoruz. Bu protokoldeki en önemli değişikliklerden biri, kimyasal fiksasyonu takiben proteaz tedavisinin optimizasyonudur. Proteaz tedavisi, prob hibridizasyon verimliliğini artırmak için nükleik aside bağlı proteinlerin uzaklaştırılmasını kolaylaştırır. Proteaz tedavisini dallı oligonükleotid prob (lar) ile inkübasyon izler. bDNA problarının uygulanmasından sonra, numuneler yıkanır ve daha sonra sinyal ön amplifikatörü ve amplifikatör DNA'ları ile inkübe edilir. Çoklu gen hedeflerinin etiketlenmesi olan multipleks in situ hibridizasyon (ISH), spektral farklılaşma için farklı renk kanallarına sahip hedef problar gerektirir7. DNA amplifikatörleri ile inkübasyonu immünofloresan (IF) takip eder.
bDNA ISH, hedefe özgü sinyallerin amplifikasyonu ile sinyalden gürültüye iyileştirmeler sağlar ve spesifik olmayan hibridizasyon olaylarından kaynaklanan arka plan gürültüsüne bir azalmasağlar 7,11. Hedef problar, spesifik olmayan hibridizasyon olaylarının olasılığını tahmin eden ve prob-hedef hibrid 7,11'in erime sıcaklığını (T m) hesaplayan halka açık yazılım programları kullanılarak tasarlanmıştır. Hedef problar, hedef DNA / RNA dizisini tamamlayan 18 ila 25 bazlı bir bölge, bir ara dizi ve 14 bazlı bir kuyruk dizisi içerir. Her biri ayrı bir kuyruk dizisine sahip bir çift hedef prob, bir hedef bölgeye (~ 50 baza yayılan) melezleşir. İki kuyruk dizisi, amplifikatör probları için 20 bağlama bölgesi içeren ön amplifikatör probları için bir hibridizasyon bölgesi oluşturur ve bunlara ek olarak etiket probu için 20 bağlama bölgesi içerir. Örnek olarak, nükleik asit molekülü üzerindeki bir kilobaz (kb) bölgesi, 20 prob çifti tarafından hedeflenir ve ön amplifikatör, amplifikatör ve etiket probu ile sıralı hibridizasyon için moleküler bir iskele oluşturur. Bu nedenle, nükleik asit molekülü başına 8000 floresan etiketin teorik verimine yol açabilir, bu da tek moleküllerin tespitini ve geleneksel FISH yaklaşımları7'ye göre büyük gelişmeler sağlar (bDNA sinyal amplifikasyonunun şeması için Şekil 1A'ya bakınız). Çoklanmış ISH için problar kurmak üzere her hedef probun farklı bir renk kanalında (C1, C2 veya C3) olması gerekir. Farklı renk kanallarına sahip bu hedef problar, farklı 14 tabanlı kuyruk dizilerine sahiptir. Bu kuyruk dizileri, farklı floresan problarla farklı sinyal amplifikatörlerini bağlayacak ve böylece birden fazla hedef arasında kolay spektral farklılaşmayı mümkün kılacaktır. Sunulan Protokolde, Adım 9'daki Tablo 4, hedef probların floresan olarak etiketlenmesi hakkında daha fazla bilgi sağlar. Ek olarak, Şekil 2 ve Şekil 3, HIV-1 ve HTLV-1 enfeksiyonlarını takiben çoklu viral nükleik asit hedeflerinin spesifik floresan etiketlemesini elde etmek için uygun Amplifikatör 4-FL (A, B veya C) (floresan probu ve son hibridizasyon adımı) 'nı nasıl seçtiğimize dair örnekler sunmaktadır.
RNA, DNA ve proteinlerin eşzamanlı floresan görselleştirmesinin çeşitli uygulamalarını gösterdik ve yüksek uzaysal zamansal çözünürlük 3,4,5 ile virüs replikasyonunun kritik aşamalarını gözlemledik. Örneğin, viral RNA, sitoplazmik ve nükleer DNA ve proteinin eşzamanlı tek hücreli görselleştirmesi, nükleer girişten önce sitoplazmada RNA içeren çekirdekleri takip etmek ve proviral DNA3'ün entegrasyonu da dahil olmak üzere HIV-1 enfeksiyonu sırasındaki önemli olayları görselleştirmemize izin vermiştir. Ayrıca konakçı faktörlerin ve ilaç tedavisinin viral enfeksiyon ve replikasyon üzerine etkilerini karakterize etmek için MICDDRP uyguladık 4,5. Ukah ve ark.'da, HIV transkripsiyonunu ve gecikme tersine çevirmesini görselleştirmek için farklı gecikme tersine çevirici ajanlarla tedavi edilen gecikmeli hücre modellerinde HIV-1 transkripsiyonunun reaktivasyonunu izledik4. Ek olarak, MICDDRP, küçük molekül tedavisine veya konakçı faktörü kısıtlamasına atfedilen antiviral inhibisyonla ilişkili fenotipik değişiklikleri görselleştirmemize izin verebilir. Yaklaşımımızın sağlamlığına ve geniş uygulanabilirliğine kavramın bir kanıtı olarak, sadece insan immün yetmezlik virüsünde (HIV)-1'de değil, aynı zamanda insan T-lenfotropik virüsünde (HTLV)-1, hepatit B virüsünde (HBV), hepatit C virüsünde (HCV) enfeksiyonu takip etmek için viral nükleik asidi etkili bir şekilde etiketlemek için protokolümüzün modifikasyonlarını kullanabileceğimizi gösterdik. Zika virüsü (ZIKV) ve influenza A virüsü (IAV). HIV-1 yaşam döngüsü hem viral DNA hem de RNA türlerinden oluştuğundan, HIV-1 replikasyon kinetiğini takiben MICDDRP optimizasyonumuzun çoğunu gerçekleştirdik. Bununla birlikte, ek olarak, viral transkripsiyon ve replikasyonu izlemek için ZIKV, IAV, HBV ve HCV gibi virüslerde her iki duyu (+) ve antisens (-) sarmallılığın farklı viral RNA transkriptlerinin sentezini izleyebileceğimizi gösterdik 3,4,5,6. Çalışmalar, çeşitli viral süreçlerin mekanik anlayışını geliştirmeyi ve bu floresan görüntüleme teknolojisini çok çeşitli hücresel modellere uygulamak için bir kılavuz görevi görmeyi amaçlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kapak kapakları veya oda slaytları üzerindeki tohum hücreleri (Süspansiyon vs Yapışkan Hücreler) (sunulan protokol kapakları kullanır).
- Süspansiyon hücrelerinin tohumlanması
- Poli-D-lizin (PDL) kaplı örtü kızaklarını hazırlayın (süspansiyon hücrelerinin örtü kaymasına yapışmasını kolaylaştırır) önce 5 dakika boyunca etanol (EtOH) içindeki örtü kaymalarını inkübe ederek (örtü kaymalarını sterilize eder ve herhangi bir kalıntıyı giderir). Daha sonra, oda sıcaklığında (RT) 30 dakika (dak) boyunca PDL'de (20 μg / mL) örtüleri inkübe etmeden önce fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 2x yıkayın.
- PDL'yi çıkarın ve PBS'de 2 kat yıkayın. Pelet hücreleri (istenen görüntüleme koşullarına göre daha önce enfekte edilmiş / tedavi edilmiş) ve 50 μL PBS'de 106hücreyi yeniden askıya alır. Cam üzerinde (PDL kaplı) 50 μL hücre tespit edin ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Yapışkan hücrelerin tohumlanması
- Steril örtü üzerindeki kültür hücreleri, 6 kuyucuklu tabağa yerleştirilir ve hücreleri viral parçacıklarla enfekte eder veya ilgilenilen bileşikle tedavi eder. Görüntüleme deneyleri için numune hazırlamadan önce hücrelerin% 50-70 akıcılığa ulaşmasına izin verin.
2. Hücresel fiksasyon: Floresan görüntüleme çalışmaları için hücresel morfolojiyi korumak
NOT: Hücresel fiksasyondan önce RT'de %4 PFA ve PBS'yi en az 30 dakika tutun.
- Hücresel ortamı aspire edin, PBS'de kapak kapaklarındaki hücreleri 3 kat yıkayın ve hücreleri 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin. PFA'yı aspire edin ve hücreleri PBS 2x'te yıkayın.
NOT: Deneyci deneye başka bir tarihte devam etmek isterse, hücreler artık kurutulabilir ve saklanabilir. Sabit hücreler depolamadan önce EtOH'de dehidre edilebilir.- Hücresel fiksasyondan sonra yıkamayı takiben PBS'yi çıkarın ve 500 μL% 50 EtOH (suda v / v) ile değiştirin. RT'de 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
- %50 EtOH'yi çıkarın ve 500 μL %70 EtOH ile değiştirin. RT'de 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
- %70 EtOH'yi çıkarın ve 500 μL %100 EtOH ile değiştirin. RT'de 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
- % 100 EtOH'yi çıkarın ve% 100 EtOH ile değiştirin.
NOT: Susuz hücreler 6 ay boyunca -20 °C'de saklanabilir. EtOH'nin buharlaşmasını önlemek için depolamadan önce plakaları bant veya parafilm ile kapatın. - Hücrelerin/virüslerin çoklanmış floresan etiketlemesine geçmek için hücreleri rehidratlayın.
- % 100 EtOH'yi çıkarın ve% 70 EtOH'nin 500 μL'si ile değiştirin. RT'de 2 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: Hücrelerin hiçbir zaman kurumasına izin vermeyin. Tüm hücreleri batırmak için her zaman yeterli çözelti kullanın. - %70 EtOH'yi çıkarın ve 500 μL %50 EtOH ile değiştirin. RT'de 2 dakika boyunca inkübe edin.
- % 50 EtOH'yi çıkarın ve 1x PBS ile değiştirin.
NOT: Proteaz seyreltme, hibridizasyon probları ve yıkama tamponunu proteaz tedavisi (Adım 4) ve hedef prob uygulamasından (Adım 5) önce hazırlayın. Reaktif hazırlama ile ilgili özel talimatlar, ilgili her adımın başında sunulmaktadır.
| Reaktif | Diğer Notlar |
| Proteaz çözeltisi | 1X PBS'de hazırlanın |
| Hedef oligonükletodie probu(ları) | Hibridizasyon tamponunda seyreltin |
| Yıkama tamponu | Hedef hibridizasyon adımlarını izleyerek yıkarlar |
| Hibridizasyon tamponu | Tablo 3'te sunulan tarif |
Tablo 1: MICDDRP protokolündeki anahtar reaktifler.
3. Hücre geçirgenliği: Büyük moleküllerin (antikorlar, nükleik asit hibridizasyon probları) girişi için hücre ve hücresel organellere erişimi arttırır
- Hücresel fiksasyon veya rehidrasyondan sonra 1x PBS'yi çıkarın ve 1x PBS'de 500 μL% 0.1 (v / v) Ara-20 ile değiştirin. RT'de 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Tek tek değiştirin. 500 μL 1x PBS ile bir kez yıkayın ve taze 1x PBS ekleyin.
4. Hibridizasyon verimliliğini artırmak için sabit viral/hücresel nükleik asitten nükleik asit bağlayıcı proteinleri uzaklaştırmak için cam slayt üzerinde coverslip immobilizasyonu ve proteaz işlemi
NOT: Hücresel geçirgenlik sırasında seyreltilmiş Proteaz III (Malzeme Tablosundaki reaktifin özelliklerine bakınız) çözeltisini hazırlayın. Proteazın geçirgenlikten önce 10 dakika boyunca RT'ye ulaşmasına izin verin.
- Sterilize edilmiş bir cam slaytın üzerine küçük bir damla oje yerleştirin. Arkanızı kurutun (hücre tabakası olmayan taraf) ve kapak kaymasının kenarını oje damlasının üzerine, yapıştırılmış hücrelerin yukarı baktığı tarafı olacak şekilde yerleştirin. Kurumayı önlemek için hareketsiz kapak kapağına birkaç damla PBS ekleyin.
- Hidrofobik bariyer kalemi (reaktifleri hücreler üzerinde lokalize tutan su itici kalem) kullanarak slayta yapıştırılan kapak kaymasının çevresine bir daire (kapak kaymasından yaklaşık 3 mm uzaklıkta) çizin.
- Protease III'ü 1x PBS (100 μL/coverslip) içinde seyreltin.
NOT: Proteaz konsantrasyonunun, ampirik optimizasyon yoluyla hücre tipleri, problar veya hedef nükleik asit (ler) deki farklılıklara bağlı olarak ayarlanması gerekebilir ( Bkz. Tartışma). Farklı viral sistemlerde en verimli RNA / DNA etiketlemesi için, aşağıdaki Tablo 2'de sunulan aşağıdaki seyreltmelerle, (1 ila 2 ) - (1 ila 15) (proteaz ila 1x PBS) arasında değişen seyreltmelerle başarı elde ettik.
| Prob Hedefleri | 1X PBS'de Proteaz Seyreltme (Proteaz III - 1X PBS) |
| HIV-1 DNA/RNA | 1 ila 5 |
| HTLV-1 DNA/RNA | 1 ila 5 |
| HBV pgRNA ve toplam HBV RNA | 1 ila 15 |
| IAV RNA | 1 ila 15 |
| ZIKV RNA | 1 ila 2 |
Tablo 2: PBS'de viral nükleik asit hibridizasyonu için proteaz III dilüsyonları.
- İmmobilizasyonu takiben 1x PBS'yi kapak kapağı üzerinde boşaltın ve seyreltilmiş Proteaz III'ü uygulayın.
- Nemlendirilmiş bir fırında 40 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Dekant proteaz çözeltisi ve daldırma slaytları 1x PBS'de. RT'de 2 dakika boyunca sallanan bir tabakla çalkalayın. Yeni 1x PBS ile tekrar yıkayın.
- Sadece DNA tespiti için, numuneleri her biri 2 dakika boyunca nükleaz içermeyen suyla üç kez yıkayın, ardından 37 ° C'de 30 dakika boyunca PBS'de seyreltilmiş 5 mg / mL RNaz A ile inkübasyon yapın.
- Decant RNase Bir çözelti ve ultra saf su ile 2 dakika boyunca 3x yıkayın. Hedef probun (lar) ın ISH ile devam edin.
NOT: Hibridizasyon tamponu, sunulan sonuçlar için vRNA boyama verimliliğini etkilemeden vDNA tespitini geliştirir (Temsili Sonuçlar). DNA Kanal 1 (C1) probları 1:1'i hibridizasyon probu ile seyreltin. RNA C2 ve C3 problarını hibridizasyon tamponunda seyreltin. Görüntüleme çalışmalarımızda kullanılan C2 ve C3 probları 50X çözeltilerdedir (1:50; hibridizasyon tamponuna hedef prob).
- Aşağıdaki adım adım prosedürü izleyerek nükleaz içermeyen suda hibridizasyon tamponunu hazırlayın:
- 15 mL'lik bir tüpte, 700 μL nükleaz serbest su, 300 μL% 50 (ağırlık / hacim (w / v)) dekstran sülfat, 300 μL 5 M NaCl, 125 μL 200 mM sodyum sitrat (pH 6.2) ve 375 mg (toz) etilen karbonat ekleyin.
- Etilen karbonatı çözmek için bir vorteks kullanarak iyice karıştırın (tüm tozun çözündüğünden ve berrak bir çözelti olduğundan emin olun).
- Ara-20'nin 25 μL'si (hacim/hacim (v/v)) %10 (hacim/hacim (v/v)) ve 2,5 mL'yi (2x çözelti) tamamlamak için yeterli nükleaz içermeyen su ekleyin.
NOT: Sunulan hibridizasyon tamponunun tarifi aşağıdaki Tablo 3'te bulunabilir. Çözüm bir hafta boyunca kararlıdır. Çözeltinin köpürmesini önlemeye dikkat ederken, Tween-20 deterjanının yeterli miktarda karıştırıldığından emin olun.
| Reaktif | Stok Konsantrasyonu | Ek Notlar |
| Nükleaz içermeyen su | NA | |
| Dextran sülfat | %50 (w/d) | Çok viskoz |
| Sodyum klorür | 5 milyon | |
| Sodyum sitrat (pH 6.2) | 200 mM | 4 °C'de depolayın |
| Etilen karbonat | NA | Toz |
| Ara-20 | %10 (d/d) |
Tablo 3: Reaktiflerin hibridizasyon tampon listesi.
5. DNA / RNA hedef hibridizasyon probları ile inkübasyon: Hedef oligonükleotid probları, ilgilenilen bölgelere bağlanır ve ön amplifikatörlerin, amplifikatörlerin ve floresan probların bağlanması için moleküler bir iskele oluşturur.
NOT: DNA / RNA problarını 40 ° C'de 10 dakika boyunca (Hücre Geçirgenliği sırasında) ısıtın ve RNaz tedavisi dahil değilse en az 10 dakika boyunca RT'ye soğutun. Hedef prob hibridizasyonundan önce RNaz tedavisi veya daha fazla numune tedavisi gerekiyorsa, buna göre probları ısıtın. Isındıktan sonra C2 ve C3 problarını döndürün ve hibridizasyon tamponunda seyreltin. Seyreltmeden sonra, C2 ve C3 probları kısaca ısıtılabilir. Sıcak 50x yıkama tamponu (Daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosuna bakınız) 40 ° C'de 10-20 dakika boyunca ve moleküler biyoloji sınıfı suda 1x'e kadar seyreltin.
- Hibridizasyon prob(lar)ının eklenmesinden önce 10 dakika boyunca 67 °C'de 200 μL hibridizasyon tamponunu inkübe edin. Probu hibridizasyon tamponunda seyreltin ( Tablo 2'de listelenen tarif). 50 μL/coverslip ekleyin.
- Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 2 saat (s) boyunca inkübe edin. Dekant problar ve daldırma kızakları 1x yıkama tamponuna. RT'de 2 dakika boyunca tabağı sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile tekrar yıkayın.
6. Amplifikatör (Amper) 1-FL Hibridizasyonu: Hedef DNA / RNA problarının kuyruk dizisine tamamlayıcı olan ön amplifikatörün eklenmesi (Adım 5)
NOT: Amplifikatörler kullanılmadan önce RT'de olmalıdır. Her bir amplifikatörü kullanmadan 30 dakika önce buzdolabından çıkarın ve RT'deki bankta bırakın.
- Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.
- Kapak kapağına 1 damla Amper 1-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Decant Amp 1-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de çanağı 2 dakika sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.
7. Amper 2-FL Hibridizasyonu: Ön amplifikatörlere konyak tanıma sırasına sahip sinyal amplifikatörü ile inkübasyon (Amp 1-FL)
- Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.
- Kapak kapağına 1 damla Amp 2-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Decant Amp 2-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de çanağı 2 dakika sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.
8. Amper 3-FL Hibridizasyon: İkinci sinyal amplifikatörü ile inkübasyon
- Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.
- Kapak kapağına 1 damla Amper 3-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Decant Amp 3-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de çanağı 2 dakika sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.
9. Amper 4-FL Hibridizasyon: Floresan etiket ve son hibridizasyon adımı
NOT: İlk olarak, hedef probun (lar) kanallarına göre uygun Amp 4 (A, B veya C) - FL'yi seçmek için Tablo 4'e bakın. İlgilenilen DNA / RNA'yı etiketlemek için hangi Amp 4-FL'nin gerekli olduğunu değerlendirin. Aşağıdaki tabloda bir örnek verilmiştir:
| A | B | C | |
| DNA Kanal 1 (C1) | 488 | 550 | 550 |
| DNA/RNA Kanal 2 (C2) | 550 | 488 | 647 |
| RNA Kanal 3 (C3) | 647 | 647 | 488 |
Tablo 4: Çoklanmış ISH için Amp 4 (A, B veya C)-FL floresan probu seçimi.
NOT: Çoğullanmış FISH (birden fazla hedef) için, doğru Amp 4 (A, B veya C)- FL'yi seçmek, ilgilendiğiniz hedefi (hedefleri) doğru şekilde etiketlemek için kritik öneme sahiptir. Hedef problar (Adım 5), seçilen Amp 4-FL'ye bağlı olarak ilgili floresan etiketlerini (Alexa 488, Atto 550 veya Alexa 647) dikte eden farklı renk kanallarına (C1, C2 veya C3) sahiptir. Çoklanmış görüntüleme için florofor kombinasyonlarının seçilmesine ilişkin örnekler Şekil 2 ve Şekil 3 açıklamalarında verilmiştir. Ek bir örnek olarak, Amp 4B-FL seçimi, DNA C1 problarını Atto 550 ile ve RNA C3 problarını Alexa 647 ile seçici olarak etiketleyecektir.
- Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.
- Kapak kapağına 1 damla Amper 4-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: Adım 9.2'yi takiben, örnekleri ışıktan korunarak kapalı tutun. - Decant Amp 4-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de 2 dakika boyunca tabağı sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile tekrar yıkayın. 1x PBS (2 dakika) ile yıkayın ve PBS'de saklayın.
10. Protein immün boyama: İlgilenilen proteinleri etiketlemek için
- PBS'yi boşaltın ve kapak kapağına 200 μL blokaj tamponu ekleyin (%1 BSA ile, %10 v/v FBS ile PBS'de %0,1 v/v Ara-20 (PBST)). RT'de 1 saat inkübe edin.
- Dekant bloke edici tampon ve PBST'de seyreltilmiş 200 μL primer antikor + % 1 w / v BSA uygulayın. RT'de 1 saat inkübe edin.
- Slaytı PBST ile RT'de sallayarak 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.
- PBST'de RT'de 1 saat boyunca tercih edilen sekonder antikoru + BSA ile% 1 uygulayın.
- Slaytı PBST ile RT'de sallayarak 10 dakika yıkayın.
11. Nükleer boyama: İmmün boyama sonrası karşı leke çekirdekleri
- PBST'yi boşaltın ve RT'de 1 dakika boyunca DAPI veya nükleer leke seçin.
- Slaytı PBS ile RT'de sallayarak 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.
12. Montaj
- Yeni steril cam sürgü üzerine 1 damla antifade çözeltisi (örneğin, Uzatma Altın) yerleştirin (İlk olarak, EtOH ile kaydırağı temizleyin ve cam üzerinde kalıntı kalmamasını sağlamak için kurumaya bırakın). Aynı uçla, antifade çözeltisi damlasını, yaklaşık olarak kapak kaymasının büyüklüğünde bir alanı kaplayacak şekilde yayın.
NOT: Antifade çözeltisi çok viskozdur ve pipet uygulaması zor olabilir. Pipetlemeden önce ucun 200 μL'lik bir uçtan kesilmesi bu sorunları hafifletebilir. - Slayttan hücre örneği içeren kapak kaymasını çıkarın ve forseps ve PBS kullanarak arkadaki artık ojeyi çıkarmak için PBS'ye batırın. Kuru forseps ve bir Kimwipe kullanarak kapak kaymasının arkası.
- Antifade çözeltisinin damlasına hafifçe yerleştirilmiş örtü kayması, damla üzerine kapak kaymasının numune tarafını (hücre tabakası ile yan taraf) yerleştirin).
- Numunelerin gece boyunca kurumasını bekleyin.
13. Görüntüleme
- Epifloresan mikroskoplu görüntü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MICDDRP'nin bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. DNA ve RNA'nın etiketlenmesini immün boyama izler. Dallanma yükselteçlerinin kullanımı sinyali arttırır ve tek nükleik asit moleküllerinin tespit edilmesini sağlar.
Şekil 1: MICDDRP şeması ve adım adım iş akışı. (A) bDNA sinyali, viral DNA (1) ve RNA türlerinin (2) tespitini arttırmak için dallanan preamplifikatör ve amplifikatör DNA'ları aracılığıyla çoğaltılır. Oligonükleotid probları, ilgilenilen hedef (ler) e çiftler halinde (şematik olarak ZZ) hibridize edilir, ön amplifikatör (Amp 1-FL, Protokolde Adım 6), amplifikatör (Amp 2- ve 3-FL) ve floresan problar (Protokolde Amp 4, Adım 9) için bir iskele oluşturur. Çoğullanmış ISH için uygun Amp 4 (A, B veya C)-FL'yi seçmek için Tablo 4'e bakın. Nükleik asidin etiketlenmesini ilgilenilen immün boyama proteinleri izler (3). (B) MICDDRP protokolünde her bir ilgili adım için zaman süresinin tahmini ile on üç ana adım. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
HIV-1 enfeksiyonunun seyrini incelemek için MICCDRP'nin uygulanması, birincil hücrelerde viral replikasyon kinetiğinin izlenmesinde yararlı bir araç olmuştur. Bu prosedürün kavramının bir kanıtı olarak, HIV-1 DNA, RNA ve protein aynı anda tek hücre düzeyinde mikroskobik olarak etiketlenir ve görselleştirilir (Şekil 2). İki HIV-1 DNA genomu, viral RNA'yı (vRNA) aktif olarak transkribe ettikleri için tek bir hücrede görselleştirilir. vRNA, nükleer gözenek kompleksi yoluyla ihraç edilmiştir ve viral protein sitoplazmada sentezlenmiştir.
Şekil 2: HIV-1 ile enfekte olmuş primer kan mononükleer hücrelerinin (PMBC'ler) MICDDRP'si. PMBC'ler HIV-1 (NL4.3) ile enfekte olmuş 2 enfeksiyon çokluğunda (MOI). Hücreler enfeksiyondan 48 saat sonra sabitlendi (hpi). (A) HIV-1 bDNA FISH probu (ATTO 550 ile etiketlenmiş; Şekilde kırmızı). Bu prob, duyu (+) vRNA ile çapraz konuşmayı önlemek için şablona (3'<-5') vDNA ipliğine melezleşir. (B) Eklenmemiş HIV-1 RNA (Alexa 647 ile etiketlenmiş; Şekilde yeşil). HIV-1 vRNA probu, 5'->3' oryantasyonunda transkripte edilen viral transkriptlere hibridize olur. (C) HIV-1 kapsid (p24) proteininin immün boyaması (Alexa 488'e konjuge ikincil antikor; şekilde beyaz). (D) Birleştirilmiş görüntü. Ölçek çubuğu 5 μm'yi temsil eder. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. HIV-1 DNA'sını (DNA C1 probu) sırasıyla ATTO 550 ve HIV-1 RNA (RNA C3 probu) Alexa 647 ile etiketlemek için, örnekler Amp 4-FL 'B' ile inkübe edildi (hibridizasyon probları için uygun kanal renklerini seçmek için Protokoldeki Tablo 4'e bakın). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek olarak, HTLV-1 enfeksiyonunu takip etmek için çift viral DNA (vDNA) ve vRNA boyama gerçekleştirdik. Nükleik asit etiketlemesinin optimizasyonu için, HIV enfeksiyonunun çoklanmış floresan görüntülemesi için geliştirilen vDNA / VRNA boyama prosedürüne yakından bağlı kaldık. HTLV-1 DNA ve RNA'yı aynı anda özel olarak etiketleyebileceğimizi gösterdik.
Şekil 3: MT-2 hücrelerinde HTLV-1 vDNA ve vRNA'nın eşzamanlı olarak etiketlenmesi. (A) HTLV-1 vDNA (ATTO 550 ile etiketlenmiş; Şekilde kırmızı) (B) Eklenmemiş HTLV-1 duyusu (+) RNA (RNA C2 probu ve Alexa 488 ile etiketlenmiş; Şekilde yeşil)). (C) HTLV-1 HBZ antisens (-) vRNA (RNA C3 probu & (Alexa 647 ile etiketlenmiş; Şekilde beyaz)). (D) Birleştirilmiş görüntü. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil eder. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. HTLV-1 ('+' & '-') RNA'sının çoğullanmış etiketlemesini elde etmek için Amp 4-FL 'B' kullanılmıştır (Protokoldeki Tablo 4'e bakınız).
Şekil 4: Hedef prob özgüllüğünü ve arka planını değerlendirmek için deneyleri kontrol edin. HIV-1 ve HTLV-1 hedef problarının özgüllüğü, lenfositik hücre hatlarında (Enfekte Olmayan Jurkat T hücreleri, HTLV-1 enfekte hücreler (MT2) ve HIV-1 ile enfekte hücrelerde (H9111B) enfeksiyonu takiben değerlendirildi. Ölçek çubukları 10 μm'yi temsil eder. (A) Hücreler HTLV-1 RNA probları ile tedavi edildi. (B) Hücreler HIV-1 (+) RNA probu (C-D) ile tedavi edildi. HIV-1 ile çapraz reaktivite olmaksızın HTLV-1 problarının özgüllüğünün daha fazla gösterilmesi. Şekil 4C'deki beyaz oklar HTLV-1 DNA'sını (kırmızı) gösterir. (E-F). vRNA boyama (yeşil) +/- RNaz tedavisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Hibridizasyon problarının özgüllüğünü doğrulamak ve ISH etiketleme yönteminin protein boyama verimliliğini ve genel arka planı nasıl etkilediğini değerlendirmek için, deneyler için en yüksek düzeyde titizlik ve tekrarlanabilirlik sağlamak için kritik kontroller gerçekleştiriyoruz. Örnek olarak, Şekil 4A-D'de, HIV-1 ve HTLV-1 vDNA ve vRNA problarımızın özgüllüğünü doğruluyoruz, çünkü iki virüs boyunca prob setleri arasında çok az çapraz reaktivite gösteriyoruz veya hiç göstermiyoruz. Prob çapraz reaktivitesi potansiyeli olan iki retrovirüsün etiketlenmesine rağmen, HIV-1 probları HTLV-1'e değil, sadece HIV-1 genetik materyaline özgüdür. Aynı eğilim HTLV-1 probları için de geçerlidir. Ek olarak, Şekil 4F'de, numune hazırlama sırasında hücrelerimizi RNaz ile tedavi edersek, vRNA boyamasını ortadan kaldırabileceğimizi gösteriyoruz. ISH (proteaz tedavisi (Protokol ve Şekil 1B'de Adım 4) ve epitop tanımanın ablasyonuna veya artmış arka plan sinyaline yol açabilecek hibridizasyon koşulları nedeniyle protein boyama etkinliğinin zayıflama olasılığını değerlendirmek için, nükleer benek belirteci sc-35 için protein boyama verimliliğinin, MICDDRP protokolü sırasında geleneksel IF yaklaşımları ve immün boyama ile karşılaştırılabilir olduğunu gösteriyoruz. Konvansiyonel IF protokolünde, hücreler MICDDRP protokolünde kullanılan 10 dakika boyunca% 0.1 Tween-20 ile geçirgenlik yerine 15 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 ile geçirgenleştirildi ( Şekil 1B'deki Protokol ve iş akışında Adım 3). Her iki koşulda da protein boyama (IF vs MICDDRP), kontrolden (primer antikoru olmayan MICDDRP) birkaç büyüklük sırasına göre bir sinyal üretti ve bu protokolü takiben üretilen düşük arka planı ve protein epitoplarının korunmasını etkili immünoboyama için korudu. Hücre başına sc-35 sinyalinin ortalama entegre floresan yoğunluğunun görüntü niceliği (Şekil 5E) daha önce tarif edildiği gibigerçekleştirilmiştir 3. Gösterilen tüm görüntüleme sonuçları için, prob ve antikor özgüllüğünü sağladık ve ayrıca ISH yaklaşımımıza atfedilen olası pertürbasyonları veya normalden daha yüksek arka plan gürültüsünü değerlendirdik.
Şekil 5: Konvansiyonel IF ve MICDDRP sonrası protein boyama etkinliğinin karşılaştırılması. Nükleer lekeler için bir biyobelirteç olan hücresel protein sc-35, Jurkat T hücrelerinde immünoboyalıydı. Tüm ölçek çubukları 10 μm'yi temsil eder. (A) Enfekte Edilmemiş Jurkat T hücreleri MICDDRP protokolüne tabi tutuldu ve yukarıdaki Şekil 2 ve Şekil 4'te kullanılan HIV-1 DNA / RNA hibridizasyon probları ile tedavi edildi. İmmünoboyama sırasında primer antikor eklenmedi. (B). Enfekte olmamış Jurkat T hücrelerine, sc-35 (beyaz) etiketli geleneksel IF uygulandı. Hücreler 15 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 ile geçirgenleştirildi. (C). MICDDRP HIV ile enfekte Jurkat T hücrelerine uygulandı. vRNA yeşil, vDNA kırmızı ve sc-35 beyaz olarak etiketlenmiştir. (D). HIV ile enfekte olmuş hücrede vRNA, vDNA ve protein etiketlemesinin (sc-35) yakın çekimi. (E) Farklı immün boyama koşullarında sc-35 hücresi başına ortalama entegre floresan sinyalinin miktarı. Y ekseni logaritmik bir ölçektedir. Noktalı çizgi, birincil antikorun eklenmediği MICDDRP protokolüne tabi tutulan enfekte olmamış hücrelerden gelen arka plan sinyalini temsil eder. MICDDRP ve konvansiyonel IF'yi takip eden sinyallerde anlamlı bir fark yoktur. İlgili duruma ulaşmak için nicelleştirme için 500'den fazla hücre örneklendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu yöntem, viral replikasyon için DNA şablonları içerebilen veya içermeyebilen RNA virüslerini incelemek için de uygulanabilir. Örneğin, iplikçiklere özgü bDNA probları, HBV, HCV, IAV ve ZIKV gibi virüslerde duyu (+) veya antisens (-) iplikçik RNA'sının ve farklı vRNA türlerinin ekspresyonunu izlemek için tasarlanabilir. Enfeksiyon sırasında farklı RNA türlerinin görselleştirilmesi, çeşitli viral sistemlerin replikasyon kinetiği hakkında fikir verebilir.
HBV enfeksiyonunun zaman seyrini takiben, HBV pregenomik RNA (pgRNA) ve total HBV RNA miktarının zamanın bir fonksiyonu olarak arttığını görebiliriz. Ek olarak, eşzamanlı olarak bir hücresel konak faktörü olan MOV10'u immünoboyadık (Şekil 6).
Şekil 6: HBV. 3E8 hücrelerinin HBV enfeksiyonunun zaman seyri. Hücreler, hücre başına 300 HBV genomu ile enfekte edildi. Viral replikasyon üç zaman noktasında (24, 48 ve 72 hpi) gösterilir. pgRNA (ATTO 550 ile etiketlenmiş; Şekilde kırmızı), toplam HBV RNA (Alexa 647 ile etiketlenmiş; Şekilde yeşil) ve MOV10 (Alexa 488'e konjuge ikincil antikor; Şekilde beyaz). Çekirdekler mavi renkte DAPI ile boyanır. Birleştirilmiş görüntülerdeki ölçek çubuğu, enfeksiyondan sonraki saatlerde 10 μm. hpi'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Görüntüleme, 60x yağ daldırma hedefi kullanılarak konfokal mikroskopi ile gerçekleştirildi. DAPI, Alexa 488, ATTO 550 ve Alexa 647'yi algılamak için kullanılan uyarma/emisyon bandpass dalga boyları sırasıyla 405/420-480, 488/505-550, 550/560-610 ve 647/655-705 nm olarak ayarlanmıştır (Şekil 7, Şekil 8 ve Şekil 9).
Şekil 7: Huh-7.5.1 hücrelerinin HCV enfeksiyonunun zaman seyri. Huh-7.5.1 hücreleri, 0.5'lik bir MOI'de hepatit C virüsü (HCV) Jc1 / Gluc2A ile enfekte oldu. Belirtilen zaman aralıklarında, hücreler sabit tutuldu ve duyu (+) vRNA, antisens (-) vRNA ve NS5A (HCV proteini) için sırayla incelendi. Çekirdekler DAPI ile boyandı. Temsilci, (+) RNA'yı yeşil (Alexa 647 ile etiketlenmiş) (-) RNA'yı kırmızı (Atto 555 ile etiketlenmiş), NS5A'yı beyaz (Alexa 488'e konjuge edilmiş ikincil keçi anti-fare) ve çekirdekleri mavi renkte göstererek her zaman noktasından görüntüleri birleştirdi. Ölçek çubukları 10 μm'yi temsil eder. Alt görüntüler, karşılık gelen zaman noktasından kesilmiş olarak büyütülür. hpi, enfeksiyondan sonraki saatler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Strand'a özgü bDNA FISH ve influenza A virüsü ile enfekte olmuş A549 hücrelerinin immün boyaması. PR8 Grip A virüsü ile enfekte olmuş A549 hücreleri sabitlendi ve (A) IAV nükleoprotein (NP) RNA (Alexa 488 ile etiketlenmiş; Şekilde yeşil) ve (B) IAV polimeraz proteini (PB1) (ikincil keçi anti-fare Atto 550; Şekilde kırmızı) ve çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. (C) Birleştirilmiş görüntü. Ölçek çubuğu 10 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Zika virüsü (ZIKV) ile enfekte olmuş hücrelerde iplikçiklere özgü bDNA FISH. Vero hücreleri, 0.1'lik bir MOI'de ZIKV ile enfekte oldu. Hücreler 48 hpi'de sabitlendi. (A) Hücreler aynı anda duyu (+) vRNA (Alexa 488 ile etiketlenmiş; Şekilde yeşil) ve antisens (-) vRNA (Atto 550 ile etiketlenmiş; Şekilde kırmızı) için boyanmıştır. Çekirdekler DAPI ile boyandı. (A) içinde, beyaz kutu hem (+) hem de (-) vRNA'ya sahip bir bölgeyi gösterir. Girişler (+) vRNA (yeşil) ve daha kıt (-) vRNA türlerinin (kırmızı) yakın çekimini sunar. (B) duyu (+) vRNA (yeşil). (C) antisens (-) vRNA (kırmızı). (A) içindeki ölçek çubuğu 10 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA, DNA ve proteinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesi genellikle kapsamlı optimizasyon gerektirir. Yaygın olarak kullanılan iki yöntem 5-etinil-2-deoksiüridin (EdU) etiketleme ve DNA FISH'tir. EdU etiketlemesi, viral DNA ve proteini aynı anda görselleştirmek için uygulanmıştır, çünkü EdU yeni ortaya çıkan DNA'ya dahil edilir ve daha sonra tıklama kimyası yoluyla azid içeren floresan boyalarla etiketlenir. Bu nedenle EdU etiketlemesi, DNA virüslerinin veya virüslerin yerel virüs replikasyon kinetiğini replikasyon için DNA şablonlarıyla izlemek için kullanılabilir12. Bununla birlikte, EdU etiketlemesinin bir eksikliği, hücreleri bölerken, çoğalan genomun EdU'yu içerecek olması, yüksek arka plan oluşturması ve kafa karıştırıcı görüntü analizi yapmasıdır. DNA FISH, hücre döngüsünden bağımsız olarak bir nükleik asit probunu doğrudan ilgili hedefe hibridize ederek bu sorunları aşabilir. Bununla birlikte, geleneksel FISH, etkili prob hibridizasyonu elde etmek, immün boyamayı ve hatta eşzamanlı RNA boyamasını engellemek için genellikle yüksek sıcaklıklara güvenmiştir13. MICDDRP, çeşitli hücresel sistemlerde DNA, RNA ve proteinin sağlam eşzamanlı floresan etiketlemesini sağlayarak bu sorunları potansiyel olarak atlatabilir.
MICDDRP protokolümüzü kullanarak protein ve nükleik asidi aynı anda etiketleyebileceğimizi göstermiş olsak da, farklı sistemlerde optimizasyona ihtiyaç vardı. Optimize etmemiz gereken ilk ana parametre proteaz tedavisiydi. Proteaz III konsantrasyonunu koşullar arasında değiştirdik. Proteaz tedavisinin optimizasyonu ampirikti, çünkü immün boyama verimliliğinden ödün vermeden en yüksek hibridizasyon verimliliğini neyin sağladığını değerlendirmek için farklı seyreltmeler kullandık. Prob özgüllüğünü ve proteaz tedavisine atfedilen protein boyama etkinliğindeki değişiklikleri değerlendirmek için uygun kontroller yan yana yapıldı. Optimizasyon gerektiren bir sonraki ana parametreler prob tasarımı ve prob hibridizasyonu idi.
Yakalama ve amplifikatör problarının uygun tasarımı, bDNA teknolojisinin hassasiyetini ve özgüllüğünü elde etmek için kritik öneme sahiptir. Prob tasarımını geliştirmek için spesifik olmayan hibridizasyon olaylarının olasılığını tahmin eden yazılım paketleri mevcuttur 7,11. Beraberindeki ön amplifikatör, amplifikatör ve floresan etiket problarına sahip bDNA probları, bDNA görüntüleme kitleriyle uyumluluğu sağlamak için artık ticari olarak satın alınabilir. Kullanıcılar, üreticilere hedef bölge (ler) için bir fasta dosyası (nükleotid dizisini temsil etmek için metin tabanlı format) biçiminde dizi bilgileri (~ 300-1000 baz çifti) sağlayabilir. Hedef problar, sağlanan diziye %90'lık > dizi homolojisi ile üretilir.
DNA etiketlemesi için, Protokolün 5. Adımında açıklanan hibridizasyon tamponundaki probların seyreltilmesinin DNA hibridizasyonunu geliştirdiğini bulduk. Hem DNA hem de RNA'yı etiketlerken, RNA probu hibridizasyon tamponunda seyreltilebilir. RNaz'ın yokluğunda DNA etiketlemesi, gözlemlenen nükleik asidin hedeflenen karaya oturmuşluğun RNA'sını içerme olasılığını dışlayamaz. Hibridizasyon verimliliğini artırmak için sıcaklığın da ayarlanması gerekebilir. Artan sıcaklık, protein boyama verimliliğini etkileyebilir, çünkü artan sıcaklıklar protein denatürasyonunu teşvik edebilir ve birincil antikorun epitop tanınmasını engelleyebilir. Sunduğumuz temsili verilerde, 40 °C'de ISH gerçekleştirdik.
Geleneksel DNA BALIKLARI ile karşılaştırıldığında, micddrp, floresan mikroskobu ile görselleştirmek için DNA, RNA ve proteini aynı anda etiketlemek için geliştirilmiş bir prosedür sağlar. Potansiyel bir sınırlama, prob seçiminin hibridizasyonun verimliliğini ve problar arasındaki verileri nicel olarak karşılaştırma yeteneğini etkileyebilmesidir. Bu protokol, elimizde bulunan çeşitli hücresel ve viral sistemlerde etkili olmuştur ve değişen koşullarda sadece küçük bir optimizasyona ihtiyaç duyulmaktadır. Son zamanlardaki yüksek profilli yayınlar, HIV entegrasyon yeri seçimi14 ve HIV ters transkripsiyon kinetiği15'i incelemek için yaklaşımımızı kullanmıştır. MICDDRP'nin gelecekteki uygulamaları, viral nükleik asitlerin, spesifik hücresel genlerin ve hücresel proteinlerin nükleik asit dizileri ile eşzamanlı olarak görselleştirilmesini içerebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma tamamen veya kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 ve U54 AI150472) tarafından desteklenmiştir. Dr. Raymond F. Schinazi ve Sadie Amichai'ye influenza A Virüsü ile enfekte olmuş hücreleri sağladıkları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
- Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
- Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
- Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
- Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
- Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
- Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).
