Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een fluorescentiebeeldvormingsbenadering, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en protein (MICDDRP), een methode die in staat is tot gelijktijdige fluorescentie eencellige visualisatie van virale eiwitten en nucleïnezuren van verschillende type en gestrandheid. Deze aanpak kan worden toegepast op een breed scala aan systemen.
Abstract
Het vastleggen van de dynamische replicatie- en assemblageprocessen van virussen is belemmerd door het ontbreken van robuuste in situ hybridisatie (ISH) -technologieën die gevoelige en gelijktijdige etikettering van viraal nucleïnezuur en eiwit mogelijk maken. Conventionele DNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) methoden zijn vaak niet compatibel met immunostaining. We hebben daarom een beeldvormingsbenadering ontwikkeld, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA en protein), die gelijktijdige eencellige visualisatie van DNA, RNA en eiwit mogelijk maakt. In vergelijking met conventionele DNA FISH maakt MICDDRP gebruik van vertakte DNA (bDNA) ISH-technologie, die de gevoeligheid en detectie van oligonucleotide-sondes drastisch verbetert. Kleine modificaties van MICDDRP maken beeldvorming van virale eiwitten mogelijk gelijktijdig met nucleïnezuren (RNA of DNA) van verschillende strengen. We hebben deze protocollen toegepast om de levenscyclus van meerdere virale pathogenen te bestuderen, waaronder humaan immunodeficiëntievirus (HIV)-1, humaan T-lymfotroop virus (HTLV)-1, hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV), Zika-virus (ZKV) en influenza A-virus (IAV). We hebben aangetoond dat we virale nucleïnezuren en eiwitten efficiënt kunnen labelen voor een breed scala aan virussen. Deze studies kunnen ons een verbeterd mechanistisch begrip geven van meerdere virale systemen en bovendien dienen als een sjabloon voor de toepassing van multiplexed fluorescentie beeldvorming van DNA, RNA en eiwit over een breed spectrum van cellulaire systemen.
Introduction
Hoewel er duizenden commerciële antilichamen beschikbaar zijn om eiwitten specifiek te labelen via conventionele immunostaining-benaderingen, en terwijl fusie-eiwitten kunnen worden ontworpen met foto-geoptimaliseerde fluorescerende tags voor het volgen van meerdere eiwitten in een monster1, is microscopische visualisatie van eiwit vaak niet compatibel met conventionele DNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)2 . Technische beperkingen in gelijktijdige visualisatie van DNA, RNA en eiwit met behulp van op fluorescentie gebaseerde benaderingen hebben een diepgaand begrip van virusreplicatie belemmerd. Door zowel viraal nucleïnezuur als eiwit in de loop van de infectie te volgen, kunnen virologen fundamentele processen visualiseren die ten grondslag liggen aan virusreplicatie en assemblage 3,4,5,6.
We hebben een beeldvormingsbenadering ontwikkeld, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en Protein (MICDDRP)3, die gebruik maakt van vertakte DNA (bDNA) in situ technologie om de gevoeligheid van nucleïnezuurdetectie te verbeteren 7,8,9 . Bovendien maakt deze methode gebruik van gepaarde sondes voor verbeterde specificiteit. bDNA-sequentiespecifieke sondes gebruiken vertakkende voorversterker en versterker-DNA's om een intens en gelokaliseerd signaal te produceren, ter verbetering van eerdere hybridisatiemethoden die afhankelijk waren van het richten op herhaalde gebieden in het DNA9. Geïnfecteerde cellen in een klinische context bevatten vaak geen overvloedig viraal genetisch materiaal, wat een grondstof vormt voor een gevoelige methode voor fluorescente nucleïnezuurdetectie in diagnostische omgevingen. De commercialisering van bDNA-technologie door middel van benaderingen zoals RNAscope7 en ViewRNA10 hebben deze niche opgevuld. De gevoeligheid van bDNA-fluorescentiebeeldvorming heeft ook een belangrijk nut in de celbiologie, waardoor schaarse nucleïnezuursoorten in celkweekmodellen kunnen worden gedetecteerd. De enorme verbetering van de gevoeligheid maakt op bDNA gebaseerde beeldvormingsmethoden geschikt voor het bestuderen van virussen. Een mogelijke tekortkoming is echter dat deze methoden zich richten op het visualiseren van RNA of RNA en eiwit. Alle replicerende cellen en veel virussen hebben DNA-genomen of vormen DNA tijdens hun replicatiecyclus, waardoor methoden die in staat zijn om zowel RNA als DNA, evenals eiwitten, in beeld te brengen, zeer wenselijk zijn.
In het MICDDRP-protocol voeren we bDNA FISH uit voor detectie van viraal nucleïnezuur met behulp van de RNAscope-methode, met wijzigingen7. Een van de belangrijkste wijzigingen in dit protocol is optimalisatie van proteasebehandeling na chemische fixatie. Proteasebehandeling vergemakkelijkt de verwijdering van eiwitten gebonden aan nucleïnezuur om de hybridisatie-efficiëntie van de sonde te verbeteren. Proteasebehandeling wordt gevolgd door incubatie met vertakte oligonucleotide-sonde(s). Na het aanbrengen van bDNA-sonde(s) worden monsters gewassen en vervolgens geïncubeerd met signaalvoorversterker en versterker-DNA's. Multiplexed in situ hybridization (ISH), labeling van meerdere gendoelen, vereist doelsondes met verschillende kleurkanalen voor spectrale differentiatie7. Incubatie met DNA-versterkers wordt gevolgd door immunofluorescentie (IF).
bDNA ISH verleent verbeteringen in signaal-naar-ruis door versterking van doelspecifieke signalen, met een vermindering van achtergrondruis van niet-specifieke hybridisatiegebeurtenissen 7,11. Doelsondes zijn ontworpen met behulp van softwareprogramma's die openbaar beschikbaar zijn en die de waarschijnlijkheid van niet-specifieke hybridisatiegebeurtenissen voorspellen en de smelttemperatuur (Tm) van de probe-target hybride 7,11 berekenen. Doelsondes bevatten een 18- tot 25-basengebied dat complementair is aan de doel-DNA / RNA-sequentie, een spacer-sequentie en een 14-base staartsequentie. Een paar doelsondes, elk met een verschillende staartsequentie, hybridiseren naar een doelgebied (verspreid over ~ 50 bases). De twee staartsequenties vormen een hybridisatieplaats voor de voorversterkersondes, die 20 bindingsplaatsen voor de versterkersondes bevatten, die bovendien 20 bindingsplaatsen voor de labelsonde bevatten. Als voorbeeld, een gebied van één kilobase (kb) op het nucleïnezuurmolecuul wordt gericht door 20 sondeparen, waardoor een moleculaire steiger ontstaat voor sequentiële hybridisatie met de voorversterker, versterker en labelsonde. Dit kan dus leiden tot een theoretische opbrengst van 8000 fluorescerende labels per nucleïnezuurmolecuul, waardoor detectie van afzonderlijke moleculen en enorme verbeteringen ten opzichte van conventionele FISH-benaderingen7 mogelijk worden (zie figuur 1A voor schematische bDNA-signaalversterking). Als u sondes wilt instellen voor gemultiplexte ISH, moet elke doelsonde zich in een ander kleurkanaal bevinden (C1, C2 of C3). Deze doelsondes met verschillende kleurkanalen bezitten verschillende 14-base staartsequenties. Deze staartsequenties binden verschillende signaalversterkers met verschillende fluorescerende sondes, waardoor gemakkelijke spectrale differentiatie over meerdere doelen mogelijk wordt. In het gepresenteerde protocol, tabel 4 in stap 9, vindt u meer informatie over fluorescerend labelende doelsondes. Daarnaast geven figuur 2 en figuur 3 voorbeelden van hoe we de juiste versterker 4-FL (A, B of C) (fluorescerende sonde en de laatste hybridisatiestap) hebben gekozen om specifieke fluorescerende etikettering van meerdere virale nucleïnezuurdoelen na HIV-1- en HTLV-1-infecties te bereiken.
We hebben verschillende toepassingen van gelijktijdige fluorescentievisualisatie van RNA, DNA en eiwitten gedemonstreerd, waarbij kritieke stadia van virusreplicatie met een hoge spatiotemporale resolutie 3,4,5 werden waargenomen. Bijvoorbeeld, gelijktijdige eencellige visualisatie van viraal RNA, cytoplasmatisch en nucleair DNA en eiwit hebben ons in staat gesteld om belangrijke gebeurtenissen tijdens HIV-1-infectie te visualiseren, waaronder het volgen van RNA-bevattende kernen in het cytoplasma voorafgaand aan nucleaire binnenkomst en integratie van proviraal DNA3. Daarnaast hebben we MICDDRP toegepast om de effecten van gastheerfactoren en medicamenteuze behandeling op virale infectie en replicatiete karakteriseren 4,5. In Ukah et al. volgden we reactivering van HIV-1-transcriptie in latentiecelmodellen die werden behandeld met verschillende latentie-omkeermiddelen om HIV-transcriptie en latentieomkering te visualiseren4. Bovendien kan MICDDRP ons in staat stellen om fenotypische veranderingen geassocieerd met antivirale remming toegeschreven aan behandeling van kleine moleculen of gastheerfactorbeperking te visualiseren. Als een proof of concept voor de robuustheid en brede toepasbaarheid van onze aanpak, hebben we aangetoond dat we wijzigingen van ons protocol kunnen gebruiken om viraal nucleïnezuur efficiënt te labelen om infectie te volgen, niet alleen in humaan immunodeficiëntievirus (HIV) -1, maar ook humaan T-lymfotroop virus (HTLV) -1, hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV), Zikavirus (ZIKV) en influenza A-virus (IAV). Omdat de HIV-1-levenscyclus bestaat uit zowel viraal DNA- als RNA-soorten, hebben we het grootste deel van onze optimalisatie van MICDDRP uitgevoerd na hiv-1-replicatiekinetiek. Daarnaast hebben we echter aangetoond dat we de synthese van verschillende virale RNA-transcripten van een of beide zintuig (+) en antisense (-) strandedness in virussen zoals ZIKV, IAV, HBV en HCV kunnen volgen om virale transcriptie en replicatie te controleren 3,4,5,6. De studies zijn gericht op het verbeteren van het mechanistische begrip van verschillende virale processen en dienen als richtlijn om deze fluorescentiebeeldvormingstechnologie te implementeren in een breed scala aan cellulaire modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zaadcellen (suspensie versus aanhangende cellen) op coverslips of kamerdia's (protocol gepresenteerd maakt gebruik van coverslips).
- Zaaien van suspensiecellen
- Bereid poly-D-lysine (PDL) gecoate coverslips (vergemakkelijkt de hechting van suspensiecellen aan coverslip) door eerst coverslips in ethanol (EtOH) gedurende 5 minuten te broeden (steriliseert coverslips en verwijdert eventuele resten). Was vervolgens 2x in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voordat u coverslips in PDL (20 μg / ml) gedurende 30 minuten (min) bij kamertemperatuur (RT) broedt.
- Verwijder PDL en was 2x in PBS. Pelletcellen (eerder geïnfecteerd/behandeld op basis van gewenste beeldvormingsomstandigheden) en resuspenderen 106cellen in 50 μL PBS. Spot 50 μL cellen op glas (PDL-gecoat) en incubeer bij RT gedurende 30 minuten.
- Zaaien van aanhangende cellen
- Kweekcellen op steriele coverslip geplaatst in 6-well schotel en infecteren cellen met virale deeltjes of behandelen met verbinding van belang. Laat cellen 50-70% confluency bereiken voorafgaand aan de monstervoorbereiding voor beeldvormingsexperimenten.
2. Cellulaire fixatie: om cellulaire morfologie te behouden voor fluorescentiebeeldvormingsstudies
OPMERKING: Houd 4% PFA en PBS op RT gedurende ten minste 30 minuten voor cellulaire fixatie.
- Aspirateer de cellulaire media, was cellen op coverslips 3x in PBS en fixeer cellen in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 minuten. Aspirateer PFA en wascellen in PBS 2x.
OPMERKING: Cellen kunnen nu worden uitgedroogd en opgeslagen als de experimentator het experiment op een andere datum wil hervatten. Vaste cellen kunnen worden gedehydrateerd in EtOH voorafgaand aan opslag.- Verwijder PBS na het wassen na cellulaire fixatie en vervang door 500 μL van 50% EtOH (v/v in water). Incubeer bij RT gedurende 5 min.
- Verwijder 50% EtOH en vervang door 500 μL van 70% EtOH. Incubeer bij RT gedurende 5 min.
- Verwijder 70% EtOH en vervang door 500 μL van 100% EtOH. Incubeer bij RT gedurende 5 min.
- Verwijder 100% EtOH en vervang door verse 100% EtOH.
OPMERKING: Gedehydrateerde cellen kunnen gedurende 6 maanden bij -20 °C worden bewaard. Sluit platen af met tape of parafilm voorafgaand aan opslag om verdamping van EtOH te voorkomen. - Rehydrateer cellen om over te gaan op multiplexed fluorescentie labeling van cellen / virus.
- Verwijder 100% EtOH en vervang door 500 μL van 70% EtOH. Incubeer bij RT gedurende 2 min.
OPMERKING: Laat cellen op geen enkel moment uitdrogen. Gebruik altijd voldoende oplossing om alle cellen onder te dompelen. - Verwijder 70% EtOH en vervang door 500 μL van 50% EtOH. Incubeer bij RT gedurende 2 min.
- Verwijder 50% EtOH en vervang door 1x PBS.
OPMERKING: Bereid proteaseverdunning, hybridisatiesondes en wasbuffer voor voorafgaand aan de proteasebehandeling (stap 4) en de doelsondetoepassing (stap 5). Specifieke instructies voor de bereiding van reagens worden aan het begin van elke respectieve stap gepresenteerd.
| Reagentia | Overige opmerkingen |
| Protease oplossing | Voorbereiden in 1X PBS |
| Doel oligonucletodie sonde(s) | Verdunnen in hybridisatiebuffer |
| Wasbuffer | Wasbeurten volgens doelhybridisatiestappen |
| Hybridisatiebuffer | Recept in tabel 3 |
Tabel 1: Belangrijke reagentia in het MICDDRP-protocol.
3. Celpermeabilisatie: verhoogt de toegang tot de cel en cellulaire organellen voor binnenkomst van grote moleculen (antilichamen, nucleïnezuurhybridisatiesondes)
- Verwijder 1x PBS na cellulaire fixatie of rehydratatie en vervang door 500 μL van 0,1% (v/v) Tween-20 in 1x PBS. Incubeer bij RT gedurende 10 min. Vervang één voor één. Was één keer met 500 μL 1x PBS en voeg verse 1x PBS toe.
4. Coverslip immobilisatie op glasschuif en proteasebehandeling om nucleïnezuurbindende eiwitten uit vast viraal / cellulair nucleïnezuur te verwijderen om de hybridisatie-efficiëntie te verbeteren
OPMERKING: Bereid de verdunde Protease III (zie details van reagens in de tabel met materialen) oplossing tijdens cellulaire permeabilisatie. Laat protease RT bereiken gedurende 10 minuten voordat het permeabiliseert.
- Plaats een klein druppeltje nagellak op een gesteriliseerde glasplaat. Droog de achterkant af (kant zonder cellaag) en plaats de rand van de coverslip op de nagellakdruppel, met de zijkant met de aangehechte cellen naar boven gericht. Voeg enkele druppels PBS toe aan de geïmmobiliseerde coverslip om uitdroging te voorkomen.
- Teken een cirkel (ongeveer 3 mm verwijderd van de coverslip) rond de omtrek van de coverslip die nu aan de dia is bevestigd met behulp van een hydrofobe barrièrepen (waterafstotende pen die reagentia gelokaliseerd houdt op cellen).
- Verdun Protease III in 1x PBS (100 μL/coverslip).
OPMERKING: Proteaseconcentratie moet mogelijk worden aangepast afhankelijk van verschillen in celtypen, sondes of doelnucleïnezuur (en) door empirische optimalisatie (zie discussie). Voor de meest efficiënte RNA/DNA-etikettering in verschillende virale systemen hadden we succes met de volgende verdunningen in tabel 2 hieronder met verdunningen variërend van (1 tot 2) -(1 tot 15) (protease tot 1x PBS).
| Probe Doelen | Proteaseverdunning in 1X PBS (Protease III tot 1X PBS) |
| HIV-1 DNA/RNA | 1 tot 5 |
| HTLV-1 DNA/RNA | 1 tot 5 |
| HBV pgRNA en totaal HBV RNA | 1 tot 15 |
| IAV-RNA | 1 tot 15 |
| ZIKV-RNA | 1 tot 2 |
Tabel 2: Protease III verdunningen in PBS voor virale nucleïnezuurhybridisatie.
- Decanteer de 1x PBS op de coverslip na immobilisatie en breng de verdunde Protease III aan.
- Incubeer in een bevochtigde oven bij 40 °C gedurende 15 min.
- Decant protease oplossing en dompelglijmen onder in 1x PBS. Roer met een schommelschaal gedurende 2 min op RT. Herhaal wassen met nieuwe 1x PBS.
- Was monsters alleen voor DNA-detectie driemaal met nucleasevrij water gedurende 2 minuten, gevolgd door incubatie met 5 mg/ml RNase A verdund in PBS gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Decanteer RNase A-oplossing en was 3x gedurende 2 minuten met ultrapuur water. Ga verder met ISH van doelsonde(s).
OPMERKING: Hybridisatiebuffer verbetert vDNA-detectie zonder de vRNA-kleuringsefficiëntie te beïnvloeden voor de gepresenteerde resultaten (representatieve resultaten). Verdunde DNA-kanaal 1 (C1) sondes 1:1 met hybridisatiesonde. Verdun RNA C2- en C3-sondes in hybridisatiebuffer. De C2- en C3-sondes die in onze beeldvormingsstudies worden gebruikt, zijn in 50X-oplossingen (1:50; doelsonde naar hybridisatiebuffer).
- Bereid hybridisatiebuffer voor in nucleasevrij water volgens de onderstaande stapsgewijze procedure:
- Voeg in een buis van 15 ml 700 μL nucleasevrij water, 300 μL van 50% (gewicht/volume (w/v)) dextransulfaat, 300 μL 5 M NaCl, 125 μL 200 mM natriumcitraat (pH 6,2) en 375 mg (poeder) ethyleencarbonaat toe.
- Meng goed met behulp van een vortex om ethyleencarbonaat op te lossen (zorg ervoor dat al het poeder is opgelost en een heldere oplossing heeft).
- Voeg 25 μL van 10% (volume/volume (v/v)) Tween-20 en voldoende nucleasevrij water toe om 2,5 ml (2x oplossing) te voltooien.
OPMERKING: Het recept voor de gepresenteerde hybridisatiebuffer is te vinden in tabel 3 hieronder. Oplossing is stabiel voor een week. Zorg voor voldoende menging van Tween-20 wasmiddel, terwijl u voorzichtig bent om borrelen van de oplossing te voorkomen.
| Reagens | Voorraad concentratie | Aanvullende opmerkingen |
| Nucleasevrij water | NA | |
| Dextransulfaat | 50% (zonder) | Zeer stroperig |
| Tafelzout | 5 meter | |
| Natriumcitraat (pH 6,2) | 200m | Bewaren bij 4 °C |
| Ethyleencarbonaat | NA | Poeder |
| Tween-20 | 10% (v/v) |
Tabel 3: Hybridisatiebufferlijst van reagentia.
5. Incubatie met DNA / RNA-doelhybridisatiesondes: Doel-oligonucleotidesondes binden aan regio('s) van belang, waardoor een moleculaire scaffold ontstaat voor voorversterkers, versterkers en fluorescerende sondes om te binden.
OPMERKING: Warm DNA/RNA-sondes op bij 40 °C gedurende 10 minuten (tijdens celpermeabilisatie) en koel af tot RT gedurende ten minste 10 minuten, als er geen RNase-behandeling is inbegrepen. Als RNase-behandeling of verdere monsterbehandeling nodig is voorafgaand aan de hybridisatie van de doelsonde, warme sondes dienovereenkomstig. Spin C2- en C3-sondes na opwarming en verdun in hybridisatiebuffer. Na verdunning kunnen C2- en C3-sondes kort worden opgewarmd. Warm 50x wasbuffer (zie materiaaltabel voor meer details) op 40 °C gedurende 10-20 minuten en verdun tot 1x in water van moleculair biologische kwaliteit.
- Incubeer 200 μL van de hybridisatiebuffer bij 67 °C gedurende 10 minuten voorafgaand aan de toevoeging van hybridisatiesonde(s). Verdunde sonde in hybridisatiebuffer (recept vermeld in tabel 2). Voeg 50 μL/coverslip toe.
- Incubeer in de bevochtigde oven bij 40 °C gedurende 2 uur (h). Decanteer sondes en dompelglijmen in 1x wasbuffer. Roer door de schaal 2 min te wiegen op RT. Herhaal de was met nieuwe 1x wasbuffer.
6. Versterker (Amp) 1-FL Hybridisatie: Toevoeging van voorversterker die complementair is aan de staartsequentie van de doel-DNA / RNA-sondes (stap 5)
OPMERKING: Versterkers moeten voor gebruik op RT staan. Haal elke individuele versterker 30 minuten voor gebruik uit de koelkast en laat op de bank bij RT liggen.
- Verwijder dia's uit 1x wasbuffer en tik/absorbeer om overtollige vloeistof te verwijderen.
- Voeg 1 druppel Amp 1-FL toe aan de coverslip. Incubeer in een bevochtigde oven bij 40 °C gedurende 30 min.
- Decant Amp 1-FL en dompel onder in 1x wasbuffer. Roer door de schaal 2 min op RT te wiegen. Herhaal de was met nieuwe 1x wasbuffer.
7. Amp 2-FL Hybridisatie: Incubatie met signaalversterker met cognate herkenningsvolgorde naar voorversterkers (Amp 1-FL)
- Verwijder dia's uit 1x wasbuffer en tik/absorbeer om overtollige vloeistof te verwijderen.
- Voeg 1 druppel Amp 2-FL toe aan de coverslip. Incubeer in een bevochtigde oven bij 40 °C gedurende 15 min.
- Decant Amp 2-FL en dompel onder in 1x wasbuffer. Roer door de schaal 2 min op RT te wiegen. Herhaal de was met nieuwe 1x wasbuffer.
8. Amp 3-FL Hybridisatie: Incubatie met tweede signaalversterker
- Verwijder dia's uit 1x wasbuffer en tik/absorbeer om overtollige vloeistof te verwijderen.
- Voeg 1 druppel Amp 3-FL toe aan de coverslip. Incubeer in een bevochtigde oven bij 40 °C gedurende 30 min.
- Decant Amp 3-FL en dompel onder in 1x wasbuffer. Roer door de schaal 2 min op RT te wiegen. Herhaal de was met nieuwe 1x wasbuffer.
9. Amp 4-FL Hybridisatie: fluorescerend label en laatste hybridisatiestap
OPMERKING: Zie eerst tabel 4 om de geschikte Amp 4 (A, B of C) - FL te kiezen op basis van de kanalen van de doelsonde(s). Beoordeel welke Amp 4-FL nodig is om DNA/RNA van belang te labelen. Een voorbeeld wordt gegeven door de onderstaande tabel:
| Een | B | C | |
| DNA-kanaal 1 (C1) | 488 | 550 | 550 |
| DNA/RNA-kanaal 2 (C2) | 550 | 488 | 647 |
| RNA-kanaal 3 (C3) | 647 | 647 | 488 |
Tabel 4: Selectie van Amp 4 (A, B of C)-FL fluorescentiesonde voor gemultiplexte ISH.
OPMERKING: Voor multiplexed FISH (meerdere doelen) is het kiezen van de juiste Amp 4 (A, B of C) - FL van cruciaal belang voor het correct labelen van uw doel van interesse (s). Doelsondes (stap 5) hebben verschillende kleurkanalen (C1, C2 of C3), die hun respectieve fluorescerende label (Alexa 488, Atto 550 of Alexa 647) dicteren, op basis van de gekozen Amp 4-FL. Voorbeelden van het kiezen van fluorofoorcombinaties voor multiplexed imaging worden gegeven in de legenda's van figuur 2 en figuur 3. Als bijkomend voorbeeld zal de selectie van Amp 4B-FL selectief DNA C1-sondes labelen met Atto 550 en RNA C3-sondes met Alexa 647.
- Verwijder dia's uit 1x wasbuffer en tik/absorbeer om overtollige vloeistof te verwijderen.
- Voeg 1 druppel Amp 4-FL toe aan de coverslip. Incubeer in een bevochtigde oven bij 40 °C gedurende 15 min.
OPMERKING: Volg stap 9.2, houd monsters bedekt, beschermd tegen het licht. - Decant Amp 4-FL en dompel onder in 1x wasbuffer. Roer door de schaal 2 min te wiegen op RT. Herhaal de was met nieuwe 1x wasbuffer. Wassen met 1x PBS (2 min) en bewaren in PBS.
10. Eiwitimmunostaining: om eiwitten van belang te labelen
- Decanteer PBS en voeg 200 μL blokkeerbuffer (1% w/v BSA, 10% v/v FBS in PBS met 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) toe aan de coverslip. Incubeer 1 uur bij RT.
- Decanterende blokkeringsbuffer en breng 200 μL primair antilichaam verdund in PBST + 1% w/v BSA aan. Incubeer 1 uur bij RT.
- Was de glijbaan twee keer met PBST gedurende 10 minuten op RT met schudden.
- Breng secundair antilichaam naar keuze aan gedurende 1 uur bij RT in PBST + 1% w / v BSA.
- Was de glijbaan met PBST gedurende 10 minuten op RT met schudden.
11. Nucleaire kleuring: Contra-vlekkernen na immunostaining
- Decanteer PBST en breng DAPI of nucleaire vlek naar keuze aan gedurende 1 min bij RT.
- Was de glijbaan twee keer met PBS gedurende 10 minuten op RT met schudden.
12. Montage
- Plaats 1 druppel antifade-oplossing (bijv. Prolong Gold) op een nieuwe steriele glazen glijbaan (eerst glijbaan reinigen met EtOH en laten drogen om ervoor te zorgen dat er geen resten op glas zitten). Verdeel met dezelfde punt de druppel antifade-oplossing om een gebied te bedekken dat ongeveer zo groot is als de coverslip.
OPMERKING: De antifade-oplossing is erg stroperig en kan moeilijk te pipetteren zijn. Het afsnijden van de tip van een tip van 200 μL voorafgaand aan het pipetteren kan deze problemen verminderen. - Verwijder coverslip met celmonster van de dia en dompel onder in PBS om resterende nagellak aan de achterkant te verwijderen met behulp van de tang en PBS. Droge tang en achterkant van de coverslip met behulp van een Kimwipe.
- Voorzichtig ingebedde coverslip in de druppel antifade-oplossing, waarbij de monsterzijde (zijkant met cellaag) van coverslip op druppel wordt geplaatst).
- Laat de monsters een nacht drogen.
13. Beeldvorming
- Afbeelding met een epifluorescente microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schema van MICDDRP is weergegeven in figuur 1. Labeling van DNA en RNA wordt gevolgd door immunostaining. Het gebruik van vertakkende versterkers verhoogt het signaal, waardoor detectie van enkele nucleïnezuurmoleculen mogelijk is.
Figuur 1: Schema van MICDDRP en stapsgewijze workflow. (A) het bDNA-signaal wordt versterkt via vertakkende voorversterker en versterker-DNA's om de detectie van viraal DNA (1) en RNA-soorten (2) te verbeteren. Oligonucleotide-sondes worden gehybridiseerd in paren (ZZ in schematisch) om interessante doelen te bereiken, waardoor een steiger ontstaat voor voorversterker (Amp 1-FL, stap 6 in protocol), versterker (Amp 2- &3-FL) en fluorescerende sondes (Amp 4, stap 9 in protocol). Raadpleeg tabel 4 voor het kiezen van de juiste Amp 4 (A, B of C)-FL voor gemultiplexte ISH. Etikettering van nucleïnezuur wordt gevolgd door immunostaining eiwitten van belang (3). (B) Dertien hoofdstappen in het MICDDRP-protocol met schatting van de tijdsduur voor elke respectieve stap. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Toepassing van MICDDRP om het verloop van hiv-1-infectie te bestuderen is een nuttig hulpmiddel geweest bij het volgen van virale replicatiekinetiek in primaire cellen. Als proof of concept van deze procedure worden HIV-1 DNA, RNA en eiwit tegelijkertijd microscopisch gelabeld en gevisualiseerd op het niveau van één cel (figuur 2). Twee HIV-1 DNA-genomen worden gevisualiseerd in een enkele cel, omdat ze actief viraal RNA (vRNA) transcriberen. vRNA is geëxporteerd via het nucleaire poriecomplex en viraal eiwit wordt gesynthetiseerd in het cytoplasma.
Figuur 2: MICDDRP van mononucleaire cellen in het primaire bloed (PMBC's) geïnfecteerd met HIV-1. PMBC's geïnfecteerd met HIV-1 (NL4.3) bij een veelvoud aan infecties (MOI) van 2. Cellen werden 48 uur na infectie (hpi) gefixeerd. (A) HIV-1 bDNA FISH-sonde (gelabeld met ATTO 550; rood in figuur). Deze sonde hybridiseert naar de sjabloon (3'<-5') vDNA-streng om kruisverwijzing met sense (+) vRNA te voorkomen. (B) Ongepliceerd HIV-1 RNA (gelabeld met Alexa 647; groen in figuur). De HIV-1 vRNA-sonde hybridiseert naar virale transcripten die zijn getranscribeerd in de 5'->3'-oriëntatie. (C) Immunostaining van HIV-1 capsid (p24) eiwit (secundair antilichaam geconjugeerd aan Alexa 488; wit in figuur). (D) Samengevoegde afbeelding. De schaalbalk vertegenwoordigt 5 μm. Kernen waren gekleurd met DAPI (blauw). Om HIV-1 DNA (DNA C1-sonde) te labelen met respectievelijk ATTO 550 en HIV-1 RNA (RNA C3-sonde) met Alexa 647, werden monsters geïncubeerd met Amp 4-FL 'B' (raadpleeg tabel 4 in Protocol om geschikte kanaalkleuren voor hybridisatiesondes te kiezen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Daarnaast hebben we dual viral DNA (vDNA) en vRNA-kleuring uitgevoerd om HTLV-1-infectie te volgen. Voor optimalisatie van de nucleïnezuuretikettering hebben we ons nauw gehouden aan de vDNA / VRNA-kleuringsprocedure die is ontwikkeld voor multiplexed fluorescentiebeeldvorming van HIV-infectie. We hebben aangetoond dat we HTLV-1 DNA en RNA tegelijkertijd specifiek kunnen labelen.
Figuur 3: Gelijktijdige labeling van HTLV-1 vDNA en vRNA in MT-2 cellen. (A) HTLV-1 vDNA (gelabeld met ATTO 550; rood in figuur) (B) Ongesplitst HTLV-1 zintuig (+) RNA (RNA C2-sonde & gelabeld met Alexa 488; groen in figuur)). (C) HTLV-1 HBZ antisense (-) vRNA (RNA C3 probe & (gelabeld met Alexa 647; wit in figuur)). (D) Samengevoegde afbeelding. De schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. Kernen waren gekleurd met DAPI (blauw). Amp 4-FL 'B' werd gebruikt (zie tabel 4 in protocol) om multiplexed labeling van HTLV-1 ('+' &'-') RNA te bereiken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Controle-experimenten om de specificiteit en achtergrond van de doelsonde te beoordelen. De specificiteit van hiv-1- en HTLV-1-doelsondes werd beoordeeld na infectie in lymfocytische cellijnen (niet-geïnfecteerde Jurkat T-cellen, HTLV-1 geïnfecteerde cellen (MT2) en hiv-1 geïnfecteerde cellen (H9111B)). Schaalstaven vertegenwoordigen 10 μm. (A) Cellen werden behandeld met HTLV-1 RNA-sondes. (B) Cellen werden behandeld met HIV-1 (+) RNA-sonde (C-D). Verdere demonstratie van de specificiteit van HTLV-1 probes zonder kruisreactiviteit met HIV-1. Witte pijlen in figuur 4C geven HTLV-1 DNA (rood) aan. (E-F). vRNA-kleuring (groen) +/- RNase-behandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om de specificiteit van de hybridisatiesondes te verifiëren en om te beoordelen hoe de ISH-etiketteringsmethode de efficiëntie van eiwitkleuring en de algehele achtergrond beïnvloedt, voeren we kritische controles uit om het hoogste niveau van striktheid en reproduceerbaarheid voor de experimenten te garanderen. Als voorbeeld verifiëren we in figuur 4A-D de specificiteit van onze HIV-1- en HTLV-1 vDNA- en vRNA-sondes, omdat we zeer weinig tot geen kruisreactiviteit laten zien tussen de sondesets over de twee virussen. Ondanks het labelen van twee retrovirussen met het potentieel voor sondekruisreactiviteit, zijn de HIV-1-sondes alleen specifiek voor HIV-1 genetisch materiaal en niet HTLV-1. Dezelfde trend geldt voor de HTLV-1 sondes. Bovendien laten we in figuur 4F zien dat we vRNA-kleuring kunnen elimineren als we onze cellen RNase-behandelen tijdens de monstervoorbereiding. Om de mogelijkheid van verzwakking van eiwitkleuringsefficiëntie als gevolg van ISH (proteasebehandeling (stap 4 in Protocol & Figuur 1B) en hybridisatiecondities te beoordelen, wat kan leiden tot ablatie van epitoopherkenning of verhoogd achtergrondsignaal, tonen we aan dat eiwitkleuringsefficiëntie voor de nucleaire spikkelmarker, sc-35, vergelijkbaar is met conventionele IF-benaderingen en immunostaining tijdens het MICDDRP-protocol. In het conventionele IF-protocol werden cellen gedurende 15 minuten gepermeabiliseerd met 0,1% Triton X-100, in plaats van permeabilisatie met 0,1% Tween-20 gedurende 10 minuten, wat wordt gebruikt in het MICDDRP-protocol (stap 3 in Protocol en workflow in figuur 1B). Eiwitkleuring over beide omstandigheden (IF vs. MICDDRP) produceerde een signaal dat enkele ordes van grootte groter was dan de controle (MICDDRP zonder primair antilichaam), wat verder de lage achtergrond aantoont die volgens dit protocol wordt gegenereerd en het behoud van eiwitepithopen voor efficiënte immunostaining. Beeldkwantificering van de gemiddelde geïntegreerde fluorescentie-intensiteit van sc-35-signaal per cel (figuur 5E) werd uitgevoerd zoals eerder beschreven3. Voor alle getoonde beeldvormingsresultaten hebben we gezorgd voor sonde- en antilichaamspecificiteit, evenals mogelijke verstoringen of hoger dan normaal achtergrondgeluid dat wordt toegeschreven aan onze ISH-aanpak.
Figuur 5: Vergelijking van de efficiëntie van eiwitkleuring volgens conventionele IF versus MICDDRP. Het cellulaire eiwit, sc-35, een biomarker voor nucleaire spikkels, was immunostained in Jurkat T-cellen. Alle schaalstaven vertegenwoordigen 10 μm. (A) Niet-geïnfecteerde Jurkat T-cellen ondergingen het MICDDRP-protocol en werden behandeld met HIV-1 DNA / RNA-hybridisatiesondes die werden gebruikt in figuur 2 en figuur 4 hierboven. Tijdens immunostaining werd geen primair antilichaam toegevoegd. (B). Niet-geïnfecteerde Jurkat T-cellen ondergingen conventionele IF, met sc-35 (wit). Cellen werden gedurende 15 minuten gepermeabiliseerd met 0,1% Triton X-100. (C). MICDDRP werd uitgevoerd op HIV-geïnfecteerde Jurkat T-cellen. vRNA is groen gelabeld, vDNA is rood en sc-35 is wit. (D). Close-up van vRNA, vDNA en eiwitetikettering (sc-35) in hiv-geïnfecteerde cellen. (E) Kwantificering van het gemiddelde geïntegreerde fluorescentiesignaal per cel van sc-35 over verschillende immunostaining-omstandigheden. De y-as bevindt zich op een logaritmische schaal. De stippellijn vertegenwoordigt het achtergrondsignaal van niet-geïnfecteerde cellen die het MICDDRP-protocol hebben ondergaan waarbij geen primair antilichaam is toegevoegd. Geen significant verschil in signaal na MICDDRP versus conventionele IF. Meer dan 500 cellen werden bemonsterd voor kwantificering voor bereik respectievelijke conditie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Deze methode kan ook worden toegepast om RNA-virussen te bestuderen die al dan niet DNA-sjablonen voor virale replicatie bevatten. Strengspecifieke bDNA-sondes kunnen bijvoorbeeld worden ontworpen om de expressie van zintuig (+) of antisense (-) streng-RNA en verschillende vRNA-soorten in virussen zoals HBV, HCV, IAV en ZIKV te volgen. De visualisatie van verschillende RNA-soorten tijdens de infectie kan inzicht geven in de replicatiekinetiek van verschillende virale systemen.
Na het tijdsverloop van HBV-infectie kunnen we zien dat de hoeveelheid HBV pre-genomisch RNA (pgRNA) en totaal HBV-RNA toeneemt als functie van de tijd. Daarnaast hebben we tegelijkertijd een cellulaire gastheerfactor, MOV10, geïmpliceerd (figuur 6).
Figuur 6: HBV. Tijdsverloop van HBV-infectie van 3E8-cellen. Cellen werden geïnfecteerd met 300 HBV-genomen per cel. Virale replicatie wordt getoond op drie tijdstippen (24, 48 en 72 hpi). pgRNA (gelabeld met ATTO 550; rood in figuur), totaal HBV-RNA (gelabeld met Alexa 647; groen in figuur) en MOV10 (secundair antilichaam geconjugeerd aan Alexa 488; wit in figuur). Kernen zijn gekleurd met DAPI in blauw. Schaalbalk op samengevoegde afbeeldingen vertegenwoordigt 10 μm. hpi, uren na infectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Beeldvorming werd uitgevoerd via confocale microscopie met behulp van een 60x olie-immersie objectief. De excitatie/ emissie bandpass golflengten die worden gebruikt om DAPI, Alexa 488, ATTO 550 en Alexa 647 te detecteren, werden ingesteld op respectievelijk 405/420-480, 488/505-550, 550/560-610 en 647/655-705 nm (figuur 7, figuur 8 en figuur 9).
Figuur 7: Tijdsverloop van HCV-infectie van Huh-7.5.1-cellen. Huh-7.5.1-cellen werden geïnfecteerd met hepatitis C-virus (HCV) Jc1/Gluc2A bij een MOI van 0,5. Op de aangegeven tijdsintervallen werden de cellen gefixeerd en sequentieel onderzocht op sense (+) vRNA, antisense (-) vRNA en NS5A (HCV-eiwit). Kernen waren gekleurd met DAPI. Representatieve samengevoegde beelden van elk tijdstip, met (+) RNA in groen (gelabeld met Alexa 647), (-) RNA in rood (gelabeld met Atto 555), NS5A in wit (secundaire geitenantimuis geconjugeerd aan Alexa 488) en kernen in blauw. Schaalbalken vertegenwoordigen 10 μm. De onderste afbeeldingen zijn vergrote uitsparingen vanaf het overeenkomstige tijdstip. hpi, uren na infectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Strandspecifieke bDNA FISH en immunostaining van A549-cellen die zijn geïnfecteerd met influenza A-virus. A549-cellen geïnfecteerd met PR8-griep A-virus werden gefixeerd en onderzocht op (A) IAV-nucleoproteïne (NP) RNA (gelabeld met Alexa 488; groen in figuur) en (B) IAV-polymerase-eiwit (PB1) (secundaire geiten-antimuis Atto 550; rood in figuur) en kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). (C) Samengevoegd beeld. Schaalbalk vertegenwoordigt 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Strand-specifieke bDNA FISH in Zika virus (ZIKV)-geïnfecteerde cellen. Vero-cellen werden geïnfecteerd met ZIKV bij een MOI van 0,1. De cellen werden gefixeerd op 48 pki. (A) Cellen werden tegelijkertijd gekleurd voor sense (+) vRNA (gelabeld met Alexa 488; groen in figuur) en antisense (-) vRNA (gelabeld met Atto 550; rood in figuur). Kernen waren gekleurd met DAPI. In (A) geeft het witte vak een gebied aan met zowel (+) als (-) vRNA. De inzetjes vertonen een close-up van (+) vRNA (groen) en de schaarsere (-) vRNA-soorten (rood). (B) sense (+) vRNA (groen). (C) antisense (-) vRNA (rood). Schaalbalk in (A) staat voor 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gelijktijdige visualisatie van RNA, DNA en eiwit vereist vaak uitgebreide optimalisatie. Twee veelgebruikte methoden zijn 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) labeling en DNA FISH. EdU-etikettering is toegepast om viraal DNA en eiwit tegelijkertijd te visualiseren, omdat EdU wordt opgenomen in ontluikend DNA en vervolgens wordt gelabeld met azide-bevattende fluorescerende kleurstoffen via klikchemie. EdU-etikettering kan dus worden gebruikt om native virusreplicatiekinetiek van DNA-virussen of virussen te monitoren met DNA-sjablonen voor replicatie12. Een tekortkoming van EdU-etikettering is echter dat in delende cellen het replicerende genoom EdU zal bevatten, waardoor een hoge achtergrond en verwarrende beeldanalyse wordt gegenereerd. DNA FISH kan deze problemen omzeilen door een nucleïnezuursonde rechtstreeks te hybridiseren naar het betreffende doelwit, ongeacht de celcyclus. Conventionele FISH vertrouwde echter vaak op hoge temperaturen om efficiënte probe-hybridisatie te bereiken, waardoor immunostaining of zelfs gelijktijdige RNA-kleuring werd belemmerd13. MICDDRP kan deze problemen mogelijk omzeilen door robuuste gelijktijdige fluorescerende etikettering van DNA, RNA en eiwit in verschillende cellulaire systemen te bieden.
Hoewel we hebben aangetoond dat we eiwit en nucleïnezuur tegelijkertijd kunnen labelen met behulp van ons MICDDRP-protocol, was optimalisatie nodig in verschillende systemen. De eerste belangrijke parameter die we moesten optimaliseren was proteasebehandeling. We varieerden de protease III-concentratie over de omstandigheden heen. Optimalisatie van proteasebehandeling was empirisch, omdat we verschillende verdunningen gebruikten om te beoordelen wat de grootste hybridisatie-efficiëntie opleverde, zonder afbreuk te doen aan de immunostaining-efficiëntie. Passende controles werden naast elkaar uitgevoerd om de specificiteit van de sonde en veranderingen in de efficiëntie van eiwitkleuring toegeschreven aan proteasebehandeling te beoordelen. De volgende belangrijke parameters die moesten worden geoptimaliseerd, waren het ontwerp van de sonde en de hybridisatie van de sonde.
Een goed ontwerp van capture- en versterkersondes is van cruciaal belang voor het bereiken van de gevoeligheid en specificiteit van bDNA-technologie. Softwarepakketten die de waarschijnlijkheid van niet-specifieke hybridisatiegebeurtenissen voorspellen, zijn beschikbaar om het sondeontwerp 7,11 te verbeteren. bDNA-sondes met de bijbehorende voorversterker-, versterker- en fluorescerende labelsondes kunnen nu commercieel worden gekocht om compatibiliteit met bDNA-beeldvormingskits te garanderen. Gebruikers kunnen fabrikanten voorzien van sequentie-informatie (~ 300-1000 basenparen) voor de doelregio('s) in de vorm van een fasta-bestand (op tekst gebaseerd formaat voor het weergeven van nucleotidesequentie). Doelsondes worden gegenereerd met > 90% sequentie homologie aan de geleverde sequentie.
Voor DNA-etikettering hebben we ontdekt dat verdunning van de sondes in de hybridisatiebuffer beschreven in stap 5 van het protocol de DNA-hybridisatie verbetert. Bij het labelen van zowel DNA als RNA kan de RNA-sonde worden verdund in de hybridisatiebuffer. DNA-etikettering bij afwezigheid van RNase kan de mogelijkheid niet uitsluiten dat het waargenomen nucleïnezuur RNA van de beoogde strengheid bevat. De temperatuur moet mogelijk ook worden aangepast om de hybridisatie-efficiëntie te verbeteren. Toenemende temperatuur kan de efficiëntie van eiwitkleuring beïnvloeden, omdat verhoogde temperaturen denaturatie van eiwitten kunnen bevorderen, waardoor epitoopherkenning van het primaire antilichaam wordt afgebroken. In onze gepresenteerde representatieve gegevens hebben we ISH uitgevoerd bij 40 °C.
In vergelijking met conventionele DNA FISH biedt MICDDRP een verbeterde procedure voor het gelijktijdig labelen van DNA, RNA en eiwit om te visualiseren via fluorescentiemicroscopie. Een mogelijke beperking is dat de selectie van sondes van invloed kan zijn op de efficiëntie van hybridisatie en het vermogen om gegevens tussen sondes kwantitatief te vergelijken. Dit protocol is effectief geweest in diverse cellulaire en virale systemen in onze handen met slechts kleine optimalisatie nodig onder verschillende omstandigheden. Recente spraakmakende publicaties hebben onze aanpak gebruikt om hiv-integratielocatieselectie14 en hiv-reverse transcriptiekinetiek15 te bestuderen. Toekomstige toepassingen van MICDDRP kunnen visualisatie van virale nucleïnezuren omvatten, gelijktijdig met nucleïnezuursequenties van specifieke cellulaire genen en cellulaire eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd geheel of gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 en U54 AI150472). We bedanken Dr. Raymond F. Schinazi en Sadie Amichai voor het leveren van cellen die zijn geïnfecteerd met influenza A-virus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
- Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
- Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
- Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
- Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
- Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
- Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).
