Summary
Presentert her er en protokoll for en fluorescensavbildningsmetode, multiplex i mmunofluorescerende cell-basert d-eteksjon av DNA, RNA og protein (MICDDRP), en metode som er istand til samtidig fluorescens enkeltcellevisualisering av viralt protein og nukleinsyrer av forskjellig type og strenghet. Denne tilnærmingen kan brukes på et mangfoldig utvalg av systemer.
Abstract
Å fange de dynamiske replikasjons- og monteringsprosessene til virus har blitt hindret av mangelen på robuste in situ hybridiseringsteknologier (ISH) som muliggjør sensitiv og samtidig merking av viral nukleinsyre og protein. Konvensjonelle DNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH) metoder er ofte ikke kompatible med immunostaining. Vi har derfor utviklet en avbildningstilnærming, MICDDRP (multiplex immunofluorescerende cell-basert d-eteksjon av DNA, RNA og protein), som muliggjør samtidig encellet visualisering av DNA, RNA og protein. Sammenlignet med konvensjonell DNA-FISK BRUKER MICDDRP forgrenet DNA (bDNA) ISH-teknologi, noe som dramatisk forbedrer oligonukleotidsondens følsomhet og deteksjon. Små modifikasjoner av MICDDRP muliggjør avbildning av virale proteiner samtidig med nukleinsyrer (RNA eller DNA) med forskjellig strenghet. Vi har brukt disse protokollene til å studere livssyklusene til flere virale patogener, inkludert humant immunsviktvirus (HIV) -1, humant T-lymfotropisk virus (HTLV) -1, hepatitt B-virus (HBV), hepatitt C-virus (HCV), Zika-virus (ZKV) og influensa A-virus (IAV). Vi viste at vi effektivt kan merke virale nukleinsyrer og proteiner på tvers av et mangfoldig utvalg av virus. Disse studiene kan gi oss forbedret mekanistisk forståelse av flere virussystemer, og i tillegg tjene som en mal for anvendelse av multiplekset fluorescensavbildning av DNA, RNA og protein over et bredt spekter av cellulære systemer.
Introduction
Mens tusenvis av kommersielle antistoffer er tilgjengelige for å spesifikt merke proteiner via konvensjonelle immunostaining-tilnærminger, og mens fusjonsproteiner kan konstrueres med fotooptimaliserte fluorescerende koder for sporing av flere proteiner i en prøve1, er mikroskopisk visualisering av protein ofte ikke kompatibel med konvensjonell DNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH)2 . Tekniske begrensninger i samtidig visualisering av DNA, RNA og protein ved hjelp av fluorescensbaserte tilnærminger har hindret grundig forståelse av virusreplikasjon. Sporing av både viral nukleinsyre og protein i løpet av infeksjonen gjør det mulig for virologer å visualisere grunnleggende prosesser som ligger under virusreplikasjon og montering 3,4,5,6.
Vi har utviklet en avbildningstilnærming, multiplex immunofluorescerende cell-basert d-eteksjon av DNA, RNA og Protein (MICDDRP)3, som benytter forgrenet DNA (bDNA) in situ-teknologi for å forbedre følsomheten til nukleinsyredeteksjon 7,8,9 . I tillegg bruker denne metoden parrede sonder for forbedret spesifisitet. bDNA-sekvensspesifikke sonder bruker forgreningsforforsterker og forsterker-DNA for å produsere et intenst og lokalisert signal, og forbedrer tidligere hybridiseringsmetoder som var avhengige av å målrette gjentatte regioner i DNA9. Infiserte celler i en klinisk sammenheng inneholder ofte ikke rikelig viralt genetisk materiale, noe som gir en vare for en sensitiv metode for fluorescerende nukleinsyredeteksjon i diagnostiske innstillinger. Kommersialiseringen av bDNA-teknologi gjennom tilnærminger som RNAscope7 og ViewRNA10 har fylt denne nisjen. Følsomheten til bDNA-fluorescensavbildning har også viktig nytte i cellebiologi, noe som gjør det mulig å oppdage knappe nukleinsyrearter i cellekulturmodeller. Den store forbedringen av følsomhet gjør bDNA-baserte bildebehandlingsmetoder egnet for å studere virus. En potensiell mangel er imidlertid at disse metodene fokuserer på å visualisere RNA eller RNA og protein. Alle replikerende celler og mange virus har DNA-genomer eller danner DNA under replikasjonssyklusen, noe som gjør metoder som er i stand til å avbilde både RNA og DNA, samt protein, svært ønskelige.
I MICDDRP-protokollen utfører vi bDNA FISH for påvisning av viral nukleinsyre ved hjelp av RNAscope-metoden, med modifikasjoner7. En av de viktigste modifikasjonene i denne protokollen er optimalisering av proteasebehandling etter kjemisk fiksering. Proteasebehandling letter fjerning av proteiner bundet til nukleinsyre for å forbedre sondehybridiseringseffektiviteten. Proteasebehandling etterfølges av inkubasjon med forgrenet oligonukleotidsonde(r). Etter påføring av bDNA-sonde(r) vaskes prøvene og inkuberes deretter med signalforforsterker og forsterker-DNA-er. Multiplekset in situ hybridisering (ISH), merking av flere genmål, krever målprober med forskjellige fargekanaler for spektral differensiering7. Inkubasjon med DNA-forsterkere etterfølges av immunfluorescens (IF).
bDNA ISH gir forbedringer i signal-til-støy ved forsterkning av målspesifikke signaler, med en reduksjon til bakgrunnsstøy fra ikke-spesifikke hybridiseringshendelser 7,11. Målprober er designet ved hjelp av programvare som er offentlig tilgjengelig som forutsier sannsynligheten for ikke-spesifikke hybridiseringshendelser, samt beregner smeltetemperatur (Tm) for sondemålshybriden 7,11. Målprober inneholder en 18- til 25-baseregion som er komplementær til mål-DNA / RNA-sekvensen, en avstandssekvens og en 14-basehalesekvens. Et par målprober, hver med en distinkt halesekvens, hybridiserer til et målområde (spenner over ~ 50 baser). De to halesekvensene danner et hybridiseringssted for forforsterkerprobene, som inneholder 20 bindingssteder for forsterkerprobene, som i tillegg inneholder 20 bindingssteder for etikettsonden. Som et eksempel er en kilobase (kb) region på nukleinsyremolekylet målrettet av 20 sondepar, og skaper et molekylært stillas for sekvensiell hybridisering med forforsterkeren, forsterkeren og etikettsonden. Dette kan dermed føre til et teoretisk utbytte på 8000 fluorescerende etiketter per nukleinsyremolekyl, noe som muliggjør påvisning av enkeltmolekyler og store forbedringer i forhold til konvensjonelle FISH-tilnærminger7 (Se figur 1A for skjematisk av bDNA-signalforsterkning). Hvis du vil definere sonder for multiplekset ISH, må hver målsonde være i en annen fargekanal (C1, C2 eller C3). Disse målprobene med forskjellige fargekanaler har forskjellige 14-baserte halesekvenser. Disse halesekvensene vil binde distinkte signalforsterkere med forskjellige fluorescerende sonder, og dermed muliggjøre lettvint spektral differensiering på tvers av flere mål. I den presenterte protokollen, tabell 4 i trinn 9, finner du ytterligere informasjon om fluorescerende merking av målprober. I tillegg gir figur 2 og figur 3 eksempler på hvordan vi valgte riktig forsterker 4-FL (A, B eller C) (fluorescerende sonde & det endelige hybridiseringstrinnet) for å oppnå spesifikk fluorescerende merking av flere virale nukleinsyremål etter HIV-1- og HTLV-1-infeksjoner.
Vi har demonstrert flere anvendelser av samtidig fluorescensvisualisering av RNA, DNA og proteiner, og observert kritiske stadier av virusreplikasjon med høy spatiotemporal oppløsning 3,4,5. For eksempel har samtidig encellet visualisering av viralt RNA, cytoplasmatisk og nukleært DNA og protein gjort det mulig for oss å visualisere viktige hendelser under HIV-1-infeksjon, inkludert følgende RNA-inneholdende kjerner i cytoplasma før nukleær inngang og integrering av proviralt DNA3. I tillegg har vi brukt MICDDRP til å karakterisere effekten av vertsfaktorer og medikamentell behandling på virusinfeksjon og replikasjon 4,5. I Ukah et al. sporet vi reaktivering av HIV-1-transkripsjon i latenscellemodeller behandlet med forskjellige latens-reverseringsmidler for å visualisere HIV-transkripsjon og latensreversering4. I tillegg kan MICDDRP tillate oss å visualisere fenotypiske endringer assosiert med antiviral inhibering som tilskrives småmolekylær behandling eller vertsfaktorbegrensning. Som et bevis på robustheten og den brede anvendeligheten av vår tilnærming, har vi vist at vi kan bruke modifikasjoner av protokollen vår til effektivt å merke viral nukleinsyre for å følge infeksjon, ikke bare i humant immunsviktvirus (HIV) -1, men også humant T-lymfotropisk virus (HTLV) -1, hepatitt B-virus (HBV), hepatitt C-virus (HCV), Zikavirus (ZIKV), og influensa A-virus (IAV). Siden HIV-1-livssyklusen består av både virale DNA- og RNA-arter, har vi utført størstedelen av vår optimalisering av MICDDRP etter HIV-1-replikasjonskinetikk. I tillegg har vi imidlertid vist at vi kan spore syntese av forskjellige virale RNA-transkripsjoner av enten eller begge sense (+) og antisense (-) strandedness i virus som ZIKV, IAV, HBV og HCV for å overvåke viral transkripsjon og replikasjon 3,4,5,6. Studiene tar sikte på å forbedre den mekanistiske forståelsen av flere virale prosesser og tjene som en retningslinje for å implementere denne fluorescensbildeteknologien til et bredt spekter av cellulære modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Frøceller (Suspension vs. Adherent Cells) på coverslips eller kammer lysbilder (protokoll presentert bruker coverslips).
- Såing av suspensjonsceller
- Forbered poly-D-lysin (PDL) belagte dekselslips (letter overholdelse av suspensjonsceller til dekkslip) ved først å inkubere deksler i etanol (EtOH) i 5 minutter (steriliserer deksler og fjerner eventuelle rester). Vask deretter 2x i fosfatbufret saltvann (PBS) før du inkuberer deksler i PDL (20 μg/ml) i 30 minutter (min) ved romtemperatur (RT).
- Fjern PDL og vask 2x i PBS. Pelletceller (tidligere infisert/behandlet basert på ønskede bildeforhold) og resuspenderer 106celler i 50 μL PBS. Spot 50 μL celler på glass (PDL-belagt) og inkuber ved RT i 30 min.
- Såing av adherente celler
- Kulturceller på steril dekselslipp plassert i 6-brønns tallerken og infiserer celler med viruspartikler eller behandler med forbindelse av interesse. Tillat celler å nå 50-70% sammenløp før prøvepreparering for avbildningseksperimenter.
2. Cellulær fiksering: For å bevare cellulær morfologi for fluorescensavbildningsstudier
MERK: Hold 4% PFA og PBS ved RT i minst 30 minutter før cellulær fiksering.
- Aspirer cellemediet, vask celler på deksler 3x i PBS, og fest celler i 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 minutter. Aspirer PFA og vask celler i PBS 2x.
MERK: Celler kan nå dehydreres og lagres hvis eksperimentøren ønsker å gjenoppta eksperimentet på en annen dato. Faste celler kan dehydreres i EtOH før lagring.- Fjern PBS etter vask etter cellefiksering og erstatt med 500 μL 50% EtOH (v / v i vann). Inkuber ved RT i 5 min.
- Fjern 50% EtOH og erstatt med 500 μL på 70% EtOH. Inkuber ved RT i 5 min.
- Fjern 70% EtOH og erstatt med 500 μL på 100% EtOH. Inkuber ved RT i 5 min.
- Fjern 100% EtOH og erstatt med fersk 100% EtOH.
MERK: Dehydrerte celler kan lagres ved -20 °C i 6 måneder. Forsegl plater med tape eller parafilm før lagring for å forhindre fordampning av EtOH. - Rehydrere celler for å bevege seg over på multiplekset fluorescensmerking av celler / virus.
- Fjern 100% EtOH og erstatt med 500 μL på 70% EtOH. Inkuber ved RT i 2 min.
MERK: Ikke la cellene tørke ut når som helst. Bruk alltid nok løsning til å senke alle cellene. - Fjern 70% EtOH og erstatt med 500 μL på 50% EtOH. Inkuber ved RT i 2 min.
- Fjern 50% EtOH og erstatt med 1x PBS.
MERK: Forbered proteasefortynning, hybridiseringsprober og vaskbuffer i forkant av proteasebehandling (trinn 4) og målsondeapplikasjon (trinn 5). Spesifikke instruksjoner om reagenspreparat presenteres i begynnelsen av hvert respektive trinn.
| Reagenser | Andre notater |
| Protease løsning | Forbered deg i 1X PBS |
| Mål oligonukletodie probe (er) | Fortynnet i hybridiseringsbuffer |
| Vask buffer | Vasker etter målhybridiseringstrinn |
| Hybridisering buffer | Oppskrift presentert i tabell 3 |
Tabell 1: Nøkkelreagenser i MICDDRP-protokollen.
3. Cellepermeabilisering: Øker tilgangen til cellen og cellulære organeller for innføring av store molekyler (antistoffer, nukleinsyrehybridiseringsprober)
- Fjern 1x PBS etter cellulær fiksering eller rehydrering og erstatt med 500 μL på 0,1% (v / v) Tween-20 i 1x PBS. Inkuber ved RT i 10 min. Bytt ut en etter en. Vask en gang med 500 μL 1x PBS og tilsett fersk 1x PBS.
4. Coverslip immobilisering på glassglass og proteasebehandling for å fjerne nukleinsyrebindende proteiner fra fast viral / cellulær nukleinsyre for å forbedre hybridiseringseffektiviteten
MERK: Klargjør den fortynnede Protease III-oppløsningen (se spesifikasjoner for reagens i materialtabell) under cellulær permeabilisering. La protease nå RT i 10 minutter før permeabilisering.
- Legg en liten dråpe neglelakk på et sterilisert glassglass. Tørk ryggen (side uten cellelag) og legg kanten av dekselet på neglelakkdråpen, med siden med de festede cellene vendt oppover. Tilsett noen dråper PBS på det immobiliserte dekselet for å forhindre tørking.
- Tegn en sirkel (ca. 3 mm fra dekselet) rundt omkretsen av dekselet som nå er festet til lysbildet ved hjelp av hydrofob barrierepenn (vannavvisende penn som holder reagenser lokalisert på celler).
- Fortynn Protease III i 1x PBS (100 μL / coverslip).
MERK: Proteasekonsentrasjonen må kanskje justeres avhengig av forskjeller i celletyper, prober eller målnukleinsyre(r) gjennom empirisk optimalisering (se diskusjon). For mest effektiv RNA / DNA-merking på tvers av forskjellige virussystemer hadde vi suksess med følgende fortynninger presentert i tabell 2 nedenfor med fortynninger fra (1 til 2) - (1 til 15) (protease til 1x PBS).
| Sondemål | Proteasefortynning i 1X PBS (protease III til 1X PBS) |
| HIV-1 DNA/RNA | 1 til 5 |
| HTLV-1 DNA/RNA | 1 til 5 |
| HBV pgRNA og totalt HBV RNA | 1 til 15 |
| IAV RNA | 1 til 15 |
| ZIKV RNA | 1 til 2 |
Tabell 2: Protease III fortynninger i PBS for viral nukleinsyrehybridisering.
- Dekanter 1x PBS på dekselet etter immobilisering og påfør fortynnet Protease III.
- Rug i en fuktet ovn ved 40 °C i 15 minutter.
- Dekantproteaseløsning og nedsenk lysbilder i 1x PBS. Agiter med en gyngeskål i 2 min på RT. Gjenta vask med ny 1x PBS.
- For bare DNA-deteksjon, vask prøver tre ganger med nukleasefritt vann i 2 minutter hver, etterfulgt av inkubasjon med 5 mg / ml RNase A fortynnet i PBS i 30 minutter ved 37 ° C.
- Decant RNase A-løsning, og vask 3x i 2 minutter med ultrarent vann. Fortsett med ISH av målsonden (e).
MERK: Hybridiseringsbuffer forbedrer vDNA-deteksjon uten å påvirke vRNA-fargingseffektiviteten for resultatene som presenteres (representative resultater). Fortynn DNA Channel 1 (C1) sonder 1:1 med hybridiseringssonde. Fortynn RNA C2- og C3-sonder i hybridiseringsbuffer. C2- og C3-sondene som brukes i våre bildestudier er i 50X-løsninger (1:50; målsonde til hybridiseringsbuffer).
- Forbered hybridiseringsbuffer i nukleasefritt vann ved å følge trinn-for-trinn-prosedyren nedenfor:
- I et 15 ml rør tilsettes 700 μL nukleasefritt vann, 300 μL 50 % (vekt/volum (w/v)) dextransulfat, 300 μL 5 M NaCl, 125 μL 200 mM natriumsitrat (pH 6,2) og 375 mg (pulver) etylenkarbonat.
- Bland godt med en virvel for å oppløse etylenkarbonat (sørg for at alt pulver er oppløst og klar oppløsning).
- Tilsett 25 μL 10% (volum / volum (v / v)) Tween-20 og nok nukleasefritt vann til å fullføre 2,5 ml (2x løsning).
MERK: Oppskriften på hybridiseringsbufferen som presenteres, finner du i tabell 3 nedenfor. Løsningen er stabil i en uke. Sørg for tilstrekkelig blanding av Tween-20 vaskemiddel, samtidig som du er forsiktig med å forhindre boblende oppløsning.
| Reagent | Lager konsentrasjon | Ytterligere merknader |
| Nukleasefritt vann | NA | |
| Dextran sulfat | 50 % (m/v) | Veldig tyktflytende |
| Natriumklorid | 5 moh | |
| Natriumsitrat (pH 6,2) | 200 mM | Oppbevares ved 4 °C |
| Etylenkarbonat | NA | Pudder |
| Tween-20 | 10 % (v/v) |
Tabell 3: Hybridiseringsbufferliste over reagenser.
5. Inkubasjon med DNA/RNA-målhybridiseringsprober: Måloligonukleotidprober binder seg til region(er) av interesse, og skaper et molekylært stillas for forforsterkere, forsterkere og fluorescerende sonder å binde.
MERK: Varm DNA / RNA-sonder ved 40 ° C i 10 minutter (under cellepermeabilisering) og avkjøl til RT i minst 10 minutter, hvis ingen RNase-behandling er inkludert. Hvis RNase-behandling eller ytterligere prøvebehandling er nødvendig før målsondehybridisering, varme sonder tilsvarende. Spinn ned C2- og C3-sonder etter oppvarming og fortynn i hybridiseringsbuffer. Etter fortynning kan C2- og C3-sonder varmes opp kort. Varm 50x vaskebuffer (se materialtabell for mer informasjon) ved 40 ° C i 10-20 minutter og fortynnet til 1x i molekylærbiologi grade vann.
- Inkuber 200 μL av hybridiseringsbufferen ved 67 °C i 10 minutter før tilsetning av hybridiseringssonde(r). Fortynn sonde i hybridiseringsbuffer (oppskrift oppført i tabell 2). Tilsett 50 μL/coverslip.
- Rug i fuktet ovn ved 40 °C i 2 timer. Dekantsonder og nedsenk lysbilder i 1x vaskebuffer. Agiter ved å gynge tallerkenen i 2 min på RT. Gjenta vask med ny 1x vaskebuffer.
6. Forsterker (Amp) 1-FL hybridisering: Tilsetning av forforsterker som er komplementær til halesekvensen til mål-DNA/RNA-sondene (trinn 5)
MERK: Forsterkere bør være på RT før bruk. Få hver enkelt forsterker ut av kjøleskapet 30 min før bruk og la stå på benken på RT.
- Fjern lysbilder fra 1x vaskebuffer og trykk / absorber for å fjerne overflødig væske.
- Legg til 1 dråpe Amp 1-FL på omslaget. Rug i fuktet ovn ved 40 °C i 30 minutter.
- Dekantert Amp 1-FL og senk i 1x vaskebuffer. Agiter ved å gynge tallerken 2 min på RT. Gjenta vask med ny 1x vaskebuffer.
7. Amp 2-FL hybridisering: Inkubasjon med signalforsterker med beslektet gjenkjenningssekvens til forforsterkere (Amp 1-FL)
- Fjern lysbilder fra 1x vaskebuffer og trykk / absorber for å fjerne overflødig væske.
- Legg til 1 dråpe Amp 2-FL på dekselet. Rug i fuktet ovn ved 40 °C i 15 minutter.
- Decant Amp 2-FL og senk i 1x vaskebuffer. Agiter ved å gynge tallerken 2 min på RT. Gjenta vask med ny 1x vaskebuffer.
8. Amp 3-FL hybridisering: Inkubasjon med andre signalforsterker
- Fjern lysbilder fra 1x vaskebuffer og trykk / absorber for å fjerne overflødig væske.
- Legg til 1 dråpe Amp 3-FL på omslaget. Rug i fuktet ovn ved 40 °C i 30 minutter.
- Decant Amp 3-FL og senk i 1x vaskebuffer. Agiter ved å gynge tallerken 2 min på RT. Gjenta vask med ny 1x vaskebuffer.
9. Amp 4-FL hybridisering: Fluorescerende etikett og endelig hybridiseringstrinn
MERK: Se først tabell 4 for å velge passende Amp 4 (A, B eller C) - FL basert på kanalene til målsonden(e). Vurder hvilken Amp 4-FL som er nødvendig for å merke DNA/RNA av interesse. Et eksempel er gitt av tabellen nedenfor:
| En | B | C | |
| DNA-kanal 1 (C1) | 488 | 550 | 550 |
| DNA/RNA-kanal 2 (C2) | 550 | 488 | 647 |
| RNA-kanal 3 (C3) | 647 | 647 | 488 |
Tabell 4: Valg av Amp 4 (A, B eller C)-FL fluorescerende sonde for multiplekset ISH.
MERK: For multiplekset FISH (flere mål) er det viktig å velge riktig Amp 4 (A, B eller C) - FL for riktig merking av målet ditt for interesse (er). Målprober (trinn 5) har forskjellige fargekanaler (C1, C2 eller C3), som dikterer deres respektive fluorescerende etikett (Alexa 488, Atto 550 eller Alexa 647), basert på den valgte Amp 4-FL. Eksempler på valg av fluoroforkombinasjoner for multiplekset avbildning er gitt i legendene i figur 2 og figur 3. Som et ekstra eksempel vil utvalg av Amp 4B-FL selektivt merke DNA C1-sonder med Atto 550- og RNA C3-sonder med Alexa 647.
- Fjern lysbilder fra 1x vaskebuffer og trykk / absorber for å fjerne overflødig væske.
- Legg til 1 dråpe Amp 4-FL på omslaget. Rug i fuktet ovn ved 40 °C i 15 minutter.
MERK: Følg trinn 9.2, hold prøvene dekket, beskyttet mot lyset. - Decant Amp 4-FL og senk i 1x vaskebuffer. Agiter ved å gynge tallerkenen i 2 min på RT. Gjenta vask med ny 1x vaskebuffer. Vask med 1x PBS (2 min) og oppbevar i PBS.
10. Protein immunostaining: Å merke protein (er) av interesse
- Dekanter PBS og tilsett 200 μL blokkeringsbuffer (1 % w/v BSA, 10 % v/v FBS i PBS med 0,1 % v/v Tween-20 (PBST)) til dekslet. Inkuber 1 time ved RT.
- Dekantblokkerende buffer og påfør 200 μL primært antistoff fortynnet i PBST + 1 % w/v BSA. Inkuber 1 time ved RT.
- Vask lysbildet to ganger med PBST i 10 minutter på RT med risting.
- Påfør sekundært antistoff i 1 time ved RT i PBST + 1% w / v BSA.
- Vask lysbildet med PBST i 10 min på RT med risting.
11. Kjernefarging: Motflekkkjerner etter immunfarging
- Decant PBST og bruk DAPI eller kjernefysisk flekk av valg i 1 min på RT.
- Vask lysbildet to ganger med PBS i 10 min på RT med risting.
12. Montering
- Plasser 1 dråpe antifadeoppløsning (f.eks. Prolong Gold) på nytt sterilt glassglass (rengjør først lysbildet med EtOH og la det tørke for å sikre at det ikke er rester på glass). Med samme spiss sprer du antifadeoppløsningen for å dekke et område omtrent på størrelse med dekselet.
MERK: Antifadeoppløsningen er svært tyktflytende og kan være vanskelig å pipett. Hvis du kutter spissen av en 200 μL-spiss før pipettering, kan du redusere disse problemene. - Fjern dekselet med celleprøve fra lysbildet og senk i PBS for å fjerne gjenværende neglelakk på baksiden ved hjelp av tang og PBS. Tørk tang og baksiden av dekselet ved hjelp av en Kimwipe.
- Forsiktig imbed coverslip i dråpen av antifade løsning, plassere prøvesiden (side med celle lag) av coverslip på slipp).
- La prøvene tørke over natten.
13. Bildebehandling
- Bilde med et epifluorescerende mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et skjema over MICDDRP er avbildet i figur 1. Merking av DNA og RNA etterfølges av immunostaining. Bruken av forgreningsforsterkere øker signalet, noe som gjør det mulig å oppdage enkeltnukleinsyremolekyler.
Figur 1: Skjematisk for MICDDRP og trinnvis arbeidsflyt. (A) bDNA-signalet forsterkes via forgreningsforforsterker og forsterker-DNA for å forbedre deteksjonen av virale DNA (1) og RNA-arter (2). Oligonukleotidprober hybridiseres parvis (ZZ i skjematisk) til mål (er) av interesse, og skaper et stillas for forforsterker (Amp 1-FL, trinn 6 i protokoll), forsterker (Amp 2- & 3-FL) og fluorescerende sonder (Amp 4, trinn 9 i protokollen). Se tabell 4 for å velge passende Amp 4 (A, B eller C) -FL for multiplekset ISH. Merking av nukleinsyre etterfølges av immunostaining proteiner av interesse (3). (B) Tretten hovedtrinn i MICDDRP-protokollen med estimering av tidsvarighet for hvert respektive trinn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Bruk av MICDDRP for å studere forløpet av HIV-1-infeksjon har vært et nyttig verktøy for å spore viral replikasjonskinetikk i primære celler. Som et bevis på konseptet av denne prosedyren, er HIV-1 DNA, RNA og protein samtidig merket og visualisert mikroskopisk på enkeltcellenivå (figur 2). To HIV-1 DNA-genomer visualiseres i en enkelt celle, da de aktivt transkriberer viralt RNA (vRNA). vRNA har blitt eksportert gjennom det nukleære porekomplekset og viralt protein syntetiseres i cytoplasma.
Figur 2: MICDDRP av primære mononukleære celler i blodet (PMBC) infisert med HIV-1. PMBC infisert med HIV-1 (NL4.3) ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 2. Cellene ble fikset 48 timer etter infeksjon (hpi). (A) HIV-1 bDNA FISH-sonde (merket med ATTO 550; rød i figur). Denne sonden hybridiserer til malen (3'<—5') vDNA-streng for å forhindre krysstale med sense (+) vRNA. (B) Uskjøtet HIV-1 RNA (merket med Alexa 647; grønn i figur). HIV-1 vRNA-sonden hybridiserer til virale transkripsjoner transkribert i 5'->3'-orienteringen. (C) Immunostaining av HIV-1 kapsid (p24) protein (sekundært antistoff konjugert til Alexa 488; hvit i figur). (D) Sammenslått bilde. Skalalinjen representerer 5 μm. Kjerner ble farget med DAPI (blå). For å merke HIV-1 DNA (DNA C1-sonde) med henholdsvis ATTO 550 og HIV-1 RNA (RNA C3-sonde) med Alexa 647, ble prøver inkubert med Amp 4-FL 'B' (se tabell 4 i protokollen for å velge passende kanalfarger for hybridiseringsprober). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I tillegg har vi utført dobbelt viralt DNA (vDNA) og vRNA-farging for å følge HTLV-1-infeksjon. For optimalisering av nukleinsyremerkingen fulgte vi nøye med vDNA / VRNA-fargeprosedyren utviklet for multiplekset fluorescensavbildning av HIV-infeksjon. Vi har vist at vi spesifikt kan merke HTLV-1 DNA og RNA samtidig.
Figur 3: Samtidig merking av HTLV-1 vDNA og vRNA i MT-2-celler. (A) HTLV-1 vDNA (merket med ATTO 550; rød i figur) (B) Uskjøtet HTLV-1-sans (+) RNA (RNA C2-sonde & merket med Alexa 488; grønn i figur)). (C) HTLV-1 HBZ antisense (-) vRNA (RNA C3 sonde & (merket med Alexa 647; hvit i figur)). (D) Sammenslått bilde. Skalastangen representerer 20 μm. Kjerner ble farget med DAPI (blå). Amp 4-FL 'B' ble brukt (se tabell 4 i protokollen) for å oppnå multiplekset merking av HTLV-1 ('+' & '-') RNA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kontrolleksperimenter for å vurdere målsondens spesifisitet og bakgrunn. Spesifisitet av HIV-1 og HTLV-1 målprober ble vurdert etter infeksjon i lymfocytiske cellelinjer (Uinfiserte Jurkat T-celler, HTLV-1-infiserte celler (MT2) og HIV-1-infiserte celler (H9111B)). Skalastenger representerer 10 μm. (A) Celler ble behandlet med HTLV-1 RNA-sonder. (B) Celler ble behandlet med HIV-1 (+) RNA-sonde (C-D). Ytterligere demonstrasjon av spesifisiteten til HTLV-1-sonder uten kryssreaktivitet med HIV-1. Hvite piler i figur 4C betegner HTLV-1 DNA (rødt). (EF). vRNA-farging (grønn) +/- RNase-behandling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å verifisere spesifisiteten til hybridiseringsprobene og for å vurdere hvordan ISH-merkingsmetoden påvirker proteinfargingseffektivitet og generell bakgrunn, utfører vi kritiske kontroller for å sikre det høyeste nivået av strenghet og reproduserbarhet for forsøkene. Som et eksempel, i figur 4AD, verifiserer vi spesifisiteten til våre HIV-1 og HTLV-1 vDNA- og vRNA-sonder, da vi viser svært liten eller ingen kryssreaktivitet mellom sondesettene på tvers av de to virusene. Til tross for merking av to retrovirus med potensial for sondekryssreaktivitet, er HIV-1-probene bare spesifikke for HIV-1 genetisk materiale og ikke HTLV-1. Den samme trenden gjelder for HTLV-1-sondene. I tillegg, i figur 4F, viser vi at vi kan eliminere vRNA-farging hvis vi RNase-behandler cellene våre under prøvepreparering. For å vurdere muligheten for demping av proteinfargingseffektivitet på grunn av ISH (proteasebehandling (trinn 4 i protokoll og figur 1B) og hybridiseringsbetingelser, som kan føre til ablasjon av epitopgjenkjenning eller økt bakgrunnssignal, demonstrerer vi at proteinfargingseffektiviteten for kjernespektrelmarkøren, sc-35, er sammenlignbar på tvers av konvensjonelle IF-tilnærminger og immunostaining under MICDDRP-protokollen. I den konvensjonelle IF-protokollen ble celler permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i 15 minutter, i stedet for permeabilisering med 0,1% Tween-20 i 10 minutter, som brukes i MICDDRP-protokollen (trinn 3 i protokoll og arbeidsflyt i figur 1B). Proteinfarging på tvers av begge forholdene (IF vs . MICDDRP) ga et signal flere størrelsesordener større enn kontrollen (MICDDRP uten primært antistoff), noe som ytterligere demonstrerte den lave bakgrunnen som ble generert etter denne protokollen og bevaring av proteinepitoper for effektiv immunostaining. Bildekvantifisering av gjennomsnittlig integrert fluorescensintensitet av sc-35-signal per celle (figur 5E) ble utført som tidligere beskrevet3. For alle bilderesultater som ble vist, sørget vi for sonde- og antistoffspesifisitet, samt vurderte eventuelle forstyrrelser eller høyere bakgrunnsstøy enn normalt som tilskrives vår ISH-tilnærming.
Figur 5: Sammenligning av proteinfargingseffektivitet etter konvensjonell IF vs. MICDDRP . Det cellulære proteinet, sc-35, en biomarkør for kjernefysiske flekker, ble immunstained i Jurkat T-celler. Alle skalastenger representerer 10 μm. (A) Uinfiserte Jurkat T-celler gjennomgikk MICDDRP-protokollen og ble behandlet med HIV-1 DNA / RNA-hybridiseringsprober brukt i figur 2 og figur 4 ovenfor. Under immunfarging ble det ikke lagt til noe primært antistoff. (B). Uinfiserte Jurkat T-celler gjennomgikk konvensjonell IF, merking sc-35 (hvit). Cellene ble permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i 15 minutter. (C). MICDDRP ble utført på HIV-infiserte Jurkat T-celler. vRNA er merket grønt, vDNA er rødt og sc-35 er hvitt. (D). Nærbilde av vRNA, vDNA og proteinmerking (sc-35) i HIV-infiserte celler. (E) Kvantifisering av gjennomsnittlig integrert fluorescenssignal per celle av sc-35 på tvers av forskjellige immunfargingsforhold. Y-aksen er på en logaritmisk skala. Den stiplede linjen representerer bakgrunnssignalet fra uinfiserte celler som gjennomgikk MICDDRP-protokollen der ingen primært antistoff ble tilsatt. Ingen signifikant forskjell i signal etter MICDDRP vs . konvensjonell IF. Over 500 celler ble samplet for kvantifisering for å nå respektive tilstand. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Denne metoden kan også brukes til å studere RNA-virus som kanskje eller ikke inkluderer DNA-maler for viral replikasjon. For eksempel kan strengspesifikke bDNA-sonder utformes for å overvåke ekspresjon av sans (+) eller antisense (-) streng-RNA og forskjellige vRNA-arter i virus som HBV, HCV, IAV og ZIKV. Visualiseringen av forskjellige RNA-arter i løpet av infeksjonen kan gi innsikt i replikasjonskinetikken til ulike virussystemer.
Etter tidsforløpet av HBV-infeksjon kan vi se at mengden HBV pregenomisk RNA (pgRNA) og totalt HBV RNA øker som en funksjon av tiden. I tillegg immunfarget vi samtidig en cellulær vertsfaktor, MOV10 (figur 6).
Figur 6: HBV. Tidsforløp av HBV-infeksjon av 3E8-celler. Celler ble infisert med 300 HBV-genomer per celle. Viral replikasjon er vist ved tre tidspunkter (24, 48 og 72 hki). pgRNA (merket med ATTO 550; rød i figur), total HBV RNA (merket med Alexa 647; grønn i figur) og MOV10 (sekundært antistoff konjugert til Alexa 488; hvit i figur). Kjerner er farget med DAPI i blått. Skalalinjen på sammenslåtte bilder representerer 10 μm. hpi, timer etter infeksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Avbildning ble utført via konfokalmikroskopi med et 60x oljenedsenkningsmål. Eksitasjons-/emisjonsbåndpassbølgelengdene som ble brukt til å oppdage DAPI, Alexa 488, ATTO 550 og Alexa 647 ble satt til henholdsvis 405/420-480, 488/505-550, 550/560-610 og 647/655-705 nm (figur 7, figur 8 og figur 9).
Figur 7: Tidsforløp for HCV-infeksjon av Huh-7.5.1-celler. Huh-7.5.1-celler ble infisert med hepatitt C-virus (HCV) Jc1/Gluc2A ved en MOI på 0,5. Ved de angitte tidsintervallene ble cellene fikset og probert sekvensielt for sense (+) vRNA, antisense (-) vRNA og NS5A (HCV-protein). Kjerner ble farget med DAPI. Representative sammenslåtte bilder fra hvert tidspunkt, som viser (+) RNA i grønt (merket med Alexa 647) (-) RNA i rødt (merket med Atto 555), NS5A i hvitt (sekundær geitantimus konjugert til Alexa 488) og kjerner i blått. Skalastenger representerer 10 μm. De nedre bildene er forstørrede utklipp fra det tilsvarende tidspunktet. HPI, timer etter infeksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Strandspesifikk bDNA-FISK og immunfarging av A549-celler infisert med influensa A-virus. A549-celler infisert med PR8 Flu A-virus ble fikset og undersøkt for (A) IAV nukleoprotein (NP) RNA (merket med Alexa 488; grønn i figur), og (B) IAV-polymeraseprotein (PB1) (sekundær geitantimus Atto 550; rød i figur) og kjerner ble farget med DAPI (blå). (C) Sammenslått bilde. Skalalinjen representerer 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Strandspesifikk bDNA FISH i Zika virus (ZIKV)-infiserte celler. Vero-celler ble infisert med ZIKV ved en MOI på 0,1. Cellene ble fikset til 48 hk. (A) Celler ble samtidig farget for sans (+) vRNA (merket med Alexa 488; grønn i figur) og antisense (-) vRNA (merket med Atto 550; rød i figur). Kjerner ble farget med DAPI. I (A) angir den hvite boksen en region med både (+) og (-) vRNA. Innfeltene presenterer et nærbilde av (+) vRNA (grønn) og de knappere (-) vRNA-artene (rød). (B) sans (+) vRNA (grønn). (C) antisense (-) vRNA (rød). Skalalinjen i (A) representerer 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samtidig visualisering av RNA, DNA og protein krever ofte omfattende optimalisering. To vanlige metoder er 5-etynyl-2-deoksyuridin (EdU) merking og DNA FISH. EdU-merking har blitt brukt til å visualisere viralt DNA og protein samtidig, da EdU er innlemmet i begynnende DNA og deretter merket med azidholdige fluorescerende fargestoffer via klikkkjemi. EdU-merking kan dermed brukes til å overvåke innfødt virusreplikasjonskinetikk av DNA-virus eller virus med DNA-maler for replikasjon12. En mangel ved EdU-merking er imidlertid at ved å dele celler, vil det replikerende genomet innlemme EdU, generere høy bakgrunn og forvirrende bildeanalyse. DNA FISH kan omgå disse problemene ved direkte hybridisering av en nukleinsyresonde til det respektive målet uavhengig av cellesyklusen. Imidlertid var konvensjonell FISH ofte avhengig av høye temperaturer for å oppnå effektiv sondehybridisering, noe som hindret immunostaining eller til og med samtidig RNA-farging13. MICDDRP kan potensielt omgå disse problemene og gi robust samtidig fluorescerende merking av DNA, RNA og protein på tvers av en rekke cellulære systemer.
Mens vi har vist at vi kan merke protein og nukleinsyre samtidig ved hjelp av vår MICDDRP-protokoll, var det nødvendig med optimalisering på tvers av forskjellige systemer. Den første store parameteren som vi måtte optimalisere var proteasebehandling. Vi varierte protease III konsentrasjon på tvers av forholdene. Optimalisering av proteasebehandling var empirisk, da vi brukte forskjellige fortynninger for å vurdere hva som ga størst hybridiseringseffektivitet, uten at det gikk ut over immunostainingseffektiviteten. Passende kontroller ble utført side om side for å vurdere sondespesifisitet og endringer i proteinfargingseffektivitet som tilskrives proteasebehandling. De neste store parameterne som trengte optimalisering var sondedesign og sondehybridisering.
Riktig utforming av fangst- og forsterkerprober er avgjørende for å oppnå sensitiviteten og spesifisiteten til bDNA-teknologien. Programvarepakker som forutsier sannsynligheten for ikke-spesifikke hybridiseringshendelser er tilgjengelige for å forbedre sondedesignet 7,11. bDNA-sonder med tilhørende forforsterker, forsterker og fluorescerende etikettprober kan nå kjøpes kommersielt for å sikre kompatibilitet med bDNA-bildebehandlingssett. Brukere kan gi produsenter sekvensinformasjon (~ 300-1000 basepar) for målområdet (e) i form av en fasta-fil (tekstbasert format for å representere nukleotidsekvens). Målprober genereres med > 90% sekvens homologi til den medfølgende sekvensen.
For DNA-merking har vi funnet ut at fortynning av sondene i hybridiseringsbufferen beskrevet i trinn 5 i protokollen forbedrer DNA-hybridisering. Ved merking av både DNA og RNA kan RNA-sonden fortynnes i hybridiseringsbufferen. DNA-merking i fravær av RNase kan ikke utelukke muligheten for at den observerte nukleinsyren inkluderer RNA av målrettet strenghet. Temperaturen må kanskje også justeres for å forbedre hybridiseringseffektiviteten. Økende temperatur kan påvirke proteinfargingseffektiviteten, da økte temperaturer kan fremme proteindenaturering, og forvirre epitopgjenkjenning av det primære antistoffet. I våre presenterte representative data har vi utført ISH ved 40 °C.
Sammenlignet med konvensjonell DNA-FISK, GIR MICDDRP en forbedret prosedyre for samtidig merking av DNA, RNA og protein for å visualisere via fluorescensmikroskopi. En potensiell begrensning er at valg av sonde kan påvirke effektiviteten av hybridisering og evne til kvantitativt å sammenligne data mellom sonder. Denne protokollen har vært effektiv på tvers av ulike cellulære og virale systemer i våre hender med bare mindre optimalisering som trengs på tvers av varierende forhold. Nylige høyprofilerte publikasjoner har brukt vår tilnærming til å studere HIV-integrasjonsstedvalg14 og HIV revers transkripsjonskinetikk15. Fremtidige anvendelser av MICDDRP kan inkludere visualisering av virale nukleinsyrer samtidig med nukleinsyresekvenser av spesifikke cellulære gener og cellulære proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet helt eller delvis av National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 og U54 AI150472). Vi takker Dr. Raymond F. Schinazi og Sadie Amichai for å gi celler infisert med influensa A-virus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
- Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
- Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
- Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
- Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
- Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
- Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).
