Summary
Apresenta-se aqui um protocolo para uma abordagem de imagem de fluorescência, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and protein (MICDDRP), um método capaz de visualização simultânea de fluorescência unicelular de proteínas virais e ácidos nucleicos de diferentes tipos e filamentos. Essa abordagem pode ser aplicada a uma gama diversificada de sistemas.
Abstract
A captura dos processos dinâmicos de replicação e montagem de vírus tem sido dificultada pela falta de tecnologias robustas de hibridização in situ (ISH) que permitam a marcação sensível e simultânea de ácidos nucleicos virais e proteínas. Os métodos convencionais de hibridização in situ por fluorescência de DNA (FISH) muitas vezes não são compatíveis com a imunocoloração. Portanto, desenvolvemos uma abordagem de imagem, MICDDRP (multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA e proteína), que permite a visualização simultânea de uma única célula de DNA, RNA e proteína. Em comparação com o DNA FISH CONVENCIONAL, O MICDDRP utiliza a tecnologia ISH de DNA ramificado (bDNA), que melhora drasticamente a sensibilidade e a detecção da sonda de oligonucleotídeos. Pequenas modificações do MICDDRP permitem a obtenção de imagens de proteínas virais concomitantemente com ácidos nucleicos (RNA ou DNA) de diferentes filamentosidades. Aplicamos esses protocolos para estudar os ciclos de vida de múltiplos patógenos virais, incluindo o vírus da imunodeficiência humana (HIV)-1, o vírus linfotrópico T humano (HTLV)-1, o vírus da hepatite B (HBV), o vírus da hepatite C (HCV), o vírus Zika (ZKV) e o vírus influenza A (IAV). Demonstramos que podemos rotular eficientemente ácidos nucleicos virais e proteínas em uma gama diversificada de vírus. Esses estudos podem nos fornecer uma melhor compreensão mecanicista de múltiplos sistemas virais e, além disso, servir como um modelo para a aplicação de imagens de fluorescência multiplexada de DNA, RNA e proteína em um amplo espectro de sistemas celulares.
Introduction
Embora milhares de anticorpos comerciais estejam disponíveis para marcar especificamente proteínas por meio de abordagens convencionais de imunocoloração, e enquanto as proteínas de fusão possam ser projetadas com tags fluorescentes foto-otimizadas para rastrear múltiplas proteínas em uma amostra1, a visualização microscópica da proteína muitas vezes não é compatível com a hibridização in situ convencional por fluorescência de DNA (FISH)2 . Limitações técnicas na visualização simultânea de DNA, RNA e proteína usando abordagens baseadas em fluorescência têm dificultado a compreensão aprofundada da replicação do vírus. O rastreamento do ácido nucleico viral e da proteína durante o curso da infecção permite que os virologistas visualizem processos fundamentais que fundamentam a replicação e a montagem do vírus 3,4,5,6.
Desenvolvemos uma abordagem de imagem, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and Protein (MICDDRP)3, que utiliza tecnologia in situ de DNA ramificado (bDNA) para melhorar a sensibilidade da detecção de ácido nucleico 7,8,9 . Além disso, esse método utiliza sondas emparelhadas para maior especificidade. As sondas específicas da sequência bDNA usam DNAs pré-amplificadores e amplificadores ramificados para produzir um sinal intenso e localizado, melhorando os métodos de hibridização anteriores que dependiam da segmentação de regiões repetidas no DNA9. As células infectadas em um contexto clínico muitas vezes não contêm material genético viral abundante, fornecendo uma mercadoria para um método sensível para a detecção de ácido nucleico fluorescente em ambientes de diagnóstico. A comercialização da tecnologia bDNA por meio de abordagens como o RNAscope7 e o ViewRNA10 preencheram esse nicho. A sensibilidade da imagem de fluorescência de bDNA também tem importante utilidade na biologia celular, permitindo a detecção de espécies escassas de ácidos nucleicos em modelos de cultura celular. A grande melhoria da sensibilidade torna os métodos de imagem baseados em bDNA adequados para o estudo de vírus. Uma deficiência potencial, no entanto, é que esses métodos se concentram na visualização de RNA ou RNA e proteína. Todas as células replicantes e muitos vírus têm genomas de DNA ou formam DNA durante seu ciclo de replicação, tornando os métodos capazes de visualizar tanto o RNA quanto o DNA, bem como proteínas, altamente desejáveis.
No protocolo MICDDRP, realizamos o bDNA FISH para detecção de ácido nucleico viral pelo método RNAscope, com modificações7. Uma das principais modificações deste protocolo é a otimização do tratamento com protease após a fixação química. O tratamento com protease facilita a remoção de proteínas ligadas ao ácido nucleico para melhorar a eficiência da hibridização da sonda. O tratamento com protease é seguido de incubação com sonda(s) de oligonucleotídeos ramificados. Após a aplicação da(s) sonda(s) de bDNA, as amostras são lavadas e subsequentemente incubadas com DNAs pré-amplificadores e amplificadores de sinal. A hibridização in situ multiplexada (ISH), marcação de múltiplos alvos gênicos, requer sondas alvo com diferentes canais de cor para diferenciação espectral7. A incubação com amplificadores de DNA é seguida por imunofluorescência (FI).
O bDNA ISH proporciona melhorias no sinal-ruído pela amplificação de sinais específicos do alvo, com redução do ruído de fundo a partir de eventos de hibridização não específicos 7,11. As sondas alvo são projetadas usando programas de software disponíveis publicamente que predizem a probabilidade de eventos de hibridização não específicos, bem como calculam a temperatura de fusão (Tm) do híbrido sonda-alvo 7,11. As sondas alvo contêm uma região de 18 a 25 bases complementar à sequência de DNA/RNA alvo, uma sequência espaçadora e uma sequência de cauda de 14 bases. Um par de sondas de destino, cada uma com uma sequência de cauda distinta, hibridizam para uma região de destino (abrangendo ~ 50 bases). As duas sequências de cauda formam um local de hibridização para as sondas pré-amplificadoras, que contêm 20 locais de ligação para as sondas amplificadoras, que, além disso, contêm 20 locais de ligação para a sonda de etiqueta. Como exemplo, uma região de uma quilobase (kb) na molécula de ácido nucleico é alvo de 20 pares de sondas, criando um andaime molecular para hibridização sequencial com o pré-amplificador, amplificador e sonda de rótulo. Isso pode, portanto, levar a um rendimento teórico de 8000 rótulos fluorescentes por molécula de ácido nucleico, permitindo a detecção de moléculas individuais e grandes melhorias em relação às abordagens convencionais do FISH7 (Veja a Figura 1A para o esquema da amplificação do sinal de bDNA). Para configurar testes para ISH multiplexado, cada teste de destino deve estar em um canal de cor diferente (C1, C2 ou C3). Essas sondas alvo com diferentes canais de cores possuem sequências de cauda distintas de 14 bases. Essas sequências de cauda ligarão amplificadores de sinal distintos com diferentes sondas fluorescentes, permitindo assim uma diferenciação espectral fácil em vários alvos. No Protocolo apresentado, a Tabela 4 da Etapa 9, fornece mais informações sobre as sondas alvo de marcação fluorescente. Além disso, a Figura 2 e a Figura 3 fornecem exemplos de como escolhemos o amplificador 4-FL (A, B ou C) apropriado (sonda fluorescente e a etapa final de hibridização) para alcançar a marcação fluorescente específica de múltiplos alvos de ácidos nucleicos virais após infecções por HIV-1 e HTLV-1.
Temos demonstrado diversas aplicações de visualização simultânea por fluorescência de RNA, DNA e proteínas, observando estágios críticos de replicação do vírus com alta resolução espaço-temporal 3,4,5. Por exemplo, a visualização simultânea de uma única célula do RNA viral, do DNA citoplasmático e nuclear e da proteína nos permitiu visualizar os principais eventos durante a infecção pelo HIV-1, incluindo o acompanhamento de núcleos contendo RNA no citoplasma antes da entrada nuclear e da integração do DNA proviral3. Além disso, aplicamos a MICDDRP para caracterizar os efeitos dos fatores do hospedeiro e do tratamento medicamentoso na infecção e replicação viral 4,5. Em Ukah et al., rastreamos a reativação da transcrição do HIV-1 em modelos de células de latência tratados com diferentes agentes de reversão de latência para visualizar a transcrição e a reversão de latência do HIV4. Além disso, o MICDDRP pode nos permitir visualizar alterações fenotípicas associadas à inibição antiviral atribuída ao tratamento de pequenas moléculas ou à restrição do fator hospedeiro. Como prova de conceito da robustez e ampla aplicabilidade de nossa abordagem, demonstramos que podemos usar modificações de nosso protocolo para rotular eficientemente o ácido nucleico viral para acompanhar a infecção não apenas no vírus da imunodeficiência humana (HIV)-1, mas também no vírus linfotrópico T humano (HTLV)-1, vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), Zika vírus (ZIKV) e vírus influenza A (IAV). Como o ciclo de vida do HIV-1 consiste em espécies de DNA viral e RNA, realizamos a maior parte de nossa otimização do MICDDRP após a cinética de replicação do HIV-1. No entanto, além disso, demonstramos que podemos rastrear a síntese de diferentes transcritos de RNA viral de uma ou ambas as cadeias de sentido (+) e antisense (-) em vírus como ZIKV, IAV, HBV e HCV para monitorar a transcrição e replicação viral 3,4,5,6. Os estudos visam melhorar a compreensão mecanicista de vários processos virais e servir como uma diretriz para implementar essa tecnologia de imagem de fluorescência para uma ampla gama de modelos celulares.
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Protocol
1. Células de sementes (Suspensão vs. Células Aderentes) em lâminas de cobertura ou de câmara (protocolo apresentado utiliza lâminas de cobertura).
- Semeadura de células de suspensão
- Prepare as coberturas revestidas com poli-D-lisina (PDL) (facilita a aderência das células de suspensão à tampa) incubando primeiro as folhas de cobertura em etanol (EtOH) por 5 minutos (esteriliza as folhas de cobertura e remove qualquer resíduo). Em seguida, lave 2x em solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes de incubar as coberturas em PDL (20 μg/mL) por 30 minutos (min) à temperatura ambiente (RT).
- Remova o PDL e lave 2x em PBS. Células de pellets (previamente infectadas/tratadas com base nas condições de imagem desejadas) e ressuspender 106células em 50 μL de PBS. Spot 50 μL de células em vidro (revestido de PDL) e incubar em RT por 30 min.
- Semeadura de células aderentes
- Células de cultura em coverslip estéril colocadas em prato de 6 poços e infectam células com partículas virais ou tratam com composto de interesse. Permita que as células atinjam 50-70% de confluência antes da preparação da amostra para experimentos de imagem.
2. Fixação celular: Preservar a morfologia celular para estudos de imagem de fluorescência
NOTA: Mantenha 4% de PFA e PBS no RT por pelo menos 30 minutos antes da fixação celular.
- Aspirar o meio celular, lavar as células em folhas de cobertura 3x em PBS e fixar as células em paraformaldeído a 4% (PFA) por 30 min. Aspirar PFA e células de lavagem em PBS 2x.
NOTA: As células agora podem ser desidratadas e armazenadas, se o experimentador desejar retomar o experimento em outra data. As células fixas podem ser desidratadas em EtOH antes do armazenamento.- Remova o PBS após a lavagem após a fixação celular e substitua por 500 μL de 50% de EtOH (v/v em água). Incubar no RT por 5 min.
- Remova 50% de EtOH e substitua por 500 μL de 70% de EtOH. Incubar no RT por 5 min.
- Remova 70% de EtOH e substitua por 500 μL de 100% de EtOH. Incubar no RT por 5 min.
- Retire 100% EtOH e substitua por 100% EtOH fresco.
NOTA: As células desidratadas podem ser armazenadas a -20 °C durante 6 meses. Sele as placas com fita adesiva ou parafilme antes do armazenamento para evitar a evaporação do EtOH. - Reidratar as células para passar para a marcação de fluorescência multiplexada de células/vírus.
- Remova 100% de EtOH e substitua por 500 μL de 70% de EtOH. Incubar em RT por 2 min.
NOTA: Não deixe as células secarem a qualquer momento. Sempre use solução suficiente para submergir todas as células. - Remova 70% de EtOH e substitua por 500 μL de 50% de EtOH. Incubar em RT por 2 min.
- Remova 50% de EtOH e substitua por 1x PBS.
NOTA: Prepare a diluição da protease, as sondas de hibridização e o tampão de lavagem antes do tratamento da protease (Etapa 4) e da aplicação da sonda alvo (Etapa 5). Instruções específicas sobre a preparação de reagentes são apresentadas no início de cada etapa respectiva.
| Reagentes | Outras Notas |
| Solução de protease | Preparar em 1X PBS |
| Sonda(s) de oligonucletodie alvo | Diluir em tampão de hibridização |
| Protetor de lavagem | Lavagens seguindo as etapas de hibridização de destino |
| Buffer de hibridização | Receita apresentada na Tabela 3 |
Tabela 1: Principais reagentes no protocolo MICDDRP.
3. Permeabilização celular: Aumenta o acesso às organelas celulares e celulares para a entrada de moléculas grandes (anticorpos, sondas de hibridização de ácido nucleico)
- Remova 1x PBS após fixação ou reidratação celular e substitua por 500 μL de 0,1% (v/v) de Tween-20 em 1x PBS. Incubar no RT por 10 min. Substitua um por um. Lave uma vez com 500 μL de 1x PBS e adicione 1x PBS fresco.
4. Imobilização de deslizamento de cobertura em lâmina de vidro e tratamento com protease para remover proteínas de ligação ao ácido nucleico do ácido nucleico viral fixo / celular para melhorar a eficiência da hibridização
NOTA: Preparar a solução diluída de Protease III (ver especificidades do reagente na Tabela de Materiais) durante a permeabilização celular. Deixe a protease atingir o TR por 10 min antes da permeabilização.
- Coloque uma pequena gota de esmalte em uma lâmina de vidro esterilizada. Seque as costas (lado sem camada celular) e coloque a borda da tampa na gota de esmalte, com o lado com as células aderidas voltadas para cima. Adicione algumas gotas de PBS na tampa imobilizada para evitar a secagem.
- Desenhe um círculo (a cerca de 3 mm de distância da tampa) em torno do perímetro da tampa agora aderida à lâmina usando caneta de barreira hidrofóbica (caneta repelente de água que mantém os reagentes localizados nas células).
- Protease III diluída em 1x PBS (100 μL/deslizamento de cobertura).
NOTA: A concentração de protease pode precisar ser ajustada dependendo das diferenças nos tipos de células, sondas ou ácido(s) nucleico(s) alvo(s) por meio de otimização empírica (Ver Discussão). Para a marcação de RNA/DNA mais eficiente em diferentes sistemas virais, tivemos sucesso com as seguintes diluições apresentadas na Tabela 2 abaixo, com diluições variando de (1 a 2 )-(1 a 15) (protease a 1x PBS).
| Alvos da sonda | Diluição de Protease em PBS 1X (Protease III a 1X PBS) |
| HIV-1 DNA/RNA | 1 a 5 |
| HTLV-1 DNA/RNA | 1 a 5 |
| PgRNA do VHB e ARN total do VHB | 1 a 15 anos |
| IAV RNA | 1 a 15 anos |
| ZIKV RNA | 1 a 2 |
Tabela 2: Diluições de protease III em PBS para hibridização de ácidos nucleicos virais.
- Decantar o PBS 1x na folha de cobertura após a imobilização e aplicar a Protease III diluída.
- Incubar em estufa humidificada a 40 °C durante 15 min.
- Solução de protease decantante e lâminas submersas em 1x PBS. Agite com um prato de balanço por 2 min no RT. Repita a lavagem com 1x PBS novo.
- Para apenas detecção de DNA, lave as amostras três vezes com água livre de nuclease por 2 min cada, seguida de incubação com 5 mg/mL de RNase A diluída em PBS por 30 min a 37 °C.
- Decant RNase A solução, e lavar 3x por 2 min com água ultrapura. Continue com o ISH da(s) sonda(s) de destino.
NOTA: O tampão de hibridização melhora a detecção de vDNA sem afetar a eficiência da coloração de vRNA para os resultados apresentados (Resultados Representativos). Sondas diluídas de DNA Channel 1 (C1) 1:1 com sonda de hibridização. Sondas de RNA C2 e C3 diluídas em tampão de hibridização. As sondas C2 e C3 utilizadas em nossos estudos de imagem estão em soluções 50X (1:50; sonda alvo para tampão de hibridização).
- Prepare o tampão de hibridização em água livre de nuclease seguindo o procedimento passo-a-passo abaixo:
- Em um tubo de 15 mL, adicione 700 μL de água livre de nuclease, 300 μL de sulfato de dextrano a 50% [peso/volume (p/v)], 300 μL de NaCl 5 M, 125 μL de citrato de sódio 200 mM (pH 6,2) e 375 mg (pó) de carbonato de etileno.
- Misture bem usando um vórtice para dissolver o carbonato de etileno (certifique-se de que todo o pó esteja dissolvido e a solução clara).
- Adicionar 25 μL de 10% (volume/volume (v/v)) Tween-20 e água isenta de nuclease suficiente para completar 2,5 mL (solução 2x).
NOTA: A receita para o buffer de hibridização apresentado pode ser encontrada na Tabela 3 abaixo. A solução é estável por uma semana. Assegure a mistura suficiente de detergente Tween-20, tendo o cuidado de evitar o borbulhamento da solução.
| Reagente | Concentração de Estoque | Notas adicionais |
| Água isenta de nuclease | NA | |
| Sulfato de dextrano | 50% (p/v) | Muito viscoso |
| Cloreto de sódio | 5 milh | |
| Citrato de sódio (pH 6,2) | 200 mM | Conservar a 4 °C |
| Carbonato de etileno | NA | Pó |
| Interpolação-20 | 10% (v/v) |
Tabela 3: Lista tampão de hibridização de reagentes.
5. Incubação com sondas de hibridização alvo de DNA/RNA: As sondas de oligonucleotídeos alvo se ligam a(s) região(ões) de interesse, criando um andaime molecular para pré-amplificadores, amplificadores e sondas fluorescentes se ligarem.
NOTA: Sondas quentes de DNA/RNA a 40 °C por 10 min (durante a permeabilização celular) e esfriam até RT por pelo menos 10 min, se nenhum tratamento com RNase estiver incluído. Se o tratamento com RNase ou tratamento adicional com amostras for necessário antes da hibridização da sonda alvo, aqueça as sondas de acordo. Gire as sondas C2 e C3 após o aquecimento e dilua em tampão de hibridização. Após a diluição, as sondas C2 e C3 podem ser brevemente aquecidas. Aquecer o tampão de lavagem de 50x (ver Tabela de Materiais para mais detalhes) a 40 °C durante 10-20 min e diluir a 1x em água de grau de biologia molecular.
- Incubar 200 μL do tampão de hibridização a 67 °C durante 10 min antes da adição da(s) sonda(s) de hibridização. Sonda diluída em tampão de hibridização (receita listada na Tabela 2). Adicionar 50 μL/tampa.
- Incubar em estufa humidificada a 40 °C durante 2 horas (h). Sondas decantadas e lâminas submergem em buffer de lavagem 1x. Agite agitando o prato por 2 min no RT. Repita a lavagem com o novo tampão de lavagem 1x.
6. Hibridização do amplificador (Amp) 1-FL: Adição de pré-amplificador que é complementar à sequência de cauda das sondas de DNA/RNA alvo (Passo 5)
NOTA: Os amplificadores devem estar em RT antes do uso. Retire cada amplificador individual da geladeira 30 min antes do uso e deixe no banco no RT.
- Remova as lâminas do tampão de lavagem 1x e toque/absorva para remover o excesso de líquido.
- Adicione 1 gota de Amp 1-FL na folha de cobertura. Incubar em estufa humidificada a 40 °C durante 30 min.
- Decantar Amp 1-FL e submergir em 1x tampão de lavagem. Agite agitando o prato 2 min no RT. Repita a lavagem com o novo tampão de lavagem 1x.
7. Hibridização Amp 2-FL: Incubação com amplificador de sinal com sequência de reconhecimento cognato para pré-amplificadores (Amp 1-FL)
- Remova as lâminas do tampão de lavagem 1x e toque/absorva para remover o excesso de líquido.
- Adicione 1 gota de Amp 2-FL na tampa. Incubar em estufa humidificada a 40 °C durante 15 min.
- Decantar Amp 2-FL e submergir em 1x tampão de lavagem. Agite agitando o prato 2 min no RT. Repita a lavagem com o novo tampão de lavagem 1x.
8. Hibridização Amp 3-FL: Incubação com segundo amplificador de sinal
- Remova as lâminas do tampão de lavagem 1x e toque/absorva para remover o excesso de líquido.
- Adicione 1 gota de Amp 3-FL na folha de cobertura. Incubar em estufa humidificada a 40 °C durante 30 min.
- Decantar Amp 3-FL e submergir em 1x tampão de lavagem. Agite agitando o prato 2 min no RT. Repita a lavagem com o novo tampão de lavagem 1x.
9. Hibridização Amp 4-FL: Etiqueta fluorescente e etapa final de hibridização
NOTA: Primeiro, consulte a Tabela 4 para escolher o Amp 4 (A, B ou C) - FL adequado com base nos canais da(s) sonda(s) de destino. Avalie qual Amp 4-FL é necessário para rotular o DNA/RNA de interesse. Um exemplo é fornecido pela tabela abaixo:
| Um | B | C | |
| DNA Canal 1 (C1) | 488 | 550 | 550 |
| DNA/RNA Canal 2 (C2) | 550 | 488 | 647 |
| RNA Canal 3 (C3) | 647 | 647 | 488 |
Tabela 4: Seleção da sonda fluorescente Amp 4 (A, B ou C)-FL para ISH multiplexada.
NOTA: Para FISH multiplexado (vários alvos), escolher o Amp 4 (A, B ou C) FL correto é fundamental para rotular adequadamente o(s) seu(s) alvo(s) de interesse(s). As sondas de destino (Etapa 5) têm diferentes canais de cores (C1, C2 ou C3), que ditam sua respectiva etiqueta fluorescente (Alexa 488, Atto 550 ou Alexa 647), com base no Amp 4-FL escolhido. Exemplos de escolha de combinações de fluoróforos para imagens multiplexadas são fornecidos nas legendas da Figura 2 e da Figura 3. Como exemplo adicional, a seleção de Amp 4B-FL rotulará seletivamente sondas de DNA C1 com Atto 550 e sondas de RNA C3 com Alexa 647.
- Remova as lâminas do tampão de lavagem 1x e toque/absorva para remover o excesso de líquido.
- Adicione 1 gota de Amp 4-FL na folha de cobertura. Incubar em estufa humidificada a 40 °C durante 15 min.
NOTA: Seguindo a etapa 9.2, mantenha as amostras cobertas, protegidas da luz. - Decante o amplificador 4-FL e submerja em 1x tampão de lavagem. Agite agitando o prato por 2 min no RT. Repita a lavagem com o novo tampão de lavagem 1x. Lave com 1x PBS (2 min) e guarde em PBS.
10. Imunocoloração de proteínas: Para rotular proteína(s) de interesse
- Decantar PBS e adicionar 200 μL de tampão de bloqueio (1% p/v BSA, 10% v/v FBS em PBS com 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) à folha de cobertura. Incubar 1 h no RT.
- Buffer bloqueador decantante e aplicar 200 μL de anticorpo primário diluído em PBST + 1% p/v BSA. Incubar 1 h no RT.
- Lave a lâmina duas vezes com PBST por 10 min no RT com agitação.
- Aplicar anticorpo secundário de escolha por 1 h no TR em PBST + 1% p/v ASC.
- Lave a lâmina com PBST por 10 min no RT com agitação.
11. Coloração nuclear: Núcleos de contra-coloração após imunocoloração
- Decant PBST e aplicar DAPI ou mancha nuclear de escolha por 1 min no RT.
- Lave a lâmina duas vezes com PBS por 10 min no RT com agitação.
12. Montagem
- Coloque 1 gota de solução antifade (por exemplo, Prolong Gold) em uma nova lâmina de vidro estéril (Primeiro, limpe a lâmina com EtOH e deixe secar para garantir que nenhum resíduo esteja no vidro). Com a mesma ponta, espalhe a gota da solução antifade para cobrir uma área aproximadamente do tamanho da tampa.
NOTA: A solução antifade é muito viscosa e pode ser difícil de pipetar. Cortar a ponta de uma ponta de 200 μL antes da pipetagem pode mitigar esses problemas. - Remova a folha de cobertura com a amostra de célula da lâmina e submerja no PBS para remover o esmalte residual na parte de trás usando a pinça e o PBS. Pinça seca e parte de trás da tampa usando um Kimwipe.
- Suavemente embutir coverslip na gota de solução antifade, colocando o lado da amostra (lado com camada celular) de coverslip na gota).
- Deixe as amostras secarem durante a noite.
13. Imagens
- Imagem com microscópio epifluorescente.
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Representative Results
Um esquema de MICDDRP é representado na Figura 1. A marcação do DNA e do RNA é seguida por imunocoloração. O uso de amplificadores ramificados aumenta o sinal, permitindo a detecção de moléculas únicas de ácido nucleico.
Figura 1: Esquema do MICDDRP e fluxo de trabalho passo a passo. (A) O sinal de bDNA é amplificado através de DNAs pré-amplificadores e amplificadores ramificados para melhorar a detecção de DNA viral (1) e espécies de RNA (2). As sondas de oligonucleotídeos são hibridizadas em pares (ZZ em esquema) para alvo(s) de interesse, criando um andaime para pré-amplificador (Amp 1-FL, Passo 6 no Protocolo), amplificador (Amp 2- & 3-FL) e sondas fluorescentes (Amp 4, Passo 9 no Protocolo). Consulte a Tabela 4 para escolher o Amp 4 (A, B ou C)-FL apropriado para ISH multiplexado. A marcação do ácido nucleico é seguida por proteínas imunocorantes de interesse (3). (B) Treze etapas principais no protocolo MICDDRP com estimativa da duração do tempo para cada respectiva etapa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A aplicação do MICDDRP para estudar o curso da infecção pelo HIV-1 tem sido uma ferramenta útil no rastreamento da cinética de replicação viral em células primárias. Como prova de conceito desse procedimento, o DNA, o RNA e a proteína do HIV-1 são simultaneamente marcados e visualizados microscopicamente no nível de célula única (Figura 2). Dois genomas de DNA do HIV-1 são visualizados em uma única célula, pois estão transcrevendo ativamente o RNA viral (vRNA). O vRNA foi exportado através do complexo de poros nucleares e a proteína viral é sintetizada no citoplasma.
Figura 2: MICDDRP de células mononucleares primárias do sangue (PMBCs) infectadas com HIV-1. PMBCs infectados com HIV-1 (NL4.3) em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 2. As células foram fixadas 48 horas após a infecção (IPH). (A) Sonda HIV-1 bDNA FISH (marcada com ATTO 550; vermelho na Figura). Esta sonda hibridiza para o molde (3'<-5') fita de vDNA para evitar o crosstalk com o sentido (+) vRNA. (B) RNA HIV-1 não emendado (marcado com Alexa 647; verde na Figura). A sonda de vRNA HIV-1 hibridiza para transcritos virais transcritos na orientação 5'—>3'. (C) Imunocoloração da proteína do capsídeo do HIV-1 (p24) (anticorpo secundário conjugado ao Alexa 488; figura branca). (D) Imagem mesclada. A barra de escala representa 5 μm. Os núcleos foram corados com DAPI (azul). Para o preenchimento do DNA HIV-1 (sonda de DNA C1) com ATTO 550 e RNA HIV-1 (sonda de RNA C3) com Alexa 647, respectivamente, as amostras foram incubadas com Amp 4-FL 'B' (Consulte a Tabela 4 em Protocolo para escolher as cores de canal apropriadas para sondas de hibridização). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Além disso, realizamos a coloração dupla de DNA viral (vDNA) e vRNA para acompanhar a infecção por HTLV-1. Para otimização da marcação do ácido nucleico, aderimos de perto ao procedimento de coloração vDNA/VRNA desenvolvido para imagens de fluorescência multiplexada da infecção pelo HIV. Demonstramos que podemos rotular especificamente o DNA HTLV-1 e o RNA simultaneamente.
Figura 3: Marcação simultânea de vDNA HTLV-1 e vRNA em células MT-2. (A) HTLV-1 vDNA (marcado com ATTO 550; vermelho na figura) (B) sentido HTLV-1 não emendado (+) RNA (sonda de RNA C2 e marcado com Alexa 488; verde na figura)). (C) HTLV-1 HBZ antisense (-) vRNA (sonda de RNA C3 & (marcada com Alexa 647; branco na Figura)). (D) Imagem mesclada. A barra de escala representa 20 μm. Os núcleos foram corados com DAPI (azul). O ampère 4-FL 'B' foi usado (Consulte a Tabela 4 em Protocolo) para obter a marcação multiplexada do RNA HTLV-1 ('+' e '-'). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Experimentos de controle para avaliar a especificidade e o histórico da sonda alvo. A especificidade das sondas alvo de HIV-1 e HTLV-1 foi avaliada após infecção em linhagens celulares linfocíticas (células T de Jurkat não infectadas, células infectadas por HTLV-1 (MT2) e células infectadas por HIV-1 (H9111B)). As barras de escala representam 10 μm. (A) As células foram tratadas com sondas de RNA HTLV-1. (B) As células foram tratadas com sonda de RNA HIV-1 (+) (C-D). Demonstração adicional da especificidade das sondas HTLV-1 sem reatividade cruzada com o HIV-1. As setas brancas na Figura 4C indicam o DNA HTLV-1 (vermelho). (E-F). coloração de vRNA (verde) +/- Tratamento com RNase. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para verificar a especificidade das sondas de hibridização e avaliar como o método de marcação ISH afeta a eficiência de coloração de proteínas e o histórico geral, realizamos controles críticos para garantir o mais alto nível de rigor e reprodutibilidade para os experimentos. Como exemplo, na Figura 4A-D, verificamos a especificidade de nossas sondas de vDNA e vRNA HIV-1 e HTLV-1, pois mostramos muito pouca ou nenhuma reatividade cruzada entre os conjuntos de sondas entre os dois vírus. Apesar da marcação de dois retrovírus com potencial de reatividade cruzada à sonda, as sondas HIV-1 são específicas apenas para o material genético do HIV-1 e não para o HTLV-1. A mesma tendência é verdadeira para as sondas HTLV-1. Além disso, na Figura 4F, mostramos que podemos eliminar a coloração de vRNA se tratarmos nossas células com RNase durante a preparação da amostra. Para avaliar a possibilidade de atenuação da eficiência de obtenção de proteínas devido à ISH (tratamento com protease (Etapa 4 no Protocolo e Figura 1B) e condições de hibridização, que podem levar à ablação do reconhecimento do epítopo ou aumento do sinal de fundo, demonstramos que a eficiência de coloração de proteínas para o marcador de salpicos nucleares, sc-35, é comparável entre as abordagens convencionais de FI e imunocoloração durante o protocolo MICDDRP. No protocolo IF convencional, as células foram permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1% por 15 minutos, em vez de permeabilização com Tween-20 a 0,1% por 10 minutos, o que é utilizado no protocolo MICDDRP (Passo 3 em Protocolo e fluxo de trabalho na Figura 1B). A coloração proteica em ambas as condições (IF vs. MICDDRP) produziu um sinal várias ordens de magnitude maior que o controle (MICDDRP sem anticorpo primário), demonstrando ainda mais o baixo background gerado após esse protocolo e a preservação dos epítopos proteicos para imunocoloração eficiente . A quantificação por imagem da intensidade média de fluorescência integrada do sinal sc-35 por célula (Figura 5E) foi realizada conforme descrito anteriormente3. Para todos os resultados de imagem mostrados, garantimos a especificidade da sonda e dos anticorpos, bem como avaliamos quaisquer possíveis perturbações ou ruído de fundo maior do que o normal atribuído à nossa abordagem ISH.
Figura 5: Comparação da eficiência de coloração de proteínas seguindo o IF convencional vs. MICDDRP . A proteína celular, sc-35, um biomarcador para manchas nucleares, foi imunocorada em células T de Jurkat. Todas as barras de escala representam 10 μm. (A) As células T Jurkat não infectadas foram submetidas ao protocolo MICDDRP e foram tratadas com sondas de hibridização DNA/RNA HIV-1 usadas na Figura 2 e Figura 4 acima. Durante a imunocoloração, nenhum anticorpo primário foi adicionado. (B). As células T de Jurkat não infectadas foram submetidas ao FI convencional, marcando sc-35 (branco). As células foram permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1% por 15 minutos. (C). O MIDCDDRP foi realizado em células T de Jurkat infectadas pelo HIV. O vRNA é rotulado verde, o vDNA é vermelho e o sc-35 é branco. (D). Close-up de vRNA, vDNA e marcação de proteínas (sc-35) em células infectadas pelo HIV. (E) Quantificação do sinal médio de fluorescência integrada por célula de sc-35 em diferentes condições de imunocoloração. O eixo y está em uma escala logarítmica. A linha pontilhada representa o sinal de fundo de células não infectadas que foram submetidas ao protocolo MICDDRP, onde nenhum anticorpo primário foi adicionado. Não houve diferença significativa no sinal após MICDDRP vs. FI convencional . Mais de 500 células foram amostradas para quantificação para atingir a respectiva condição. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Este método também pode ser aplicado para estudar vírus de RNA que podem ou não incluir modelos de DNA para replicação viral. Por exemplo, sondas de bDNA específicas de fita podem ser projetadas para monitorar a expressão de RNA de fita de sentido (+) ou antisense (-) e diferentes espécies de vRNA em vírus como HBV, HCV, IAV e ZIKV. A visualização de diferentes espécies de RNA durante o curso da infecção pode fornecer informações sobre a cinética de replicação de vários sistemas virais.
Após o curso temporal da infecção pelo HBV, podemos ver que a quantidade de RNA pré-genômico do HBV (pgRNA) e RNA total do HBV aumenta em função do tempo. Além disso, imunocoramos simultaneamente um fator hospedeiro celular, o MOV10 (Figura 6).
Figura 6: HBV. Curso temporal da infecção pelo HBV de células 3E8. As células foram infectadas com 300 genomas de HBV por célula. A replicação viral é mostrada em três pontos de tempo (24, 48 e 72 hpi). pgRNA (marcado com ATTO 550; vermelho na Figura), RNA total do HBV (marcado com Alexa 647; verde na Figura) e MOV10 (anticorpo secundário conjugado ao Alexa 488; branco na Figura). Os núcleos são corados com DAPI em azul. A barra de escala nas imagens mescladas representa 10 μm. hpi, horas após a infecção. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A imagem foi realizada por microscopia confocal com objetivo de imersão em óleo de 60x. Os comprimentos de onda do passa-banda de excitação/emissão utilizados para detectar DAPI, Alexa 488, ATTO 550 e Alexa 647 foram ajustados para 405/420-480, 488/505-550, 550/560-610 e 647/655-705 nm, respectivamente (Figura 7, Figura 8 e Figura 9).
Figura 7: Curso temporal da infecção pelo HCV das células Huh-7.5.1. As células Huh-7.5.1 foram infectadas com o vírus da hepatite C (HCV) Jc1/Gluc2A a um MOI de 0,5. Nos intervalos de tempo indicados, as células foram fixadas e sondadas sequencialmente quanto ao sentido (+) vRNA, antisense (-) vRNA e NS5A (proteína HCV). Os núcleos foram corados com DAPI. Imagens representativas mescladas de cada ponto de tempo, mostrando (+) RNA em verde (marcado com Alexa 647) (-) RNA em vermelho (marcado com Atto 555), NS5A em branco (cabra secundária anti-camundongo conjugado ao Alexa 488) e núcleos em azul. As barras de escala representam 10 μm. As imagens inferiores são recortes ampliados a partir do ponto de tempo correspondente. hpi, horas após a infecção. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: BDNA FISH específico da cadeia e imunocoloração de células A549 infectadas com o vírus influenza A. As células A549 infectadas com o vírus PR8 Flu A foram fixadas e sondadas para (A) RNA nucleoproteína IAV (NP) (marcado com Alexa 488; verde na Figura) e (B) proteína da polimerase IAV (PB1) (cabra secundária anti-camundongo Atto 550; vermelho na Figura) e núcleos foram corados com DAPI (azul). (C) Imagem mesclada. A barra de escala representa 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: BDNA FISH específico da cadeia em células infectadas pelo vírus Zika (ZIKV). As células Vero foram infectadas com ZIKV a um MOI de 0,1. As células foram fixadas em 48 hpi. (A) As células foram coradas simultaneamente para sentido (+) vRNA (marcado com Alexa 488; verde na Figura) e antisense (-) vRNA (marcado com Atto 550; vermelho na Figura). Os núcleos foram corados com DAPI. Em (A), a caixa branca denota uma região com vRNA (+) e (-). As inserções apresentam um close-up de (+) vRNA (verde) e as espécies mais escassas (-) vRNA (vermelhas). (B) sentido (+) vRNA (verde). (C) antisense (-) vRNA (vermelho). A barra de escala em (A) representa 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A visualização simultânea de RNA, DNA e proteína geralmente requer otimização extensiva. Dois métodos comumente usados são a marcação de 5-etil-2-desoxiuridina (EdU) e DNA FISH. A marcação EdU tem sido aplicada para visualizar o DNA viral e a proteína simultaneamente, já que a EdU é incorporada no DNA nascente e, posteriormente, marcada com corantes fluorescentes contendo azida por meio da química click. A marcação EdU pode, portanto, ser usada para monitorar a cinética de replicação de vírus nativos de vírus de DNA ou vírus com modelos de DNA para replicação12. Uma falha da marcação EdU, no entanto, é que, ao dividir as células, o genoma replicante incorporará a EdU, gerando alta análise de imagem de fundo e confusa. O DNA FISH pode contornar esses problemas hibridizando diretamente uma sonda de ácido nucleico para o respectivo alvo, independentemente do ciclo celular. No entanto, o FISH convencional muitas vezes dependia de altas temperaturas para alcançar uma hibridização eficiente da sonda, dificultando a imunocoloração ou mesmo a coloração simultânea do RNA13. O MICDDRP pode potencialmente contornar esses problemas, fornecendo uma marcação fluorescente simultânea robusta de DNA, RNA e proteína em uma variedade de sistemas celulares.
Embora tenhamos demonstrado que podemos rotular proteínas e ácidos nucleicos simultaneamente usando nosso protocolo MICDDRP, a otimização foi necessária em diferentes sistemas. O primeiro parâmetro importante que tivemos que otimizar foi o tratamento da protease. Variamos a concentração de protease III ao longo das condições. A otimização do tratamento com protease foi empírica, pois utilizamos diferentes diluições para avaliar o que produziu a maior eficiência de hibridização, sem comprometer a eficiência da imunocoloração. Controles apropriados foram realizados lado a lado para avaliar a especificidade da sonda e as alterações na eficiência de coloração de proteínas atribuídas ao tratamento com protease. Os próximos parâmetros principais que precisavam de otimização eram o projeto da sonda e a hibridização da sonda.
O projeto adequado de sondas de captura e amplificador é fundamental para alcançar a sensibilidade e a especificidade da tecnologia bDNA. Pacotes de software que predizem a probabilidade de eventos de hibridização não específicos estão disponíveis para melhorar o projeto da sonda 7,11. As sondas bDNA com as sondas de pré-amplificador, amplificador e etiqueta fluorescente que as acompanham agora podem ser compradas comercialmente para garantir a compatibilidade com os kits de imagem bDNA. Os usuários podem fornecer aos fabricantes informações de sequência (~ 300-1000 pares de bases) para a(s) região(ões) de destino na forma de um arquivo fasta (formato baseado em texto para representar a sequência de nucleotídeos). As sondas de destino são geradas com > homologia de sequência de 90% à sequência fornecida.
Para a marcação do DNA, descobrimos que a diluição das sondas no tampão de hibridização descrito na Etapa 5 do Protocolo melhora a hibridização do DNA. Ao marcar o DNA e o RNA, a sonda de RNA pode ser diluída no tampão de hibridização. A marcação de DNA na ausência de RNase não pode excluir a possibilidade de que o ácido nucleico observado inclua RNA da cadeia alvo. A temperatura também pode ter que ser ajustada para melhorar a eficiência da hibridização. O aumento da temperatura pode afetar a eficiência da coloração de proteínas, pois o aumento das temperaturas pode promover a desnaturação da proteína, ablando o reconhecimento do epítopo do anticorpo primário. Em nossos dados representativos apresentados, realizamos a ISC a 40 °C.
Em comparação com o DNA FISH CONVENCIONAL, O MICDDRP fornece um procedimento aprimorado para marcar simultaneamente DNA, RNA e proteína para visualizar via microscopia de fluorescência. Uma limitação potencial é que a seleção da sonda pode afetar a eficiência da hibridização e a capacidade de comparar quantitativamente os dados entre as sondas. Este protocolo tem sido eficaz em diversos sistemas celulares e virais em nossas mãos, com apenas uma pequena otimização necessária em condições variadas. Publicações recentes de alto perfil utilizaram nossa abordagem para estudar a seleção do local de integração do HIV14 e a cinética de transcrição reversa do HIV15. Aplicações futuras do MICDDRP podem incluir a visualização de ácidos nucleicos virais concomitantemente com sequências de ácidos nucleicos de genes celulares específicos e proteínas celulares.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado no todo ou em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 e U54 AI150472). Agradecemos ao Dr. Raymond F. Schinazi e Sadie Amichai por fornecerem células infectadas com o vírus da gripe A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
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