Estudando a Atividade de Neuropeptídeos e Outros Reguladores do Sistema Excretório no Mosquito Adulto

Summary

Este protocolo descreve metodologias por trás do ensaio ramsay, microeletrodos seletivos de íons, técnica de eletrodo seletivo de digitalização (SIET) e ensaios de contração in vitro, aplicados para estudar o sistema excretório de mosquitos adultos, composto pelos túbulos e traseiros malpighianos, para medir coletivamente as taxas de íons e secreção de fluidos, atividade contratil e transporte transepitelial.

Abstract

Estudos de fisiologia de insetos, particularmente nas espécies que são vetores de patógenos causando doenças em humanos e outros vertebrados, fornecem a base para desenvolver novas estratégias para o controle de pragas. Aqui, uma série de métodos são descritos que são rotineiramente utilizados para determinar os papéis funcionais de neuropeptídeos e outros fatores neuronais (ou seja, aminas biogênicas) no sistema excretório do mosquito, Aedes aegypti. Os túbulos malpighianos (TM), responsáveis pela formação primária da urina, podem continuar funcionando por horas quando removidos do mosquito, permitindo medidas de secreção de fluidos após tratamentos hormonais. Como tal, o ensaio ramsay é uma técnica útil para medir as taxas de secreção de MTs isolados. Microeletrodos seletivos de íons (ISME) podem ser usados sequencialmente para medir concentrações de íons (ou seja, Na⁺ e K⁺) no fluido secretado. Este ensaio permite a medição de vários MTs em um determinado momento, determinando os efeitos de vários hormônios e drogas. A Técnica de Eletrodo seletivo de digitalização usa ISME para medir a tensão representativa da atividade iônica na camada não írpara adjacente à superfície dos órgãos de transporte de íons para determinar o transporte transepiteno de íons em tempo real. Este método pode ser usado para entender o papel dos hormônios e outros reguladores sobre absorção de íons ou secreção através da epitélio. Os ensaios de contração de porca também são uma ferramenta útil para caracterizar neuropeptídeos mioativos, que podem aumentar ou reduzir a capacidade deste órgão de remover o excesso de fluido e resíduos. Coletivamente, esses métodos fornecem uma visão de como o sistema excretório é regulado em mosquitos adultos. Isso é importante porque a coordenação funcional dos órgãos excretórios é crucial para superar desafios como o estresse de dessecação após o término e antes de encontrar um hospedeiro vertebrado adequado para obter uma farinha de sangue.

Introduction

A manutenção dos níveis de sal e água nos insetos permite que eles tenham sucesso em muitos nichos ecológicos e ambientais, utilizando uma variedade de estratégias de ^{alimentação1}. A maioria dos insetos desenvolveu mecanismos para regular a composição de seu hemoglifo dentro de limites estreitos, a fim de suportar os diferentes desafios associados ao seu ambiente ^particular2. Os insetos terrestres são frequentemente confrontados com o desafio de conservar a água e o sistema excretório sofre anti-diurese para evitar a perda de água e alguns sais essenciais, evitando, portanto, a dessecação. Em contraste, a diurese ocorre quando o inseto se alimenta e é desafiado com excesso de água e potencialmente ^sais3,4. Por meio de seu sistema excretório especializado e altamente ativo, os insetos desenvolveram mecanismos regulatórios que atuam para combater seus desafios osmoregulatórios. Em mosquitos Aedes aegypti adultos, o sistema excretório é composto pelos túbulos malpighianos (TM) e hindgut, este último é composto pelo íleo anterior e reto ^posterior5. Os MTs são responsáveis pela geração de urina primária, geralmente rica em NaCl e/ou KCl. A urina primária é então modificada através de processos secretos e reabsortivos à medida que viaja rio abaixo do túbulo e entra no ^hindgut5. A excreta final pode ser hiper ou hipoosmótica para o hemolítico, dependendo das condições alimentares/ambientais, e é enriquecida em resíduos tóxicos e ^{nitrogenados2}.

Os MTs são ideais para estudar muitas características do fluido epitelial e do transporte de soluto, pois realizam uma grande variedade de funções de transporte e ^{excreção2,6}. Através da regulação ^hormonal2, os TM funcionam segregando íons e outros solutos do sangue para o lúmen ^léculo7, fornecendo um gradiente osmótico permitindo que a água seja transportada por aquaporinas8,9, que cria coletivamente a urina primária, antes de viajar em direção ao traseiro reabsorguente2. Assim, coletando o fluido secretado de MTs isolados, pode-se monitorar continuamente o transporte transepitelial de fluidos e íons. A medição da taxa de secreção e a composição da urina fornecem uma visão sobre os mecanismos responsáveis pelo íon transepiteliol e transporte de fluidos. Um método popular para estudar taxas de secreção de fluidos é o ensaio ramsay, que foi introduzido pela primeira vez por Ramsay em ¹⁹⁵³¹⁰. Neste método, a extremidade distal (fechada) do túbulo é tratada com um hormônio (ou outro composto/droga de teste), enquanto a extremidade proximal (aberta) é enrolada em torno de um pino em óleo de parafina saturada de água, que secreta a urina primária, acumulando-se como uma gota na ponta do pino. Os MTs isolados são capazes de sobreviver e funcionar por longos períodos (até 24 h) em condições in vitro otimizadas, o que os torna modelos adequados e eficientes para a medição da secreção de fluidos. Os insetos têm sistemas circulatórios abertos, assim os MTs são facilmente dissecados e removidos, pois geralmente flutuam livremente no hemolymph6. Além disso, com exceção dos pulgões — que não possuem ^MTs11 — o número de TM em uma determinada espécie de inseto pode variar consideravelmente de quatro a centenas (cinco em mosquitos Aedes) permitindo múltiplas medições de um inseto.

Os MTs em mosquitos Aedes, em comum com outros insetos endopterygote, são compostos por dois tipos de células que formam um simples epitélio2,12; grandes células principais, que facilitam o transporte ativo de cálas (ou seja, Na⁺ e K⁺) para o lúmen, e células estelares finas, que auxiliam na secreção transepiteliol ^{cl-secreção13}. Os MTs não são inervados2, e em vez disso são regulados por vários hormônios, incluindo fatores diuréticos e anti-diuréticos, permitindo o controle do transporte de íons (principalmente Na⁺, K⁺, e Cl^–) e água osmoticamente ^{obrigatória2}. Inúmeros estudos têm examinado a regulação hormonal dos Aedes MTs para entender o papel dos fatores endócrinos no transporte transepitelio14,15,16,17,18. Como mostrado nos resultados representativos, os protocolos aqui demonstram os efeitos de diferentes fatores hormonais em MTs isolados de mosquitos adultos A. aegypti, incluindo controle diurético e anti-diurético (Figura 1). O ensaio de Ramsay é usado para demonstrar como um hormônio anti-diurético, AedaeCAPA-1, inibe a secreção fluida de TM estimulado pelo hormônio diurético _{31 (DH31}) (Figura 1).

O tamanho menor dos insetos tem exigido o desenvolvimento de micro métodos para medir a atividade iônica e concentrações em amostras de fluidos, ou perto da superfície de tecidos isolados, como os MTs e intestino. Métodos variados foram implementados, incluindo o uso de radioisótopos de ^íons19, o que requer a coleta das gotas de fluido secretadas para medição de concentrações de ^íons20. Túbulos Aedes estimulados in vitro normalmente secretam ~0,5 nL/^min21, assim o manuseio de volumes tão pequenos pode representar um desafio e potencialmente introduzir erro após a transferência. Como resultado, microeletrodos seletivos de íons (ISMEs) têm sido amplamente utilizados para medir concentrações de íons em gotículas secretas de MTs in vitro. Neste método, um eletrodo de referência e ISME, preenchidos com a solução de enchimento e ionfora apropriadas, são posicionados na gotícula de urina secretada para determinar as concentrações de ^íon22. Adaptado de Donini e ^colegas23, este protocolo atual utiliza um ionophore Na⁺-seletivo para medir a atividade de íons em gotículas secretas de MTs estimulados em mosquitos Aedes adultos. Uma vez que os microeletrores seletivos medem a atividade de íons, esses dados podem ser expressos como concentrações de íons, seguindo a suposição de que as soluções de calibração e amostras experimentais compartilham o mesmo coeficiente de atividade de ^íon21 (Figura 1B,C).

A Técnica de Eletrodo Seletivo de Digitalização (SIET) também faz uso de ISMEs para medir gradientes de concentração de íons na camada não tumercada adjacente a órgãos, tecidos ou células que estão transportando íons. Os ISMEs medem gradientes de tensão que podem ser usados para calcular os gradientes de concentração de íons e direção e magnitude do fluxo de íons através do órgão, tecido ou ^célula20. Nesta técnica, o ISME é montado em um manipulador de três eixos controlado por motores micro-passo computadorizados para que sua posição 3D seja controlada até o nível de ^{micrômetro20}. As tensões são medidas em dois pontos dentro da camada não-rarizado usando um protocolo de amostragem programado e controlado por software de computador. Os dois pontos são tipicamente separados por uma distância de 20-100 μm com um ponto dentro de 5-10 μm da superfície do órgão, tecido ou célula e o segundo ponto a mais 20-100 μm de distância. A diferença de magnitude das tensões entre os dois pontos é calculada para obter um gradiente de tensão24,25,26, que é então usado para calcular o gradiente de concentração e, posteriormente, o fluxo líquido utilizando a Lei ^{de Fick24,27}. Este método é útil para avaliar o transporte de íons específicos em diferentes regiões do intestino e MTs de insetos, ou em momentos específicos após uma exposição de farinha de sangue ou tratamento. Por exemplo, o SIET pode ser usado para entender como processos absortivos e secretores no sistema excretório do mosquito são regulados por ^hormônios28, bem como diferentes comportamentos alimentares e condições de ^criação25. Trabalhos anteriores utilizando o SIET revelaram locais envolvidos no transporte de íons ao longo das papilas anais e reto de mosquitos larvais e ^adultos24,28. O protocolo atual, descrito anteriormente por Paluzzi e seus ^colegas26, mede o fluxo na⁺ através da epitélio retal pad do reto feminino adulto (Figura 2).

O segmento final do sistema excretório do mosquito requer movimento muscular coordenado para ajudar a misturar alimentos e segregar o ^{desperdício26}. Produtos não absorvíveis de digestão a partir do midgut, juntamente com a urina primária secretada pelos TM, são passados através da válvula pilênca e entregues ao ^hindgut2. Contrações espontâneas de hindguta começam na válvula pilórica e ocorrem em ondas peristálticas, que são transmitidas sobre o íleo através da contração coordenada de músculos circulares e longitudinais ao redor da superfície basal das células epiteliais26. Finalmente, os músculos dentro do reto ajudam a impulsionar e eliminar o desperdício através do canal anal. Embora a motilidade do inseto hindgut seja miogênica, exigindo ^Ca2+ extracelular para produzir contrações espontâneas, esses processos também podem ser regulados neuronalmente26,29,30. Essa regulação exógena pelo sistema nervoso é importante após a alimentação, pois o animal deve expulsar resíduos do intestino e restaurar o equilíbrio hemólquio31. Como resultado, a realização de bioensações in vitro para identificar neuropeptídeos miostimulatórios ou mioinhibitórios é útil para avaliar como os neuroquímicos influenciam a motilidade hindgut. O protocolo atual, realizado por Lajevardi e ^Paluzzi28, utiliza gravações de vídeo para examinar a motilidade ileal em resposta a neuropeptídeos (Figura 3). Da mesma forma, um transdutor de força ou conversor de impedância também pode ser usado para observar traços de contrações através de um software de aquisição de ^dados32,33. No entanto, o uso da tecnologia de vídeo nos permite avaliar visualmente o órgão e analisar melhor usando um subconjunto de parâmetros para identificar o papel dos hormônios na motilidade hindgut.

O uso dessas técnicas pode ajudar a caracterizar fatores que regulam e coordenam o transporte de fluidos e íons ao longo do sistema excretório, juntamente com a motilidade hindgut. É importante ressaltar que é suportada uma ligação funcional entre a resposta diurética pelos TM e a motilidade hindgut, pois hormônios diuréticos, como _DH31 e 5HT, caracterizados por sua capacidade de estimular a secreção de fluidos pelos TM, também foram encontrados para exibir ações miotrópicas ao longo do mosquito hindgut21,34,35 . Esses achados destacam a importância de uma coordenação rigorosa entre os TM e o hindgut durante eventos como diurese pós-prandial em insetos que requerem eliminação rápida de resíduos.

Aqui, são descritas a abordagem detalhada por trás da técnica de ensaio de Ramsay para medir a taxa de secreção de fluidos no mosquito A. aegypti e o uso de microeletrodos seletivos para determinar as concentrações na⁺ dentro do fluido secreto dos MTs, que quando combinado permite que as taxas de transporte de íons transepitelais sejam determinadas. Além disso, a Técnica de Eletrodo seletivo de digitalização e ensaios de contração de contração de porcas são descritos para medir o fluxo de íons e a motilidade, respectivamente, o que ajuda a elucidar a regulação hormonal do hindgut (Figura 4).

Protocol

1. Fazendo pratos forrados de silicone NOTA: Esta etapa deve ser feita antes dos experimentos. Esses pratos serão feitos para preparar o prato de ensaio para dissecções, e para experimentos de ensaio de contração. Prepare o silicone usando um kit de elastômero de silicone seguindo as recomendações do fabricante. Misture os componentes líquidos de duas partes a uma razão de 10 a 1. Misture suavemente e completamente invertendo, mas certifique-se de minimizar a formação de …

Representative Results

A aplicação de DH31 contra MTs não estimulados resulta em um aumento significativo na taxa de secreção de fluidos, confirmando seu papel como hormônio diurético em mosquitos Aedes (Figura 1A). Quando os túbulos são tratados com AedaeCAPA-1, observa-se uma redução na taxa de secreção em MTs estimulados por DH31. A Figura 1B demonstra o uso de eletrodos seletivos de íons para medir as concentrações na+</…

Discussion

Ao ingerir uma refeição de sangue, os insetos hematófagos enfrentam o desafio do excesso de solutos e água em seu hemolymph2. Para lidar com isso, eles possuem um sistema excretório especializado, que é fortemente controlado por fatores hormonais, permitindo que os insetos iniciem rapidamente a diurese pós-prandial. O ensaio ramsay e o uso de microeletrodos seletivos de íons permite a medição das taxas de secreção de fluidos, juntamente com concentrações de íons e taxas de transport…

Materials

1 mL syringes	Fisher Scientific	14955456
35 mm Petri dishes	Corning Falcon (Fisher Scientific)	C351008
Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)	World Precision Instruments	1B100F-4	used for ISME reference electrodes
Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)	World Precision Instruments	1B200F-4	used for SIET reference electrodes
Borosillicate glass capillary unfilamented tubes (OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)	World Precision Instruments	TW150-4	used for ISME and SIET electrodes
CO2 pad	Diamed	GEN59-114
Dimethyltrimethylsilylamine solution	Sigma-Aldrich	41716
Faraday cage	Custom		Can be fabricated by local machine shop
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	157740
Forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools	91150-20
Glass Petri dish	Fisher Scientific	08-748A
Hydrated mineral oil	Fisher Scientific	8042-47-5	Specific brand is not important
INFINITY1-2CB video camera	Luminera	INFINITY1-2CB
Micromanipulators (left and right handed)	World Precision Instruments	MMJL and MMJR	Specific brand is not important so long as high quality manipulator
Mineral Oil, Light	Fisher Scientific	0121-4
Minutien pins (0.1 mm stainless steel)	Fine Science Tools	26002-10
Non-hardening modeling clay	Sargent Art		Specific brand is not important
Olympus light microscope (FOR SIET)	Olympus	customized system
Plastic Pasteur (transfer) pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)	Sigma-Aldrich	A-005-M	84 kDa
Polyvinyl chloride (PVC)	Sigma-Aldrich	81395
Scalpel Blade	Fine Science Tools	10050-00
Scalpel Handle	Fine Science Tools	10053-09
Schneider's Drosophila medium	Sigma-Aldrich	S0146
SIET system	Applicable Electronics	customized system	Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview
Silver wire	World Precision Instruments	AGW1010
Sodium ionophore II cocktail A	Fluka	99357
Standard polystyrene Petri (culture) dishes	Fisherbrand	FB012921	Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller	Sutter Instruments	FGPN7
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Chemical Company	NC9285739
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
VWR advanced hotplate stirrer – aluminum	VWR	9578	Specific brand is not important