Summary
Bu protokol, Ramsay tahlilinin arkasındaki metodolojileri, iyon seçici mikroelekrodları, Tarama İyon seçici Elektrot Tekniğini (SIET) ve in vitro kasılma testlerini özetlemektedir, Malpighian tübülleri ve arkalarından oluşan yetişkin sivrisinek boşaltım sistemini incelemek için uygulanan, iyon ve akışkan salgı oranlarını, kontinentil aktiviteyi ve transepithelial iyon taşımacılığını toplu olarak ölçmek için.
Abstract
Böcek fizyolojisi çalışmaları, özellikle insanlarda ve diğer omurgalılarda hastalığa neden olan patojenlerin vektörleri olan türlerde, haşere kontrolü için yeni stratejiler geliştirmek için temel sağlar. Burada, nöropeptitlerin ve diğer nöronal faktörlerin (yani biyojenik aminlerin) sivrisinek, Aedes aegypti'nin boşaltım sistemindeki fonksiyonel rollerini belirlemek için rutin olarak kullanılan bir dizi yöntem açıklanmaktadır. Birincil idrar oluşumundan sorumlu malpighian tübülleri (MTs), sivrisinekten çıkarıldığında saatlerce çalışmaya devam edebilir ve hormon tedavilerini takiben sıvı salgısı ölçümlerine izin verebilir. Bu nedenle, Ramsay tahlili izole MTs'den salgı oranlarını ölçmek için yararlı bir tekniktir. İyon seçici mikroelekrodlar (ISME), salgılanan sıvıdaki iyon konsantrasyonlarını (yani Na+ ve K+) ölçmek için ardışık olarak kullanılabilir. Bu tahlil, çeşitli hormonların ve ilaçların etkilerini belirleyerek belirli bir zamanda birkaç MT'nin ölçülecekliğine izin verir. Tarama İyon seçici Elektrot Tekniği, iyonların neredeyse gerçek zamanlı olarak transepithelial taşınmasını belirlemek için iyon taşıma organlarının yüzeyine bitişik bozulmamış tabakadaki iyonik aktivitenin voltaj temsilcisini ölçmek için ISME kullanır. Bu yöntem, hormonların ve diğer düzenleyicilerin epitel boyunca iyon emilimi veya salgılanması üzerindeki rolünü anlamak için kullanılabilir. Hindgut kasılma tahlilleri, bu organın fazla sıvı ve atıkları giderme yeteneğini artırabilecek veya azaltabilecek miyoaktif nöropeptidleri karakterize etmek için de yararlı bir araçtır. Toplu olarak, bu yöntemler boşaltım sisteminin yetişkin sivrisineklerde nasıl düzenlendiği hakkında fikir sağlar. Bu önemlidir, çünkü boşaltım organlarının fonksiyonel koordinasyonu, eklozyondan sonra ve kan metrini elde etmek için uygun bir omurgalı konakçı bulmadan önce desiccation stresi gibi zorlukların üstesinden gelmede çok önemlidir.
Introduction
Böceklerde tuz ve su seviyelerinin korunması, çeşitli beslenme stratejilerinden yararlanarak birçok ekolojik ve çevresel nişte başarılı olmalarını sağlar1. Çoğu böcek, kendi çevreleriyle ilgili farklı zorluklara dayanmak için hemolimflerinin bileşimini dar sınırlar içinde düzenlemek için mekanizmalar geliştirmişdir2. Karasal böcekler genellikle su tasarrufu zorluğu ile karşı karşıyadır ve boşaltım sistemi su kaybını ve bazı temel tuzları önlemek için anti-diürez geçirir, bu nedenle desiccation kaçınır. Buna karşılık, diürezi böcek beslendiğinde ve fazla su ve potansiyel olarak tuzlarla mücadele edildiğinde ortaya çıkar3,4. Özel ve son derece aktif boşaltım sistemleri sayesinde, böcekler osmoregulatory zorluklarına karşı koymak için hareket eden düzenleyici mekanizmalar geliştirmişlerdir. Yetişkin Aedes aegypti sivrisineklerinde, boşaltım sistemi Malpighian tübüllerinden (MTs) ve arkadan oluşur, ikincisi ön ileum ve posterior rektumdan oluşur5. MT'ler, genellikle NaCl ve/veya KCl bakımından zengin olan birincil idrar üretmektir. Birincil idrar daha sonra tübülün aşağı doğru ilerlerken ve arka kapıya girerken salgı ve reabsorptive süreçlerle değiştirilir5. Son atılım, beslenme/ çevre koşullarına bağlı olarak hemolimf için hiper veya hiposmotik olabilir ve toksik ve azotlu atıklarda zenginleştirilir2.
MTs, çok çeşitli taşıma ve boşaltım işlevlerini yerine getirmeleri nedeniyle epitel sıvısı ve çözünür taşımacılığın birçok özelliği üzerinde çalışmak için idealdir2,6. Hormonal düzenleme2 aracılığıyla, MTs, kandan tübül lümen7'ye iyonlar ve diğer solutlar salgılayarak işlev görür ve suyun, reabsorptive hindgut2'ye doğru seyahat etmeden önce, toplu olarak birincil idrarı oluşturan aquaporins8,9 tarafından taşınmasına izin veren ozmotik bir gradyan sağlar2. Böylece, salgılanan sıvıyı izole edilmiş MT'lerden toplayarak, sıvı ve iyonların transepithelial naklini sürekli olarak izleyebilirsiniz. Salgı oranının ve idrar bileşiminin ölçülmesi, transepithelial iyon ve sıvı taşınımından sorumlu mekanizmalar hakkında fikir sağlar. Sıvı salgılama oranlarını incelemek için popüler bir yöntem, ilk kez Ramsay tarafından 195310'da tanıtılan Ramsay tahlildir. Bu yöntemde, tübüllerin distal (kapalı) ucu bir hormon (veya başka bir test bileşiği / ilacı) ile tedavi edilirken, proksimal (açık) uç, birincil idrarı salgılayan, pimin ucunda bir damlacık olarak biriken su doymuş parafin yağını bir pimin etrafına sarılır. İzole MT'ler, optimize edilmiş in vitro koşullar altında uzun süre (24 saate kadar) hayatta kalabilir ve çalışabilir, bu da onları sıvı salgısı ölçümü için uygun ve verimli modeller haline getirir. Böcekler açık dolaşım sistemlerine sahiptir, bu nedenle MT'ler genellikle hemolimf6'da serbestçe yüzdükleri için kolayca parçalara çıkarılır ve çıkarılır. Ek olarak, MTs11'den yoksun yaprak bitleri hariç, belirli bir böcek türündeki MT sayısı, bir böcekten birden fazla ölçüme izin veren dört ila yüzlerce (Aedes sivrisineklerinde beş) arasında önemli ölçüde değişebilir.
Aedes sivrisineklerindeki MT'ler, diğer endopterygot böcekleri ile ortak olarak, basit bir epitel oluşturan iki hücre türünden oluşur2,12; Lümene cations (na+ ve K+) aktif naklini kolaylaştıran büyük ana hücreler ve transepithelial Cl-secretion13'e yardımcı olan ince yıldız hücreleri. MT'ler innervated2 değildir ve bunun yerine hem idrar söktürücü hem de anti-diüretik faktörler de dahil olmak üzere çeşitli hormonlar tarafından düzenlenir, iyon taşımacılığının (özellikle Na+, K + ve Cl-) ve osmotik olarak zorunlu suyun kontrolüne izin verir2. Çok sayıda çalışma, endokrin faktörlerin transepithelial transport14,15,16,17,18 üzerindeki rolünü anlamak için Aedes MTs'nin hormonal düzenlemesini incelemıştır. Temsili sonuçlarda gösterildiği gibi, buradaki protokoller, hem diüretik hem de anti-diüretik kontrol de dahil olmak üzere yetişkin dişi A. aegypti sivrisineklerinden izole EDILMIŞ MT'ler üzerindeki farklı hormonal faktörlerin etkilerini göstermektedir (Şekil 1). Ramsay tahlili, anti-diüretik hormon olan AedaeCAPA-1'in diüretik hormon 31 (DH31) tarafından uyarılan MT'lerin sıvı salgısını nasıl inhibe ettiğini göstermek için kullanılır (Şekil 1).
Böceklerin daha küçük boyutu, sıvı örneklerindeki iyonik aktiviteyi ve konsantrasyonları ölçmek için veya MT'ler ve bağırsak gibi izole dokuların yüzeyine yakın mikro yöntemlerin geliştirilmesini gerektirmektedir. İyon konsantrasyonlarının ölçümü için salgılanan sıvı damlalarının toplanmasını gerektiren iyon19 radyoisotoplarının kullanımı da dahil olmak üzere çeşitli yöntemler uygulanmıştır20. Uyarılmış Aedes tübülleri in vitro tipik olarak ~0.5 nL/ min21 salgılar, bu nedenle bu tür küçük hacimlerin işlenmesi bir zorluk oluşturabilir ve transfer sırasında potansiyel olarak hata verebilir. Sonuç olarak, iyon seçici mikroelekrodlar (ISME'ler), tüp bebek olarak salgılanan MT damlacıklarındaki iyon konsantrasyonlarını ölçmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu yöntemde, uygun dolgu çözeltisi ve iyonofor ile dolu bir referans elektrot ve ISME, iyon konsantrasyonlarını belirlemek için salgılanan idrar damlacıklarına konumlandırılmıştır22. Donini ve meslektaşlarından uyarlanmış23, bu mevcut protokol, yetişkin Aedes sivrisineklerinde uyarılmış MTs'den salgılanan damlacıklardaki iyon aktivitesini ölçmek için Na+seçici bir iyonofor kullanır. İyon seçici mikroelekrodlar iyon aktivitesini ölçttüklerinden, bu veriler kalibrasyon çözeltilerinin ve deneysel numunelerin aynı iyon aktivite katsayısını21 paylaştığı varsayımını takiben iyon konsantrasyonları olarak ifade edilebilir (Şekil 1B,C).
Tarama İyon seçici Elektrot Tekniği (SIET), iyonları taşıyan organlara, dokulara veya hücrelere bitişik bozulmamış katmandaki iyon konsantrasyon gradyanlarını ölçmek için ISME'lerden de yararlanır. ISME'ler, daha sonra iyon konsantrasyon gradyanlarını ve organ, doku veya hücredeki iyon akısının yönünü ve büyüklüğünü hesaplamak için kullanılabilecek voltaj gradyanlarını ölçer20. Bu teknikte, ISME, bilgisayarlı mikro-step motorlar tarafından kontrol edilen üç eksenli bir manipülatöre monte edilir, böylece 3B konumu mikrometre seviyesine kontrol edilir20. Gerilimler, bilgisayar yazılımı tarafından programlanmış ve kontrol edilen bir örnekleme protokolü kullanılarak karıştırılmamış katman içinde iki noktada ölçülür. İki nokta tipik olarak 20-100 μm'lik bir mesafe ile ayrılır ve organ, doku veya hücrenin yüzeyinin 5-10 μm içinde bir nokta ve ikinci nokta 20-100 μm daha uzaktadır. İki nokta arasındaki gerilimlerin büyüklüğü farkı, daha sonra Fick Yasası24,27 kullanılarak konsantrasyon gradyanını ve daha sonra net akıyı hesaplamak için kullanılan bir voltaj gradyanı24,25,26 elde etmek için hesaplanır. Bu yöntem, belirli iyonların böcek bağırsağı ve MT'lerin farklı bölgelerinde veya kan metrini veya tedavi maruziyetini takiben belirli zaman noktalarında taşınmasını değerlendirmek için yararlıdır. Örneğin, SIET, sivrisinek boşaltım sistemindeki emilimsel ve salgı süreçlerinin hormonlar28'in yanı sıra farklı beslenme davranışları ve yetiştirme koşulları25 tarafından nasıl düzenlendiğini anlamak için kullanılabilir. SIET'i kullanan önceki çalışmalar, larva ve yetişkin sivrisineklerin anal papilla ve rektum boyunca iyon taşımacılığında yer alan alanları ortaya çıkardı24,28. Paluzzi ve meslektaşları26 tarafından daha önce açıklanan mevcut protokol, yetişkin kadın rektumunun rektal ped epitelinde Na+ akısını ölçer (Şekil 2).
Sivrisinek boşaltım sisteminin son bölümü, yiyecekleri karıştırmaya ve atık salgılaya yardımcı olmak için koordineli kas hareketi gerektirir26. Midguttan emilemeyen sindirim ürünleri, MTs tarafından salgılanan birincil idrarla birlikte, pilorik kapaktan geçirilir ve arka cama teslim edilir2. Spontan arka kapak kasılmaları pilorik kapakta başlar ve epitel hücrelerinin bazal yüzeyini çevreleyen dairesel ve boyuna kasların koordineli kasılması yoluyla ileum üzerinden aktarılan peristaltik dalgalarda meydana gelir26. Son olarak, rektum içindeki kaslar anal kanaldan atıkların itmeye ve ortadan kaldırılmasına yardımcı olur. Böcek arkagözü hareketliliği miyojenik olmasına rağmen, spontan kasılmalar üretmek için hücre dışı Ca2+ gerektirse de, bu süreçler nöronally olarak da düzenlenebilir26,29,30. Sinir sistemi tarafından yapılan bu eksojen düzenleme, beslenmeden sonra önemlidir, çünkü hayvanın atıkları bağırsaktan atmalı ve hemolimf dengesini geri kazanmalıdır31. Sonuç olarak, miyostimülatör veya miyoinhibitory nöropeptidleri tanımlamak için in vitro biyoassayların gerçekleştirilmesi, nörokimyasalların hindgut hareketliliğini nasıl etkilediğini değerlendirmede yararlıdır. Lajevardi ve Paluzzi28 tarafından gerçekleştirilen mevcut protokol, nöropeptitlere yanıt olarak ileal hareketliliği incelemek için video kayıtlarını kullanır (Şekil 3). Benzer şekilde, bir veri toplama yazılımı aracılığıyla kasılma izlerini gözlemlemek için bir kuvvet dönüştürücüsü veya empedans dönüştürücüsü de kullanılabilir32,33. Bununla birlikte, video teknolojisini kullanmak, organı görsel olarak değerlendirmemize ve hormonların arka motilite üzerindeki rolünü tanımlamak için bir parametre alt kümesi kullanarak daha fazla analiz etmemize izin verir.
Bu tekniklerin kullanılması, boşaltım sistemi boyunca sıvı ve iyon taşımacılığını düzenleyen ve koordine eden faktörlerin ve arka cam hareketliliğinin karakterize edilmesine yardımcı olabilir. Daha da önemlisi, MTs tarafından diüretik yanıt ve hindgut hareketliliği arasında fonksiyonel bir bağlantı desteklenir, çünkü DH31 ve 5HT gibi diüretik hormonlar, MTs tarafından sıvı salgısını uyarma yetenekleri ile karakterizedir, ayrıca sivrisinek arkagözü boyunca miyotropik eylemler sergilediği bulunmuştur21,34,35 . Bu bulgular, hızlı atık eliminasyonu gerektiren böceklerde post-prandial diürezi gibi olaylar sırasında MTs ve hindgut arasındaki sıkı koordinasyonun önemini vurgulamaktadır.
Burada, sivrisinekteki sıvı salgı oranını ölçmek için Ramsay tahlil tekniğinin arkasındaki ayrıntılı yaklaşım, A. aegypti ve MTs'nin salgılanan sıvısı içindeki Na+ konsantrasyonlarını belirlemek için iyon seçici mikroelektodların kullanımı açıklanmıştır, bu da birleştirildiğinde transepithelial iyon taşıma oranlarının belirlenmesine izin verir. Ek olarak, Tarama İyon seçici Elektrot Tekniği ve hindgut kasılma tahlilleri, sırasıyla iyon akısını ve hareketliliği ölçmek için tanımlanmıştır, bu da arkagının hormonal regülasyonunu hafifletmeye yardımcı olur (Şekil 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Silikon kaplı yemekler yapmak
NOT: Bu adım denemelerden önce yapılmalıdır. Bu yemekler, diseksiyonlar için ve kasılma tahlil deneyleri için tahlil yemeği hazırlamak için yapılacaktır.
- Silikonu, üreticinin önerilerine uyarak silikon bir elastomer kiti kullanarak hazırlayın. İki parçalı sıvı bileşenleri 10 ila 1 oranında karıştırın. Ters çevirerek hafifçe ve iyice karıştırın, ancak kabarcık oluşumunu en aza indirdiğinden emin olun.
- Silikon elastomer'i standart 60 mm tek kullanımlık polistiren kültür yemeklerine normalde 7-9 mm arasında bir derinliğe dökün. Gerektiği kadar yemek hazırlayın. Silikonu bulaşıklara döktükten kısa bir süre sonra mikroskop altında ince bir pim kullanarak hava kabarcıklarını çıkarın. Bulaşıkları en az 48 saat oda sıcaklığında (RT) tozsuz bir hazneye veya kabine veya kürlemesi (sertleşmesi) için yaklaşık 4 saat boyunca 50 °C'de fırına yerleştirin (Şekil 5A).
2. Ramsay tahlil yemeğinin yapılması
NOT: Yemek deneyden deneye yeniden kullanılabilir, bu nedenle bu adımı yalnızca çanak hasar görmüşse veya kırılırsa tekrarlayın. Diseksiyonlar için ayrı bir tabak kullanılır.
- Neşter kullanarak (standart keskin önlemlerle), silikon kaplı Petri kaplarından birinde, kabın üstünden yaklaşık 5 mm silikonu yeterince çıkararak test kabını hazırlamak için kuyular oluşturun (bu ~ 20 μL banyo damlacığı takmalıdır). Bundan önce, kuyuların nerede yapılacağına dikkat etmek için çanağın altındaki pozisyonları işaretlemek için kalıcı bir işaret kullanın. Kuyular, borunun distal ucunun sığmasına izin vermek için yaklaşık ~ 4 mm çapında ~ 1 cm aralıklı olmalıdır. Her kuyu bir sıvı salgılayan tübül içerecektir, böylece 20 kuyu içeren bir yemek deney başına 20 MT'ye kadar analiz edilmesine izin verecektir.
- Minutien pimlerini hazırlamak için, 0,1 mm paslanmaz çelik pimleri bandın eksenine dik bir şekilde bir etiket bandı parçasına bir satır halinde yerleştirin. Makas kullanarak, bandın uzunluğu boyunca kesin ve pimlerin eşit yarısını oluşturun. Her kuyu için yarım pim kullanın.
- Künt bir çift toka kullanarak, her yarım iğneyi her kuyunun yanında silikon kaplı test kabına yerleştirin. Böcek tübüllerinin uzunluğuna bağlı olarak, yarım iğneyi tübülün distal ucunun banyo salinine dalmasına ve proksimal ucun pimin etrafına dolamasına izin verecek bir mesafeye yerleştirin. Bu adım, kuyuları kolayca görselleştirmek için mikroskop altında yapılabilir. Pimler yeniden kullanılabilir, ancak hasar görmüş veya kaybolmuşsa yarım pim yerine. (Şekil 5B)
3. Poli-L-lizin kaplı SIET kabının yapımı
NOT: Bu adım, siet ölçümleri sırasında organın çanağın dibine yapışması ve ölçüm alanının her numune için aynı kalmasını sağlaması açısından önemlidir. Bu yemeklerin hazırlanması deneylerden en az 2 gün önce yapılmalıdır. Her yemek belirli bir tedavi uygulanırken sadece bir kez kullanılmalıdır. Her numuneyi takiben veya poli-L-lizin kaplaması çizilmiş veya hasar görmüşse atın.
- Her numune için, seviyeli bir yüzeye 35 mm Petri kabı yerleştirin. Kapakları ve pipeti 70 μL poli-L-lizin (0,1 mg/mL) her yemeğin ortasına çıkarın. Kapakları tekrar yerleştirin ve poli-L-lizini bozulmadan kuru (~48 h) bırakın.
- Kuruduktan sonra, eksizyonlu organın diseksiyonlardan sonra nereye yerleştirilmesi gerektiğini daha iyi görselleştirmek için bulaşık tabanını kurutulmuş poli-L-lizin katını özetleyen bir daire ile işaretleyin. Deneylerde tuzlu su ve tedavi çözeltilerinin hacimlerini en aza indirmek için gerekirse, poli-L-lizin kaplamasını çevrelemek için sıcak bir tutkal tabancası kullanın, elektrodun hareket etmesi ve arka plan ölçümleri yapması için yeterli alan bırakın (yapıştırılan dairenin ~ 20-25 mm çapı yeterlidir). Bu kaplamalı yemekler rt'de süresiz olarak saklanabilir (Şekil 5C).
4. Ramsay ve kasılma tahlil yemeklerini deneyler için hazırlamak
NOT: Yemek yeniden kullanılabilir (daha önce kullanılan salin / tedavileri çıkarmak için uygun yıkama sağlanır), bu nedenle bu adımı ancak plaka hasarlıysa veya kırılırsa tekrarlayın. Diseksiyonlar için ayrı bir tabak kullanılır. Bu adım deney günü gerçekleştirilir.
- Kasılma tahlil kabı için neşter kullanın (standart keskin önlemlerle), tahlil kabını hazırlamak için silikon kaplı Petri kaplarından birinde kuyular oluşturun. Neşteri, incelenmiş dokuyu kenarlara sabitlemeyi kolaylaştırmak için kuyuların üçgen şeklinde olacak şekilde açılandır. Kuyular 250 μL'ye kadar dayanacak kadar büyük olmalı ve tüm ağıt kanalına sığmalıdır (çok derin kazmak yerine, kuyuyu yaklaşık 0,5-1 cm'ye kadar genişletin) (Şekil 5D).
- Ramsay plakası için bir pipet kullanın ve 20 μL'ye kadar çözelti kuyularını doldurun (18 μL 1X Aedes salin:Schneider'ın 5.2 adımda hazırlanan ortamı ve 2 μL hormon / ilaç). Uyarılmamış kontroller için kuyuları 20 μL 1X Aedes saline:Schneider's medium ile doldurun. Tüm kuyular doldurulduktan sonra, kuyular ve Minutien pimleri suya gömülene kadar nemlendirilmiş mineral yağı test kabına dökün. Salgılanan damlacıkları engelleyebilecek hava kabarcıklarını patlatmak veya çıkarmak için 20 μL pipet ucu kullanın.
5. Çözümlerin hazırlanması
- Petzel ve meslektaşlarından uyarlanan Tablo 1'de açıklandığı gibi 2X Aedes aegypti salin ve 10x glikoz hazırlayın36. Stok çözeltileri 4 °C'de saklanmalıdır. 1X Aedes aegypti salin (Tablo 1) çalışma stokları yapın ve 4 °C'de saklayın. Deneme gününde, çalışma stoklarının kullanmadan önce RT'ye gelmesine izin verin. Mantar veya bakteri üremesine dair herhangi bir kanıt varsa taze hazırlayın.
- Banyo damlacığı hazırlamak için Aedes salinini (adım 5.1'den itibaren) Schneider'ın ortamıyla 1:1 oranında karıştırın. Ne kadar gerekli olduğuna bağlı olarak küçük aliquots içinde hazırlayın. Schneider'ın ortasını buzdolabında tutun, mantar veya bakteri üremesine dair herhangi bir kanıt varsa atın. (Bu adım deney günü yapılmalıdır).
- SIET kullanan Na+ akı ölçümleri için, daha önce açıklandığı gibi değiştirilmiş bir Ca2+içermeyen Aedes salin (Tablo 2) hazırlayın26.
6. Sivrisinek MTs ve hindgut diseksiyonları
- Yetişkin sivrisinek diseksiyonları için, pupayı küçük bir beherde toplayın ve beslenme için sakkaroz çözeltisi içeren bir kavanoza yerleştirin. Sivrisinek yaşını belirlemek için, yumurtadan çıkmış sivrisinekleri izole edin ve gelecekteki diseksiyonlar için sivrisineklerin yaşını ve cinsiyetini not eden farklı bir kavanoza yerleştirin.
- Sivrisinekleri bir CO2 pedine kesilecek şekilde kısaca yerleştirin ve tepkisiz olana kadar bekleyin. İnce tokparlamalar kullanarak, sivrisinekleri bacağından veya kanadından alın ve adım 1'de hazırlanan silikon elastomer kaplı bir diseksiyon kabına yerleştirin. Sivrisinekleri bir tarafa yerleştirin (yanal tarafı yukarı) ve bir Minutien iğnesi ile, sivrisinekleri yerinde sabitlemek için toraksa saplanın. İsteğe bağlı olarak, daha kolay diseksiyon için sivrisineklerden kanatları ve bacakları çıkarın.
- Pasteur pipet kullanarak, sivrisinekleri tamamen saline batırmak için bir damla RT Aedes salin ekleyin. Diseksiyonun tamamının salin altında olduğundan emin olun (Aedes salin yapmak için Tablo 1'e bakın).
- Diseksiyon kabını stereoskopik bir mikroskop altına yerleştirin. Son karın segmentini ince toparlamalarla sıkıştırın ve sivrisinekten yavaşça çekin. Bu adım aynı anda mikroskop altına bakarak kolaylaştırılmıştır. MTs ve hindgut ile tutturulmuş midgut açığa edilmelidir (Şekil 6).
- Ramsay tahlilleri için, her boruyu midgut-hindgut kavşağından dikkatlice çıkarın ve organlara zarar vermediklerinden emin olun. Tübülleri tek tek çıkarmak için keskin ince forseps kullanın - test için hasarlı tübüller kullanmayın. (Kurulum için 7. adıma bakın.)
- SIET için, arkadaki arkayı Ca2+-free Aedes salin'de inceleyin (adım 5.3). Poli-L-lizin kabının da sabit hacimli Ca2+içermeyen Aedes salin olduğundan emin olun. Manikürü rektumdan dikkatlice çıkarın ve arkagutu (ölçülenlere bağlı olarak diğer bağlı organları çıkarabilir) poli-L-lizin kabına yerleştirin. Rektal ped epitel boyunca iyon taşımayı ölçüyorsanız, en az bir rektal pedinin hemolimf-bakan tarafını mikroelekrodun erişebileceği şekilde konumlandırın (Şekil 7).
- En arka ucu kapmak için ön uçları kullanarak, arka kısmı kabın dibine getirin (ölçülecek herhangi bir yapıya zarar vermeden). Organ poli-L-lizin ceketine dokunduğu anda yapışır. Bu parçalanmış numune ölçümler için hazır. (SIET kurulumu ve ölçümleri için 14-16. adımlara bakın.)
- İleum kasılma tahlilleri için, diseksiyon sırasında arkagın midgut'a bağlı kaldığından emin olun (Şekil 4D). Arka kısmın engelsiz bir görünümüne sahip olmak için MT'leri dikkatlice çıkarın. Bu organ, 4.1. (Test videoları edinmek için 17. adıma bakın.)
7. Ramsay tahlilinin kurulması
- Kanatçıkların ucunu kullanarak, borunun proksimal (açık) ucunu, propsların üzerine örterek dikkatlice kaldırın (tübülleri sıkıştırmayın) ve tahlil kabının bir kuyusuna aktarın. Bu adım ince cam problar kullanılarak da yapılabilir.
- Tübül kuyuya batırıldıktan sonra, borunun proksimal ucunun toparlamalarla alın, banyo damlacığı çıkarın ve ucunun pimin etrafına sarın. Tübülleri pimin etrafına iki kez sarın ve banyo damlacığında kalan tübül uzunluğunu diğer tübüllerle tutarlı tutun. Bu noktada, tübülün distal ucu banyo damlacığı içinde olmalıdır, proksimal uç ise pimin etrafındaki banyo damlacığı uzağına sarılarak salgılanan sıvının pimin ucunda açık proksimal uçtan birikmesini sağlar.
- Tübül pimin etrafına sarıldıktan hemen sonra, kuyuları (örneğin, A, B, C), zamanı (sıvının tübülden salgılanmaya başlayacağı başlangıç zamanı olacaktır) ve diğer tanımlayıcı bilgileri (örneğin, hormon, genotip vb.) not edin.
- Her sivrisinek beş tübüle sahiptir, böylece tübüllerin geri kalanıyla 7.1-7.3 adımlarını tekrarlayın. Kontrol ve deneysel tedaviler için, beş tübül farklı tedaviler içinde bölün. Tahlil çanağının tamamı dolana kadar bir sonraki diseksiyonla devam edin. Pratikte, bu teknik tübülleri parçalamak, banyo salinine aktarmak ve pimin etrafına sarmak için tipik olarak 2-3 dakika sürmelidir, böylece her tübül arasındaki başlangıç saatinde 2-3 dakikalık bir fark yaratılmalıdır.
NOT: Deneye başlamadan önce, mikroskobun oküler mikrometresini seçilen hedefin altında bir sahne mikrometresi ile kalibre edin. Salgılanan damlacıklar rutin olarak 40x-50x toplam büyütme altında ölçülür. - Ayrılan kuluçka süresinden sonra salgılanan damlacık ölçülebilir. Mikroskobun oküler mikrometresini kullanarak, salgılanan damlacık çapını ölçün ve kaydedin. Kalibrasyon dönüşümü ile ölçülen oküler birim çapını çarparak salgılanan damlacık çapını (d) hesaplayın (Tablo 3). V = πd3/6 denklemini kullanarak salgılanan damlacık hacmini hesaplayın.
- Salgılanma hızını (nL min-1) hesaplamak için denklemi kullanın, sıvı salgılama hızı = V/salgı süresi, burada V, 7,5 adımda hesaplanan salgılanan damlacık hacmidir ve salgı süresi tübül kuluçka süresini ifade eder.
8. ISME kurulumu
- ISME istasyonunu kurmak için stereomikroskopun her iki tarafına mikromanipülatörler yerleştirin. Gümüş tellerin klorlaşması, ferrik klorür çözeltisine daldırılarak ve her bir gümüş teli mikroelektorit tutucuların her birine geçirerek (veya gerekirse telleri koaksiyel kablolara lehimleme) elde edilebilir. Gümüş teller klorsuz hale geldiğinde bu adımı tekrarlayın.
- Gümüş kabloları bir veri toplama sistemine okuyacak bir amplifikatöre bağlayın. Sistemi üreticinin talimatlarına göre kurun ve kalibre edin. Artan elektrik paraziti durumunda, uygun şekilde topraklanmış bir Faraday kafesi kullanın.
9. Mikroelekrodların ISME ve SIET için hazırlanması
- P-97 Flaming Brown pipet çekeceği kullanarak, ucu 1-5 μm olan ~5–6 unfilamented borosilikat cam kılcal damarları (dış çapı 1,5 mm, iç çapı 1,12 mm, uzunluk 100 mm) çekin. Bunlar iyon seçici mikroelekrodlar olarak kullanılacaktır. SIET mikroelekrodlar için, elde edilen elektrot kısa bir sap ile karakterize ~ 5 μm uç açıklığına sahip olmalıdır.
- Bir kaputta, mikroelekrodları bir ocak üzerine yerleştirin (elektrotların uçlarını kırmamak için dikkatlice aşağı doğru ayarlayın). 15 cm'lik cam Petri kabının içine diklorodimetilsilane ekleyin ve ocaktaki elektrotları ters çevirin. Elektrodun tüm yüzeylerine hidrofobik bir kat ekleyerek iyon seçici elektrotları silanize etmek için diklorodimetilsilane kullanın, böylece hidrofobik iyonofore37'yi muhafaza etmesini sağlar. Kullanılmayan silanize elektrotlar birkaç hafta bırakılabilir; bu nedenle, bu adım birkaç haftada bir veya yeni çekilen elektrotlar için gerçekleştirilir.
NOT: Yanıcı, aşındırıcı ve toksik olan diklorodimetilsilane kullanırken dikkatli olun, güvenli kullanım için MSDS'ye bakın.- Ocak 350 °C'ye çevirin ve 75 dakika boyunca yerinde bırakın. Cam Petri kabına eklemek için 1:2 mikroelekrod sayısının diklorodimetilsilane hacmine (μL) oranını kullanın. Böylece, 10 mikroelekrod için 20 μL diklorodimetilsilane ekleyin.
- 75 dakika sonra sıcak tabağı kapatın. Elektrotlar ve sıcak plaka soğuduktan sonra, cam Petri kabını çıkarın ve elektrotları (peripps ile) kalıplama killi bir saklama kutusuna aktarın. Herhangi bir hasarı önlemek için elektrodun ucunun yukarı doğru işaret ettiğinden emin olun.
- ISME için referans elektrotları yapmak için ~ 4-5 filamentli borosilikat cam kılcal boruları çekin (dış çap 1 mm, iç çap 0,58 mm, uzunluk 100 mm). Bu elektrotların silanize edilmesine gerek yok. Ucun zarar görmesini önleyerek benzer bir kutuda etiketleyin ve saklayın.
- SIET referans elektrotları standart cam kılcal damarlardan (dış çapı 2 mm, iç çapı 1,12 mm, uzunluk 102 mm) yapılır. Kılcal damarlar erimiş 1 M KCl + % 3 agar ile doldurulur ve kullanıma kadar 1 M KCl (tamamen batırılmış) içeren 50 mL santrifüj tüpünde saklanmalıdır. Kabarcıklar oluşmaya başlayana veya agar kırılana kadar tekrar tekrar kullanılabilirler. Herhangi bir hava alanı varsa, camı atın ve devrenin tamamlandığından emin olmak için yeni bir tane kullanın.
10. Dolgu şırınnalarının hazırlanması
NOT: Bu adım, ISME için elektrotları doldurmak için ince uçlu şırınnalar oluşturmak için yapılır.
- Tek kullanımlık iğne ile 1 mL kayma uçlu şırınga kullanın. İğneyi atın ve şırıngayı 1 mL işaretine kadar geri çekin. Dumanın altında, Bunsen brülörunu açın ve şırıngın plastik ucunu erimeye başlayana kadar ısıtın. Eski bir çift toparlama kullanarak, erimiş şırınd ucunu dikkatlice sıkıştırın ve ucu germek için aşağı çekin.
- Makas kullanarak erimiş ucu istediğiniz uzunluğa kesin ve çapı elektrotların içine sığacak kadar küçük bırakın (Şemaya bakın). Şırınna soğuduktan sonra, tıkanma olmadığından emin olmak için şırınnanın basıncını suyla test edin. Gerekli olan her dolum çözümü için bir tane oluşturun ve buna göre etiketlenin (Şekil 8).
11. ISME ve SIET için İyon Seçici ve Referans Mikroelekrodunun Doldurulması
NOT: Mikroelekrod, çalışmaya devam ettiği sürece yeniden kullanılabilir (her deneyden önce kalibre edin). İsME için bu adım Ramsay tahlilinde MT'ler kuluçkaya yatarken yapılabilir.
- Na+seçici bir mikroelekrod yapmak için, 100 mM NaCl ile elektrodu doldurmak için 10. Dolgu çözeltisinin elektrot ucuna kadar dolduğundan emin olun. Hava kabarcıkları ortaya çıkarsa, mikroelekrodu hafifçe hareket ettirin veya çözeltiyi çıkarın ve yeniden doldurun. Bu, daha iyi görselleştirmek için stereoskopik bir mikroskop altında yapılmalıdır.
- Stereoskopik mikroskop altında, 10 μL pipet ucunu Na+seçici iyonofor çözeltisine batırın. Elektrodu pipete dik olarak dizerek, basınç oluşturmak ve küçük bir iyonophore damlası atmak için ucun altına eldivenli bir parmak yerleştirin. Bir mikroskopun yüksek hedefi altında görüntüleme, iyonofor damlasına mikroelektofit ucuna dikkatlice dokunun, ucu kırmaktan kaçının. Normalde, mikroelekrodlar, iyonofor / dolgu çözeltisi kenarlığı düz olana kadar 150-300 μm arasında bir iyonofor kokteyl kolonu uzunluğu ile doldurulur.
DİkKAT: Bu iyonofor toksiktir, güvenli kullanım için MSDS'ye bakın. - Küçük bir beherde, 100 mM NaCl ile yarıya kadar doldurun ve kabın üst kısmına biraz modelleme kili yerleştirin. Na+ iyonoforu alındıktan sonra, elektrot ucunu kabın duvarına yerleştirin, ucun 100 mM NaCl içinde oturmasına izin verin ve isme'yi kullanıma hazır olana kadar beherde tutun.
- ISME referans elektrotunu yapmak için, çözeltinin ula doldurulmasını sağlamak için 500 mM KCl ile bir elektrot doldurun (yukarıdakiyle aynı protokolü izleyin). KCL'leri bir beherde saklayın.
12. ISME için elektrotların kalibre edilmesi
NOT: Bu adım salgılanan sıvının ölçümleri alınmadan hemen önce gerçekleştirilir (~10-15 dakika önce). Eğimin tutarlı olduğundan emin olmak için her ~5-6 ölçümünde kalibrasyon yapılmalıdır.
- Elektrot uçlarını, parafin yağına batırıldığında iyonoforenin yer değiştirmesini önlemek için tetrahidrofuranda çözünmüş ~%3,5 (w/v) polivinil klorür çözeltisi kullanarak kaplayın.
DİkKAT: Bu yanıcıdır, güvenli kullanım için MSDS'ye bakın. - Na+ elektrotunu kalibre etmek için, aşağıdaki NaCl standart konsantrasyonlarının 10 μL damlacıklarını Ramsay çanağının kenarına inkübe edilmiş MTs ile yerleştirin: 200 mM NaCl ve 20 mM + 180 mM LiCl. Standart damlacıkları ~ 2 cm aralıklarla, üstüne daha yüksek konsantrasyonda yerleştirin.
- Klorlu gümüş tellerin üzerine hem referans elektrot hem de iyon seçici elektrot yerleştirin ve mikromanipülatörlere bağlı elektrot tutucuları kullanarak güvenli bir şekilde sabitleyin. Mikromanipülatörleri kullanarak her iki elektrodu da 200 mM NaCl damlacığı doğru yönlendirerek elektrot uçlarının çanağın dibine değmemesini sağlayın. Kayda başlamak ve okumanın sabitlenmesine izin vermek için elektrometreyi açın.
- Okumayı kaydedin ve bir sonraki standarda (20 mM NaCl + 180 mM LiCl) devam edin. Eğimi hesaplayın ve elektrot okuması kararlıysa ve eğim aralıktaysa, salgılanan damlacık ölçümleri için elektrot kullanmaya devam edin. Okuma kararsızsa, uygun bir kayıt veya eğim vermiyorsa veya dengeyi sağlamak biraz zaman alıyorsa, yeni bir iyon seçici elektrot hazırlayın veya uç boyunca bir doku çalıştırarak referans elektrodun ucunu kırın. Na+ için eğim ~ 58-60 mV38 olmalıdır, ancak kabul edilebilir bir aralık 50-60 mV'dir.
13. İSME kayıtları ve hesaplamaları
- Sıvı salgı oranının ölçümlerini takiben (bkz. adım 7.7), mikromanipülatörleri kullanarak hem referans hem de iyon seçici elektrotları salgılanan damlacığa dikkatlice taşıyın. Kaydı açın ve okumanın sabitlenmesine ve değer kaydetmesine izin verin. Diğer damlacıklar için bu adımı tekrarlayın (her ~5-6 ölçümde kalibrasyon ölçümlerini tekrarlayın).
- Katyon konsantrasyonları, daha önce açıklanan denklem kullanılarak hesaplanır22,38, [iyon] = [C] x 10ΔV/m, burada [C] ISME'yi kalibre etmek için kullanılan kalibrasyon çözeltisinin mmol L-1'deki konsantrasyonudur, ΔV salgılanan sıvı damlacığı ile aynı kalibrasyon çözeltisinin voltajı arasındaki voltaj değişimidir, ve m, aynı zamanda eğim olan iki standart kalibrasyon arasındaki voltaj farkıdır.
14. SIET kurulumu
NOT: SIET sistemi daha önce 27.39 olarak açıklanmıştır. Arka plan gürültüsünü azaltmak için, ışık mikroskobu ve baş sahnenin etrafına bir Faraday kafesi monte edilir. Bu makalede sunulan deneyler, Otomatik Tarama Elektrot Tekniği (ASET) yazılımı 2.0'da aşağıdaki ayarları kullanır: iyon degradelerinin mikroelektorit hareketlerini takiben tamamen yeniden kurulmasına izin vermek için 4 saniyelik bir bekleme süresi, bekleme süresini takip eden 0,5 sn için voltaj kaydedilmesi, 100 μm'lik bir gezi mesafesi ve her kayıt için üç tekrar. Bazı ayarlar gerektiğinde ASET'te kullanıcı tarafından değiştirilebilir.
- IPA-2 İyon/Polarografik Amplifikatör'ü, ışık mikroskobu (ekli bir video kamerayla) ve çalışan bu ASET ve cellSen'lerin her birine bağlı bilgisayarları açın.
- 9.1–9.3, 9.5, 10 ve 11.1–11.3 adımlarında açıklanan mikroelekrotları ve referans elektrotları hazırlayın. İyon seçici mikroelekrod, 100 mM NaCl dolgulu Na+ iyonofor içerecek ve referans elektrot (agar köprüleri ile) her zaman 3 M KCl ile doldurulacaktır.
- Na+seçici mikroelekrod'u gümüş klorür (AgCl) telden oluşan tutucuya yerleştirin ve dişi konektör jakına takın. Şırıng kullanarak referans elektrot tutucusunu taze 3 M KCl ile doldurun (deneme gününden önce yapılabilir ve RT'de saklanabilir).
NOT: Deneylerden sonra referans elektrot tutucuyu ddH2O ile yıkayın. - 3 M KCl'ye batırılmış tüm referans elektrotları içeren bir referans elektrodu beherden çıkarın, bir parmağınızı bir uca yerleştirin ve agarın düşmesini önlemek için cam kılcal damarı bu parmağa doğru yatırın. Bir ucunu tutucuya dikkatlice yerleştirin, kabarcık oluşmamasını sağlayın. Bir kabarcık varsa, referans elektrotunu çıkarın, tutucuyu daha fazla 3 M KCl ile yeniden doldurun ve tekrarlayın. Elektrot tutucuyu dişi konektör jakına yerleştirin.
15. SIET için elektrotların kalibre edilmesi
- Na+ ölçümleri için 150 mM NaCl ve 15 mM NaCl + 135 mM LiCl çözümleri kullanın24. İki çözelti arasında Na+ konsantrasyonlarında, salindeki Na+ (20 mM) seviyelerini kapsayan 10 kat fark olmalıdır (Tablo 2).
- Kalibrasyon çözümlerini RT'de 50 mL santrifüj tüpünde ve aliquot'ta deneyi yaparken petri kabında saklayın. Bu aliquot günün sonunda atılır. Stok çözeltilerinde herhangi bir kirlenme kanıtı varsa, atın ve taze çözümler yapın.
- Kalibre etmek için, iki kalibrasyon çözeltisini (adım 15.1) tek tek 35 mm Petri kaplarına yerleştirin ve bunları mikroskop aşamasına yerleştirin. Bilgisayar hareket kontrol ünitesinde seçilen "devre dışı bırak" ile step motorlarını kontrol eden manuel ayar düğmelerini kullanarak, mikroelekrod ucunun kalibrasyon çözeltisinin içine yerleştirildiğından emin olun. Ucu çok fazla batırmayın, çünkü kırılabilir. Uç kırılırsa, yeni bir iyon seçici mikroelektod hazırlayın ve yeniden kalibre edin.
- Amplifikatöre bağlı bilgisayarda ASET yazılımını açın. Kalibrasyon ayarlarını açın. Kalibrasyon tipi için Nernst Slope'ı seçin, numuneyi 3 saniye ayarlayın ve kalibrasyon çözeltilerinin konsantrasyonlarını girin. Örneğin, Na+ ölçümleri için çözelti 1'e 150 mM girin, Na+seçici mikroelekrod ucunu ve referans elektrotunu bu kalibrasyon çözeltisinin içine yerleştirin. Amplifikatördeki voltaj okuması kararlı olmalıdır. Çözüm 1'e tıklayın, voltajın (mV olarak) kaydedilmesini bekleyin. Daha sonra, mikroelekrod ve referans elektrotunu 15 mM NaCl + 135 mM LiCl çözeltisinin içine yerleştirin, çözelti 2'ye 15 mM girin ve voltaj okumasını elde etmek için Çözelti 2'ye tıklayın. Eğim, bu ayarlarda hesaplanan bu iki voltaj arasındaki fark olacaktır. Kalibrasyondan sonra Tamam'a tıklayın.
- İyon konsantrasyonunda on kat değişiklik için Na+seçici mikroelekrodlar için eğimler 59.0 ± 1.624 civarında olmalıdır. Nernst eğimi bu aralıktan büyük ölçüde saparsa, yeni bir mikroelekrod veya aliquot yeni standartlar hazırlayın (kontamine olabilecekleri için). Her 2-3 numuneden önce voltaj stabilitesi bağlı olarak kalibrasyon gereklidir. Voltaj kararsız hale gelirse ve dalgalanmaya başlarsa, yeni bir iyon seçici mikroelektonde hazırlayın.
16. SIET ölçümleri
NOT: Bilgisayar Hareket Kontrol ünitesindeki motor anahtarı, ASET aracılığıyla bilgisayar tuşlarını kullanarak elektrodu manipüle etmek dışında veya ölçüm kayıtları sırasında (bu noktada anahtar Etkinleştir'e geçirilmelidir) her zaman Devre Dışı Bırak'a geçirilmelidir.
- Kalibrasyondan sonra organı parçalara ayrıştırın (bkz. adım 6.6). Poli-L-lizin çanağı, parçalanmış numune ile mikroskop aşamasına yerleştirin ve referans elektrodun ucunu salinin içine yerleştirin. İyon seçici mikroelekrod ucunu, ucu kırmamaya dikkat ederek saline batırın.
- Işık mikroskobu altında bakarken mikroelekrod konumunu ayarlamak için manuel ayar düğmelerini kullanın. Mikroelekrod'un dikey konumunu, ucu organ veya doku ile aynı düzlemde olacak şekilde ayarlayın. İstediğiniz konuma girdikten sonra motor anahtarını Etkinleştir'e çevirin. Bu noktada, step motorlar yalnızca bilgisayar yazılımı kullanılarak çalıştırılabilir.
- Bilgisayar ok tuşlarını kullanarak, arka plan kayıtlarını ölçmek için mikroelekrod'u yatay olarak dokudan 3 mm uzaklıkta bir konuma getirin. F2 tuşuna basarak notlar ekleyin. Hazır olduğunuzda, kaydetmeye başlayın ( F5 tuşuna basarak). Arka plan aktivitesinin beş ölçümünü elde edin. Her numune için ortalama arka plan gerilim aktivitesi, aynı örnek için doku boyunca ölçülen voltaj gradyanlarından çıkarılır.
- Mikroelekrod ucunu dokuya yakın bir şekilde hareket ettirerek organı delmemeye dikkat edin. Mikroelektrod ucunu doğrudan dokuya dik olarak sağa, dik olarak yerleştirmek için keyhit hassasiyetini azaltın. En büyük iyon aktivitesinin yerini belirlemek için rektal ped boyunca her yerde üç kayıt elde edin. En büyük etkinliği ("hotspot" sitesi) görüntüleyen sitede temel tuzlu su ölçümleri alın.
- Motoru Devre Dışı Bırakmak için değiştirin ve istenen son dozu elde etmek için uygun tedaviyi çanağa ekleyin. Uygulamadan sonra, yeni bir not oluşturun (yani, tedavi adı ve doz), motoru Etkinleştir'e geri geçirin ve F5 kullanarak voltaj kayıtlarını alın. Amaç zaman içinde değişiklikleri gözlemlemekse, belirli zaman aralıklarında ölçümler yapmaya devam edin. Araştırmacının amacına bağlı olarak SIET kullanılarak belirli uygulamalar için birden fazla protokol oluşturulabilir.
- ASET yazılımının doku boyunca sahadaki voltajı kaydetmesini izleyin ve bunu dokudan 100 μm uzaklıktaki bir gezi mesafesinde (Şekil 7) voltajdan çıkarın. dokuda ilk kayıt alındığından, pozitif voltaj farkı, voltajın epitelde (doku) (Şekil 7A) epitelden (Şekil 7B) daha yüksek olduğunu ve böylece katyonun emildiğini gösterir. Negatif voltaj gradyani, katyon salgısının göstergesidir.
- Tedaviyi takiben (3 mm uzaklıkta) tekrar arka plan kayıtları alın ve tedaviyi takiben iyon akısını hesaplarken bunları kullanın. "Taban çizgisi" içinde bir dizi arka plan kaydı ve tedaviden sonra bir set yapın. Mikroelekrod bilgisayar tuşlarıyla ayarlanmadığında veya voltaj kaydedilmediğinde motoru Devre Dışı Bırak'a geçirin. Verileri bir metin dosyasına verin ve tüm hesaplamaları yapmak için Excel'i kullanarak açın.
- Daha önce açıklanan denklemleri kullanarak iyon akısı hesaplayın24,26. Her tedavi için net iyon akısı, temel iyon akı ölçümlerinden mutlak bir değişiklik olarak ifade edilebilir. Sonuçların önemini doğrulamak için bir araç kontrolü (yani, tedavi yerine yemeğe tek başına tuzlu su eklemek) kullanılabilir. Hormonal tedaviyi takiben iyon taşınımındaki değişiklikler, bu kontrole yanıt olarak yapılan değişikliklere göre değerlendirilmelidir.
17. Hindgut kasılma tahlilleri
- 4.1 adımında açıklanan çanaktaki kuyulardan birini bilinen bir Aedes salin hacmiyle doldurun (adım 5.1). Diseksiyondan sonra (adım 6.7), midguta bağlı parçalanmış arkalığı dikkatlice diğer tabaktaki kuyuya aktarın ve incelenen organı (ileum) çimdiklememeye dikkat edin. Bağırsakları kuyunun içindeki saline batırın ve Minutien pimlerini midgut ve rektum içine yerleştirin. Bunu yaparak, ileum gerginlik altında olmamalıdır ve ön ileumdaki pilorik kapaktan kaynaklanan spontan kasılmalar gözlenmelidir.
- Bir video kamerayı stereoskopik mikroskopa bağlayın ve video yakalama yazılımı (örneğin, Luminera'nın SONSUZLUK YAKALAMAsı) kullanarak video kaydedin. Parçalanmış organı içeren kabı mikroskop altına yerleştirin ve 2 dakika boyunca kaydedin. Bu "Temel" koşulu olacaktır.
- Kuyudaki hacmin artması üzerine ileal hareketlilikteki değişiklikleri hesaba katmak için kuyuya bilinen bir 1X Aedes salin hacmi (adım 5.1) ekleyin. Uygulamayı takip eden 1 dakika bekleyin, sonra 2 dakika boyunca tekrar kaydedin. Bu "tuzlu su" durumudur.
- Bilinen bir tedavi hacmi ekleyin (kuyuda istenen dozu elde etmek için 10x stok konsantrasyonundan). Uygulamayı takip eden 1 dakika bekleyin, sonra 2 dakika boyunca tekrar kaydedin. Bu "tedavi" durumu olacaktır.
- Tüm videoları kaydedin ve MP4'e dönüştürün. Analiz etmek için, 2 dakikalık aralıklarla kasılma sayısını sayın (pilorik kapakçıkta başlatılan ve ileum boyunca uzanan peristaltik bir dalga olarak tanımlanır). Daralma oranını elde etmek için bu sayıyı 2 dakikaya bölün. Daralma veya gevşeme süresi gibi diğer parametreler de değerlendirilebilir. Ham veri toplamayı takiben, her örnek için "temel" koşullar için verilere göre her parametreyi ifade edin. "Salin" ve "tedavi" için kat değişimini "taban çizgisine" göre çizin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DH31'in uyarılmamış MTs'ye karşı uygulanması, akışkan salgılama oranında önemli bir artışa neden olur ve Aedes sivrisineklerinde idrar söktürücü hormon olarak rolünü doğrular (Şekil 1A). Tübüller AedaeCAPA-1 ile tedavi edildiğinde, DH31 uyarılmış MTs'de salgılama oranında bir azalma gözlenir. Şekil 1B, salgılanan damlacıklardaki Na+ konsantrasyonlarını ölçmek için iyon seçici elektrotların kullanımını göstermektedir. DH31'in MTs üzerinde tedavisinin salgılanan damlacıktaki Na+ konsantrasyonu üzerinde hiçbir etkisi olmadı; bununla birlikte, AedaeCAPA-1 uygulaması ile salgılanan sıvıdaki Na+ konsantrasyonu önemli ölçüde artmıştır. Ek olarak, uyarılmamış kontrollerle karşılaştırıldığında, DH31 önemli ölçüde daha yüksek bir Na+ taşıma oranına yol ken, AedaeCAPA-1 DH31 uyarılmış tübüllerdeki bu artışı kaldırmıştır (Şekil 1C). Birlikte, bu örnek sonuçlar diüretik ve anti-diüretik hormonların uygulanmasını takiben sıvı salgılama oranlarının ve salgılanan damlacıklardaki iyon konsantrasyonunun nasıl ölçülebileceğini göstermektedir. Deney için üç ila altı günlük dişiler diseksiyon edildi ve 23-35 MT arasında analiz edildi. P < tek yönlü ANOVA ve eşleşmeyen t-testleri kullanılarak 0.05'e < farklar istatistiksel olarak anlamlı olarak belirtildi.
SIET, yetişkin dişi sivrisineklerin rektal ped epitelleri boyunca Na+ taşımacılığındaki değişiklikleri değerlendirmek için kullanıldı. İncelenen uyarılmamış rekreasyonların çoğunda hemolimf yönlendirilmiş Na+ taşıma (emilim) sergilendi ve bu nedenle sadece bu preparatlar incelendi. Temel aktivitedeki değişkenlik nedeniyle, salin veya peptit uygulamasından sonra, salindeki ilk taşıma aktivitesine göre iyon akısı farkı hesaplandı. Bu değerler iyon akısında (tedaviyi takip eden iyon akısı – taban çizgisi koşullarında iyon akısı) negatif bir değişiklik verir, ancak tüm organlar tedavileri takiben emilimli kalmıştır. Na+ emiliminde yapılan değişiklikleri incelemek için bir lökokinin analogu (Drosokinin) kullanıldı ve bu da na+ emiliminde salin kontrolüne kıyasla dört kat azalmaya neden oldu (Şekil 2).
Bir nöropeptid olan pyrokinin-2'nin (PK2) ileal hareketlilik üzerindeki rolünü değerlendirmek için, daha önce sivrisinek ileum28'de zenginleştirilmiş A. aegypti PK2 reseptörini aktive ettiği gösterilen bir Rhodnius prolixus analogu kullanıldı. Temel seviyelere göre PK2 ileal kasılmaları önemli ölçüde inhibe eder (Şekil 3).
Şekil 1: Diüretik ve anti-diüretik nöropeptidlerin in vitro sıvı salgılama oranına etkisi, yetişkin kadın A. aegypti MTs tarafından Na+ konsantrasyonu ve taşıma oranı. Aedae DromeDH31 (25 nM) ile uyarılan MT'lere CAPA-1 (0.1 fM) uygulandı. (A) MTs nöropeptitler ile 60 dakika ve uyarılmamış kontroller için 120 dakika kuluçkaya alındı. (B) Salgılanan damlacıktaki Na+ konsantrasyonları ISME kullanılarak ölçüldü ve taşıma hızını (C) hesaplamak için değerler kullanıldı. Denetimlerden önemli ölçüde farklı olan sütunlar, tek yönlü ANOVA ve Bonferroni test sonrası tarafından belirlendiği gibi aynı harfle gösterilir (n = 23–35). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SIET kullanılarak ölçülen kadın rektal ped epitelinde Na+ taşımacılığındaki değişiklikler. Na+ emilimi, uyarılmamış temel salin koşullarında kaydedildi ve ardından ek salin (araç kontrolü) veya 1 μM Drosokinin (n = 10-12) ile tedavi edildi. Her tedavi için hemolimf yönlendirilmiş Na+ akısındaki değişiklikler ölçüldü. Drosokinin'e yanıt olarak Na+ emiliminde dört kat azalma oldu, eşleşmeyen iki kuyruklu bir t-testi ile belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Salin (araç kontrolü) ve RhoprPK2 uygulamasından sonra dişi sivrisineklerin ileal hareketliliğinde değişiklik. Her iki tedaviyi de takiben kasılma sıklığındaki değişiklik, her örnek için temel koşullara göre kaydedildi (n = 32). Eşkenar dörtgen PK2, eşleştirilmiş iki kuyruklu bir t-testi ile belirlenen ileal hareketliliği azalttı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ramsay tahlilinin şeması, iyon seçici mikroelekrodların (ISME), tarama iyon seçici elektrot tekniğinin (SIET) kullanımı ve arka cam kasılma tahlilleri. Endokrin faktörlerin sivrisinek boşaltım sistemi üzerindeki fonksiyonel rollerini belirlemek için kullanılan dört yöntemin illüstrasyonları, Aedes aegypti. (A) Ramsay tahlili, izole Malpighian tübüllerinde sıvı salgı oranlarını ölçmek için kullanılır. Tübüllerin proksimal (açık) ucu, mineral yağ ile çevrili bir pimin etrafına sarılırken, distal (kapalı) uç tedavi salininde yıkanır. Belirli bir zaman diliminden sonra, proksimal uç birincil idrarı salgılar ve pim üzerinde damlacık olarak birikir. (B) İyon konsantrasyonunu ölçmek için bir veri toplama sistemine bağlı olarak salgılanan damlacık içine bir referans elektrot ve ISME yerleştirilir. (C) SIET, bir poli-L-lizin çanağının dibine yapıştıktan sonra organdan ~2 μm uzağa dik olarak yerleştirilmiş iyon seçici bir mikroelektrod kullanarak iyon taşımacılığını ölçar. Bu şemadaki kırmızı okların yönü, Na+ 'nın organ yüzeyinden uzak bölgeye göre epitel boyunca daha büyük bir voltaj kaydı ile gösterilen saline emildiğini gösterir. (D) Hindgut kasılma tahlilleri, kasılma sıklığı, uzunluğu ve gevşeme süresindeki değişiklikleri değerlendirmek için video kayıtları kullanılarak gerçekleştirilir. Bu şemada, organlar bir kuyunun içine yerleştirilir ve ileumun serbestçe yüzmesine ve büzülebilmesi için doğrudan orta kısma ve rektuma metal bir pim yerleştirilir. Hem niteliksel hem de nicel olarak hareketlilikteki değişiklikleri değerlendirmek için kuyuya tedaviler eklenir. BioRender kullanılarak oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: (A) Sivrisinekleri parçalamak için kullanılan yemekler, (B) Ramsay tahlil, (C) SIET ve (D) kasılma tahlil ölçümleri. A, B ve D tamamen silikonla kaplanmışken, C merkezde poli-L-lizin ile kaplanmıştır. Ramsay tahlil (B) için kullanılan kabı hazırlamak için küçük bir silikon kaplı Petri kabı kullanılır ve küçük ~4-5 mm kuyular 1 cm arayla oyulur (yaklaşık ~ 20 kuyu oyulabilir / tabak). Sıvı salgı oranını ölçmek için izole tübüllere tutunmak için her kuyunun yanına Minutien metal pimleri yerleştirilir. Poli-L-lizin çanağı (C), SIET ölçümleri sırasında organın tabana yapışmasını sağlar. Kasılma tahlil çanağındaki (D) kuyular tuzlu su ve aşağıdaki tedavilerle doldurulur. Kuyunun içine yerleştirilen kasma organı bir video kamera kullanılarak gözlemlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Sivrisinek boşaltım sistemi, Aedes aegypti. Bir kan unu sonra, solutes, su ve besinler, midgut, pilorik kapak, MTs ve hindgut içeren (ancak bunlarla sınırlı olmayan) besin kanalı boyunca geçirilir. Midgut, gıda sindirimi ve besin emilimi için ana sitedir. Beş MT, çevredeki hemolimften su, solut ve atık taşır ve bu birincil idrarı, ikincisi dört (erkek) veya altı (kadın) rektal ped içeren bir ön ileum ve arka rektumdan oluşan arka tarafa salgılar. Arka plan, atık atılmadan önce son yeniden emilme alanı görevi görür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: SIET ölçümleri sırasında parçalanmış bir sivrisinek arka korumasının hareketsiz görüntüleri. Altı rektal pedden birinin epitel boyunca iyon aktivitesini ölçmek için, Na+seçici mikroelekrod dokudan (A) 2 μm uzağa yerleştirilir. Mikroelekrod ucu bu noktadan (B) 100 μm uzaklıkta bir gezi mesafesinde (Δx) hareket ettirilmeden önce bu sahada voltaj kaydedilir. Bu iki nokta arasındaki gerilim gradyanı, konsantrasyon gradyanını ve iyon akısını hesaplamak için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: ISME ve SIET için dolgu şırınnaları. NaCl ve KCl çözeltilerini mikroelekrodlara doldurmak için kullanılan şırıngaların bir resmi. Bu, tek kullanımlık iğneli dört adet 1 mL kayma ucu şırıngasını, bir elektrota yerleştirilmesini sağlamak için değiştirilmiş gerilmiş bir uçla gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| 2X Aedes aegypti salin | ||
| 500 mL için: | ||
| Bir beherde, 400 mL ddH2O ekleyin, ardından aşağıdaki solutları ekleyin: | ||
| Parça | Ağırlık (g) | Son konsantrasyon (mM) |
| NaCl | 8.766 | 150 |
| HEPES | 5.957 | 25 |
| Kartal | 0.253 | 3.4 |
| NaOH | 0.3 | 7.5 |
| NaHCO3 | 0.151 | 1.8 |
| MgSO4 | 0.12 | 1 |
| CaCl2-2H20 | 0.249 | 1.7 |
| Karıştırın ve pH'ı 7,1'e ayarlayın | ||
| 2x Aedes salin yapmak için 500 mL'lik son hacme ddH2O ekleyin | ||
| 10X glikoz | ||
| 500 mL için: | ||
| Bir beherde, 450 mL ddH2O ekleyin, sonra ekleyin: | ||
| Parça | Ağırlık (g) | Son konsantrasyon (mM) |
| Glikoz | 4.5 | 5 |
| Karıştırın ve 500 mL'lik son hacme ddH2O ekleyin | ||
| 1X Aedes aegypti salin yapmak için: | ||
| 100 mL için: | ||
| Bir beherde, 40 mL ddH2O ekleyin, sonra ekleyin: | ||
| Parça | Birim (mL) | |
| 2x Aedes tuzlu su | 10 | |
| Karıştır, pH'ı 7,1'e ayarla | ||
| Filtre sterilize | ||
Tablo 1: Aedes aegypti salin yapımı. Aedes salin yapmak için, ayrı ayrı 2X Aedes salin ve 10x glikoz hazırlayın, 4 ° C buzdolabında saklayın. Dokuları, Ramsay tahlillerini ve kasılma testlerini parçalamak için kullanılan çalışma stoklarını (1x Aedes salin) hazırlamak için bu iki çözümü kullanın.
| Kalsiyumsuz Aedes aegypti Saline + NMDG | ||
| 500 mL için: | ||
| Bir beherde, 400 mL ddH2O ekleyin, ardından aşağıdaki solutları ekleyin: | ||
| Parça | Ağırlık (g) | Son konsantrasyon (mM) |
| NaCl | 1.17 | 20 |
| NMDG | 25.38 | 130 |
| HEPES | 5.957 | 25 |
| Kartal | 0.253 | 3.4 |
| NaHCO3 | 0.151 | 1.8 |
| MgSO4 | 0.12 | 1 |
| Glikoz | 0.9 | 5 |
| Karıştırın ve pH'ı 7,1'e ayarlayın | ||
| DDH2O'yu 500 mL'lik son hacme ekleyin | ||
Tablo 2: SIET ölçümleri için kullanılan modifiye Aedes aegypti salin. Bu Ca2+-free salin, SIET ölçümleri sırasında spontan arka kapak kasılmalarını önlemek için kullanılır. Bu salin, arka plan gürültüsünü azaltmak için N-metil-D-glukamin (NMDG) ile equimolar ikame ile oluşan azaltılmış Na+ (20 mM) oluşan Na+ taşımacılığını ölçmek için özeldir.
| DH31 uyarılmış MTs | Damlacık çapı (üniteler) | Damlacık çapı (um) | Damlacık hacmi (um3) | Salgı Oranı (nl/dak) |
| n | Tedavi #1 (60 dk) | Tedavi #1 (60 dk) | Tedavi #1 (60 dk) | Tedavi #1 (60 dk) |
| 1 | 16 | 313.73 | 16167692.56 | 0.27 |
| 2 | 14 | 274.51 | 10831090.91 | 0.18 |
| 3 | 17 | 333.33 | 19392547.25 | 0.32 |
| 4 | 13 | 254.90 | 8671977.67 | 0.14 |
| 5 | 14 | 274.51 | 10831090.91 | 0.18 |
| 6 | 22 | 431.37 | 42029685.15 | 0.70 |
| 7 | 15 | 294.12 | 13321768.16 | 0.22 |
| 8 | 16 | 313.73 | 16167692.56 | 0.27 |
| 9 | 20 | 392.16 | 31577524.53 | 0.53 |
| Demek | 16.33333333 | 320.26 | 18776785.52 | 0.31 |
| STD HATASI | 0.06 |
Tablo 3: Örnek Ramsay tahlil verileri. Yetişkin dişi sivrisineklerden DH31 uyarılmış MTs'den toplanan örnek verileri gösteren tablo. Salgılanan damlacık çapını ölçerken, önce stereomikroskop oküler mikrometre ile ölçün ve değeri not edin. Daha sonra, damlacık çapını μm'de elde etmek için deneyden önce yapılan kalibrasyon dönüşümü ile oküler birim çapını çarpın. 7.7 adımında belirtilen denklemi ve ardından 7.8 adımında belirtilen denklemi kullanarak salgı oranını kullanarak denklemin hacmini hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir kan unu yutarken, hematophagus böcekleri hemolimflerinde aşırı solut ve su zorluğuyla karşı karşıya kalır2. Bununla başa çıkmak için, hormonal faktörler tarafından sıkı bir şekilde kontrol edilen ve böceklerin prandial diürezi hızla başlatmasına izin veren özel bir boşaltım sistemine sahiptirler. Ramsay tahlilleri ve iyon seçici mikroelekrodların kullanımı, izole edilmiş böcek MT'lerindeki iyon konsantrasyonları ve taşıma oranları ile birlikte sıvı salgılama oranlarının ölçülmesine izin verir. Bu yaklaşımlar içindeki kritik adımlar, böcek MT'lerinin uygun şekilde diseksiyonunu sağlamayı içerir. Aedes MTs uyarılmamış kontrollerde kolayca salgılanmıyor, bu nedenle salgıyı uyarmak için hormonlar ve ilaçlar uygulanabilir. Bununla birlikte, diüretik uygulama veya dikkatli diseksiyonlarda bile, bazı MT'ler hasar görürse salgılanamayabilir (görsel muayene ile hiç açık olmasa bile), bu nedenle tahlilin birden fazla turunun yapılması gerekebilir. Hem ISME hem de SIET ölçümleri sırasında iyon seçici elektrotların doğru kullanımı için, standartların eğiminin iyonofor için bildirilen normal aralıkta olduğundan emin olun, bu da en doğru okumaları verecektir. Bununla birlikte, okumalar kararsızsa, iyonoforenin alındığını ve sızıntıdığını doğrulamak için mikroskop altındaki elektrodu inceleyin. Hava kabarcıkları varsa, uç kırılmışsa veya iyonofor düzgün bir şekilde alınmamışsa yeni bir elektrot hazırlanmalıdır. İyonofor/dolgu kenarlığı dışbükey ise elektrotlar az silanize edilir ve daha fazla diklorodimetilsilane kullanılmalıdır. Sınır içbükey ise, elektrotlar aşırı silanize edilir ve daha az diklorodimetilsilane kullanılmalıdır. Ek olarak, bazı elektrotlar Na+seçici elektrot gibi diğerlerinden daha az kararlı olabilir, böylece eğim K+ veya H+ ile karşılaştırıldığında daha hızlı bozulur.
Bu yaklaşımlar, MT'ler tarafından sıvı salgısının arkasındaki mekanizmaların incelenmesi için sınırsız fırsat sağlar. Genomik düzenlemedeki son gelişmeler nedeniyle, boşaltım organlarında ifade edilen belirli genlerin düzenleyici ve/veya fonksiyonel rolünü araştırmak için CRISPR-Cas9 gen düzenleme ve RNA paraziti gibi ters genetik stratejiler kullanılabilir. Çalışmalar, Aedes40 ve Drosophila41 MTs'deki hormonal düzenlemeyi anlamak için bu tür araçlar kullanmıştır. Ayrıca, banyo damlası hormonların belirli rollerine bakacak şekilde değiştirilebilir14,15,18,21,42, ikinci haberci sistemleri ve salgı oranı ve iyon konsantrasyonları üzerindeki ilaçlar. Bu metodolojiler Rhodnius prolixus38, larva ve yetişkin sivrisinek türleri, Drosophila41 ve mayfly türleri (Hexagenia rigida)43 gibi diğer çeşitli böceklerde uygulanmıştır. Benzer şekilde, Cl-, K+, H+ ve NH4+ gibi farklı iyonlar incelenebilir.
SIET ölçümleri sırasında, temel koşullar sırasında her örnek arasında değişkenlik olabilir. Sivrisineklerin yaşını, cinsiyetini ve beslenme durumunu kontrol ederken, özellikle bağırsakların farklı bölgelerini (yani ileum-rektum kavşağından belirli mesafeler ön veya arka) incelerken farklılıklar hala ortaya çıkabilir. Bu farklılıklar, tedaviyi takip eden iyon akısı temel koşullara göre bir değişiklik olarak ifade edilerek hesaba katılabilir. Zamanla, iyon aktivitesi de dalgalanabilir ve bu nedenle burada sunulan sonuçlarda gösterildiği gibi, bir araç kontrolüne (salin) kıyasla değişiklikleri değerlendirmek önemlidir. Voltaj okumaları büyük ölçüde dalgalanmaya başlarsa, yeni bir iyon seçici mikroelektod hazırlayın ve yeniden kalibre edin. Üçüncü bir kalibrasyon çözeltisi (en düşük kalibrasyon çözeltisi konsantrasyonundan seyreltilmiş 10 kat) kullanmak, daha doğru bir Nernst eğimi kurulmasına daha fazla yardımcı olabilir. Na+ aktivitesi genellikle arka plan gürültüsüne karşı oldukça hassas olduğundan, daha az Na+ 'dan oluşan değiştirilmiş bir Aedes salin kullanılır (Tablo 2). Paraziti önlemek ve herhangi bir arka planı azaltmak için ölçümler sırasında Faraday kafesine mesafe tutmak da önemlidir. Ek olarak, organ hala kabın altındaki poli-L-lizine yapışdığında spontan kasılmalar üretiyorsa, saline bir kalsiyum şelatör eklemek bunu önlemeye daha fazla yardımcı olacaktır. Burada sunulan sonuçlarda gösterildiği gibi, rektal ped epitel boyunca iyon taşımacılığını inceliyorsanız, mikroelekrod ucunu rektal pad'in hemolimf-bakan tarafı boyunca küçük artışlarla hareket ettirerek en büyük iyon aktivitesi gösteren "hotspot" bölgesini tanımlamak önemlidir. İyon aktivitesinde herhangi bir büyük değişiklik tespit edilemezse, organ hasar görmüş veya mikroelekrod ucu rektal ped açıklığı ile aynı üç boyutlu düzlemde olmayabilir ve bu nedenle başka bir sivrisinek kesilmelidir.
SIET, farklı koşullarda yetiştirilen sivrisineklerdeki iyon aktivitesini incelemek gibi çeşitli deneyler için kullanılabilir25 veya farklı diyetlerle beslenir (örneğin, sakkarozla beslenen ve kanla beslenen vs. beslenmemiş), kan unu takiben kritik olan iyon taşıma mekanizmalarını tanımlamak için yararlı olabilir. Bu nedenle, ölçümlerin numuneler arasında aynı bölgeden elde edildiğinden emin olmak önemlidir. Örneğin, ölçümler ileum-rektum kavşağından veya bu bölgeden ön olarak (ileum boyunca) veya posterior olarak (rektal epitel boyunca) belirli mesafelerde alınabilir. Bu ölçümler, organın çanaktan farklı konumlandırılmasını gerektiren rektal ped epitel boyunca da elde edilebilir. Ayrıca, SIET'nin yalnızca arka plan boyunca iyon aktivitesini ölçmekle sınırlı olmadığını belirtmek önemlidir; midgut ve MTs de dahil olmak üzere diğer organlar da incelenebilir. Benzer şekilde, K+, H+, NH4+ ve Cl-akı SIET25,44,45 kullanılarak ölçülebilir ve ölçümler bir tedaviyi takip eden belirli zaman aralıklarında alınabilir44. Bu teknik hem larva hem de yetişkin sivrisineklerde26,44 ve Chironomus riparius46, Trichoplusia ni45,47 ve Hexagenia rigida43 dahil olmak üzere diğer çeşitli böceklerde kullanılmıştır. Bu deneyler, Ramsay tahlil ve ISME ile birlikte sıvı salgısı, iyon konsantrasyonu ve iyon taşımacılığı üzerindeki farklı tedavilerin ve çevresel faktörlerin rolünü daha iyi anlamak için kullanılabilir.
Son olarak, kasılma tahlilleri bağırsak hareketliliğini etkileyen nöroendokrin faktörleri tanımlamak için yararlıdır. Bu test kas yapısı tarafından oluşturulan hareketlere dayandığından, incelenen organın zarar görmemesi çok önemlidir. Bu nedenle, eşekarısı sadece organları tahlil çanağında aktarırken çevredeki yapıları kapmak için kullanılmalıdır. Bu bitişik organların kuyunun içinde bir pim ile kavrayışılması, incelenen izole organın hareket etmesini ve hareketini etkilemesini de önler. Spontan kasılmalar gözlenmezse doku hasar görmüş olabilir ve yeni bir diseksiyon gereklidir. Böcek bağırsağı kontrtil aktivitesini incelemek için yaygın olarak kullanılan diğer yöntemler arasında bir kuvvet dönüştürücü32 veya empedans monitörünün kullanımı yer almaktadır33. Bu yöntemler sivrisinek arkalığında daralma oranını ölçmek için de kullanılabilir; ancak, amaç bu değişiklikleri video kayıtları aracılığıyla görsel olarak incelemekse, bu protokolde açıklanan yöntemler faydalı olacaktır ve daha fazla analiz için kullanılabilir48.
Bu protokolde özetlenen dört teknik, çeşitli böceklerin boşaltım sisteminde bir dizi nöropeptitin rolünün ortaya çıkarılmasına yardımcı oldu. Bu yöntemlerin nicel PCR ve immünofizokimya gibi böcek fizyologları tarafından kullanılan ek tekniklerle birlikte kullanılması, vektör kontrolü için yeni potansiyel hedefler olarak hizmet edebilecek alttaki yolların ve sinyal sistemlerinin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiç kimse.
Acknowledgments
Bu araştırma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Discovery Grants tarafından AD ve J-PP'ye finanse edildi. AL ve FS, lisansüstü araştırmalarını desteklemek için NSERC CGS-M ödülleri aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955456 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning Falcon (Fisher Scientific) | C351008 | |
| Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm) |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | used for ISME reference electrodes |
| Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm) |
World Precision Instruments | 1B200F-4 | used for SIET reference electrodes |
| Borosillicate glass capillary unfilamented tubes (OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm) |
World Precision Instruments | TW150-4 | used for ISME and SIET electrodes |
| CO2 pad | Diamed | GEN59-114 | |
| Dimethyltrimethylsilylamine solution | Sigma-Aldrich | 41716 | |
| Faraday cage | Custom | Can be fabricated by local machine shop | |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-748A | |
| Hydrated mineral oil | Fisher Scientific | 8042-47-5 | Specific brand is not important |
| INFINITY1-2CB video camera | Luminera | INFINITY1-2CB | |
| Micromanipulators (left and right handed) | World Precision Instruments | MMJL and MMJR | Specific brand is not important so long as high quality manipulator |
| Mineral Oil, Light | Fisher Scientific | 0121-4 | |
| Minutien pins (0.1 mm stainless steel) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Non-hardening modeling clay | Sargent Art | Specific brand is not important | |
| Olympus light microscope (FOR SIET) | Olympus | customized system | |
| Plastic Pasteur (transfer) pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL) | Sigma-Aldrich | A-005-M | 84 kDa |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81395 | |
| Scalpel Blade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10053-09 | |
| Schneider's Drosophila medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| SIET system | Applicable Electronics | customized system | Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview |
| Silver wire | World Precision Instruments | AGW1010 | |
| Sodium ionophore II cocktail A | Fluka | 99357 | |
| Standard polystyrene Petri (culture) dishes | Fisherbrand | FB012921 | Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay |
| Stereomicroscope with ocular micrometer | Nikon | SMZ800 | |
| Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller | Sutter Instruments | FGPN7 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Chemical Company | NC9285739 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| VWR advanced hotplate stirrer - aluminum | VWR | 9578 | Specific brand is not important |
References
- Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic factors in insects: the role of CAPA peptides. General and Comparative Endocrinology. 176, 300-308 (2012).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. Journal of Experimental Biology. 206, 3845-3856 (2003).
- Bradley, T. J.
- Patrick, M. L., Aimanova, K., Sanders, H. R., Gill, S. S. P-type Na+/K+-ATPase and V-type H+-ATPase expression patterns in the osmoregulatory organs of larval and adult mosquito Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 209, 4638-4651 (2006).
- Coast, G. The endocrine control of salt balance in insects. General and Comparative Endocrinology. 152, 332-338 (2007).
- Maddrell, S. H. P., Overton, J. A. Methods for the study of fluid and solute transport and their control in insect Malpighian tubules. Methods in Enzymology. , 617-632 (1990).
- Beyenbach, K. W., Oviedo, A., Aneshansley, D. J. Malpighian tubules of Aedes aegypti: Five tubules, one function. Journal of Insect Physiology. 39, 639-648 (1993).
- Misyura, L., Yerushalmi, G. Y., Donini, A. A mosquito entomoglyceroporin, Aedes aegypti AQP5, participates in water transport across the Malpighian tubules of larvae. Journal of Experimental Biology. 220, 3536-3544 (2017).
- Drake, L. L., Rodriguez, S. D., Hansen, I. A. Functional characterization of aquaporins and aquaglyceroporins of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 5, 7795 (2015).
- Ramsay, J. A. Active transport of water by the Malpighian tubules of the stick insect, Dixippus morosus (Orthoptera, Phasmidae). Journal of Experimental Biology. 31, 104-113 (1954).
- Jing, X., White, T. A., Yang, X., Douglas, A. E. The molecular correlates of organ loss: the case of insect Malpighian tubules. Biology Letters. 11, 20150154 (2015).
- Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. T. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800 (2015).
- O'Connor, K. R., Beyenbach, K. W. Chloride channels in apical membrane patches of stellate cells of Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 204, 367-378 (2001).
- Ionescu, A., Donini, A. AedesCAPA-PVK-1 displays diuretic and dose dependent antidiuretic potential in the larval mosquito Aedes aegypti (Liverpool). Journal of Insect Physiology. 58, 1299-1306 (2012).
- Coast, G. M., Garside, C., Webster, S. G., Schegg, K. M., Schooley, D. A. Mosquito natriuretic peptide identified as a calcitonin-like diuretic hormone in Anopheles gambiae (Giles). Journal of Experimental Biology. 208, 3281-3291 (2005).
- Clark, T. M., Bradley, T. J. Additive effects of 5-HT and diuretic peptide on Aedes Malpighian tubule fluid secretion. Comparative Biochemistry and Physiology. 119, 599-605 (1998).
- Veenstra, J. A. Effects of 5-hydroxytryptamine on the Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 34, 299-304 (1988).
- Pollock, V. P., et al. Conservation of capa peptide-induced nitric oxide signalling in Diptera. Journal of Experimental Biology. 207, 4135-4145 (2004).
- Maddrell, S. H. P., Gardiner, B. O. C. The passive permeability of insect Malpighian tubules to organic solutes. Journal of Experimental Biology. 60, 641-652 (1974).
- O'Donnell, M. J. Too much of a good thing: How insects cope with excess ions or toxins in the diet. Journal of Experimental Biology. 212, 363-372 (2009).
- Sajadi, F., Curcuruto, C., Al Dhaheri, A., Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic action of a CAPA neuropeptide against a subset of diuretic hormones in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Donini, A., O'Donnell, M. J., Orchard, I. Differential actions of diuretic factors on the Malpighian tubules of Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 42-48 (2008).
- Donini, A., et al. Secretion of water and ions by Malpighian tubules of larval mosquitoes: Effects of diuretic factors, second messengers, and salinity. Physiological and Biochemical Zoology. 79, 645-655 (2006).
- Donini, A., O'Donnell, M. J. Analysis of Na+, Cl-, K+, H+ and NH4+ concentration gradients adjacent to the surface of anal papillae of the mosquito Aedes aegypti: Application of self-referencing ion-selective microelectrodes. Journal of Experimental Biology. 208, 603-610 (2005).
- Durant, A. C., Donini, A. Development of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito larvae in high ammonia sewage in septic tanks causes alterations in ammonia excretion, ammonia transporter expression, and osmoregulation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Paluzzi, J. P. V., Vanderveken, M., O'Donnell, M. J. The heterodimeric glycoprotein hormone, GPA2/GPB5, regulates ion transport across the hindgut of the adult mosquito, Aedes aegypti. PLoS One. 9, 86386 (2014).
- Nguyen, H., Donini, A. Larvae of the midge Chironomus riparius possess two distinct mechanisms for ionoregulation in response to ion-poor conditions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299, 762-773 (2010).
- Lajevardi, A., Paluzzi, J. -P. V. Receptor characterization and functional activity of pyrokinins on the hindgut in the adult mosquito, Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 11, 490 (2020).
- Cook, B. J., Holman, G. M. The role of proctolin and glutamate in the excitation-contraction coupling of insect visceral muscle. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology and Pharmacology. 80, 65-73 (1985).
- Robertson, L., Rodriguez, E. P., Lange, A. B. The neural and peptidergic control of gut contraction in Locusta migratoria: The effect of an FGLa/AST. Journal of Experimental Biology. 215, 3394-3402 (2012).
- Te Brugge, V. A., Schooley, D. A., Orchard, I. Amino acid sequence and biological activity of a calcitonin-like diuretic hormone (DH31) from Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 382-390 (2008).
- Lange, A. B., et al. The distribution and physiological effects of the myoinhibiting peptides in the kissing bug, Rhodnius prolixus. Frontiers in Neuroscience. 6, 98 (2012).
- Robertson, L., Chasiotis, H., Galperin, V., Donini, A. Allatostatin A-like immunoreactivity in the nervous system and gut of the larval midge Chironomus riparius: Modulation of hindgut motility, rectal K+ transport and implications for exposure to salinity. Journal of Experimental Biology. 217, 3815-3822 (2014).
- Kwon, H., Pietrantonio, P. V. Calcitonin receptor 1 (AedaeGPCRCAL1) hindgut expression and direct role in myotropic action in females of the mosquito Aedes aegypti (L.). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43, 588-593 (2013).
- Messer, A. C., Brown, M. R. Non-linear dynamics of neurochemical modulation of mosquito oviduct and hindgut contractions. Journal of Experimental Biology. 198, 2325-2336 (1995).
- Petzel, D. H., Berg, M. M., Beyenbach, K. W. Hormone-controlled cAMP-mediated fluid secretion in yellow-fever mosquito. The American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 253, 701-711 (1987).
- Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay assay to measure fluid secretion and ion flux rates in the Drosophila melanogaster Malpighian tubule. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53144 (2015).
- Paluzzi, J. -P. V., Naikkhwah, W., O'Donnell, M. J. Natriuresis and diuretic hormone synergism in R. prolixus upper Malpighian tubules is inhibited by the anti-diuretic hormone, RhoprCAPA-α2. Journal of Insect Physiology. 58, 534-542 (2012).
- Rheault, M. R., O'Donnell, M. J., Morris, C. E. Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods. Journal of Experimental Biology. 207, 2173-2184 (2004).
- Sajadi, F., et al. CAPA neuropeptides and their receptor form an anti-diuretic hormone signaling system in the human disease vector, Aedes aegypti. Scientific Reports. 10, 1755 (2020).
- Rodan, A. R., Baum, M., Huang, C. L. The Drosophila NKCC Ncc69 is required for normal renal tubule function. American Journal of Physiology. 303, 883-894 (2012).
- Yu, M. J., Beyenbach, K. W. Effects of leucokinin-VIII on Aedes Malpighian tubule segments lacking stellate cells. Journal of Experimental Biology. 207, 519-526 (2004).
- Nowghani, F., et al. Impact of salt-contaminated freshwater on osmoregulation and tracheal gill function in nymphs of the mayfly Hexagenia rigida. Aquatic Toxicology. 211, 92-104 (2019).
- D'Silva, N. M., O'Donnell, M. J. Mechanisms of transport of H+, Na+ and K+, across the distal gastric caecum of larval Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 121, 103997 (2020).
- Kolosov, D., O'Donnell, M. J. Malpighian tubules of caterpillars: blending RNAseq and physiology to reveal regional functional diversity and novel epithelial ion transport control mechanisms. Journal of Experimental Biology. 222, (2019).
- Jonusaite, S., Kelly, S. P., Donini, A. Tissue-specific ionomotive enzyme activity and K+ reabsorption reveal the rectum as an important ionoregulatory organ in larval Chironomus riparius exposed to varying salinity. Journal of Experimental Biology. 216, 3637-3648 (2013).
- O'Donnell, M. J., Ruiz-Sanchez, E. The rectal complex and Malpighian tubules of the cabbage looper (Trichoplusia ni): regional variations in Na+ and K+ transport and cation reabsorption by secondary cells. Journal of Experimental Biology. 218, 3206-3214 (2015).
- Simo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44, 819-826 (2014).
