Summary
这里介绍了一个制造球形成像设备的协议。该设备可对癌细胞球体进行动态或纵向荧光成像。该协议还提供了一个简单的图像处理程序,用于分析癌细胞入侵。
Abstract
癌细胞从原发性肿瘤侵入相邻的健康组织是转移的早期步骤。侵入性癌细胞构成重大临床挑战,因为一旦其传播开始,就不存在有效的消除方法。更好地了解调节癌细胞入侵的机制可能导致新疗法的发展。由于它们与肿瘤的生理相似性,嵌入胶原蛋白中的球形已被研究人员广泛利用,以研究癌细胞侵入细胞外基质(ECM)的机制。然而,这种检测受到(1)对球体嵌入ECM缺乏控制的限制:(2) 胶原蛋白 I 和玻璃底盘成本高,(3) 由于抗体和荧光染料的低效渗透以及 (4) 耗时的图像处理和数据量化,不可靠的免疫荧光标签。为了应对这些挑战,我们优化了三维 (3D) 球形协议,使用延时视频或纵向成像对嵌入胶原蛋白 I 中的荧光标记癌细胞进行成像,并分析癌细胞入侵情况。首先,我们描述了球形成像设备 (SID) 的制造,以可靠和最小的胶原蛋白 I 体积嵌入球体,从而降低了检测成本。接下来,我们为活体和固定球体的强荧光标记描述步骤。最后,我们提供了一个易于使用的斐济宏图像处理和数据量化。总之,这种简单的方法提供了一个可靠和负担得起的平台,以监测胶原蛋白I的癌细胞入侵。此外,此协议可以轻松修改,以满足用户的需求。
Introduction
在癌症进展过程中,癌细胞可以获得一种移动和侵入性表型,使它们能够逃离肿瘤质量并侵入周围的组织1。最终,这些侵入性癌细胞可以在继发性器官内到达并生长,这个过程称为癌症转移1。转移导致超过90%的癌症相关死亡2.原因之一是,虽然局部肿瘤在临床上是可控的,但一旦发生转移性扩散,就不存在消除侵入性癌细胞的有效方法。因此,侵入性癌细胞的出现和从局部性疾病向侵入性疾病的过渡是一项重大的临床挑战。确定癌细胞如何启动和维持侵入行为可能导致新的有效疗法的发展。
3D球形模型是研究受控癌细胞的移动行为的理想平台,但生理相关条件3。事实上,在这个测定中,癌细胞的球体嵌入细胞外基质(ECM),例如胶原蛋白I,它模仿了简化的肿瘤。然后,成像用于可视化癌细胞从球体侵入胶原蛋白基质。但是,多个挑战限制了此过程。
第一个挑战发生在嵌入步骤,液体胶原蛋白矩阵可以扩散到盘面,导致球体接触菜的底部。因此,球体中的细胞扩散到二维(2D)表面,打破了三维(3D)球形形态。增加胶原蛋白的体积是一种高效但成本高昂的解决方案。为了防止细胞在二维表面扩散,同时保持最小的胶原蛋白体积,我们开发了一个球形成像设备 (SID),将一个 1 毫米厚的 3 孔聚二甲基硅烷 (PDMS) 插入玻璃底盘。
球形测定的第二个挑战是球形中癌细胞的标签,由于抗体和荧光染料的渗透率低,这种效应会随着球形尺寸的增加而增加。虽然标记细胞的理想解决方案是建立稳定表达荧光蛋白的细胞系,但这一选择大多局限于不朽的细胞系,并受荧光蛋白幻想的可用性的限制。在这里,我们描述了一个优化的协议,用于固定球体的免疫荧光染色,以及在嵌入球体之前,有效地使用细胞质染料给细胞贴上标签。
球形测定的第三个挑战是缺乏简单的斐济宏,无法随着时间的推移对细胞入侵进行半自动量化。为了应对这一挑战,我们描述了一个简单的方法来分析球形区域随着时间的推移。我们以 4T1 和 67NR 细胞线为例说明了此协议的优点。
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Protocol
1. 制造球形成像设备 (SID), 以优化球形嵌入 (持续时间 1 天)
- 使用 3D 打印机创建间隔器(图 1A、B和补充文件 1)。
- 称出基聚合物的 10:1(wt/wt)比:塑料杯中的交叉链接器 [例如,20 克乙基苯基聚合物和 2 克硅树脂交叉连结剂,以创建聚二甲基硅氧烷 (PDMS)]。
- 使用一次性移液器在塑料杯中彻底混合 PDMS 解决方案。
- 将塑料杯放入真空室,从混合物中去除气泡。快速释放真空压力,清除困在混合物表面的少量空气,并消散剩余的气泡。
- 在 100 °C 下孵化 3D 打印垫片 5 分钟,以提高其灵活性。
- 用 100% 异丙醇擦拭两个玻璃板,用于彻底构建 PDMS 模具。如果玻璃板以前用于铸造 PDMS,请务必通过用剃刀刀片轻轻刮拭玻璃板并用 100% 异丙酚擦拭玻璃板来去除剩余的任何旧 PDMS。
- 将 3D 打印隔板冲洗在两个干净的玻璃板之间,构建模具。
- 使用玻璃板外缘的大粘合器夹密封模具。在底部边缘放置两个活页夹,在上角放置一个。
- 检查模具的顶部,以确保垫片与玻璃板齐平。这保证了不会出现变形,并且将创建均匀的 PDMS 表。
注意:如果产生的纸张厚度不均匀,则需要稍微调整夹子。 - 切开一次性移液器的尖端(从尖端约 2 厘米),然后以缓慢恒定的速度将 PDMS 混合物添加到模具的左上角。慢慢倒入混合物,防止产生大气囊。
- 将霉菌放入真空室,以去除倒气过程中形成的气泡。
- 通过在 100 °C 下孵育 1 小时霉菌来治愈 PDMS。
- 从孵化器中检索模具,使其冷却以触摸。
- 从装有固化 PDMS 的垫片中取出活页夹和玻璃板。
- 使用剃须刀刀片切开模具四面在隔板和玻璃板之间创建的密封件。切入所有四面后,开始拆开模具以显示隔板中的 PDMS 板。
- 使用钳子小心地将新的 PDMS 表从垫片上剥离。
- 在切割垫上,从纸张上打出直径为 17.5 mm 的 PDMS 磁盘,然后用不同尺寸的活检打孔打三个均匀分布的 5.5 毫米直径孔。在这里,这些 3 孔 PDMS 磁盘称为"插入"(图 1C)。
注:对 PDMS 进行非单形切割,或通过血浆处理绑定出现故障,可能导致未来的泄漏。 - 使用胶带轻轻去除任何灰尘颗粒,清洁每个插入物。
- 将插入物粘在一块双面胶带上,并将胶带包裹在 10 厘米的 Petri 菜的盖子上。
- 将培养皿的盖子与打开的 35 mm 玻璃底盘一起放入等离子机中。
- 通过血浆处理在 300 mTorr 下激活插入物和玻璃的表面 1 分钟。可以使用手持等离子棒。
- 使用钳子,快速将一个插入物(图 1D)的上部(即处理好的侧面)连接到玻璃底盘的玻璃部分(图 1E)。重复所有菜肴。
- 在旋转玻璃底盘时,使用指尖和拇指施加均匀的压力。这将确保插入玻璃底盘的稳定安全性。
- 在60°C下孵化SID(图1F)20分钟,以加强玻璃和PDMS之间的粘附。
- 使用与步骤 1.21 或手持魔杖相同的设置,在 SID 上执行第二轮血浆处理。这将使免费的 PDMS 表面粘附在涂层溶液中的聚 L-赖氨酸(见 1.26)。
- 新鲜准备以下解决方案。
- 涂装溶液:1 倍 PBS,含 0.01% (卷/卷) 聚 L-莱辛 [例如,将 10 μL 的 0.1% (卷/卷) 聚 L-莱辛添加到 90μL 的 1x PBS]。
- 交叉链接溶液:含有1倍(伏/伏)谷胱甘肽的蒸馏水[例如,将10+10x谷胱甘油醛加入90μL蒸馏水]。
- 存储解决方案:1x PBS,含10倍(卷/伏)青霉素-链霉素[例如,将100倍青霉素-链霉素的1mL添加到1x PBS的9mL]。
- 每个孔添加 35 μL 的涂层溶液,并在室温下孵育 1 小时。
- 吸气多L-Lysine,用蒸馏水冲洗整个小岛屿发展中国家3次。
- 每个孔每孔加入 35 μL 的交叉链接溶液,在室温下孵育 30 分钟。
- 吸气交叉链接溶液,用蒸馏水冲洗整个小岛屿发展中国家3次。
- 将 70% 的乙醇加入每个小岛屿发展中国家,并在紫外线 (UV) 光下放置 30 分钟。
- 在引擎盖下,吸气乙醇,用蒸馏水冲洗小岛屿发展中国家3次。
- 每个小岛屿发展中国家添加 2.5 mL 的存储解决方案。
注:在此阶段,SID 可在 4 °C 下存储一周。据观察,PDMS 和玻璃之间的绑定强度会随着时间的推移而降低。在一周后,建议用户在使用前测试 SID,以检测其潜在泄漏情况。为此,吸气存储解决方案,并在每个孔中添加 35 μL 的 1x PBS。使用后,PDMS 插件可以从玻璃底盘上剥离。为了实现玻璃底盘的最佳清洁,应使用同丙酚和盐酸进行几次洗涤,以去除 PDMS 残留物。
2. 球形形成并嵌入胶原蛋白(持续4天)
注:对于球体的实时成像,纵向或延时视频,使用表达细胞质和/或核荧光蛋白的细胞线。如果可用这样的单元格线,请按照本节中描述的步骤执行。或者,在第3节中,建议使用细胞质染料在球形中标记癌细胞。
- 使用悬挂滴技术形成4T1和/或67NR细胞的球形,如先前描述的4,5,6,7,具有3,000个细胞/40μL液滴和3天的潜伏时间。最后加入牛食,在冰上保持所有溶液, 在任何时候。
- 使用明亮的场显微镜识别正确形成的球形。
- 用 8 mL 预热完整介质填充 15 mL 圆锥管。
- 用 P1000 移液器收集球形,并转移到 15 mL 圆锥管中。通过管道将一些完整的介质进出,防止球体粘在移液器尖端的内壁上,并限制球形损失,从而弄湿移液器尖端。
- 允许球体沉入管子底部,并通过交换介质小心地清洗球体。重复两次。
- 根据制造商的建议,准备一个 5 毫克/mL 胶原蛋白 I 溶液(替代凝胶程序,请参阅下面的示范性计算)。用完整的介质代替蒸馏水。在计算要使用的介质体积时,请考虑在 20μL 的完整介质中添加球形 [例如,对于一个 SID, 需要 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = 108 μL 的 5 毫克/ mL 胶原蛋白 I (准备 20% 额外, 以考虑处理粘性液体时的管道损失); 22 μL 的完整介质 = 10.8 μL 的 10 倍 PBS = 1.2 μL 的 1 M NaOH = 54 μL 的 10 毫克/mL 胶原蛋白 I 库存]。
- 使用 P200 移液器在 20 μL 介质中收集所有球形,并将它们添加到步骤 2.6 中准备的胶原蛋白 I 溶液中。
- 慢慢地混合溶液,上下管道,以避免胶原蛋白I浓度的异质性,限制气泡的形成。将溶液放在冰上。
- 从小岛屿发展中国家取出存储解决方案,用 3 mL 的 1x PBS 清洗 3 次。最后洗涤后,让小岛屿发展中国家干燥,以免稀释胶原蛋白I溶液。
- 启动计时器,将含有一个球体的胶原蛋白 I 溶液的 30 μL 分配到小岛屿发展中国家的三个孔之一。视觉上确保 30 μL 中包含单个球形。
- 重复步骤 2.10 两次以上,以填补小岛屿发展中国家的所有 3 个孔。
- 如果球形位于 PDMS 边界附近,则使用 10 μL 移液器尖端重新定位球体。如果两个或三个球体最终被分配到其中一个孔中,则相同的移液器尖端可用于将球形彼此分离。停止时间器。
注:在胶原蛋白I聚合和凝固期间,SID经常倒置和倒置,确保球体位于 ECM 层的垂直中心,并防止 2D 细胞入侵。应最大限度地提高倒转(翻转)的频率。由于翻转频率由以 2.10-2.12 测量的球形"分配时间"控制,因此应尽量减少分配时间。在我们的实验室中,平均分配时间为 2 分钟。 - 要垂直中心在胶原蛋白层中的球体,翻转小岛屿发展中国家颠倒和孵育在37°C的分配时间。
- 翻转小岛屿发展中国家,并在37°C孵化,以分配时间。
注:球体在倒置方向上花费的时间长度应等于在倒置方向上花费的时间。 - 重复步骤 2.13 和 2.14 30 分钟,直到胶原蛋白 I 聚合。
- 添加 2.5 mL 的完整介质/SID,如果需要,请获取初始时间点的球体图像。
- 如果使用多个SID,则重复步骤2.10-2.16。
3. 球形的荧光标签
- 实时成像(持续 6-7 天)
注:如果有表达细胞质和/或核荧光蛋白的细胞系,请按照第 2 节中描述的步骤执行。或者,对于细胞质标记,建议使用以下协议。- 按照第 2 节中描述的协议步骤 2.1-2.5。
- 在200μL的无血清介质中将细胞质染料稀释至25μM。
注意:虽然此实验中使用了红色细胞质染料,但任何其他可用颜色都应适合。癌细胞被标记在球形内使用核染料稀释到20μM在200μL的无血清介质(见 材料表)。 - 最后洗涤后,在细胞质或核染料溶液中重新悬浮球体,并在室温下孵育20分钟,防止光线照射。
注:采用这种方法,球形中心细胞的标记将不有效。为了实现所有细胞的标签,通过将菜放在摇杆上,可以延长潜伏期。讨论中描述了替代方案。 - 在完全介质中清洗球形3次。
- 继续执行第 2 节中描述的协议步骤 2.6-2.17。
- 图像球体通过延时成像每10分钟24-72小时(图2),或通过纵向成像,每天,长达7天(图3)。使用激光扫描共分显微镜,10倍空气目标(0.4数孔径和3.1毫米工作距离),1024 x 1024像素,曝光时间8微克/像素,针孔90μm,6 x 15μm z步和3个视场,每个领域包含一个球体。
注:对于延时成像,使用最小的激光功率,为显微镜配备温度、湿度和气体控制的环境室。在37°C下将嵌入的球体培养为+8小时或成像前的过夜,以最大限度地减少显微镜上的时间。
- 球体的免疫荧光染色(持续2天)
注:此处描述的程序是从先前发布的协议8 、9中调整和优化的。此方法可在第 2 节和第 3.1 节概述的协议之后使用。- 新鲜准备以下解决方案。
- 修复解决方案:包含 4% PFA(卷/伏)的 1 倍 PBS [例如,将 5 mL 的 16% (vol/vol) PFA 添加到 15 mL 的 1x PBS]。
- 修复和渗透解决方案:1x PBS 包含 4% PFA(卷/卷)和 0.5% 特里顿 X-100(卷/卷)[例如,添加 50 μL 的特里顿 X-100 至 10 mL 的固定解决方案]。
- 阻止解决方案:1 倍 PBS 包含 1% FBS(卷/伏)和 1% BSA (wt/vol) [例如,在 1x PBS 的 10 mL 中溶解 100 毫克 BSA,然后添加 100 μL 的 FBS]。
- 洗涤液:1x PBS,含0.05%Tween 20(卷/伏)[例如,添加25微升的Tween 20至50 mL的1x PBS]。
- 从小岛屿发展中国家取出培养介质,用温暖的 1x PBS 清洗一次。
- 每个小岛屿发展中国家添加2 mL的固定和渗透溶液,并在室温下孵育5分钟。
- 取出固定和渗透溶液,每个 SID 添加 2 mL 的固定溶液,并在室温下孵育 20 分钟。
- 用洗涤液清洗3次。
- 每个 SID 添加 2 mL 的阻塞溶液,并在 4 °C 下孵育 24 小时,轻微摇晃。
注:在此步骤中,样品可在周末在 4 °C 下孵化。请注意,较长的阻塞时间可能会干扰免疫荧光标记程序。 - 在阻塞溶液中稀释主要抗体。
- 在 48 井板中加入 150μL 的阻塞溶液,加入原发抗体/井。
- 使用细钳子,小心地分离含有球形的胶原蛋白I的插头,并转移到井中。如果标记了多个球形,则重复重复。在使用不同的抗体时,擦拭任何可能留在钳子上的液体,以防止污染。
- 在4°C下孵化过夜,轻微摇晃。
- 将 300μL 的洗涤液添加到空井和满井中。
- 小心地将含有球形的胶原蛋白 I 的插头转移到"洗"井中。
- 用洗涤液洗3次2小时,室温下,轻微摇晃。
注:转移含有球形的胶原蛋白I的插头,而不是吸附溶液,可以帮助减少样品损失和样品损坏。 - 稀释阻塞溶液中的二次抗体,4',6-迪米迪诺-2-苯酚(DAPI)和/或苯丙酮。
- 添加 150 μL 的阻塞溶液,每口井配备二次抗体、DAPI 和/或法洛丁。
- 使用钳子,小心地将含有球体的胶原蛋白插头转移到井中。如果标记了多个球形,则重复重复。
- 在室温下孵化1小时,轻微摇晃。
- 重复步骤 3.2.11 和 3.2.12。
- 用洗涤液洗3次30分钟,室温下轻微摇晃。
- 使用剃须刀刀片,将 3 孔 PDMS 插入三个部分,以便每个部件都包含一个孔。
- 将两块 PDMS 放在显微镜幻灯片上。
- 使用 P200 尖端添加一滴安装解决方案,末端被切断。防止气泡形成。
- 小心地将胶原蛋白转移到每个孔中。
注:如果球形位于胶原蛋白塞的顶部,则倒置胶原蛋白插头,使球体最终更接近玻璃盖。 - 在顶部放置一个盖夹,并使用胶带密封。
- 让样品在室温下干燥10分钟,免受光线照射。
- 将样品存放在4°C,防止光线照射至成像。
- 新鲜准备以下解决方案。
4. 图像处理,分析癌症入侵随着时间的推移
注:此宏所需的格式为单通道 x、y、t 图像,保存为.tiff文件。
- 如果获得多个 z 片(即 x、y、z、t 图像),请在斐济打开图像并选择 图像|堆栈|Z 项目。 建议使用 最大强度 选项。或者,单个 z 切片可用于运行宏。将图像保存为.tiff文件。
- 在桌面上创建一个单独的"处理"文件夹。
- 选择 文件|保存为|图像序列。使用 TIFF 格式,根据帧数更新数字,选中框以切片标签作为文件名并选择 "确定"。选择第 2 步中创建的"处理"文件夹。
- 从"处理"文件夹中打开一个图像。它应该是一个x,y图像,对应于一个单一的时间点。
- 选择 图像|调整|自动阈值。 在下拉菜单中选择方法 "尝试所有 "并选中黑色背景上的白色对象的框。
- 显示每个自动阈值方法的结果的蒙太奇图像。
- 确定最佳的自动阈值方法,例如 雷尼恩特罗皮。
- 要确认自动阈值方法的选择,请从"处理"文件夹中打开任何其他图像,并使用 "图像|测试所选阈值方法调整|自动阈值。
- 关闭所有图像。
- 下载球体区域时间宏(补充文件2)。
- 通过拖放打开斐济宏。
- 在行 58 中,根据需要更新自动阈值方法。
- 在第 62 行中,根据单元格尺寸更新大小范围。
- 选择 运行。
- 选择"处理"文件夹并键入"处理"作为"父文件夹",然后选择 "确定"。
- 运行结束后,保存表"摘要"。第一列表示图像的名称:第三列表示球形区域:第六、第七和第八列指定安装在球体上的椭圆的参数。
- "处理"文件夹现在包含每个时间点的已处理图像,扩展_SpheroidArea。
注意:如果球形中心变暗,请使用选择工具为所有时间点填充白色,然后继续步骤 3。同样,球体周围的空间可以充满黑色来"清洁"图像。如果图像是干净的,请注释行 61 以加快运行速度。
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Representative Results
由于其生物相容性,PDMS 被广泛用于限制井、邮票和模具的微压造,从而彻底改变了微模式和微流体设备。在此处描述的方法中,它用于创建 SID,可定制的井,可优化球形嵌入和成像过程。图 1说明了用于制造 SID 的主要组件。为了铸造 PDMS 模具,一个 1 毫米厚的隔板是 3D 打印(图 1A,B),放置在两个玻璃板之间,用大夹子密封。在板之间的空间中浇注和烘烤 PDMS,形成一张 1 毫米厚的 PDMS 纸。SID 示意图 (图 1C)表示最佳设备的尺寸,但由于使用活检冲孔(图 1D)手动打孔,孔距离略有变化。图 1D,F表示 PDMS 插入内间隔均匀的孔的干净圆形切口。
使用SID有助于高效嵌入,因此使用延时(图2,视频1)或纵向(图3)成像记录胶原蛋白I内癌细胞的入侵。尽管在胶原蛋白 I 聚合过程中对所有 SID 都使用了相同的反转频率,但胶原蛋白插头内的球形位置会略有不同。因此,使用工作距离长(+1 毫米)的目标非常重要。否则,对于位于胶原蛋白插头顶部附近的球形,对焦和成像可能很困难。相比之下,定位在胶原蛋白塞底部附近的球形细胞将具有移动到玻璃表面并在玻璃上迁移的细胞,而不是侵入胶原蛋白I矩阵。需要丢弃此类球形的视频。胶原蛋白插头的厚度(这里大约 800 μm)由小岛屿发展中国家每个孔中分配的体积控制,并根据此协议中显示的球体的入侵距离进行调整。使用较小或较少侵入性球形时,可通过在小岛屿发展中国家的每个孔中分配更小的胶原蛋白 I 来降低胶原蛋白插头的厚度。
要使用斐济宏正确分析入侵,在成像过程中正确标记癌细胞至关重要。如步骤 4.17 中所述,如果标记不理想,则图像处理步骤允许进行图像校正。虽然我们说明纵向成像在6天(图3),这需要细胞质和/或核荧光蛋白的稳定表达,类似的纵向成像可以在更短的时间内使用染料标签进行。
现场成像后,我们介绍了上皮卡德林(E-卡德林)、皮质素和F-actin(图4)的免疫带状手术的一些结果。在这些示例中,我们使用了 4T1 和 67NR 细胞线。 图 5 显示了使用斐济宏测量球体区域的图像处理过程的分步图解。
图1:SID的制造。(A) 垫片的顶视图示意图。(B) 3D 打印间隔器。(C) 小岛屿发展中国家的顶级视图示意图。3 孔 PDMS 插入(D)被绑定到玻璃底盘(E),创建最终的 SID(F)。尺寸为毫米。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2:球形的实时成像。代表 20 小时和 40 小时时间点从视频 1, 4T1 球形的最大投影。4T1细胞使用细胞质染料标记。比例尺吧,100μm。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3:球体的纵向成像。具有代表性的显微图(最大投影)的混合4T1/67NR球形图像每天。4T1和67NR细胞分别稳定地表达细胞质mScarlet和绿色荧光蛋白(GFP)。比例尺吧,100μm。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图4:球形免疫荧光成像。4T1球形在嵌入胶原蛋白I.E-cadherin(青色、A)、皮质素(黄色、B)和F-actin(品红色、A和B)2天后固定的代表性显微图(最大投影)被标记。比例尺吧,100μm。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图5:图像处理分析。使用斐济宏(A) 分步说明图像处理过程,以测量球体的区域(B)。请点击这里查看此数字的较大版本。
视频1:使用细胞质染料标记每10分钟4T1球形图像,46小时和10分钟4T1细胞的代表视频。 缩放栏,100μm。 请点击这里下载此视频。
补充文件1:间隔器(STL文件)的3D模型。请点击这里下载此文件。
补充文件2:球形区域时间宏。请点击这里下载此文件。
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Discussion
3D 打印间隔器设计用于创建 1 毫米厚的 PDMS 纸张,然后可以按照实验应用的要求轻松创建各种形状的 PDMS。由于其制造的简单性和改变设计的自由度,这种 PDMS 铸造方法被选为小岛屿发展中国家的初始设计。如果需要大量 SID,则可以通过创建 3D 打印模具来提高生产效率,该模具已经包含带三个相同间隔孔的 PDMS 磁盘,并将工艺简化为一步。这将消除冲出每个磁盘以及随后的三个孔的需要,并减少整体准备时间。
虽然3孔冲床是开发用于35毫米玻璃底盘,其他尺寸是可用的,允许更多的孔,因此,更多的球形成像并行。此外,定制尺寸的盖玻璃也可在商业上使用,与 3D 打印支架相结合,可进行高通量球形检测。采用这种方法,限制因素就是数据采集的速度,例如,在我们的多色延时共处成像中,获取单个球体的 3D 堆栈大约需要 2.5 分钟。因此,获取小岛屿发展中国家 3 个球体的 3D 堆栈大约需要 8 分钟。因此,为了将我们首选的成像频率保持在每堆栈 10 分钟,我们无法增加 SID 中的孔数。
为了记录和量化3D球形模型中活癌细胞的入侵,亮场成像可以使用5。然而,荧光显微镜是首选,因为它提供了增加的对比度,并在图像处理的方便和精度。如果无法生成表达细胞质和/或核荧光蛋白的细胞系,我们建议使用细胞质染料。由于细胞内细胞质染料的保留时间在我们的成像条件下是三天,因此细胞应在挂滴的3天周期后,并在嵌入前立即标记。嵌入后细胞的标签可能不特别标记胶原蛋白,并减少细胞标签。嵌入后超过 3 天的成像需要使用不同的球形播种协议10 或细胞系稳定地表达荧光蛋白。
我们成功地形成并成像了包含 60 到 5,000 个细胞/滴的球形。小球形是记录入侵多日的理想之选,因为其整个入侵区域很容易适应更高放大倍数(20x-30x)目标的单一视场。此外,它们可以很容易地用细胞质或核染料在整个标签。最后,由于散射减少,球形中的每个单元可以可视化和分割。然而,小球形几乎看不到肉眼,可能需要额外的标签与组织标记。相比之下,较大的球形更容易处理,但更易下沉到菜的底部,由于其重量。此外,球形中心的细胞在使用染料时并不总是被标记,或者使用通心显微镜可见,其渗透深度约为100微米。为了利用延时成像可视化整个大球体的所有癌细胞,可以使用多光子显微镜,为第二代谐波一代 (SHG) 的胶原纤维可视化提供额外优势,无需标记。此外,成像可以用光片显微镜8,11,12,提供更缩短的图像采集时间,从而允许高通量球形检测,但也需要更多的数据存储和先进的图像处理。如果不需要延时视频,我们的固定3D球体标签程序可以进一步与光学清除8,10相结合。此外,嵌入球体的低温选解可以消除染料或抗体在标记过程中的渗透问题,以及成像过程中光线的渗透问题。然而,在我们手中,由于在保存长而脆弱的入侵链方面面临技术挑战,成功的低温治疗仅限于入侵和非侵入性细胞的早期阶段。
我们的协议还与使用核染料兼容,在球形内标记癌细胞,使单细胞能够跟踪延时数据。斐济插件 TrackMate13 可用于自动跟踪细胞并提取单个细胞的动能参数,如速度、瞬时速度和持久性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢圣殿生物工程的成员进行了宝贵的讨论。我们感谢大卫安布罗斯在流细胞学核心(刘易斯卡茨医学院)的帮助细胞分拣和托尼博姆从IDES中心(工程学院,坦普尔大学)的3D打印的帮助。我们也感谢我们的资助资源:美国癌症协会研究学者格兰特134415-RSG-20-034-01-CSM,征服癌症现在/青年研究员奖,国家卫生研究院,R00 CA172360和R01 CA230777,所有BG。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
48-well plate | Falcon | T1048 | |
Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
Conical tubes | Falcon | 352095 | |
Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
Disposable container | Staples | Plastic cups | |
Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
Double-faced tape | Scotch | ||
Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
MilliQ water | |||
Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
Petri dish | Corning | 353003 | |
Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
Pipets | Gilson | F167300 | |
Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
Primary antibodies, user specific | |||
Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
Secondary antibodies, user specific | |||
Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
Tape | Scotch | ||
Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
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