Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में इलेक्ट्रिक-फील्ड-प्रेरित तंत्रिका अग्रदूत सेल भेदभाव

Published: April 14, 2021 doi: 10.3791/61917
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang Ming Chao Tung University, 3Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 4College of Engineering, Chang Gung University

Summary

इस अध्ययन में, हम तंत्रिका स्टेम और जनक कोशिकाओं (एनपीसी) के भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो पूरी तरह से माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली में प्रत्यक्ष वर्तमान (डीसी) पल्स उत्तेजना से प्रेरित होता है।

Abstract

शारीरिक इलेक्ट्रिक फील्ड्स (ईएफ) सेल माइग्रेशन, भेदभाव, विभाजन और मृत्यु में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यह पेपर एक माइक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चर सिस्टम का वर्णन करता है जिसका उपयोग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके दीर्घकालिक सेल भेदभाव अध्ययन के लिए किया जाता था। माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में निम्नलिखित प्रमुख घटक होते हैं: एक ऑप्टिकली पारदर्शी इलेक्ट्रोटैक्टिक चिप, एक पारदर्शी इंडियम-टिन-ऑक्साइड (आईटीओ) हीटर, एक संस्कृति मीडिया-फिलिंग पंप, एक विद्युत शक्ति आपूर्ति, एक उच्च आवृत्ति शक्ति एम्पलीफायर, एक ईएफ मल्टीप्लेक्सर, एक प्रोग्रामेबल एक्स-वाई-जेड मोटराइज्ड चरण, और एक इनवर्टेड चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप एक डिजिटल कैमरे से लैस। माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम समग्र प्रायोगिक सेटअप को सरल बनाने में फायदेमंद है और बदले में, रिएजेंट और नमूना खपत। इस काम में प्रत्यक्ष वर्तमान (डीसी) पल्स उत्तेजना से प्रेरित तंत्रिका स्टेम और जनक कोशिकाओं (एनपीसी) का भेदभाव शामिल है। स्टेम सेल रखरखाव माध्यम में, माउस एनपीसी (mNPCs) डीसी पल्स उत्तेजना के बाद न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स, और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स में विभेदित। परिणाम सुझाव है कि सरल डीसी पल्स उपचार mNPCs के भाग्य को नियंत्रित कर सकता है और तंत्रिका तंत्र विकारों के लिए चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सिस्टम का उपयोग कई चैनलों में सेल संस्कृति के लिए, दीर्घकालिक ईएफ उत्तेजना के लिए, सेल रूपात्मक अवलोकन के लिए, और स्वचालित समय-चूक छवि अधिग्रहण के लिए किया जा सकता है। यह माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम न केवल आवश्यक प्रयोगात्मक समय को छोटा करता है, बल्कि माइक्रोएनवायरमेंट पर नियंत्रण की सटीकता को भी बढ़ाता है।

Introduction

तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (एनपीसी, जिसे तंत्रिका स्टेम और जनक कोशिकाओं के रूप में भी जाना जाता है) न्यूरोडीजेनेरेटिव चिकित्सीय रणनीति1के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार के रूप में हो सकता है। अविभेदित एनपीसी में स्व-नवीकरण क्षमता, बहु-शक्ति और प्रसार क्षमता2,3है। पिछले एक अध्ययन में बताया गया है कि एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स और मॉलिक्यूलर मध्यस्थ एनपीसी के भेदभाव को विनियमित करते हैं । एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) और बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (आरएफजीएफ) एनपीसी प्रसार को बढ़ावा देते हैं, इस प्रकार अविभेदित राज्य 4 को बनाएरखते हैं।

पिछले अध्ययनों में यह बताया गया है कि विद्युत उत्तेजना कोशिका शारीरिक गतिविधियों जैसे विभाजन 5 , माइग्रेशन 6 ,7,8,भेदभाव1,9,10और कोशिका मृत्यु11को विनियमित कर सकती है । इलेक्ट्रिक फील्ड्स (ईएफ) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र विकास 12 ,13, 14के विकास और उत्थान में महत्वपूर्ण भूमिकानिभातेहैं । 2009 से 2019 तक, इस प्रयोगशाला ने माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम 1,6,7,8,15, 16,17में ईएफ के अनुप्रयोग के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जांच की है। एक मल्टीचैनल, ऑप्टिकली पारदर्शी, इलेक्ट्रोटेक्टिक (एमओई) चिप को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए उपयुक्त होने के लिए डिज़ाइन किया गया था। चिप उच्च ऑप्टिकल पारदर्शिता और अच्छा स्थायित्व था और एक ही अध्ययन में तीन स्वतंत्र उत्तेजना प्रयोगों और कई इम्यूनो दाग स्थितियों के एक साथ आचरण की अनुमति दी । माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम समग्र प्रायोगिक सेटअप को सरल बनाने में फायदेमंद है और बदले में, रिएजेंट और नमूना खपत। यह पेपर एक माइक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चर सिस्टम के विकास का वर्णन करता है जिसका उपयोग दीर्घकालिक सेल भेदभाव अध्ययन के लिए किया जाता था।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. डिजाइन और मो चिप के निर्माण

  1. उपयुक्त सॉफ्टवेयर(चित्रा 1A,सामग्री की तालिका)का उपयोग करके व्यक्तिगत पॉलीमिथाइल मेथाक्रिलेट (पीएमएमए) परतों और डबल-तरफा टेप के लिए पैटर्न खींचें। दोनों पीएमएमए चादरें और एक सीओ2 लेजर मशीन लेखक(चित्रा 1B)के साथ डबल तरफा टेप काटें ।
    1. सीओ2 लेजर मुंशी पर स्विच करें और इसे एक पर्सनल कंप्यूटर से कनेक्ट करें। सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डिजाइन पैटर्न फ़ाइल खोलें।
    2. लेजर मुंशी (चित्रा 2 ए) के मंच पर पीएमएमए शीट्स (275 मिमी x 400 मिमी) या डबल-तरफा टेप(210 मिमीx 297 मिमी) रखें। ऑटो-फोकस टूल का उपयोग करके पीएमएमए शीट्स या डबल-तरफा टेप की सतह पर लेजर पर ध्यान केंद्रित करें।
    3. प्रिंटर के रूप में लेजर लेखक का चयन करें, और फिर पीएमएमए शीट या डबल-तरफा टेप पर प्रत्यक्ष एब्लेशन शुरू करने और पीएमएमए शीट या टेप(चित्रा 2B)पर व्यक्तिगत पैटर्न प्राप्त करने के लिए लेजर लेखक का उपयोग करके पैटर्न को "प्रिंट" करें।
  2. पीएमएमए शीट्स से सुरक्षात्मक फिल्म निकालें, और नाइट्रोजन गैस का उपयोग करके सतह को साफ करें।
    नोट: पीएमएमए पैटर्न की ड्राइंग और पीएमएमए शीट की सीधी मशीनिंग पिछली रिपोर्ट17के अनुसार की गई थी ।
  3. पीएमएमए शीट्स की कई परतों को एक साथ बांधने के लिए, 1 मिमी पीएमएमए शीट्स (लेयर 1, 2, और 3) के तीन टुकड़े ढेर करें, और उन्हें 110 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए थर्मल बॉण्डर में 5 किलो/सेमी2 के दबाव में बांधें ताकि प्रवाह/विद्युत उत्तेजना चैनल असेंबली(चित्रा 2C)का रूप दिया जा सके ।
    नोट: व्यावसायिक रूप से प्राप्त पीएमएमए शीट के विभिन्न बैचों में थोड़ा अलग ग्लास संक्रमण तापमान (टीजी) होता है। टीजी के करीब 5 डिग्री सेल्सियस वेतन वृद्धि पर इष्टतम संबंध तापमान का परीक्षण करने की आवश्यकता है।
  4. तेजी से अभिनय साइनोक्रेलेट गोंद के साथ मो चिप असेंबली की परत 1 में व्यक्तिगत उद्घाटन के लिए एडाप्टर के 12 टुकड़ों का पालन करें।
    नोट: एडाप्टर इंजेक्शन मोल्डिंग द्वारा पीएमएमए के बने होते हैं। नीचे फ्लैट सतहों मो चिप से जोड़ने के लिए कर रहे हैं । 1/4W-28 महिला पेंच धागा असर एडाप्टर सफेद उंगली तंग प्लग, फ्लैट नीचे कनेक्टर, या Luer एडाप्टर जोड़ने के लिए कर रहे हैं । फास्ट एक्टिंग साइनोक्रिलेट ग्लू का इस्तेमाल करते समय सावधानी बरतें। आंखों में छिड़काव करने से बचें।
  5. चिप(चित्रा 1A)को इकट्ठा करने से पहले 30 मिनट के लिए पराबैंगनी (यूवी) विकिरण का उपयोग करके 1 मिमी पीएमएमए सब्सट्रेट्स (लेयर 1-3), डबल-तरफा टेप (लेयर 4) और 3 मिमी ऑप्टिकल ग्रेड पीएमएमए (लेयर 5) को कीटाणुरहित करें।
  6. पीएमएमए असेंबली (लेयर 1-5)(चित्रा 1A)को पूरा करने के लिए डबल-तरफा टेप (लेयर 4) के साथ 3 मिमी ऑप्टिकल ग्रेड पीएमएमए (लेयर 5) पर 1 मिमी पीएमएमए सब्सट्रेट्स (लेयर 1-3) का पालन करें।
  7. चिप पर असेंबली के लिए क्लीन कवर ग्लास तैयार करें।
    1. एक धुंधला जार में डिटर्जेंट के दस गुना कमजोर पड़ने भरें (सामग्री की मेजदेखें), और 15 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर का उपयोग करके इस डिटर्जेंट में कवर ग्लास को साफ करें।
    2. डिटर्जेंट के सभी निशानों को हटाने के लिए नल के पानी के नीचे धुंधला जार को अच्छी तरह से कुल्ला करें।
    3. नल के पानी के सभी निशान को हटाने के लिए आसुत पानी के साथ rinsing जारी रखें, और दो बार कदम 1.7.2 दोहराएं।
    4. साफ किए हुए कवर ग्लास को नाइट्रोजन गैस से उड़ाकर सुखा लें।
  8. चिप(चित्रा 1A)कोडांतरण से पहले 30 मिनट के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर यूवी विकिरण का उपयोग कर PMMA विधानसभा (परत 1-5), डबल तरफा टेप (परत 6), और कवर ग्लास (परत 7) कीटाणुरहित ।
  9. साफ कवर ग्लास (परत 7) का पालन करें पीएमएमए असेंबली (लेयर 1-5) के साथ डबल-साइड टेप (लेयर 6)(चित्रा 1A)।
  10. रात भर वैक्यूम चैंबर में मो चिप को इनक्यूबेट करें; बाद की प्रक्रियाओं(चित्रा 3)के लिए मो चिप असेंबली का उपयोग करें ।

2. सेल संस्कृति क्षेत्रों में सब्सट्रेट पर पॉली-एल-लिसिन (पीएलएल) कोटिंग

  1. पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन ट्यूब, फ्लैट-बॉटम कनेक्टर, कोन कनेक्टर, कोन-लुएर एडाप्टर, व्हाइट फिंगर-टाइट प्लग (जिसे डाट भी कहा जाता है), लूयर एडाप्टर, लूयर लॉक सिरिंज, और ब्लैक रबर डाट(चित्रा 4A,सामग्री की तालिका)तैयार करें। उपरोक्त सभी घटकों को 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर एक ऑटोक्लेव में स्टरलाइज करें।
  2. सफेद उंगली तंग प्लग के साथ आगर पुल एडाप्टर(चित्रा 1A)के उद्घाटन सील । मीडियम इनलेट और आउटलेट एडाप्टर(चित्रा 4B)के माध्यम से फ्लैट-बॉटम कनेक्टर को मो चिप असेंबली से कनेक्ट करें। शंकु-लूयर एडाप्टर को 3-तरह के स्टॉपकॉक से कनेक्ट करें।
  3. 3 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 0.01% पीएलएल समाधान का 2 एमएल जोड़ें जो मध्यम इनलेट के 3-वे स्टॉपकॉक(चित्रा 4B-) से जोड़ता Equation 1 है।
  4. मीडियम आउटलेट(चित्रा 4B-)के 3-तरह के स्टॉपकॉक से एक खाली 3 एमएल सिरिंज कनेक्ट Equation 2 करें।
  5. सेल संस्कृति क्षेत्रों को पीएलएल समाधान के साथ भरें। मैन्युअल रूप से कोटिंग समाधान को धीरे-धीरे आगे और पीछे पंप करें। संस्कृति क्षेत्रों के अंदर समाधान को सील करने के लिए दो 3-तरह के स्टॉपकॉक को बंद करें।
  6. 5% सीओ2 वातावरण से भरे इनक्यूबेटर में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर मो चिप को इनक्यूबेट करें।

3. नमक पुल नेटवर्क की तैयारी

  1. चरण 2.6 के बाद, दो 3-तरह के स्टॉपकॉक खोलें और दो सीरिंज का उपयोग करके चैनल में कोटिंग समाधान को मैन्युअल रूप से पंप करके चैनलों में बुलबुले को दूर करें।
  2. पूर्ण माध्यम के 3 एमएल ड्रा (स्टेम सेल रखरखाव माध्यम है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम/हैम के पोषक तत्व मिश्रण एफ-12 (DMEM/F12), 2% बी-27 पूरक से मिलकर, 20 एनजी/एमएल ईजीएफ, और 20 एनजी/एमएल एलबीजीएफ) एक 3 एमएल सिरिंज में जो मीडियम इनलेट के 3-वे स्टॉपकॉक से जुड़ता है(चित्रा 4B-और चित्रा Equation 1 4B-) Equation 3 ।
  3. सेल संस्कृति क्षेत्रों में कोटिंग समाधान को बदलने के लिए पूर्ण माध्यम के 3 एमएल जोड़ें। मीडियम आउटलेट(चित्रा 4B-)के 3-तरह के स्टॉपकॉक से एक खाली 5 एमएल सिरिंज कनेक्ट Equation 4 करें।
  4. नमक पुल नेटवर्क(चित्रा 5)तैयार करें ।
    1. एक अंतर का उत्पादन करने के लिए काले रबर डाट काटें, और काले रबर डाट के माध्यम से चांदी (एजी)/सिल्वर क्लोराइड (AgCl) इलेक्ट्रोड डालें और लुएर लॉक सिरिंज(चित्रा 4A)में डालें ।
    2. ल्यूयर एडाप्टर के साथ सफेद फिंगरटाइट प्लग को बदलें, और लूयर एडाप्टर को भरने के लिए 3% गर्म एगर को इंजेक्ट करें।
      नोट: गर्म एगरॉज की तैयारी के लिए, फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के 100 एमएल में 3 ग्राम एगरल्ड पाउडर को भंग करें और 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर एक ऑटोक्लेव में स्टरलाइज करें।
    3. लूयर लॉक सिरिंज को लूयर एडाप्टर से कनेक्ट करें। सुई के साथ सिरिंज का उपयोग कर Luer ताला सिरिंज को भरने के लिए काले रबर डाट के माध्यम से 3% गर्म agarose सुई सुई के साथ सुई के साथ सुई का उपयोग कर सुई के माध्यम से पैदा हुई। एगर उठे के लिए 10 से 20 मिनट की अनुमति दें ठंडा और जमना।
      नोट: एगर उठे की मात्रा क्षमता बढ़ाने के लिए, लूयर लॉक सिरिंज को लूयर एडाप्टर(चित्रा 4 और चित्रा 5)पर रखा गया है। इसके बाद बड़े इलेक्ट्रोड को लूयर लॉक सिरिंज में डाला जाता है। इलेक्ट्रोड दीर्घकालिक प्रयोग के लिए एक स्थिर विद्युत उत्तेजना प्रदान करने में सक्षम है।

4. एमएनपीसी की तैयारी

  1. संस्कृति 5% सीओ2 वातावरण से भरे इनक्यूबेटर में 25टी सेल कल्चर फ्लास्क में 37 डिग्री सेल्सियस पर कंप्लीट मीडियम में एमएनपीसी1। उपसंस्कृति कोशिकाओं को हर 3-4 दिनों में, और कोशिकाओं के साथ सभी प्रयोगों को करते हैं जो मूल स्रोत से 3-8 मार्ग से गुजरे हैं।
  2. सेल निलंबन को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें, और 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर न्यूरोस्फीयर को स्पिन-डाउन करें। सुपरनेट को एस्पिरेट करें, और 1x डल्बेको के पीबीएस (डीपीबीएस) के साथ न्यूरोस्फीयर को धोएं। 5 मिनट के लिए 100 × जी पर न्यूरोस्फीयर को स्पिन-डाउन करें।
  3. 1x डीपीबीएस को एस्पिरेट करें और फिर न्यूरोस्फीयर को पूर्ण माध्यम में फिर से व्यतीत करें। अच्छी तरह से और धीरे-धीरे मिलाएं।
  4. 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके न्यूरोस्फीयर सस्पेंशन का 1 एमएल जोड़ें जो आउटलेट के 3-वे स्टॉपकॉक(चित्रा 4B-) से जोड़ता Equation 2 है।

5. डीसी पल्स उत्तेजना के लिए माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम का सेटअप(चित्रा 6)

  1. पारदर्शी आईटीओ हीटर पर सेल-वरीयता प्राप्त मो चिप स्थापित करें जो प्रोग्रामेबल एक्स-वाई-जेड मोटराइज्ड स्टेज पर बांधा जाता है।
    नोट: आईटीओ सतह तापमान आनुपातिक-अभिन्न-व्युत्पन्न नियंत्रक द्वारा नियंत्रित किया जाता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है। चिप के भीतर सेल संस्कृति क्षेत्रों के तापमान की निगरानी के लिए चिप और आईटीओ हीटर के बीच एक कश्मीर प्रकार थर्मोकपल क्लैंप किया जाता है। मो चिप एक प्रोग्रामेबल एक्स-वाई-जेड मोटराइज्ड स्टेज पर स्थापित है और अलग-अलग चैनल सेक्शन पर ऑटोमैटिक टाइम-लैप्स इमेज एक्विजिशन के लिए उपयुक्त है । आईटीओ हीटर के निर्माण और सेल कल्चर हीटिंग सिस्टम के सेटअप को पहले18,19वर्णित किया गया है ।
  2. मध्यम आउटलेट के माध्यम से मो चिप में मैनुअल पंपिंग द्वारा mNPCs को 2014 करें। 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस आईटीओ हीटर पर सेल-सीडेड मो चिप को इनक्यूबेट करें।
  3. 4 घंटे के बाद, एक सिरिंज पंप का उपयोग कर 20 μL/h की प्रवाह दर पर मध्यम इनलेट के माध्यम से मो चिप के माध्यम से पूरा माध्यम पंप ।
    नोट: MNPCs होते है और एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए चिप में बनाए रखा है EF उत्तेजना से पहले सेल लगाव और विकास की अनुमति है । अपशिष्ट तरल आउटलेट के 3-तरह के स्टॉपकॉक से जुड़े एक खाली 5 एमएल सिरिंज में एकत्र किया जाता है, जो चित्रा 6Aमें "अपशिष्ट" के रूप में दिखाया गया है। मो माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम कॉन्फ़िगरेशन चित्र 6में दिखाया गया है। यह माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम कोशिकाओं को पोषण की निरंतर आपूर्ति प्रदान करता है। एक निरंतर पीएच मूल्य बनाए रखने के लिए पूर्ण ताजा माध्यम को लगातार मो चिप में पंप किया जाता है। इसलिए, कोशिकाओं को सीओ2 इनक्यूबेटर के बाहर सुसंस्कृत किया जा सकता है।
  4. चिप पर एजी/एजीसीएल इलेक्ट्रोड के जरिए ईएफ मल्टीप्लेक्सर को मो चिप से जोड़ने के लिए इलेक्ट्रिकल तारों का इस्तेमाल करें । 50% ड्यूटी चक्र (50% समय-ऑन और 50% टाइम-ऑफ)(चित्रा 6बी)पर 100 हर्ट्ज की आवृत्ति पर 300 एमवी/एमएम की परिमाण के साथ आउटपुट स्क्वायर-वेव डीसी दालों के लिए एक ईएफ मल्टीप्लेक्सर और एक फ़ंक्शन जनरेटर को एम्पलीफायर से जोड़ें।
    1. बिजली के तारों को ईएफ मल्टीप्लेक्सर से जोड़ें। एजी/एजीसीएल इलेक्ट्रोड के जरिए बिजली के तारों को मो चिप से कनेक्ट करें।
    2. बिजली के तारों का उपयोग करके ईएफ मल्टीप्लेक्सर को एम्पलीफायर से जोड़ें। फ़ंक्शन जनरेटर को एम्पलीफायर और डिजिटल ऑसिलोस्कोप से कनेक्ट करें।
      नोट: EF मल्टीप्लेक्स एक सर्किट है जिसमें सर्किट में संस्कृति कक्ष की बाधा शामिल है और एक समानांतर इलेक्ट्रॉनिक नेटवर्क में सभी व्यक्तिगत कक्षों को जोड़ता है। तीन संस्कृति कक्षों में से प्रत्येक को धारावाहिक में एक चर प्रतिरोधक (वीआर) और मल्टीप्लेक्सर में एक एममीटर (चित्र 6ए में μAके रूप में दिखाया गया है) से जुड़ा हुआ है। प्रत्येक संस्कृति कक्ष के माध्यम से बिजली के वर्तमान वीआर को नियंत्रित करके विविध है, और वर्तमान इसी ammeter पर दिखाया गया है । प्रत्येक सेल संस्कृति क्षेत्र में बिजली के क्षेत्र की ताकत ओम के कानून द्वारा गणना की गई थी, मैं = σEA, जहां मैं बिजली का प्रवाह है, σ (डीएमईएम/एफ 12 20 के लिए1.38 एस एम-1के रूप में सेट) संस्कृति माध्यम की विद्युत चालकता है, ई विद्युत क्षेत्र है, और एक इलेक्ट्रोटैक्टिक चैंबर का क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र है। चित्रा 1में दिखाए गए सेल संस्कृति क्षेत्र आयाम के लिए, इलेक्ट्रिक करंट क्रमशः 50% शुल्क चक्र में डीसी और डीसी पल्स के लिए ~ 87 एमए और ~ 44 एमए है।
  5. 48h के लिए 100 हर्ट्ज की आवृत्ति पर 300 एमवी/मिमी की तीव्रता के साथ डीसी दालों को वर्ग करने के लिए mNPCs विषय। कोशिकाओं को पर्याप्त पोषण की आपूर्ति करने और माध्यम में निरंतर पीएच मूल्य बनाए रखने के लिए 10 माइक्रोन/एच की दर से पूर्ण माध्यम को लगातार पंप करें ।

6. प्रतिरक्षा परिवर्तन के बाद mNPCs के परख डीसी उत्तेजना स्पंदित

नोट: इस चरण में, सभी अभिकर् प को सिरिंज पंप का उपयोग करके मध्यम इनलेट के माध्यम से पंप किया जाता है।

  1. 1 सीडिंग के बाद 3, 7, या 14 दिनों के इन विट्रो (DIV) खेती के बाद,20मिनट के लिए 25 माइक्रोल/मिनट की प्रवाह दर पर 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं ।
  2. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। 1x PBS को बदलने के लिए 20 मिनट के लिए 25 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह दर पर चिप में 4% पीएफए पंप करें। 4% पीएफए को बदलने के लिए, कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए 25 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह दर पर 1x पीबीएस से धोएं ।
  3. 6 मिनट के लिए 50 μL/min की प्रवाह दर पर चिप में 0.1% ट्राइटन एक्स-100 पंप कोशिकाओं को पार करने के लिए। कोशिकाओं के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए अतिरिक्त 30 मिनट के लिए प्रवाह दर को 50 माइक्रोन/एच तक कम करें। 0.1% ट्राइटन एक्स-100 को बदलने के लिए, कोशिकाओं को 6 मिनट के लिए 50 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह दर पर 1x पीबीएस के साथ धोएं।
  4. गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग को कम करने के लिए 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) वाले पीबीएस के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक करें। 6 मिनट के लिए 50 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह दर पर चिप में 1% बीएसए पंप करें। प्रवाह दर को 100 माइक्रोन/एच तक कम करें और 1 घंटे के लिए पंप करें।
  5. 6 मिनट के लिए 50 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह दर पर चिप में डबल इम्यूनोदाता के लिए एंटीबॉडी पंप करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए चिप को इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 50 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह दर पर 1x पीबीएस के साथ धोएं।
  6. 6 मिनट के लिए ५० μL/मिनट की प्रवाह दर पर चिप में एलेक्सा फ्लोरर-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी पंप । 50 μL/h करने के लिए प्रवाह दर को कम करने, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एंटीबॉडी पंप। कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 50 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह दर पर 1x पीबीएस के साथ धोएं।
  7. परमाणु धुंधला के लिए, अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 20 μL/min के प्रवाह दर पर चिप में ३३३४२ पंप । कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 50 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह दर पर 1x पीबीएस के साथ धोएं।
  8. इम्यूनोदाता के बाद, एक कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं का निरीक्षण करें।

7. छवि विश्लेषण और डेटा प्रोसेसिंग

  1. बिल्ट-इन माप उपकरणों के साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट छवियों का विश्लेषण करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. नियंत्रण और उपचार समूहों में Hoechst-जवाबी नाभिक (कोशिकाओं की कुल संख्या) की तुलना करें, और प्रत्येक फेनोटाइपिक मार्कर व्यक्त कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

मो चिप का विस्तृत विन्यास चित्र 1में दिखाया गया है । माइक्रोफ्लुइडिक चिप प्रायोगिक सेटअप आकार, नमूना मात्रा और रिएजेंट वॉल्यूम को कम करने के लिए एक फायदेमंद दृष्टिकोण प्रदान करता है। मो चिप को एक ही अध्ययन(चित्रा 3)में एक साथ तीन स्वतंत्र ईएफ उत्तेजना प्रयोगों और कई इम्यूनोस्टेपिंग स्थितियों को करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इसके अलावा, मो चिप, जिसमें उच्च ऑप्टिकल पारदर्शिता होती है, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी परीक्षाओं के लिए उपयुक्त है। मो चिप को एक ही प्रयोग में एक साथ विभिन्न सेल संस्कृति स्थितियों (उदाहरण के लिए, कई ईएफ उत्तेजना, कई दवाएं, विभिन्न कोटिंग सब्सट्रेट, कोशिकाओं की कई श्रृंखला) के प्रभावों की जांच करने के लिए भी डिज़ाइन किया गया है।

एमएनपीसी को स्क्वायर-वेव डीसी दालों (परिमाण 300 एमवी/एमएम 100 हर्ट्ज की आवृत्ति पर) के संपर्क में किया गया था। डीसी पल्स उत्तेजना 48 घंटे के लिए आयोजित किया गया था। विभेदित कोशिकाओं को Tuj1 (न्यूरॉन-विशिष्ट वर्ग III β-ट्यूबलिन), ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (एस्ट्रोसाइट्स की पहचान करने के लिए जीएफएपी), और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट मार्कर O4 के साथ इम्यूनोडांग किया गया था। डीसी पल्स उपचार के बाद, एमएनपीसी ने DIV 7 में न्यूरॉन्स (Tuj1 + कोशिकाओं) की काफी अधिक संख्या व्यक्त की। DIV 3 में, एस्ट्रोसाइट्स (GFAP + कोशिकाओं) नियंत्रण (सीटीएल) समूह की तुलना में उत्तेजना समूहों में अपेक्षाकृत उच्च स्तर पर मौजूद थे । सीटीएल समूह के साथ तुलना में, ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स (O4 + कोशिकाओं) डीईवी 7 और DIV 14(चित्रा7) में उत्तेजना समूह में काफी अधिक थे। इन परिणामों से पता चलता है कि डीसी पल्स उत्तेजना के परिणामस्वरूप एमएनपीसी ने स्टेम सेल रखरखाव माध्यम में एक साथ न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स में अंतर किया। इन परिणामों से पता चलता है कि मो माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम माइक्रोस्कोपी द्वारा दीर्घकालिक सेल भेदभाव अध्ययन के लिए उपयुक्त है।

Figure 1
चित्रा 1:मल्टीचैनल ऑप्टिकली पारदर्शी इलेक्ट्रोटैक्टिक चिप का विस्तृत विन्यास। (ए)मो चिप असेंबली का विस्फोट दृश्य। मो चिप में पीएमएमए शीट्स (50 एमएम एक्स 25 एमएम एक्स 1 एमएम), डबल-तरफा टेप (50 एमएम एक्स 25 एमएम एक्स 0.07 एमएम), एडाप्टर (10 एमएम एक्स 10 एमएम एक्स 6) होते हैं। मिमी), ऑप्टिकल ग्रेड पीएमएमए शीट (50 मिमी x 75 मिमी x 3 मिमी), डबल-तरफा टेप (24 मिमी x 60 मिमी x 0.07 मिमी), और एक कवर ग्लास (24 मिमी × 60 मिमी)। मो चिप में तीन सेल कल्चर चैंबर हैं। मो चिप में मीडियम इनलेट/आउटलेट और अगर नमक पुलों के लिए छेद को जोड़ने का काम किया गया है । कोशिकाओं को कोशिका संस्कृति क्षेत्र (चौड़ाई 3 मिमी x लंबाई 42 मिमी x ऊंचाई 0.07 मिमी) में सुसंस्कृत किया गया था। चित्रा 1A चांग एट अल से संशोधित किया गयाहै। (ख)मो चिप की तस्वीर जिसमें एडाप्टर, पीएमएमए शीट्स, डबल-साइड टेप और कवर ग्लास शामिल हैं । संक्षिप्त रूप: मो = मल्टीचैनल ऑप्टिकली पारदर्शी इलेक्ट्रोटेक्टिक; पीएमएमए = पॉलीमिथाइल मेथाक्रिलेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:मो चिप के निर्माण और कोडांतरण प्रक्रियाएं। (क)पीएमएमए शीट्स या डबल-तरफा टेप के डिजाइन किए गए पैटर्न लेजर माइक्रोमशीनिंग का उपयोग करके गढ़े गए थे। (ख)अलग-अलग पीएमएमए शीट्स को सीओ2 लेजर मुंशी ने काटा था । (ग)साफ पीएमएमए शीट्स की कई परतों को एक थर्मल बॉंडर द्वारा एक साथ बंधुआ किया गया था । संक्षिप्त रूप: मो = मल्टीचैनल ऑप्टिकली पारदर्शी इलेक्ट्रोटेक्टिक; पीएमएमए = पॉलीमिथाइल मेथाक्रिलेट; सीओ2 = कार्बन डाइऑक्साइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:मो चिप की एक तस्वीर। इस आंकड़े को चांग एट अलसेसंशोधित किया गया है । संक्षिप्तीकरण: मो = मल्टीचैनल ऑप्टिकली पारदर्शी इलेक्ट्रोटेक्टिक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:एमओ चिप के लिए मध्यम और विद्युत कनेक्शन। (ए)मध्यम प्रवाह नेटवर्क के लिए घटकों की तस्वीर और एमओ माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में ईएफ नेटवर्क, जिसमें पीएफई ट्यूब, फ्लैट-बॉटम कनेक्टर, शंकु कनेक्टर, कोन-लूयर एडाप्टर, व्हाइट फिंगर-टाइट प्लग, लूयर एडाप्टर, लूयर लॉक सिरिंज, ब्लैक रबर डाट, और एजी/एजीसीएल इलेक्ट्रोड शामिल हैं । (ख)मीडियम फ्लो नेटवर्क के लिए कॉन्फिग्रेशन की तस्वीर । संक्षिप्त रूप: मो = मल्टीचैनल ऑप्टिकली पारदर्शी इलेक्ट्रोटेक्टिक; ईएफ = इलेक्ट्रिक फील्ड; PTFE = पॉलीटीट्राफ्लोरोएथिलीन; एजी = चांदी; एजीसीएल = चांदी क्लोराइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:एक तस्वीर एक माइक्रोस्कोप पर मो चिप दिखा । संक्षिप्त रूप: मो = मल्टीचैनल ऑप्टिकली पारदर्शी इलेक्ट्रोटेक्टिक; एजी = चांदी; AgCl = चांदी क्लोराइड; आईटीओ = इंडियम-टिन-ऑक्साइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:विन्यास और सिस्टम डीसी पल्स उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया। (A)डीसी पल्स उत्तेजना के लिए पूरी प्रणाली का विन्यास। मो चिप से जुड़ी सीरिंज का इस्तेमाल मीडियम इन्फ्यूजन और वेस्ट एफफ्लक्स के लिए किया जाता था । चिप में डीसी पल्स एजी/एजीसीएल इलेक्ट्रोड के माध्यम से संचालित बिजली आपूर्ति द्वारा प्रदान की गई थी । डिवाइस सेटअप एक उलटा चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप के एक्स-वाई-जेड मोटराइज्ड चरण पर स्थापित किया गया था जो डिजिटल कैमरे से लैस था । (ख)प्रयोगशाला पीठ पर सेटअप दिखाते हुए एक तस्वीर । संक्षिप्त रूप: मो = मल्टीचैनल ऑप्टिकली पारदर्शी इलेक्ट्रोटेक्टिक; एजी = चांदी; AgCl = चांदी क्लोराइड; आईटीओ = इंडियम-टिन-ऑक्साइड; EF = इलेक्ट्रिक फील्ड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:नियंत्रण समूह (सीटीएल) में एमएनपीसी कोशिकाओं का भेदभाव और डीईवी 3, 7 और 14 में डीसी पल्स उत्तेजना समूह में। न्यूरॉन (Tuj1 + कोशिकाओं), एस्ट्रोसाइट्स (GFAP + कोशिकाओं), और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स (O4 + कोशिकाओं) में(ए-सी)सीटीएल समूह और(डी-एफ)उत्तेजना (डीसी दालों) समूह में प्रतिशत । यह आंकड़ा चांग एट अल1द्वारा प्रकाशित किया गया है । संक्षिप्त रूप: सीटीएल: नियंत्रण; डीसी = प्रत्यक्ष वर्तमान; Tuj1 = न्यूरॉन-विशिष्ट वर्ग III β-ट्यूबलिन; GFAP = ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन; O4 = ओलिगोडेन्ड्रोसाइट मार्कर O4। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

मो चिप के निर्माण के दौरान, एडाप्टर तेजी से अभिनय साइनोक्रिलेट गोंद के साथ मो चिप की परत 1 से जुड़े होते हैं। गोंद को एडाप्टर के 4 कोनों पर लागू किया जाता है, और फिर एडाप्टर पर समान रूप से दबाव लागू किया जाता है। गोंद का पूर्ण बहुलीकरण सुनिश्चित करने के लिए गोंद की अतिरिक्त मात्रा से बचा जाना चाहिए। इसके अलावा, पूरा मो चिप विधानसभा एक वैक्यूम चैंबर में इनक्यूबेटेड है । यह कदम पीएमएमए परत, दो तरफा टेप और कवर ग्लास के बीच बुलबुले को हटाने में मदद करता है।

इलेक्ट्रोड सामग्री का चुनाव इस तथ्य पर आधारित है कि क्लोराइड आयन, जो माध्यम में प्रचुर मात्रा में मौजूद हैं, सेल संस्कृति क्षेत्र के माध्यम से बहने वाले इलेक्ट्रोलाइटिक उत्पाद हैं। ईएफ उत्तेजना प्रयोग के दौरान, इलेक्ट्रोड के चारों ओर पीएच स्थिर रहा। इलेक्ट्रोड सामग्री इलेक्ट्रोलाइट्स पानी के रूप में प्लैटिनम (पीटी) का उपयोग करके एक सरल विन्यास और सकारात्मक इलेक्ट्रोड और नकारात्मक इलेक्ट्रोड पर क्रमशः हाइड्रोजन आयनों (एच+)और हाइड्रोक्साइड आयनों (ओह- )उत्पन्न करता है, जो संस्कृति क्षेत्र में पीएच परिवर्तन को प्रेरित करता है। पीटी इलेक्ट्रोड के उपयोग से बचना ईएफ उत्तेजना प्रयोग के दौरान पीएच परिवर्तन की समस्या को दरकिनार करता है।

नमक पुल नेटवर्क तैयार करने के दौरान गर्म एगर उठे और बुलबुला मुक्त एगरेग आवश्यक हैं। गर्म agarose उच्च तरलता है और आसानी से नमक पुल नेटवर्क में इंजेक्शन किया जा सकता है । लूयर एडाप्टर में 3% गर्म एगर को इंजेक्ट करने के बाद ल्यूयर लॉक सिरिंज को लूयर एडाप्टर से कनेक्ट करें। इस कदम के दौरान, एगर को लुएर लॉक सिरिंज में धकेल दिया जाएगा ताकि नमक पुल नेटवर्क का एक बुलबुला मुक्त फर्म कनेक्शन प्राप्त किया जा सके। नमक पुलों में बुलबुले विद्युत प्रतिरोध को बढ़ाते हैं और इसलिए, प्रत्याशित विद्युत प्रवाह तक नहीं पहुंचा जा सकता है। एगर उठे इंजेक्शन के बाद, सेल संस्कृति क्षेत्र में जमने वाले मलबे के गठन को रोकने के लिए 10-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा और जमना करने के लिए एगर उठे होने का इंतजार करना महत्वपूर्ण है।

मो चिप एक आईटीओ हीटर है कि एक प्रोग्राम एक्स वाई-जेड मोटर चालित मंच पर बंद कर दिया है पर रखा गया है । पूरी प्रणाली चिप में सेल संस्कृति क्षेत्रों के भीतर सेल भेदभाव की निगरानी के लिए एक डिजिटल कैमरे से लैस एक उल्टे चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप पर बनाया गया है । एक इनक्यूबेटर के बाहर मो माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में स्वचालित समय-चूक छवियों के सेल आकृति विज्ञान और अधिग्रहण का निरीक्षण करना सुविधाजनक है। यह माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम न केवल आवश्यक प्रयोगात्मक समय को छोटा करता है, बल्कि माइक्रोएनवायरमेंट पर नियंत्रण की सटीकता को भी बढ़ाता है।

एमएनपीसी कोशिकाएं संस्कृति मीडिया में निलंबन के रूप में बढ़ती हैं । हालांकि, एमएनपीसी मो चिप में पीएलएल-लेपित प्लेट का पालन करने वाले भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण हैं। 30-40 कोशिकाओं द्वारा गठित न्यूरोस्फीयर को एमएनपीसी भेदभाव शुरू करने के लिए पसंद किया जाता है। एमएनपीसी का अतिवृद्धि भेदभाव प्रक्रिया के दौरान सेल अस्तित्व को ख़राब कर देगा। इसके अलावा, स्पंदित डीसी उत्तेजना के बाद, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रयोगात्मक प्रवाह दर से प्रभावित किया जा सकता है। इसलिए, धोने के दौरान कोशिकाओं को अलग करने से बचने के लिए विभिन्न चरणों के लिए कई प्रवाह दरों का उपयोग करें।

इस अध्ययन में इस तकनीक की एक सीमा यह है कि चिप की पूरी तरह से सफाई में दिक्कत के कारण मो चिप का दोबारा इस् तेम नहीं किया जा सकता। हालांकि, मो चिप को सीधे फेज-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप या स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत रखा जा सकता है । रिपोर्ट किए गए माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली का जल-तंग डिजाइन यह सुनिश्चित करता है कि बफर/मध्यम वाष्पीकरण न हो, बफर/मध्यम और संबंधित विद्युत गुणों की सटीक सांद्रता को बनाए रखें । अभिवाची मात्रा और इसी ऑपरेशन समय को कम करके, मो माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम सेल भेदभाव का अध्ययन करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है।

पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि ईजीएफ और टीएफजीएफ अविभेदित राज्य4में एनपीसी के अस्तित्व, विस्तार और रखरखाव को बढ़ावा देते हैं । इस अध्ययन में डीसी दलों ने स्टेम सेल मेंटेनेंस मीडियम में एमएनपीसी के भेदभाव को प्रेरित किया जिसमें ईजीएफ और बीडब्ल्यूजीएफ शामिल थे । पिछले अध्ययनों से यह सूचित किया गया है कि ईएफ एनईसी के भेदभाव को ईजीएफ और 21,22के बिना भेदभाव माध्यम में न्यूरॉन्स और/या एस्ट्रोसाइट्स में बदलता है । इन परिणामों से पता चलता है कि एमसीपीसीएस ने डीसी पल्स उत्तेजना के बाद न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स में अंतर किया। उनका यह भी सुझाव है कि सरल डीसी पल्स ट्रीटमेंट एनपीसी के भाग्य को नियंत्रित कर सकता है । उत्तेजना समय, EF शक्ति, या कर्तव्य चक्र पर आगे अनुकूलन के साथ, डीसी दालों एनपीसी भेदभाव में हेरफेर करने के लिए लागू किया जा सकता है और चिकित्सकीय रणनीतियों के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि तंत्रिका तंत्र विकारों के इलाज के लिए एनपीसी को रोजगार ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने प्रोफेसर तांग के तांग, इंस्टीट्यूट ऑफ बायोमेडिकल साइंसेज, एकेडमिक्स सिनिका को माउस न्यूरल स्टेम और जनक कोशिकाओं (एमएनपीसी) प्रदान करने में उनकी सहायता के लिए धन्यवाद दिया । लेखकों ने एमएनपीसी के भेदभाव पर उनकी बहुमूल्य चर्चा के लिए प्रोफेसर तांग के तांग और सुश्री यांग-शान ली को भी धन्यवाद दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) BHT K2R20 Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL plastic tube Protech Technology Enterprise Co., Ltd CT-15-PL-TW Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized
3 mL syringe TERUMO DVR-3413 3 mL oral syringes, without needle
3 mm optical grade PMMA (Layer 5) CHI MEI Corporation ACRYPOLY PMMA Sheet Optical grade PMMA
3-way stopcock NIPRO NCN-3L Sterile disposable 3-way stopcock
5 mL syringe TERUMO DVR-3410 5 mL oral syringes, without needle
Adaptor Dong Zhong Co., Ltd. Customized PMMA adaptor
Agarose Sigma-Aldrich A9414 Agarose, low gelling temperature
Amplifier A.A. Lab Systems Ltd A-304 High voltage amplifier
AutoCAD software Autodesk Educational Version Drafting
B-27 supplement Gibco 12587-010 B-27 supplement (50x), minus vitamin A
Basic fibroblast growth factor (bFGF)  Peprotech AF-100-18B Also called recombinant human FGF-basic
Black rubber bung TERUMO DVR-3413 From 3 mL oral syringes, without needle
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich B4287 Blocking reagent 
Centrifuge HSIANGTAI CV2060 Centrifuge
CO2 laser scriber Laser Tools and Technics Corp.  ILS-II Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm
Cone connector IDEX Health & Science F-120X One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural
Cone-Luer adaptor IDEX Health & Science P-659 Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK
Confocal fluorescence microscope Leica Microsystems TCS SP5 Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Digital camera OLYMPUS E-330 Automatic time-lapse image acquisition
Digital oscilloscope Tektronix TDS2024 Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency.
Double-sided tape 3M  PET 8018 Purchased from http://en.thd.com.tw/
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) Gibco 12400024 DMEM/F-12, powder, HEPES
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600010 DPBS, powder, no calcium, no magnesium
EF multiplexer Asiatic Sky Co., Ltd. Customized Monitor and control the electric current in individual channels
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Also called recombinant human EGF
Fast-acting cyanoacrylate glue 3M  7004T Strength instant adhesive (liquid)
Flat bottom connector IDEX Health & Science P-206 Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue
Function generator Agilent Technologies 33120A High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability
Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150117 Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed
Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) Abcam ab150086 Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 Nuclear staining
ImageJ software National Institutes of Health 1.48v Analyze the fluorescent images 
Indium–tin–oxide (ITO) glass Merck 300739 For ITO heater
Inverted phase contrast microscope OLYMPUS CKX41 For cell morphology observation
K-type thermocouple Tecpel TPK-02A Temperature thermocouples
Luer adapter IDEX Health & Science P618-01 Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene
Luer lock syringe TERUMO DVR-3413 For agar salt bridges
Mouse anti-GFAP eBioscience 14-9892 Astrocytes marker
Oligodendrocyte  marker  O4  antibody R&D Systems MAB1326 Oligodendrocytes marker
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148 Fixing agent
Phosphate buffered saline (PBS) Basic Life BL2651 Washing solution
Poly-L-Lysine (PLL) SIGMA P4707 Coating solution
Precision cover glasses thickness No. 1.5H MARIENFELD 107242 https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programmable X-Y-Z motorised stage Tanlian Inc Customized Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportional–integral–derivative (PID) controller Toho Electronics TTM-J4-R-AB Temperature controller 
PTFE tube Professional Plastics Inc. Taiwan Branch Outer diameter 1/16 Inches White translucent PTFE tubing
Rabbit anti-Tuj1 Abcam ab18207 Neuron marker
Syringe pump New Era Systems Inc NE-1000 NE-1000 programmable single syringe pump
TFD4 detergent FRANKLAB TFD4 Cover glass cleaner
Thermal bonder Kuan-MIN Tech Co. Customized Purchased from http://kmtco.com.tw/
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Permeabilized solution
Ultrasonic cleaner LEO LEO-300S Ultrasonic steri-cleaner
Vacuum chamber DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. DOV-30 Vacuum drying oven
White fingertight plug IDEX Health & Science P-316 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
  2. Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
  3. Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
  4. Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
  5. Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
  6. Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
  7. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
  8. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
  9. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
  10. Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
  11. Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
  12. Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
  13. Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
  14. Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
  15. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
  16. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
  17. Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
  19. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
  20. Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
  21. AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
  22. Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 170 इलेक्ट्रिक फील्ड्स न्यूरल स्टेम और जनक कोशिकाएं विभेदन पॉलीमिथाइल मेथाक्रिलेट पीएमएमए माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम
माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में इलेक्ट्रिक-फील्ड-प्रेरित तंत्रिका अग्रदूत सेल भेदभाव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, H. F., Chou, S. E., Cheng, J. … More

Chang, H. F., Chou, S. E., Cheng, J. Y. Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (170), e61917, doi:10.3791/61917 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter