Summary
In questo studio, presentiamo un protocollo per la differenziazione delle cellule staminali neurali e progenitrici (NPC) indotte esclusivamente dalla stimolazione dell'impulso a corrente continua (DC) in un sistema microfluidico.
Abstract
I campi elettrici fisiologici (EF) svolgono un ruolo vitale nella migrazione cellulare, nella differenziazione, nella divisione e nella morte. Questo articolo descrive un sistema di coltura cellulare microfluidico che è stato utilizzato per uno studio di differenziazione cellulare a lungo termine usando la microscopia. Il sistema microfluidico è costituito dai seguenti componenti principali: un chip elettrotattico otticamente trasparente, un riscaldatore ITO (Indium-Tin-Oxide) trasparente, una pompa di riempimento dei supporti di coltura, un alimentatore elettrico, un amplificatore di potenza ad alta frequenza, un multiplexer EF, uno stadio motorizzato X-Y-Z programmabile e un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di una fotocamera digitale. Il sistema microfluidico è utile per semplificare l'impostazione sperimentale complessiva e, a sua volta, il reagente e il consumo del campione. Questo lavoro comporta la differenziazione delle cellule staminali neurali e progenitrici (NPC) indotte dalla stimolazione dell'impulso a corrente continua (DC). Nel mezzo di manutenzione delle cellule staminali, i PNG del topo (mNPC) si differenziarono in neuroni, astrociti e oligodendrociti dopo la stimolazione dell'impulso DC. I risultati suggeriscono che un semplice trattamento a impulsi CC potrebbe controllare il destino degli mNPC e potrebbe essere utilizzato per sviluppare strategie terapeutiche per i disturbi del sistema nervoso. Il sistema può essere utilizzato per la coltura cellulare in più canali, per la stimolazione EF a lungo termine, per l'osservazione morfologica cellulare e per l'acquisizione automatica di immagini time-lapse. Questo sistema microfluidico non solo riduce i tempi sperimentali richiesti, ma aumenta anche l'accuratezza del controllo sul microambiente.
Introduction
Le cellule precursori neurali (NPC, note anche come cellule staminali neurali e progenitrici) possono essere un candidato promettente per la strategia terapeutica neurodegenerativa1. I PNG indifferenziati hanno capacità di auto-rinnovo, multipotenza e capacità proliferativa2,3. Uno studio precedente ha riferito che la matrice extracellulare e i mediatori molecolari regolano la differenziazione dell'NPC. Il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) promuovono la proliferazione dei NPC, mantenendo così lo stato indifferenziato4.
Studi precedenti hanno riferito che la stimolazione elettrica può regolare le attività fisiologiche cellulari come ladivisione 5,lamigrazione 6,7,8,ladifferenziazione 1,9,10e la morte cellulare11. I campi elettrici (EFs) svolgono un ruolo vitale nello sviluppo e nella rigenerazione dello sviluppo del sistemanervoso centrale 12,13,14. Dal 2009 al 2019, questo laboratorio ha studiato le risposte cellulari all'applicazione di EF nel sistema microfluidico1,6,7,8,15,16,17. Un chip elettrotattico multicanale, otticamente trasparente (MOE) è stato progettato per essere adatto per la colorazione dell'immunofluorescenza per la microscopia confocale. Il chip aveva un'elevata trasparenza ottica e una buona durata e permetteva lo svolgimento simultaneo di tre esperimenti di stimolazione indipendenti e diverse condizioni immunostained in un unico studio. Il sistema microfluidico è utile per semplificare l'impostazione sperimentale complessiva e, a sua volta, il reagente e il consumo del campione. Questo documento descrive lo sviluppo di un sistema di coltura cellulare microfluidico che è stato utilizzato per uno studio di differenziazione cellulare a lungo termine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Progettazione e fabbricazione del chip MOE
- Disegnare modelli per singoli strati di metacrilato di polimetile (PMMA) e il nastro a doppia parte utilizzando un software appropriato (Figura 1A, Tabella dei materiali). Tagliare sia i fogli PMMA che il nastro a doppia mano con uno scriber per macchine laser CO2 (Figura 1B).
- Accendere lo scriber laser CO2 e collegarlo a un personal computer. Aprire il file del modello progettato utilizzando il software.
- Posizionare i fogli PMMA (275 mm x 400 mm) o il nastro a doppia mano (210 mm x 297 mm) sulla piattaforma dello scriber laser(Figura 2A). Mettere a fuoco il laser sulla superficie dei fogli PMMA o sul nastro a doppia mano utilizzando lo strumento di messa a fuoco automatica.
- Selezionare lo scriber laser come stampante, quindi "stampare" il modello utilizzando lo scriber laser per avviare l'ablazione diretta sul foglio PMMA o sul nastro a doppia mano e ottenere singoli motivi sul foglio o sul nastro PMMA (Figura 2B).
- Rimuovere il film protettivo dai fogli PMMA e pulire la superficie utilizzando gas azoto.
NOTA: Il disegno del modello PMMA e la lavorazione diretta del foglio PMMA sono stati eseguiti secondo un precedente rapporto17. - Per legare insieme più strati di fogli PMMA, impilare tre pezzi di fogli PMMA da 1 mm (strati 1, 2 e 3) e incollarli sotto una pressione di 5 kg /cm2 in un bonder termico per 30 minuti a 110 °C per formare l'assemblaggio del canale di flusso /stimolazione elettrica(Figura 2C).
NOTA: Diversi lotti di lamiere PMMA ottenute commercialmente hanno una temperatura di transizione del vetro leggermente diversa (Tg). La temperatura di incollaggio ottimale deve essere testata a incrementi di 5 °C vicino al Tg. - Aderire a 12 pezzi di adattatori alle singole aperture nello strato 1 dell'assemblaggio del chip MOE con colla cianoacrilato ad azione rapida.
NOTA: Gli adattatori sono realizzati in PMMA mediante stampaggio a iniezione. Le superfici piane nella parte inferiore sono per il collegamento al chip MOE. Gli adattatori con filetto a vite femmina da 1/4W-28 sono per il collegamento di spine bianche a tenuta di dita, connettori inferiori piatti o adattatori Luer. Fai attenzione quando usi colla cianoacrilato ad azione rapida. Evitare di spruzzi negli occhi. - Disinfettare i substrati PMMA da 1 mm (strati 1-3), il nastro a doppia fronte (Strato 4) e il PMMA di grado ottico da 3 mm (strato 5) utilizzando l'irradiazione ultravioletta (UV) per 30 minuti prima di assemblare il chip(Figura 1A).
- Aderire ai substrati PMMA da 1 mm (strati 1-3) sul PMMA di grado ottico da 3 mm (Strato 5) con il nastro a doppia aspetto (Strato 4) per completare l'assieme PMMA (Layers 1-5)(Figura 1A).
- Preparare il vetro di copertura pulito per l'assemblaggio sul chip.
- Riempire una diluizione dieci volte del detergente in un barattolo di colorazione (vedere il tavolo dei materiali) e pulire il vetro di copertura in questo detergente utilizzando un pulitore ad ultrasuoni per 15 minuti.
- Risciacquare accuratamente il barattolo di colorazione sotto l'acqua corrente del rubinetto per rimuovere tutte le tracce del detergente.
- Continuare il risciacquo con acqua distillata per rimuovere tutte le tracce di acqua del rubinetto e ripetere il passaggio 1.7.2 due volte.
- Asciugare il vetro di copertura pulito soffiandolo con gas azoto.
- Disinfettare l'assieme PMMA (Strati 1-5), il nastro a doppia parte (Strato 6) e il vetro di copertura (Strato 7) utilizzando l'irradiazione UV all'interno di un armadio di biosicurezza per 30 minuti prima di assemblare il truciolo(Figura 1A).
- Aderire al vetro di copertura pulito (Strato 7) all'assieme PMMA (Livelli 1-5) con il nastro a doppia fronte (Livello 6)(Figura 1A).
- Incubare il chip MOE in una camera a vuoto durante la notte; utilizzare l'assieme chip MOE per le procedure successive (Figura 3).
2. Rivestimento della poli-L-lisina (PLL) sul substrato nelle regioni di coltura cellulare
- Preparare il tubo in politetrafluoroetilene, il connettore a fondo piatto, il connettore cono, l'adattatore cono-Luer, la spina bianca a tenuta di dita (chiamata anche tappo), l'adattatore Luer, la siringa di blocco Luer e il bung in gomma nera(Figura 4A,Tabella dei materiali). Sterilizzare tutti i componenti di cui sopra in autoclave a 121 °C per 30 min.
- Sigillare le aperture degli adattatori a ponte di agar(Figura 1A)con le spine bianche a tenuta di dita. Collegare il connettore flat-bottom all'assieme del chip MOE tramite gli adattatori di ingresso e di uscita medi (Figura 4B). Collegare l'adattatore cono-Luer ai fermavi a 3.
- Aggiungere 2 ml di soluzione PLL allo 0,01% utilizzando una siringa da 3 ml che si collega al fermallo a 3 via dell'ingresso medio (Figura 4B-
). - Collegare una siringa vuota da 3 ml al fermago a 3 strade della presa media (Figura 4B-
). - Riempire le aree di coltura cellulare con la soluzione PLL. Pompare manualmente la soluzione di rivestimento avanti e indietro lentamente. Chiudi i due fermacock a 3 via per sigillare la soluzione all'interno delle regioni culturali.
- Incubare il chip MOE a 37 °C durante la notte in un incubatore pieno di atmosfera di CO2 al 5%.
).
).3. Preparazione della rete di ponti salati
- Dopo il passaggio 2.6, aprire i due fermavi a 3 via e sciacquare le bolle nei canali pompando manualmente la soluzione di rivestimento avanti e indietro nel canale utilizzando le due siringhe.
- Prelevare 3 mL di mezzo completo (mezzo di manutenzione delle cellule staminali costituito dal mezzo di aquila modificato di Dulbecco / miscela nutritiva del prosciutto F-12 (DMEM / F12), supplemento B-27 al 2%, 20 ng/mL EGF e 20 ng/mL bFGF) in una siringa da 3 ml che si collega al fermallo a 3 way dell'ingresso medio (Figura 4B- e Figura 4B-
). - Aggiungere 3 mL di mezzo completo per sostituire la soluzione di rivestimento nelle regioni di coltura cellulare. Collegare una siringa vuota da 5 ml al fermago a 3 strade della presa media (Figura 4B-
). - Preparare la rete di ponti di sale (Figura 5).
- Tagliare il bung di gomma nera per produrre uno spazio e inserire gli elettrodi argento (Ag)/cloruro d'argento (AgCl) attraverso il bung di gomma nera e nella siringa di blocco Luer(Figura 4A).
- Sostituire la spina bianca con l'adattatore Luer e iniettare il 3% di agarosio caldo per riempire l'adattatore Luer.
NOTA: Per la preparazione dell'agarosio caldo, sciogliere 3 g di polvere di agarosio in 100 mL di salina tamponata da fosfati (PBS) e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 30 min. - Collegare la siringa di blocco Luer all'adattatore Luer. Iniettare il 3% di agarosa calda attraverso il bung di gomma nera per riempire la siringa di blocco Luer usando la siringa con ago. Lasciare raffreddare e solidificare da 10 a 20 minuti per l'agarosio.
NOTA: Per aumentare la capacità di volume dell'agarosio, la siringa di blocco Luer è montata sull'adattatore Luer(figura 4 e figura 5). Quindi, i grandi elettrodi vengono inseriti nella siringa di blocco Luer. L'elettrodo è in grado di fornire una stimolazione elettrica stabile per l'esperimento a lungo termine.
).
).4. Preparazione di mNPC
- Coltura degli mNPC1 nel mezzo completo in un pallone da coltura cellulare 25T a 37 °C in un incubatore pieno di atmosfera di CO2 al 5%. Sottocultura le cellule ogni 3-4 giorni, ed eseguire tutti gli esperimenti con cellule che hanno subito 3-8 passaggi dalla fonte originale.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml e spin-down delle neurosfere a 100 × g per 5 min. Aspirare il supernatante e lavare le neurosfere con pbs (DPBS) di 1x Dulbecco. Spin-down delle neurosfere a 100 × g per 5 min.
- Aspirare il 1x DPBS e quindi rimpiorsi le neurosfere nel mezzo completo. Mescolare accuratamente e delicatamente.
- Aggiungere 1 ml della sospensione della neurosfera utilizzando una siringa da 1 ml che si collega al fermallo a 3 via dell'uscita (Figura 4B- ).
5. Installazione del sistema microfluidico per la stimolazione dell'impulso CC (Figura 6)
- Installare il chip MOE semisezionato sulla stufa ITO trasparente fissata su uno stadio motorizzato X-Y-Z programmabile.
NOTA: La temperatura superficiale ITO è controllata da un controller proporzionale-integrale-derivato e mantenuta a 37 °C. Una termocopia di tipo K viene bloccata tra il chip e il riscaldatore ITO per monitorare la temperatura delle regioni di coltura cellulare all'interno del chip. Il chip MOE è installato su uno stadio motorizzato X-Y-Z programmabile ed è adatto per l'acquisizione automatica di immagini time-lapse nelle singole sezioni del canale. La fabbricazione del riscaldatore ITO e l'installazione del sistema di riscaldamento a coltura cellulare sono stati descritti inprecedenza 18,19. - Infondere gli mNPC pompando manualemente nel chip MOE tramite la presa media. Incubare il chip MOE semisemito di cellule sul riscaldatore ITO a 37 °C per 4 ore.
- Dopo 4 ore, pompare il mezzo completo attraverso il chip MOE tramite l'ingresso medio a una portata di 20 μL/h utilizzando una pompa per siringhe.
NOTA: Gli mNPC vengono coltivati e mantenuti nel chip per ulteriori 24 ore prima della stimolazione EF per consentire l'attacco cellulare e la crescita. Il liquido di scarto viene raccolto in una siringa vuota da 5 ml collegata al fermallo a 3 strade dell'uscita, indicata come "rifiuto" nella figura 6A. La configurazione del sistema microfluidico MOE è illustrata nella figura 6. Questo sistema microfluidico fornisce un continuo apporto di nutrizione alle cellule. Il mezzo fresco completo viene continuamente pompato nel chip MOE per mantenere un valore di pH costante. Pertanto, le cellule possono essere coltivate al di fuori di un incubatore di CO2. - Utilizzare fili elettrici per collegare un multiplexer EF al chip MOE tramite gli elettrodi Ag/AgCl sul chip. Collegare un multiplexer EF e un generatore di funzioni a un amplificatore per emettere impulsi CC ad onda quadra con una magnitudine di 300 mV/mm ad una frequenza di 100 Hz a cicli di servizio del 50% (50% di time-on e 50% di tempo libero)(Figura 6B).
- Collegare i fili elettrici al multiplexer EF. Collegare i fili elettrici al chip MOE tramite gli elettrodi Ag/AgCl.
- Collegare il multiplexer EF all'amplificatore utilizzando fili elettrici. Collegare il generatore di funzioni all'amplificatore e all'oscilloscopio digitale.
NOTA: Il multiplexer EF è un circuito che include l'impedenza della camera di coltura nel circuito e collega tutte le singole camere in una rete elettronica parallela. Ognuna delle tre camere di coltura è collegata elettricamente in serie a un resistore variabile (Vr) e un amperometro (mostrato come μA nella figura 6A) nel multiplexer. La corrente elettrica attraverso ogni camera di coltura è variata controllando la Vr, e la corrente è mostrata sull'ammetro corrispondente. La forza del campo elettrico in ogni regione di coltura cellulare è stata calcolata dalla legge di Ohm, I= σEA, dove I è la corrente elettrica, σ (impostata come 1,38 S·m-1 per DMEM/F1220) è la conduttività elettrica del mezzo di coltura, E è il campo elettrico, e A è l'area trasversale della camera elettrotassica. Per la dimensione della regione di coltura cellulare mostrata nella figura 1, la corrente elettrica è rispettivamente ~87 mA e ~44 mA per l'impulso DC e DC al 50% del ciclo di servizio.
- Sottosezione degli mNPC a impulsi CC quadrati con una magnitudine di 300 mV/mm alla frequenza di 100 Hz per 48h. Pompare continuamente il mezzo completo ad una velocità di 10 μL/h per fornire un'alimentazione adeguata alle cellule e mantenere un valore di pH costante nel mezzo.
6. Test di immunofluorescenza degli MNPC dopo stimolazione CC pulsata
NOTA: In questo passaggio, tutto il reagente viene pompato tramite l'ingresso medio utilizzando una pompa per siringhe.
- Dopo 3, 7 o 14 giorni di coltivazione in vitro (DIV) dopo la semina1, lavare le cellule con 1x PBS ad una portata di 25 μL/min per 20 min.
- Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (PFA). Pompare il 4% di PFA nel chip ad una portata di 25 μL/min per 20 min per sostituire il 1x PBS. Per sostituire il 4% di PFA, lavare le celle con 1x PBS a una portata di 25 μL/min per 20 min.
- Pompare lo 0,1% di Tritone X-100 nel chip ad una portata di 50 μL/min per 6 minuti per permeabilizzare le cellule. Ridurre la portata a 50 μL/h per altri 30 minuti per reagire con le cellule. Per sostituire lo 0,1% di Tritone X-100, lavare le celle con 1x PBS ad una portata di 50 μL/min per 6 min.
- Bloccare le cellule con PBS contenente l'1% di albumina siere bovina (BSA) per ridurre il legame anticorpale non specifico. Pompare l'1% di BSA nel chip ad una portata di 50 μL/min per 6 min. Ridurre la portata a 100 μL/h e pompare per 1 h.
- Pompare gli anticorpi per la doppia immunosocienza nel chip ad una portata di 50 μL/min per 6 min e incubare il truciolo per 18 ore a 4 °C. Lavare le celle con 1x PBS ad una portata di 50 μL/min per 15 min.
- Pompare gli anticorpi secondari coniugati con Fluor Alexa nel chip ad una portata di 50 μL/min per 6 min. Ridurre la portata a 50 μL/h e pompare gli anticorpi per 1 h a temperatura ambiente al buio. Lavare le celle con 1x PBS ad una portata di 50 μL/min per 15 min.
- Per la colorazione nucleare, pompare hoechst 33342 nel chip ad una portata di 20 μL/min per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Lavare le celle con 1x PBS ad una portata di 50 μL/min per 15 min.
- Dopo l'immunosocienza, osservare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale.
7. Analisi delle immagini ed elaborazione dei dati
- Analizzare le immagini fluorescenti utilizzando il software con strumenti di misurazione integrati (vedere la tabella dei materiali).
- Confrontare i nuclei controsostenibili hoechst (numero totale di cellule) nei gruppi di controllo e trattamento e calcolare la percentuale di cellule che esprimono ciascun marcatore fenotipico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La configurazione dettagliata del chip MOE è illustrata nella figura 1. Il chip microfluidico fornisce un approccio vantaggioso per ridurre le dimensioni di configurazione sperimentale, il volume del campione e il volume del reagente. Il chip MOE è stato progettato per eseguire tre esperimenti di stimolazione EF indipendenti e diverse condizioni di immunosocienza simultaneamente in un unico studio (Figura 3). Inoltre, il chip MOE, che ha un'elevata trasparenza ottica, è adatto per esami di microscopia confocale. Il chip MOE è anche progettato per studiare gli effetti delle diverse condizioni di coltura cellulare (ad esempio, stimolazione EF multipla, diversi farmaci, substrato di rivestimento diverso, serie multiple di cellule) contemporaneamente in un singolo esperimento.
Gli mNPC erano esposti a impulsi CC ad onde quadrate (magnitudine 300 mV/mm ad una frequenza di 100 Hz). La stimolazione dell'impulso CC è stata condotta per 48 ore. Le cellule differenziate sono state immunosostenibili con Tuj1 (classe III β-tubulina specifica del neurone), proteina acida fibrillare gliale (GFAP per identificare gli astrociti) e marcatore oligodendrocito O4. Dopo il trattamento dell'impulso DC, gli mNPC hanno espresso un numero significativamente elevato di neuroni (cellule Tuj1+) a DIV 7. Al DIV 3, gli astrociti (cellule GFAP+) erano presenti a livelli relativamente più alti nei gruppi di stimolazione rispetto al gruppo di controllo (CTL). Rispetto al gruppo CTL, gli oligodendrociti (cellule O4+) erano significativamente più alti nel gruppo di stimolazione a DIV 7 e DIV 14(Figura 7). Questi risultati mostrano che la stimolazione dell'impulso CC ha portato gli mNPC a differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti contemporaneamente nel mezzo di mantenimento delle cellule staminali. Questi risultati suggeriscono che il sistema microfluidico MOE è adatto per uno studio di differenziazione cellulare a lungo termine per microscopia.
Figura 1: Configurazione dettagliata del chip elettrotattico multicanale otticamente trasparente. (A) Vista esplosa dell'assieme del chip MOE. Il chip MOE è costituito da fogli PMMA (50 mm x 25 mm x 1 mm), nastro a doppia fazione (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), adattatori (10 mm x 10 mm x 6 mm ), foglio PMMA di grado ottico (50 mm x 75 mm x 3 mm), nastro a doppia fronte (24 mm x 60 mm x 0,07 mm) e un vetro di copertura (24 mm × 60 mm). Ci sono tre camere di coltura cellulare nel chip MOE. Il chip MOE ha fori di collegamento per l'ingresso/uscita media e i ponti di sale dell'agar. Le celle sono state coltivate nella regione di coltura cellulare (larghezza 3 mm x lunghezza 42 mm x altezza 0,07 mm). La figura 1A è stata modificata da Chang etal. (B) Fotografia del chip MOE comprendente adattatori, fogli PMMA, nastro a doppia mano e vetro di copertura. Abbreviazioni: MOE= elettrotassista otticamente trasparente multicanale; PMMA = metacrilato di polimetile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: I processi di fabbricazione e assemblaggio delchip MOE. (A) I modelli progettati dei fogli PMMA o del nastro a doppia mano sono stati fabbricati utilizzando micromacchina laser. (B)I singoli fogli PMMA sono stati tagliati da uno scriber laser a CO2. (C) I molteplici strati dei fogli PMMA puliti sono stati incollati insieme da un legante termico. Abbreviazioni: MOE= elettrotassista otticamente trasparente multicanale; PMMA = metacrilato di polimetile; CO2 = anidride carbonica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Una fotografia del chip MOE. Questa cifra è stata modificata da Chang etal. Abbreviazione: MOE= elettrotassista otticamente trasparente multicanale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Collegamento medio ed elettrico alchip MOE. (A) Fotografia dei componenti per la rete a flusso medio e la rete EF nel sistema microfluidico MOE, tra cui il tubo PTFE, il connettore a fondo piatto, il connettore a cono, l'adattatore cono-Luer, la spina bianca a tenuta di dita, l'adattatore Luer, la siringa di blocco Luer, il bung in gomma nera e gli elettrodi Ag/AgCl. (B) Fotografia della configurazione per la rete a flusso medio. Abbreviazioni: MOE= elettrotassista otticamente trasparente multicanale; EF = campo elettrico; PTFE = politetrafluoroetilene; Ag = argento; AgCl = cloruro d'argento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Una fotografia che mostra il chip MOE al microscopio. Abbreviazioni: MOE= elettrotassista otticamente trasparente multicanale; Ag = argento; AgCl = cloruro d'argento; ITO = indio-stagno-ossido. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: La configurazione e il sistema utilizzato per la stimolazione dell'impulso CC. (A) La configurazione dell'intero sistema per la stimolazione dell'impulso CC. Le siringhe collegate al chip MOE sono state utilizzate per infusione media ed efflux di scarto. L'impulso CC nel chip è stato fornito da un alimentatore condotto attraverso gli elettrodi Ag/AgCl. La configurazione del dispositivo è stata installata sullo stadio motorizzato X-Y-Z di un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di una fotocamera digitale. (B) Una fotografia che mostra l'installazione su un banco di laboratorio. Abbreviazioni: MOE= elettrotassista otticamente trasparente multicanale; Ag = argento; AgCl = cloruro d'argento; ITO = indio-stagno-ossido; EF = campo elettrico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Differenziazione delle cellule mNPC nel gruppo di controllo (CTL) e nel gruppo di stimolazione dell'impulso CC a DIV 3, 7 e 14. La percentuale di neuroni (cellule Tuj1+), astrociti (cellule GFAP+) e oligodendrociti (cellule O4+) in (A-C) nel gruppo CTL e (D-F) nel gruppo di stimolazione (impulsi DC). Questa cifra è stata pubblicata da Chang etal. Abbreviazioni: CTL: controllo; DC = corrente diretta; Tuj1 = classe III specifica del neurone β-tubulina; GFAP = proteina acida fibrillare gliale; O4 = marcatore oligodendrocito O4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Durante la fabbricazione del chip MOE, gli adattatori sono attaccati allo Strato 1 del chip MOE con colla cianoacrilato ad azione rapida. La colla viene applicata su 4 angoli degli adattatori e quindi la pressione viene applicata uniformemente sugli adattatori. L'eccesso di quantità di colla deve essere evitato per garantire la completa polimerizzazione della colla. Inoltre, l'assemblaggio del chip MOE completato viene incubato in una camera a vuoto. Questo passaggio aiuta a rimuovere le bolle tra lo strato PMMA, il nastro a doppia parte e il vetro di copertura.
La scelta del materiale dell'elettrodo si basa sul fatto che gli ioni cloruro, che sono abbondantemente presenti nel mezzo, sono i prodotti elettrolitici che scorrono attraverso la regione di coltura cellulare. Durante l'esperimento di stimolazione EF, il pH intorno agli elettrodi è rimasto costante. Una configurazione più semplice che utilizza il platino (Pt) come materiale dell'elettrodo elettrolizza l'acqua e genera ioni idrogeno (H+) e ioni idrossido (OH-) rispettivamente all'elettrodo positivo e all'elettrodo negativo, inducendo cambiamenti di pH nella regione di coltura. Evitare l'uso di elettrodi Pt elude il problema dei cambiamenti di pH durante l'esperimento di stimolazione EF.
L'agarosio caldo e l'agarosio senza bolle sono essenziali durante la preparazione della rete di ponti salati. L'agarosio caldo ha un'elevata fluidità e può essere facilmente iniettato nella rete del ponte di sale. Collegare la siringa di blocco Luer all'adattatore Luer dopo aver iniettato l'agarosio caldo al 3% nell'adattatore Luer. Durante questo passaggio, l'agarosio verrà spinto verso l'alto nella siringa di blocco Luer in modo da ottenere una connessione solida senza bolle della rete di ponti di sale. Le bolle nei ponti di sale aumentano la resistenza elettrica e quindi la corrente elettrica prevista non può essere raggiunta. Dopo l'iniezione di agarosio, è importante attendere che l'agarosio si raffredda e si solidifidi a temperatura ambiente per 10-20 minuti per prevenire la formazione di detriti di agarosio solidificati nella regione di coltura cellulare.
Il chip MOE è posizionato su un riscaldatore ITO bloccato su uno stadio motorizzato X-Y-Z programmabile. L'intero sistema è costruito su un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di una fotocamera digitale per monitorare la differenziazione cellulare all'interno delle regioni di coltura cellulare nel chip. È conveniente osservare la morfologia cellulare e l'acquisizione delle immagini automatiche time-lapse nel sistema microfluidico MOE all'esterno di un incubatore. Questo sistema microfluidico non solo riduce i tempi sperimentali richiesti, ma aumenta anche l'accuratezza del controllo sul microambiente.
Le cellule mNPC crescono come sospensione nei mezzi di coltura. Tuttavia, gli mNPC aderenti alla piastra rivestita in PLL nel chip MOE sono fondamentali per la differenziazione. Le neurosfere formate da 30-40 cellule sono preferite per iniziare la differenziazione mNPC. La crescita troppo degli MNPC comprometterà la sopravvivenza cellulare durante il processo di differenziazione. Inoltre, dopo la stimolazione CC pulsata, la colorazione immunofluorescenza sperimentale può essere influenzata dalla portata. Quindi, utilizzare diverse portate per diversi passaggi per evitare di staccare le cellule durante il lavaggio.
In questo studio, una limitazione di questa tecnica è che il chip MOE non può essere riutilizzato a causa della difficoltà di una pulizia accurata del chip. Tuttavia, il chip MOE può essere posizionato direttamente sotto un microscopio a contrasto di fase o un microscopio confocale a scansione. Il design a tenuta d'acqua del sistema microfluidico segnalato garantisce che non si verifichi un tampone/evaporazione media, mantenendo l'accurata concentrazione del tampone/mezzo e le corrispondenti proprietà elettriche. Riducendo i volumi di reagenti e il corrispondente tempo di funzionamento, il sistema microfluidico MOE fornisce un approccio efficiente per studiare la differenziazione cellulare.
Uno studio precedente ha dimostrato che EGF e bFGF promuovono la sopravvivenza, l'espansione e la manutenzione degli NPC nello stato indifferenziato4. In questo studio, gli impulsi CC hanno indotto la differenziazione degli mNPC nel mezzo di manutenzione delle cellule staminali che conteneva EGF e bFGF. Studi precedenti hanno riferito che EF promuove la differenziazione dei PNG in neuroni e/o astrociti nel mezzo di differenziazione senza EGF e bFGF14,21,22. Questi risultati mostrano che gli mNPC si differenziarono in neuroni, astrociti e oligodendrociti dopo la stimolazione dell'impulso CC. Suggeriscono anche che un semplice trattamento a impulsi CC potrebbe controllare il destino dei PNG. Con un'ulteriore ottimizzazione del tempo di stimolazione, della forza EF o del duty cycle, gli impulsi CC possono essere applicati per manipolare la differenziazione NPC e possono essere utilizzati per lo sviluppo di strategie terapeutiche che impiegano NPC per trattare i disturbi del sistema nervoso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il professor Tang K. Tang, Istituto di Scienze Biomediche, Academia Sinica, per la sua assistenza nella fornitura di cellule staminali neurali del topo e progenitrici (mNPC). Gli autori ringraziano anche il professor Tang K. Tang e la signora Ying-Shan Lee, per la loro preziosa discussione sulla differenziazione degli MNPC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
References
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
- Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
- Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
- Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
- Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
- Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
- Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
- Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
- Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
- Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
- Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
- Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
- Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
- AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
- Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).
