Summary
在这项研究中，我们提出了一个单纯由微流系统中直接电流（DC）脉冲刺激诱导的神经干细胞和祖细胞（NPC）分化的协议。
Abstract
生理电场 （EF） 在细胞迁移、分化、分裂和死亡中起着至关重要的作用。本文描述了一个利用显微镜进行长期细胞分化研究的微流体细胞培养系统。微流体系统由以下主要部件组成：光学透明电控芯片、透明钛-锡氧化物 （ITO） 加热器、培养物介质灌装泵、电源、高频功率放大器、EF 多路复用器、可编程 X-Y-Z 电动舞台以及配备数码相机的倒相对比显微镜。微流体系统有利于简化整体实验设置，进而有利于试剂和样品的消耗。这项工作涉及由直接电流（DC）脉冲刺激诱导的神经干细胞和祖细胞（NPC）的分化。在干细胞维持介质中，小鼠NC（mNPC）在直流脉冲刺激后分化成神经元、星形细胞和寡头细胞。结果表明，简单的直流脉冲治疗可以控制mNPC的命运，并可用于开发神经系统疾病的治疗策略。该系统可用于多渠道的细胞培养、长期EF刺激、细胞形态观测和自动延时图像采集。这种微流体系统不仅缩短了所需的实验时间，而且提高了微环境控制的准确性。
Introduction
神经前体细胞（NPC，也称为神经干细胞和祖细胞）可以作为神经退行性治疗策略1的有希望的候选人。未分化的NPC具有自我更新能力、多能性和增殖能力2、3。先前的一项研究曾报道说，细胞外基质和分子介质调节NPC的分化。表皮生长因子（EGF）和基本成纤维细胞生长因子（bFGF）促进NPC增殖，从而保持无差别状态4。
先前的研究曾报道，电刺激可以调节细胞生理活动，如第5分区、迁移6、7、8、分化1、9、10和细胞死亡11。电场在中枢神经系统发育和再生中起着至关重要的作用。从2009年至2019年，该实验室调查了EF在微流体系统1、6、7、8、15、16、17中应用的细胞反应。多通道、光学透明、电触电 （MOE） 芯片设计用于免疫荧光染色，用于共焦显微镜。该芯片具有较高的光学透明度和良好的耐用性，允许在一项研究中同时进行三次独立的刺激实验和若干免疫受污染条件。微流体系统有利于简化整体实验设置，进而有利于试剂和样品的消耗。本文描述了用于长期细胞分化研究的微流体细胞培养系统的发展。
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Protocol
1. MOE 芯片的设计和制造
- 使用适当的软件（图1A，材料表）绘制单个聚甲基甲基酸酯（PMMA）层和双面胶带的图案。用 CO2 激光机抄写机（图 1B）切割 PMMA 板材和双面胶带。
- 打开 CO2 激光抄写机并将其连接到个人计算机。使用软件打开设计模式文件。
- 将 PMMA 板（275 mm x 400 mm）或双面胶带（210 mm x 297 mm）放在激光抄写机平台上（图 2A）。使用自动对焦工具将激光对焦到 PMMA 板材或双面胶带的表面。
- 选择激光抄写机作为打印机，然后使用激光抄写机"打印"图案，在 PMMA 板或双面胶带上启动直接消融，并在 PMMA 纸张或磁带上获取单个图案（图2B）。
- 从 PMMA 片中取出保护膜，使用氮气清洁表面。
注：PMMA模式的绘制和PMMA表的直接加工是根据先前的报告17进行的。 - 为了将多层 PMMA 表粘合在一起，将三块 1 mm PMMA 纸（第 1 层、第 2 层和第 3 层）粘合在热粘合器中，在 110 °C 下粘合 30 分钟，形成流量/电刺激通道组件（图 2C）。
注：不同批次的商业获得PMMA表有略有不同的玻璃过渡温度（Tg）。最佳粘合温度需要在 Tg 附近的 5 °C 增量下进行测试。 - 用速效氰酸酯胶粘附在 MOE 芯片组件第 1 层的单独开口中，将 12 件适配器粘附在单独的开口上。
注：适配器由PMMA通过注射成型制成。底部的平面用于连接到 MOE 芯片。承载 1/4W-28 女性螺丝线的适配器用于连接白色手指紧插头、平底连接器或 Luer 适配器。使用速效氰酸酯胶时要小心。避免溅入眼睛。 - 使用紫外线 （UV） 辐照对 1 mm PMMA 基板（第 1-3 层）、双面胶带（第 4 层）和 3 毫米光学级 PMMA（第 5 层）进行消毒 30 分钟，然后组装芯片（图 1A）。
- 将 1 mm PMMA 基板（第 1-3 层）与双面胶带（第 4 层）一起粘附在 3 毫米光学级 PMMA （第 5 层）上，以完成 PMMA 组件（图 1-5）（图 1A）。
- 为芯片上的装配准备干净的盖玻璃。
- 将洗涤剂稀释十倍于染色罐（见 材料表），然后使用超声波清洁剂清洁该洗涤剂中的盖玻璃15分钟。
- 彻底冲洗自来水下的染色罐，去除洗涤剂的所有痕迹。
- 继续用蒸馏水冲洗，去除所有自来水的痕迹，并重复步骤1.7.2两次。
- 用氮气吹干清洁的盖玻璃。
- 在组装芯片（图 1A）之前，使用紫外线照射对 PMMA 组件（第 1-5 层）、双面胶带（第 6 层）和盖玻璃（第 7 层）进行消毒。
- 将清洁盖玻璃（第 7 层）与双面胶带（第 6 层）（图 1A） 粘附到 PMMA 组件（第1-5层）上。
- 在真空室中连夜孵化 MOE 芯片;使用教育部芯片组件进行后续程序（图3）。
2. 在细胞培养区域的基板上涂层聚 L-lysine （PLL）
- 准备聚二甲苯管、平底连接器、锥形连接器、锥体适配器、白色手指紧插头（也称为塞子）、Luer适配器、Luer锁注射器和黑色橡胶栓（图4A，材料表）。在 121 °C 的高压灭菌器中对上述所有部件进行消毒，30 分钟。
- 用白色手指紧插头密封阿加桥适配器（图1A）的开口。通过介质入口和插座适配器（图 4B）将平底连接器连接到 MOE 芯片组件。将锥-卢尔适配器连接到三向塞孔。
- 使用连接到介质入口的 3mL 注射器添加 2 mL 的 0.01% PLL 解决方案（图 4B
- ）。 - 将空的 3 mL 注射器连接到介质插座的 3 路停止孔（图 4B-
）。 - 用 PLL 解决方案填充细胞培养区域。手动泵送涂层溶液来回缓慢。关闭两个三向停止孔，以密封文化区域内的解决方案。
- 在充满 5% CO2 大气的孵化器中，在 37 °C 的夜间孵化 MOE 芯片。
- ）。
）。3. 盐桥网的筹备工作
- 继步骤 2.6 之后，打开两个 3 向止损孔，使用两个注射器手动泵送通道中的涂层溶液，冲走通道中的气泡。
- 绘制 3 毫升的完整介质（干细胞维护介质，由杜尔贝科的改良鹰介质/哈姆的营养混合物 F-12 （DMEM/F12） 组成），2% B-27 补充， 20 ng/mL EGF 和 20 ng/mL bFGF 进入 3 mL 注射器，连接到介质入口的 3 路塞孔（图 4B- 图 4B - 图 4B
）。 - 添加 3 mL 的完整介质，以取代细胞培养区域的涂层解决方案。将空的 5 mL 注射器连接到介质插座的 3 路停止孔（图 4B-
）。 - 准备盐桥网络（图5）。
- 切开黑色橡胶袋以产生间隙，并通过黑色橡胶袋插入银（Ag）/银氯化物 （AgCl） 电极，并插入 Luer 锁注射器（图 4A）。
- 用 Luer 适配器更换白色手指紧闭插头，并注入 3% 的热糖来填充 Luer 适配器。
注意：为准备热糖，在100mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中溶解3克蔗糖粉，在121°C的高压灭菌器中消毒30分钟。 - 将卢尔锁注射器连接到卢尔适配器。通过黑色橡胶袋注射3%的热糖，用针头填充Luer锁注射器。允许10至20分钟，使糖冷却和凝固。
注：为了增加蔗糖的体积容量，Luer锁注射器安装在Luer适配器上（图4 和 图5）。然后，将大电极插入 Luer 锁注射器中。电极能够为长期实验提供稳定的电刺激。
）。
）。4. 筹备跨国公司
- 在充满 5% CO2 大气的孵化器中，在 37 °C 的 25T 细胞培养瓶中将 mNPC1 培养成完整的介质。每3-4天对细胞进行一次亚培养，对从原始来源经过3-8段的细胞进行所有实验。
- 将细胞悬架转移到 15 mL 圆锥管中，以 100 × g 的速度旋转神经球 5 分钟。吸气超自然，用 1x 杜尔贝科的 PBS （DPBS） 清洗神经球。在 100 × g 下旋转神经球 5 分钟。
- 吸气1倍DPBS，然后在完整的介质中恢复神经球。彻底而温和地混合。
- 使用连接到插座的 3 路塞孔的 1 mL 注射器添加 1 mL 的神经圈悬架（图 4B- ）。
5. 设置直流脉冲刺激微流体系统 （图6）
- 将细胞种子 MOE 芯片安装到透明 ITO 加热器上，该加热器固定在可编程 X-Y-Z 电动化阶段。
注：ITO 表面温度由比例积分衍生控制器控制，并保持在 37 °C。 芯片和 ITO 加热器之间夹紧 K 型热电偶，以监测芯片内细胞培养区域的温度。MOE 芯片安装在可编程 X-Y-Z 电动化阶段，适用于各个通道部分的自动延时图像采集。ITO加热器的制造和细胞培养加热系统的设置，已经描述过之前18，19。 - 通过中等插座手动泵入 MOE 芯片，注入 mNPC。在 37 °C ITO 加热器上孵化细胞种子 MOE 芯片 4 小时。
- 4 小时后，使用注射器泵将整个介质通过 MOE 芯片通过介质入口泵送至 20 μL/h 的流量。
注意：mNPC 在 EF 刺激之前在芯片中生长和维护 24 小时，以允许细胞附着和生长。废液收集在一个空的5mL注射器连接到出口的三向塞，显示为"废物"图 6A。教育部微流体系统配置见 图6。这种微流体系统为细胞提供持续的营养供应。完整的新鲜介质不断泵入MOE芯片，以保持恒定的pH值。因此，细胞可以在二氧化碳 孵化器外培养。 - 使用电线通过芯片上的 Ag/AgCl 电极将 EF 多路复用器连接到 MOE 芯片。将 EF 多路复用器和功能发生器连接到放大器，以 50% 的负荷周期（50% 的上时间和 50% 的超时）（图 6B）以 100 Hz 的频率输出面积为 300 mV/mm 的方波直流脉冲。
- 将电线连接到 EF 多路复用器。通过 Ag/AgCl 电极将电线连接到 MOE 芯片。
- 使用电线将 EF 多路复用器连接到放大器。将功能生成器连接到放大器和数字示波器。
注：EF多路复用器是一个电路，包括电路中文化室的阻抗，并在平行电子网络中连接所有单个腔室。三个培养室中的每一个都以串行方式连接到多路复用器中的可变电阻器 （Vr） 和 ammeter（图 6A中的 μA）。通过每个培养室的电流通过控制 Vr 而变化，电流显示在相应的 ammet 上。每个细胞培养区域的电场强度由 Ohm 定律 I= σEA计算，我是电流，σ（DMEM/F12 20 设置为 1.38S_m-1）是培养介质的导电性，E 是电场，A 是电控室的横截面区域。对于图 1中显示的细胞培养区域维度，直流和直流脉冲的电流分别为 +87 mA 和 +44 mA，工作周期为 50%。
- 将 mNPC 按 100 Hz 的频率对方直流脉冲进行 300 mV/mm 的方形直流脉冲，频率为 48h。以 10μL/h 的速度连续泵送整个介质，为细胞提供充足的营养，并在介质中保持恒定的 pH 值。
6. 脉冲直流刺激后对 mNPC 的免疫荧光检测
注意：在此步骤中，所有试剂均通过中等入口使用注射器泵泵送。
- 在播种1后，在体外（DIV）培养3、7或14天后，以25μL/min的流速用1倍PBS清洗细胞20分钟。
- 用4%的副甲醛（PFA）修复细胞。以 25μL/min 的流速将 4% PFA 泵入芯片，20 分钟以取代 1 倍 PBS。要更换 4% PFA，用 1 倍 PBS 清洗电池，流速为 25μL/min，20 分钟。
- 以 50μL/min 的流速将 0.1% 的 Triton X-100 泵入芯片中，6 分钟以渗透细胞。将流速降低到 50 μL/h，再延长 30 分钟，以便与细胞做出反应。要更换 0.1% 的 Triton X-100，以 50μL/min 的流速洗涤电池 6 分钟。
- 用含有 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 的 PBS 阻断细胞，以减少非特异性抗体结合。以 50μL/min 的流速泵入芯片 1% BSA，6 分钟。将流速降低到 100 μL/h，泵降低 1 小时。
- 以 50μL/min 的流速泵送抗体，在 6 分钟内将双免疫沉着的抗体泵入芯片，并在 4 °C 下孵育芯片 18 小时。 以 50μL/min 的流速用 1 倍 PBS 清洗细胞 15 分钟。
- 以 50μL/min 的流速泵送 Alexa 氟共生的二次抗体到芯片中 6 分钟。将流速降低到 50 μL/h，并在黑暗中的室温下泵送抗体 1 小时。以 50μL/min 的流速用 1 倍 PBS 清洗细胞 15 分钟。
- 对于核染色，在黑暗中的室温下，以 20μL/min 的流速将 Hoechst 33342 泵入芯片，持续 10 分钟。以 50μL/min 的流速用 1 倍 PBS 清洗细胞 15 分钟。
- 免疫染色后，使用共聚焦荧光显微镜观察细胞。
7. 图像分析和数据处理
- 使用内置测量工具的软件分析荧光图像（参见 材料表）。
- 比较控制和治疗组中受霍赫斯特计数器控制的细胞核（细胞总数），并计算表达每个表型标记的细胞百分比。
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Representative Results
MOE芯片的详细配置显示在 图1中。微流体芯片为减少实验设置尺寸、样品体积和试剂体积提供了有益的方法。MOE芯片设计用于在一项研究中同时进行三个独立的EF刺激实验和几个免疫染色条件（图3）。此外，光学透明度高的MOE芯片也适合共焦显微镜检查。MOE芯片还设计用于在单个实验中同时研究不同细胞培养条件（例如，多个EF刺激、多种药物、不同涂层基板、多系列细胞）的影响。
mNPC 暴露于方波直流脉冲（频率为 100 Hz 的 300 mV/mm 级）。直流脉冲刺激进行了48小时。分化细胞被免疫，包括Tuj1（神经元特异性III类β-图布林）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP识别星形细胞）和寡头细胞标记物O4。直流脉冲治疗后，mNPC在DIV 7中表示神经元（Tuj1+细胞）数量显著增加。在DIV 3中，刺激组中的星形细胞（GFAP+细胞）水平相对高于对照组（CTL）。与CTL组相比，在DIV 7和DIV 14（图7）的刺激组中寡头细胞（O4+细胞）显著较高。这些结果表明，直流脉冲刺激导致mNPC在干细胞维持介质中同时分化成神经元、星形细胞和寡头细胞。这些结果表明，教育部微流体系统适合通过显微镜进行长期细胞分化研究。
图1：多通道光学透明电触芯片的详细配置。 MOE 芯片由 PMMA 板材（50 mm x 25 mm x 1 mm）、双面胶带（50 mm x 25 mm x 0.07 mm）、适配器（10 mm x 10 mm x 6 mm 组成 光学级 PMMA 片（50 mm x 75 mm x 3 mm）、双面胶带（24 mm x 60 mm x 0.07 mm）和盖玻璃（24 毫米× 60 毫米）。教育部芯片中有三个细胞培养室。MOE 芯片为介质入口/出口和阿加盐桥连接孔。细胞在细胞培养区培养（宽度3毫米×长42毫米×高0.07毫米）。图1A已由张等人修改为6。（B） 由适配器、PMMA 纸张、双面胶带和盖玻璃组成的 MOE 芯片的照片。缩写：教育部=多通道光学透明电触电：PMMA=聚甲基甲基丙烯酸酯。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：MOE芯片的制造和组装工艺 。 （A） PMMA 板材或双面胶带的设计图案是使用激光微加工制造的。（B） 单个 PMMA 表被二氧化碳 激光抄写机切割。（C） 清洁的 PMMA 表的多层由热粘合器粘合在一起。缩写：教育部=多通道光学透明电触电：PMMA=聚甲基甲基酸酯;二氧化碳2= 二氧化碳。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：教育部芯片的照片。 这个数字已经从张等人6修改。缩写：MOE=多通道光学透明电触电。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：与教育部芯片的中电连接 。 （A） 拍摄教育部微流系统中流网和 EF 网络的组件，包括 PTFE 管、平底连接器、锥形连接器、锥形-Luer 适配器、白色手指紧插头、Luer 适配器、Luer 锁注射器、黑色橡胶块和 Ag/AgCl 电极。（B） 中流网络配置的照片。缩写：教育部=多通道光学透明电触电：EF =电场;PTFE = 聚特氟乙烯;农业=银;阿格克=氯化银。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：一张在显微镜上显示教育部芯片的照片。 缩写：教育部=多通道光学透明电触电：农业=银;阿格克=氯化银;ITO = 氧化钠。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：用于直流脉冲刺激的配置和系统。 （A） 整个系统的配置用于直流脉冲刺激。与MOE芯片相连的注射器用于中等输液和废物排泄。芯片中的直流脉冲由通过Ag/AgCl电极进行的电源提供。设备设置安装在配备数码相机的倒相对比显微镜的 X-Y-Z 电动化阶段。（B） 一张显示实验室长凳上设置的照片。缩写：教育部=多通道光学透明电触电：农业=银;阿格克=氯化银;ITO = 氧化钛;EF=电场。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：在对照组（CTL）和DIV 3、7和14的直流脉冲刺激组中区分mNPC细胞。刺激（DC脉冲）组中神经元（Tuj1+细胞）、星形细胞（GFAP+细胞）和寡头细胞（O4+细胞）的百分比（A-C）和（D-F）中的百分比。这个数字已经由张等人出版。缩写：CTL：控制：直流=直流电：Tuj1 = 神经元特异性 III 类β图布林;GFAP = 胶质纤维酸性蛋白质;O4=寡头细胞标记O4。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在制造 MOE 芯片时，适配器将连接到 MOE 芯片的 1 层，并带有速效氰酸酯胶水。胶水涂在适配器的 4 个角上，然后均匀地施加在适配器上。必须避免胶水过量，以确保胶水完全聚合。此外，已完成的 MOE 芯片组件在真空室中孵育。此步骤有助于消除 PMMA 层、双面胶带和盖玻璃之间的气泡。
电极材料的选择是基于这样一个事实，即氯化物离子，这是丰富的存在于中等，是电解产品流经细胞培养区。在 EF 刺激实验中，电极周围的 pH 保持恒定。使用铂 （Pt） 作为电极材料的更简单配置电解水，并在正极和负极分别产生氢离子 （H+）和氢氧化物离子 （OH-），从而在培养区域引起 pH 值变化。避免使用Pt电极可避免在EF刺激实验中规避pH变化问题。
在盐桥网的准备过程中，热糖和无泡沫的糖是必不可少的。热糖具有较高的流动性，可以很容易地注入盐桥网络。将 3% 的热阿加罗斯注射到 Luer 适配器后，将 Luer 锁注射器连接到 Luer 适配器。在这一步骤中，将将蔗糖推入 Luer 锁注射器，从而实现盐桥网络的无气泡牢固连接。盐桥上的气泡增加了电阻，因此无法达到预期的电流。在阿加罗斯注射后，重要的是等待糖在室温下冷却和凝固10-20分钟，以防止在细胞培养区形成凝固的糖体碎片。
MOE 芯片被放置在 ITO 加热器上，该加热器锁定在可编程的 X-Y-Z 电动舞台上。整个系统建在一个倒相对比显微镜上，配备了数码相机来监控芯片细胞培养区域内的细胞分化。在孵化器外的教育部微流体系统中观察细胞形态和获取自动延时图像是很方便的。这种微流体系统不仅缩短了所需的实验时间，而且提高了微环境控制的准确性。
mNPC细胞作为培养介质中的暂停而生长。但是，MNPC 粘附在 MOE 芯片中的 PLL 涂层板对分化至关重要。由30-40个细胞形成的神经球是启动mNPC分化的首选。在分化过程中，mNPC的过度生长会损害细胞的生存。此外，脉冲直流刺激后，免疫荧光染色实验可受流速影响。因此，使用多个流速为不同的步骤，以避免在洗涤过程中分离细胞。
在这项研究中，这种技术的一个局限性是，由于芯片的彻底清洗困难，MOE芯片无法重复使用。但是，MOE 芯片可以直接放置在相对比显微镜或扫描共焦显微镜下。报告微流体系统的防水设计可确保不发生缓冲/中度蒸发，保持缓冲/中等的准确浓度和相应的电气特性。通过减少试剂体积和相应的运行时间，教育部微流体系统为研究细胞分化提供了有效的方法。
此前的研究表明，EGF和bFGF促进NPC在无差别状态下的生存、扩张和维护。在这项研究中，直流脉冲诱导了含有EGF和bFGF的干细胞维持介质中mNPC的分化。先前的研究曾报告说，EF在没有EGF和bFGF14、21、22的分化介质中促进NPC分化成神经元和/或星形细胞。这些结果表明，在直流脉冲刺激后，mNPC分化成神经元、星形细胞和寡头细胞。他们还建议，简单的直流脉冲治疗可以控制NPC的命运。随着刺激时间、EF强度或工作周期的进一步优化，直流脉冲可用于操纵 NPC 分化，并可用于开发利用 NPC 治疗神经系统疾病的治疗策略。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢西尼卡学院生物医学研究所的唐K.唐教授在提供小鼠神经干细胞和祖细胞（mNPC）方面的帮助。作者还感谢唐克唐教授和李英山女士就跨国公司的区别化问题进行了宝贵的讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
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