Summary
I denne studien presenterer vi en protokoll for differensiering av nevrale stamme- og stamceller (NPCer) utelukkende indusert av likestrømspulsstimulering i et mikrofluidisk system.
Abstract
Fysiologiske elektriske felt (EF) spiller viktige roller i cellemigrasjon, differensiering, divisjon og død. Dette dokumentet beskriver et mikrofluidisk cellekultursystem som ble brukt til en langsiktig celledifferensieringsstudie ved hjelp av mikroskopi. Det mikrofluidiske systemet består av følgende hovedkomponenter: en optisk gjennomsiktig elektrotaktisk brikke, en gjennomsiktig indium-tinn-oksid (ITO) varmeapparat, en kulturmediefyllende pumpe, en elektrisk strømforsyning, en høyfrekvent effektforsterker, en EF multiplexer, et programmerbart X-Y-Z motorisert stadium og et invertert fasekontrastmikroskop utstyrt med et digitalt kamera. Det mikrofluidiske systemet er gunstig for å forenkle det generelle eksperimentelle oppsettet og i sin tur reagens- og prøveforbruket. Dette arbeidet innebærer differensiering av nevrale stamme- og stamceller (NPCer) indusert av likestrøm (DC) pulsstimulering. I stamcellevedlikeholdsmediet differensierte musens NPCer (mNPCer) til nevroner, astrocytter og oligodendrocytter etter DC-pulsstimuleringen. Resultatene tyder på at enkel DC puls behandling kan kontrollere skjebnen til mNPCs og kan brukes til å utvikle terapeutiske strategier for nervesystemet lidelser. Systemet kan brukes til cellekultur i flere kanaler, for langsiktig EF-stimulering, for cellemorfologiske observasjoner og for automatisk tidsforløpbildeanskaffelse. Dette mikrofluidiske systemet forkorter ikke bare den nødvendige eksperimentelle tiden, men øker også nøyaktigheten av kontroll på mikromiljøet.
Introduction
Nevrale forløperceller (NPCer, også kjent som nevrale stamme- og stamceller) kan være en lovende kandidat for nevrodegenerativ terapeutisk strategi1. De udifferensierte NPCene har selvfornyelseskapasitet, multistyrke og proliferativ evne2,3. En tidligere studie har rapportert at den ekstracellulære matrisen og molekylære mediatorer regulerer differensiering av NPC. Den epidermale vekstfaktoren (EGF) og grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF) fremmer NPC-spredning, og opprettholder dermed den uavklarte tilstanden4.
Tidligere studier har rapportert at elektrisk stimulering kan regulere cellefysiologiske aktiviteter som divisjon5, migrasjon6,7,8, differensiering1,9,10og celledød11. Elektriske felt (EFs) spiller viktige roller i utviklingen og regenereringen av sentralnervesystemet utvikling12,13,14. Fra 2009 til 2019 har dette laboratoriet undersøkt cellulære responser på anvendelsen av EF i det mikrofluidiske systemet1,6,7,8,15,16,17. En flerkanals, optisk gjennomsiktig, elektrotaktisk (MOE) brikke ble designet for å være egnet for immunfluorescensfarging for konfokal mikroskopi. Brikken hadde høy optisk gjennomsiktighet og god holdbarhet og tillot samtidig gjennomføring av tre uavhengige stimuleringsforsøk og flere immunosterte forhold i en enkelt studie. Det mikrofluidiske systemet er gunstig for å forenkle det generelle eksperimentelle oppsettet og i sin tur reagens- og prøveforbruket. Denne artikkelen beskriver utviklingen av et mikrofluidisk cellekultursystem som ble brukt til en langsiktig celledifferensieringsstudie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Design og fabrikasjon av MOE-brikken
- Tegn mønstre for individuelle PMMA-lag (polymetylmetakrylat) og dobbeltsidig tape ved hjelp av passende programvare (Figur 1A, Materialfortegnelse). Klipp både PMMA-arkene og det dobbeltsidige båndet med en CO2-lasermaskinskriver ( figur1B).
- Slå på CO 2-laserskriveren og koble den til en personlig datamaskin. Åpne den utformede mønsterfilen ved hjelp av programvaren.
- Plasser PMMA-arkene (275 mm x 400 mm) eller dobbeltsidig tape (210 mm x 297 mm) på plattformen til laserskriveren (Figur 2A). Fokuser laseren på overflaten av PMMA-arkene eller det dobbeltsidige båndet ved hjelp av autofokusverktøyet.
- Velg laserskriveren som skriver, og "skriv ut" mønsteret ved hjelp av laserskriveren for å starte direkte ablasjon på PMMA-arket eller dobbeltsidig tape og få individuelle mønstre på PMMA-arket eller båndet (Figur 2B).
- Fjern beskyttelsesfilmen fra PMMA-arkene, og rengjør overflaten ved hjelp av nitrogengass.
MERK: Tegningen av PMMA-mønsteret og direkte maskinering av PMMA-arket ble utført i henhold til en tidligere rapport17. - For å binde sammen flere lag pmma ark, stable tre stykker av 1 mm PMMA ark (lag 1, 2 og 3), og binde dem under et trykk på 5 kg /cm2 i en termisk bonder i 30 min ved 110 °C for å danne strømning / elektrisk stimulering kanal montering (Figur 2C).
MERK: Ulike partier med kommersielt oppnådd PMMA-ark har litt forskjellig glassovergangstemperatur (Tg). Den optimale bindingstemperaturen må testes ved trinn på 5 °C nær Tg. - Fest 12 adapterstykker til de enkelte åpningene i lag 1 på MOE-sponenheten med hurtigvirkende cyanoacrylatlim.
MERK: Adapterne er laget av PMMA ved sprøytestøping. De flate overflatene nederst er for tilkobling til MOE-brikken. Adapterlageret 1/4W-28 hunnskruegjenge er for tilkobling av hvite fingertette plugger, flate bunnkontakter eller Luer-adaptere. Vær forsiktig når du bruker hurtigvirkende cyanoacrylatlim. Unngå å plaske inn i øynene. - Desinfiser 1 mm PMMA-substratene (lag 1-3), det tosidige båndet (lag 4) og PMMA i optisk kvalitet (lag 5) ved hjelp av ultrafiolett (UV) bestråling i 30 minutter før du monterer brikken (figur 1A).
- Fest PMMA-substratene på 1 mm (lag 1-3) på PMMA i 3 mm optisk klasse (lag 5) med det tosidige båndet (lag 4) for å fullføre PMMA-enheten (lag 1-5) (figur 1A).
- Forbered det rene dekselglasset til monteringen på brikken.
- Fyll en ti ganger fortynning av vaskemiddelet i en fargekanne (se materialbordet), og rengjør dekselglasset i dette vaskemiddelet ved hjelp av en ultralydrenser i 15 minutter.
- Skyll fargingskannen grundig under rennende vann fra springen for å fjerne alle spor av vaskemiddelet.
- Fortsett skyllingen med destillert vann for å fjerne alle spor av vann fra springen, og gjenta trinn 1.7.2 to ganger.
- Tørk det rensede dekkglasset ved å blåse det med nitrogengass.
- Desinfiser PMMA-enheten (lag 1-5), det dobbeltsidige båndet (lag 6) og dekkglasset (lag 7) ved hjelp av UV-bestråling inne i et biosikkerhetsskap i 30 minutter før du monterer brikken (Figur 1A).
- Fest det rensede dekkglasset (lag 7) til PMMA-enheten (lag 1-5) med det tosidige båndet (lag 6) (figur 1A).
- Inkuber MOE-brikken i et vakuumkammer over natten; bruk MOE-brikkeenheten til senere prosedyrer (figur 3).
2. Belegg poly-L-lysin (PLL) på substratet i cellekulturregionene
- Forbered polytetrafluoretylenrøret, flatbunnskontakten, kjeglekontakten, kjegle-Luer-adapteren, den hvite fingertette pluggen (også kalt propp), Luer-adapter, Luer-låsesprøyte og svart gummislynge (Figur 4A, Materialbord). Steriliser alle de ovennevnte komponentene i en autoklav ved 121 °C i 30 minutter.
- Forsegle åpningene på agarbroadapterne (figur 1A) med de hvite fingertette pluggene. Koble den flate bunnkontakten til MOE-sponenheten via medieinntaket og utløpsadapterne (figur 4B). Koble cone-Luer-adapteren til 3-veis stoppekraner.
- Tilsett 2 ml 0,01 % PLL-oppløsning ved hjelp av en 3 ml sprøyte som kobles til 3-veis stoppekranen på medieinntaket (Figur 4B-
). - Koble en tom 3 ml sprøyte til 3-veis stoppekranen på medieuttaket (Figur 4B-
). - Fyll cellekulturområdene med PLL-løsningen. Pump beleggløsningen langsomt frem og tilbake manuelt. Lukk de to 3-veis stoppekranene for å forsegle løsningen inne i kulturregionene.
- Inkuber MOE-brikken ved 37 °C over natten i en inkubator fylt med 5 % CO2-atmosfære.
).
).3. Tilberedning av saltbronettverket
- Etter trinn 2.6 åpner du de to 3-veis stoppekranene og skyller bort boblene i kanalene ved å pumpe beleggløsningen manuelt frem og tilbake i kanalen ved hjelp av de to sprøytene.
- Tegn 3 ml komplett medium (stamcellevedlikeholdsmedium som består av Dulbeccos modifiserte Eagles medium/Skinls næringsblanding F-12 (DMEM/F12), 2 % B-27 supplement, 20 ng/ml EGF og 20 ng/ml bFGF) i en 3 ml sprøyte som kobles til 3-veis stoppekranen på medieinntaket (Figur 4B- og Figur 4B-
). - Tilsett 3 ml komplett medium for å erstatte beleggløsningen i cellekulturregionene. Koble en tom 5 ml sprøyte til 3-veis stoppekranen på medieuttaket (Figur 4B-
). - Klargjøre saltbronettverket (Figur 5).
- Klipp den svarte gummiflekken for å lage et mellomrom, og sett inn elektrodene i sølv (Ag)/sølvklorid (AgCl) gjennom den svarte gummislyden og inn i Luer-låsesprøyten (Figur 4A).
- Sett på plass den hvite fingertette pluggen med Luer-adapteren, og injiser 3 % varm agarose for å fylle Luer-adapteren.
MERK: For fremstilling av den varme agarose, oppløs 3 g agarosepulver i 100 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og steriliser i en autoklav ved 121 °C i 30 minutter. - Koble Luer-låsesprøyten til Luer-adapteren. Injiser 3% varm agarose gjennom den svarte gummismungen for å fylle Luer-låsesprøyten ved hjelp av sprøyten med kanyle. La det avkjøles i 10 til 20 minutter før agaroseen avkjøles og størkner.
MERK: For å øke volumkapasiteten til agarose, monteres Luer-låsesprøyten på Luer-adapteren (figur 4 og figur 5). Deretter settes de store elektrodene inn i Luer-låsesprøyten. Elektroden er i stand til å gi en stabil elektrisk stimulering for det langsiktige eksperimentet.
).
).4. Utarbeidelse av mNPCer
- Kultur mNPCs1 i hele mediet i en 25T cellekultur kolbe ved 37 °C i en inkubator fylt med 5% CO2 atmosfære. Subkulturer cellene hver 3-4 dager, og utfør alle eksperimenter med celler som har gjennomgått 3-8 passasjer fra den opprinnelige kilden.
- Overfør cellefjæringen til et 15 ml konisk rør, og spinn ned nevrosfærene ved 100 × g i 5 minutter. Aspirer supernatanten, og vask nevrosfærene med 1x Dulbeccos PBS (DPBS). Spin-down nevrosfærene på 100 × g i 5 min.
- Aspirer 1x DPBS og resuspend deretter nevrosfærene i hele mediet. Bland grundig og forsiktig.
- Tilsett 1 ml av nevrosfærens suspensjon ved hjelp av en 1 ml sprøyte som kobles til 3-veis stoppekranen på utløpet (Figur 4B- ).
5. Oppsett av det mikrofluidiske systemet for likestrømspulsstimulering (Figur 6)
- Monter den celleseedede MOE-brikken på den gjennomsiktige ITO-varmeren som er festet på et programmerbart X-Y-Z motorisert stadium.
MERK: ITO-overflatetemperaturen styres av en proporsjonal-integrert-derivatregulator og opprettholdes ved 37 °C. En K-type termokobling klemmes mellom brikken og ITO-varmeren for å overvåke temperaturen i cellekulturområdene i brikken. MOE-brikken er installert på et programmerbart X-Y-Z motorisert stadium og er egnet for automatisk tidsforløpbildeanskaffelse ved individuelle kanalseksjoner. Fabrikasjonen av ITO-varmeren og oppsettet av cellekulturvarmesystemet er beskrevet tidligere18,19. - Tilsett mNPCene ved manuell pumping inn i MOE-brikken via medieuttaket. Inkuber den celleseedede MOE-brikken på ITO-varmeren på 37 °C i 4 timer.
- Etter 4 timer pumper du hele mediet gjennom MOE-brikken via middels innløp med en strømningshastighet på 20 μL/t ved hjelp av en sprøytepumpe.
MERK: MNPCene dyrkes og vedlikeholdes i brikken i ytterligere 24 timer før EF-stimulering for å tillate cellefeste og vekst. Avfallsvæsken samles i en tom 5 ml sprøyte som er koblet til 3-veis stoppekranen på utløpet, vist som "avfall" i figur 6A. Moe mikrofluidisk systemkonfigurasjon vises i figur 6. Dette mikrofluidiske systemet gir en kontinuerlig tilførsel av ernæring til cellene. Det komplette friske mediet pumpes kontinuerlig inn i MOE-brikken for å opprettholde en konstant pH-verdi. Derfor kan cellene dyrkes utenfor en CO 2-inkubator. - Bruk elektriske ledninger til å koble en EF-multiplekser til MOE-brikken via Ag/AgCl-elektrodene på brikken. Koble en EF-multiplekser og en funksjonsgenerator til en forsterker for å sende dc-pulser med en størrelsesorden på 300 mV/mm med en frekvens på 100 Hz ved 50 % driftssykluser (50 % tid på og 50 % fritid) (Figur 6B).
- Koble de elektriske ledningene til EF-multiplekseren. Koble de elektriske ledningene til MOE-brikken via Ag/AgCl-elektrodene.
- Koble EF multiplekseren til forsterkeren ved hjelp av elektriske ledninger. Koble funksjonsgeneratoren til forsterkeren og det digitale oscilloskopet.
MERK: EF multiplexer er en krets som inkluderer impedansen til kulturkammeret i kretsen og forbinder alle individuelle kamre i et parallelt elektronisk nettverk. Hvert av de tre kulturkamrene er elektrisk koblet i serielt til en variabel motstand (Vr) og et ammeter (vist som μA i figur 6A) i multiplekseren. Den elektriske strømmen gjennom hvert kulturkammer er variert ved å kontrollere Vr, og strømmen vises på det tilsvarende ammeteret. Den elektriske feltstyrken i hver cellekulturregion ble beregnet av Ohms lov, I = σEA, hvor jeg er den elektriske strømmen, σ (satt som 1,38 S·m-1 for DMEM / F1220) er kulturmediets elektriske ledningsevne, E er det elektriske feltet, og A er tverrsnittsområdet til det elektrotaktiske kammeret. For cellekulturområdedimensjonen som vises i figur 1, er den elektriske strømmen ~ 87 mA og ~ 44 mA for henholdsvis DC- og DC-puls ved 50 % driftssyklus.
- Underkast mNPCene til firkantede DC-pulser med en størrelsesorden på 300 mV / mm ved frekvensen på 100 Hz i 48 timer. Pump hele mediet kontinuerlig med en hastighet på 10 μL / t for å levere tilstrekkelig ernæring til cellene og for å opprettholde en konstant pH-verdi i mediet.
6. Immunfluorescence analyser av mNPCs etter pulserende DC stimulering
MERK: I dette trinnet pumpes alt reagens via medieinntaket ved hjelp av en sprøytepumpe.
- Etter 3, 7 eller 14 dager in vitro (DIV) modning etter sådd1, vask cellene med 1x PBS med en strømningshastighet på 25 μL / min i 20 minutter.
- Fest cellene med 4% paraformaldehyd (PFA). Pump 4% PFA inn i brikken med en strømningshastighet på 25 μL / min i 20 minutter for å erstatte 1x PBS. For å erstatte 4% PFA, vask cellene med 1x PBS med en strømningshastighet på 25 μL / min i 20 minutter.
- Pump 0,1% Triton X-100 inn i brikken med en strømningshastighet på 50 μL / min i 6 min for å permeabilisere cellene. Reduser strømningshastigheten til 50 μL/t i ytterligere 30 minutter for å reagere med cellene. For å erstatte 0,1% Triton X-100, vask cellene med 1x PBS med en strømningshastighet på 50 μL / min i 6 minutter.
- Blokker cellene med PBS som inneholder 1% bovint serumalbumin (BSA) for å redusere ikke-spesifikk antistoffbinding. Pump 1% BSA inn i brikken med en strømningshastighet på 50 μL / min i 6 min. Reduser strømningshastigheten til 100 μL/t og pump i 1 time.
- Pump antistoffene for dobbel immunstaining inn i brikken med en strømningshastighet på 50 μL/ min i 6 min, og inkuber brikken i 18 timer ved 4 °C. Vask cellene med 1x PBS med en strømningshastighet på 50 μL/min i 15 min.
- Pump De Alexa Fluor-konjugiserte sekundære antistoffene inn i brikken med en strømningshastighet på 50 μL/min i 6 minutter. Reduser strømningshastigheten til 50 μL/t, og pump antistoffene i 1 time ved romtemperatur i mørket. Vask cellene med 1x PBS med en strømningshastighet på 50 μL/min i 15 min.
- For kjernefysisk farging pumper du Hoechst 33342 inn i brikken med en strømningshastighet på 20 μL/min i 10 minutter ved romtemperatur i mørket. Vask cellene med 1x PBS med en strømningshastighet på 50 μL/min i 15 min.
- Etter immunstaining, observere cellene ved hjelp av et konfokalt fluorescensmikroskop.
7. Bildeanalyse og databehandling
- Analyser de fluorescerende bildene ved hjelp av programvare med innebygde måleverktøy (se Materialtabellen).
- Sammenlign Hoechst-mottellerte kjerner (totalt antall celler) i kontroll- og behandlingsgruppene, og beregn prosentandelen celler som uttrykker hver fenotypiske markør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den detaljerte konfigurasjonen av MOE-brikken vises i figur 1. Den mikrofluidiske brikken gir en gunstig tilnærming for å redusere den eksperimentelle oppsettstørrelsen, prøvevolumet og reagensvolumet. MOE-brikken ble designet for å utføre tre uavhengige EF-stimuleringsforsøk og flere immundempende tilstander samtidig i en enkelt studie (figur 3). I tillegg er MOE-brikken, som har høy optisk gjennomsiktighet, egnet for konfokale mikroskopiundersøkelser. MOE-brikken er også designet for å undersøke effekten av forskjellige cellekulturforhold (f.eks. flere EF-stimulering, flere stoffer, forskjellige beleggssubstrat, flere serier av celler) samtidig i et enkelt eksperiment.
MNPCene ble eksponert for dc-pulser med kvadratisk bølge (størrelsesorden 300 mV/mm med en frekvens på 100 Hz). DC-pulsstimuleringen ble utført i 48 timer. De differensierte cellene ble immunostert med Tuj1 (nevronspesifikk klasse III β-tubulin), glial fibrillært surt protein (GFAP for å identifisere astrocytter) og oligodendrocyttmarkør O4. Etter DC-pulsbehandlingen uttrykte mNPCene betydelig høyt antall nevroner (Tuj1 + celler) ved DIV 7. Ved DIV 3 var astrocytter (GFAP+-celler) til stede på relativt høyere nivåer i stimuleringsgruppene enn i kontrollgruppen (CTL). Sammenlignet med CTL-gruppen var oligodendrocytter (O4+-celler) signifikant høyere i stimuleringsgruppen ved DIV 7 og DIV 14 (figur 7). Disse resultatene viser at DC-pulsstimuleringen resulterte i at mNPCer differensierer seg i nevroner, astrocytter og oligodendrocytter samtidig i stamcellevedlikeholdsmedium. Disse resultatene tyder på at MOE mikrofluidisk system er egnet for en langsiktig celledifferensieringsstudie ved mikroskopi.
Figur 1: Den detaljerte konfigurasjonen av flerkanals optisk gjennomsiktig elektrotaktisk brikke. (A) Eksplodert visning av MOE-brikkeenheten. MOE-brikken består av PMMA-ark (50 mm x 25 mm x 1 mm), dobbeltsidig tape (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), adaptere (10 mm x 10 mm x 6 mm), PMMA-ark av optisk klasse (50 mm x 75 mm x 3 mm), dobbeltsidig tape (24 mm x 60 mm x 0,07 mm) og et dekselglass (24 mm × 60 mm). Det er tre cellekulturkamre i MOE-brikken. MOE-brikken har koblingshull for middels innløp/utløp og agarsaltbroene. Celler ble dyrket i cellekulturområdet (bredde 3 mm x lengde 42 mm x høyde 0, 07 mm). Figur 1A er endret fra Chang et al.6. (B) Fotografi av MOE-brikken som består av adaptere, PMMA-ark, dobbeltsidig tape og dekkglass. Forkortelser: MOE = flerkanals optisk gjennomsiktig elektrotaktisk; PMMA = polymetylmetakrylat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fabrikasjons- og monteringsprosessene til MOE-brikken ( A) De utformede mønstrene til PMMA-arkene eller dobbeltsidig tape ble fremstilt ved hjelp av lasermikromaskinering. (B) De enkelte PMMA-arkene ble kuttet av en CO2-laserskriver. (C) De mange lagene i de rensede PMMA-arkene ble limt sammen av en termisk bonder. Forkortelser: MOE = flerkanals optisk gjennomsiktig elektrotaktisk; PMMA = polymetylmetakrylat; CO2 = karbondioksid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Et bilde av MOE-brikken. Denne figuren er endret fra Chang et al.6. Forkortelse: MOE = flerkanals optisk gjennomsiktig elektrotaktisk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Middels og elektrisk tilkobling til MOE-brikken ( A) Fotografi av komponentene for mellomstrømsnettet og EF-nettverket i MOE-mikrofluidisk system, inkludert PTFE-røret, flatbunnskontakten, kjeglekontakten, kjegle-Luer-adapteren, den hvite fingertette pluggen, Luer-adapteren, Luer-låsesprøyten, svart gummislyd og Ag/AgCl-elektrodene. (B) Fotografi av konfigurasjonen for mellomstrømsnettverket. Forkortelser: MOE = flerkanals optisk gjennomsiktig elektrotaktisk; EF = elektrisk felt; PTFE = polytetrafluoretylen; Ag = sølv; AgCl = sølvklorid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Et fotografi som viser MOE-brikken på et mikroskop. Forkortelser: MOE = flerkanals optisk gjennomsiktig elektrotaktisk; Ag = sølv; AgCl = sølvklorid; ITO = indium-tinnoksid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Konfigurasjonen og systemet som brukes til dc pulsstimulering. (A) Konfigurasjonen av hele systemet for DC pulsstimulering. Sprøytene som er koblet til MOE-brikken ble brukt til middels infusjon og avfallsutløp. LIKE-pulsen i brikken ble levert av en strømforsyning utført gjennom Ag/AgCl-elektrodene. Enhetsoppsettet ble installert på X-Y-Z motorisert stadium av et invertert fasekontrastmikroskop utstyrt med et digitalt kamera. (B) Et fotografi som viser oppsettet på en laboratoriebenk. Forkortelser: MOE = flerkanals optisk gjennomsiktig elektrotaktisk; Ag = sølv; AgCl = sølvklorid; ITO = indium-tinnoksid; EF = elektrisk felt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Differensiering av mNPC-cellene i kontrollgruppen (CTL) og i DC-pulsstimuleringsgruppen ved DIV 3, 7 og 14. Prosentandelen av nevronceller (Tuj1+), astrocytter (GFAP+-celler) og oligodendrocytter (O4+-celler) i (A-C) CTL-gruppen og (D-F) i stimuleringsgruppen (DC-pulser). Denne figuren er publisert av Chang et al.1. Forkortelser: CTL: kontroll; DC = likestrøm; Tuj1 = nevronspesifikk klasse III β-tubulin; GFAP = glial fibrillært surt protein; O4 = oligodendrocyttmarkør O4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under fabrikasjonen av MOE-brikken er adapterne festet til Lag 1 på MOE-brikken med hurtigvirkende cyanoacrylatlim. Limet påføres 4 hjørner av adapterne, og deretter påføres trykket jevnt over adapterne. Overflødig mengde lim må unngås for å sikre fullstendig polymerisering av limet. Videre inkuberes den ferdige MOE-brikkeenheten i et vakuumkammer. Dette trinnet bidrar til å fjerne boblene mellom PMMA-laget, det dobbeltsidige båndet og dekkglasset.
Valget av elektrodematerialet er basert på det faktum at kloridioner, som er rikelig til stede i mediet, er de elektrolytiske produktene som strømmer gjennom cellekulturområdet. Under EF-stimuleringseksperimentet forble pH rundt elektrodene konstant. En enklere konfigurasjon ved hjelp av platina (Pt) som elektrodematerialet elektrolyserer vann og genererer hydrogenioner (H+) og hydroksydioner (OH-) ved henholdsvis den positive elektroden og den negative elektroden, som induserer pH-endringer i kulturregionen. Unngå bruk av Pt-elektroder omgår problemet med pH-endringer under EF-stimuleringseksperimentet.
Den varme agarose og boblefrie agarose er avgjørende under utarbeidelsen av saltbronettverket. Den varme agarose har høy fluiditet og kan lett injiseres i saltbronettverket. Koble Luer-låsesprøyten til Luer-adapteren etter å ha injisert den 3 % varme agaroseen i Luer-adapteren. I løpet av dette trinnet vil agarose bli presset opp i Luer-låsesprøyten slik at en boblefri fast tilkobling av saltbronettverket kan oppnås. Bobler i saltbroene øker den elektriske motstanden, og dermed kan den forventede elektriske strømmen ikke nås. Etter agaroseinjeksjonen er det viktig å vente på at agarose skal avkjøles og størkne ved romtemperatur i 10-20 min for å forhindre dannelse av størknet agarose rusk i cellekulturområdet.
MOE-brikken plasseres på en ITO-varmeapparat som er låst på et programmerbart X-Y-Z motorisert stadium. Hele systemet er bygget på et invertert fasekontrastmikroskop utstyrt med et digitalt kamera for å overvåke celledifferensiering i cellekulturregionene i brikken. Det er praktisk å observere cellemorfologien og oppkjøpet av de automatiske tidsforløpbildene i MOE-mikrofluidsystemet utenfor en inkubator. Dette mikrofluidiske systemet forkorter ikke bare den nødvendige eksperimentelle tiden, men øker også nøyaktigheten av kontroll på mikromiljøet.
MNPC-cellene vokser som en suspensjon i kulturmedier. Imidlertid er mNPCer som holder seg til PLL-belagt plate i MOE-brikken avgjørende for differensiering. Nevrosfærer dannet av 30-40 celler foretrekkes for å initiere mNPC-differensiering. Overvekst av mNPCer vil svekke celleoverlevelse under differensieringsprosessen. Videre, etter den pulserende DC-stimuleringen, kan immunfluorescensfargingen påvirkes av strømningshastigheten. Bruk derfor flere strømningshastigheter for forskjellige trinn for å unngå å løsne celler under vasken.
I denne studien er en begrensning av denne teknikken at MOE-brikken ikke kan gjenbrukes på grunn av vanskeligheten med grundig rengjøring av brikken. MOE-brikken kan imidlertid plasseres under et fasekontrastmikroskop eller et konfokalt mikroskop direkte. Den vanntette utformingen av det rapporterte mikrofluidiske systemet sikrer at buffer / middels fordampning ikke oppstår, og opprettholder den nøyaktige konsentrasjonen av bufferen / mediet og de tilsvarende elektriske egenskapene. Ved å redusere reagensvolumer og tilsvarende driftstid, gir MOE mikrofluidisk system en effektiv tilnærming for å studere celledifferensiering.
En tidligere studie har vist at EGF og bFGF fremmer NPC overlevelse, ekspansjon og vedlikehold i den uavklarte tilstanden4. I denne studien induserte DC-pulsene differensiering av mNPCene i stamcellevedlikeholdsmediet som inneholdt EGF og bFGF. Tidligere studier har rapportert at EF fremmer differensiering av NPCer i nevroner og/eller astrocytter i differensieringsmedium uten EGF og bFGF14,21,22. Disse resultatene viser at mNPCene differensiert til nevroner, astrocytter og oligodendrocytter etter DC-pulsstimuleringen. De antyder også at enkel DC-pulsbehandling kan kontrollere skjebnen til NPCer. Med ytterligere optimalisering på stimuleringstid, EF-styrke eller driftssyklus, kan likestrømspulser brukes til å manipulere NPC-differensiering og kan brukes til utvikling av terapeutiske strategier som bruker NPCer til å behandle nervesystemforstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker professor Tang K. Tang, Institutt for biomedisinske vitenskaper, Academia Sinica, for hans hjelp til å gi mus nevrale stamceller og stamceller (mNPCs). Forfatterne takker også professor Tang K. Tang og Ms. Ying-Shan Lee for deres verdifulle diskusjon om differensiering av mNPCer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
References
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
- Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
- Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
- Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
- Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
- Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
- Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
- Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
- Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
- Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
- Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
- Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
- Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
- AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
- Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).
