Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

زينوبوس لايفيس تحضير مستخلص البيض وطرق التصوير الحية لتصور التنظيم السيتوبلازمي الديناميكي

Published: June 6, 2021 doi: 10.3791/61923
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine, 2Current Address: Department of Biological Sciences, University of Southern California, 3Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine

Summary

وصفنا طريقة لإعداد والتصوير الحي للمقتطفات السيتوبلازمية غير المخففة من بيض Xenopus laevis .

Abstract

تستخدم مستخلصات بيض Xenopus laevis تقليديا للمقايسات البيوكيميائية السائبة ، وقد ظهرت كأداة قوية قائمة على التصوير لدراسة الظواهر السيتوبلازمية ، مثل التحريك الخلوي وتشكيل المغزل الانقسامي وتجميع النواة. بناء على الطرق المبكرة التي صورت المستخلصات الثابتة التي تم أخذ عينات منها في نقاط زمنية متفرقة ، تقوم الأساليب الحديثة بتصوير المقتطفات الحية باستخدام الفحص المجهري بفاصل زمني ، مما يكشف عن ميزات أكثر ديناميكية مع دقة زمنية محسنة. تتطلب هذه الطرق عادة معالجات سطحية متطورة لوعاء التصوير. نقدم هنا طريقة بديلة للتصوير الحي لمستخلصات البيض التي لا تتطلب معالجة سطحية كيميائية. من السهل تنفيذ واستخدام المواد الاستهلاكية المختبرية ذات الإنتاج الضخم للتصوير. وصفنا نظاما يمكن استخدامه لكل من الفحص المجهري واسع المجال والبؤر. وهي مصممة لمقتطفات التصوير في مجال ثنائي الأبعاد (2D) ، ولكن يمكن تمديدها بسهولة إلى التصوير في 3D. إنه مناسب تماما لدراسة تكوين النمط المكاني داخل السيتوبلازم. من خلال البيانات التمثيلية ، نوضح التنظيم الديناميكي النموذجي للأنابيب الدقيقة والنوى والميتوكوندريا في مستخلصات الطور البيني المحضرة باستخدام هذه الطريقة. يمكن أن توفر بيانات الصور هذه معلومات كمية عن ديناميكيات السيتوبلازم والتنظيم المكاني.

Introduction

يشكل السيتوبلازم الحجم الرئيسي للخلية وله تنظيم متميز. يمكن أن تتجمع مكونات السيتوبلازم حقيقي النواة ذاتيا في مجموعة واسعة من الهياكل المكانية ، مثل زهور النجمة microtubule وجهاز Golgi ، والتي بدورها يتم ترتيبها ديناميكيا وقلبها اعتمادا على هوية الخلية وحالتها الفسيولوجية. وبالتالي فإن فهم التنظيم المكاني للسيتوبلازم وارتباطه بالوظائف الخلوية مهم لفهم كيفية عمل الخلية. تم استخدام مستخلصات بيض Xenopus laevis تقليديا في المقايسات البيوكيميائية السائبة1،2،3،4،5،6،7،8 ، لكن العمل الأخير يؤسسها كنظام تصوير حي قوي للدراسات الميكانيكية للهياكل السيتوبلازمية ووظائفها الخلوية9،10،11 ، 12،13،14،15،16،17،18. تحافظ هذه المستخلصات غير المخففة على العديد من هياكل ووظائف السيتوبلازم ، مع السماح بالتلاعب المباشر بمحتويات السيتوبلازم التي لا يمكن تحقيقها في النماذج التقليدية القائمة على الخلايا19,20. هذا يجعلها مثالية لتوصيف الظواهر السيتوبلازمية وتشريح أسسها الميكانيكية.

تتطلب الطرق الحالية لمستخلصات التصوير تعديلات على السطح الكيميائي ، أو تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة. تتطلب إحدى الطرق القائمة على غطاء الغطاء تخميل البولي إيثيلين جلايكول (PEG) لأغطية الزجاج21. تتطلب الطريقة القائمة على المستحلب الدقيق ترسب بخار ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane على الأسطح الزجاجية22,23. تسمح الأنظمة القائمة على الموائع الدقيقة بالتحكم الدقيق في حجم وهندسة وتكوين قطرات الاستخراج ، ولكنها تتطلب مرافق تصنيع دقيقة متخصصة11،12،24.

نقدم هنا طريقة بديلة لتصوير مستخلصات البيض سهلة التنفيذ وتستخدم مواد متاحة بسهولة ومنخفضة التكلفة. يتضمن ذلك تحضير غرفة تصوير مع شريحة وغطاء مغطى بشريط بروبيلين الإيثيلين المفلور (FEP). يمكن استخدام الغرفة لتصوير المستخلصات مع مجموعة متنوعة من أنظمة الفحص المجهري ، بما في ذلك المجاهر المجسمة والمجاهر المستقيمة والمقلوبة. لا تتطلب هذه الطريقة أي معالجة كيميائية للأسطح مع تحقيق وضوح بصري مماثل تم الحصول عليه باستخدام الطرق القائمة على الزجاج التي تمت مناقشتها أعلاه. وهي مصممة لتصوير طبقة من مقتطفات بسمك موحد عبر حقل 2D ، ويمكن تمديدها بسهولة لتصوير حجم 3D من المستخلصات. إنه مناسب تماما للتصوير بفاصل زمني للسلوك السيتوبلازمي الجماعي على مجال رؤية كبير.

لقد استخدمنا مستخلصات البيض البينية المحتجزة لتوضيح طريقة التصوير لدينا. يتبع إعداد المستخلص بروتوكول Deming و Kornbluth19. باختصار ، يتم سحق البيض الذي يتم القبض عليه بشكل طبيعي في الطور الاستوائي من الانقسام الاختزالي الثاني عن طريق الدوران بسرعة منخفضة. يطلق هذا الدوران السيتوبلازم من الاعتقال الاختزالي ويسمح للمستخلص بالمضي قدما في الطور البيني. عادة ، يتم إضافة السيتوكلاسين B قبل الدوران الساحق لمنع تكوين F-actin. ومع ذلك ، يمكن حذفه إذا كان F-actin مطلوبا. يضاف Cycloheximide أيضا قبل الدوران الساحق لمنع مستخلص الطور البيني من دخول الانقسام التالي. يتم وضع المستخلصات لاحقا في غرف التصوير المذكورة أعلاه وتوضع على المجهر. أخيرا ، يتم تسجيل الصور بمرور الوقت على فترات زمنية محددة بواسطة كاميرا متصلة بالمجهر ، مما ينتج عنه سلسلة صور بفاصل زمني تلتقط السلوك الديناميكي للمستخلص في حقل 2D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) بجامعة ستانفورد.

1. إعداد الشرائح وأغطية

  1. ضع طبقة من الشريط اللاصق الإيثيلين بروبيلين المفلور (FEP) على شريحة زجاجية باستخدام قضيب الأسطوانة. قطع الشريط الزائد على الحواف بشفرة حلاقة نظيفة. قم بإعداد أغطية مغلفة بشريط FEP بنفس الطريقة (الشكل 1 أ).
  2. ضع فاصل تصوير لاصق على الوجهين على الجانب المطلي بشريط FEP من الشريحة. اترك البطانة الواقية في الأعلى غير مقشرة (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: يجب تحضير الشرائح وأغطية الغلاف قبل التجربة. يمكن استخدامها على الفور ، أو تخزينها في صناديق لمنع تراكم الغبار على الأسطح. يبلغ عمق البئر في فاصل التصوير 120 ميكرومتر وقطره 9 مم.

2. التحضير والتصوير الحي لمستخلصات البيض البينية

ملاحظة: تم تكييف البروتوكول التالي من Deming و Kornbluth19 و Murray20 و Smythe و Newport25 مع تعديلات. يجب تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. قبل ثلاثة إلى عشرة أيام من جمع البويضات ، قم بحقن أنثى ضفادع Xenopus laevis الناضجة تحت الجلد في الكيس الليمفاوي الظهري مع 100 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحوامل (PMSG).
  2. قبل ستة عشر إلى ثمانية عشر ساعة من جمع البيض المخطط له ، قم بحقن الضفادع من الخطوة 2.1 ب 500 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية المشيمائية البشرية (hCG). اترك الضفادع عند 18 درجة مئوية في مخزن وضع البيض (100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 2 مللي متر KCl ، 1 مللي متر MgSO 4 · 7H 2 O ، 2.5 ملليمتر CaCl 2 · 2H2 O ، 0.5 ملي متر HEPES، 0.1 مللي متر EDTA ، تحضير كمحلول مخزون 20x عند درجة حموضة7.4 وتخفيفه بماء خزان الضفدع النظيف إلى 1x قبل الاستخدام) حتى جمع البيض.
  3. في يوم التجربة ، اجمع البيض في طبق بتري زجاجي كبير وقم بتقييم جودة البيض. تخلص من أي بيض يشبه الكرات البيضاء المنتفخة أو يظهر في خيط (الشكل 1 ب). افحص البيض تحت مجسمة ، واحتفظ بالبيض بمظهر طبيعي (الشكل 1C) ، وتخلص من البيض ذي الصبغة غير المنتظمة أو المرقطة (الشكل 1 د).
    ملاحظة: يعمل هذا البروتوكول مع البيض الذي يتم جمعه من ضفدع واحد ، والذي يضع عادة 25 مل من البيض بعد 16 ساعة من حقن قوات حرس السواحل الهايتية. عادة ، يتم تحفيز ما مجموعه 3 إلى 6 ضفادع بواسطة قوات حرس السواحل الهايتية ، ويتم اختيار الضفدع ذو أعلى جودة للبيض لتجربة تحضير المستخلص.
  4. انقل البيض إلى دورق زجاجي سعة 400 مل ، وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت لوضع البيض عن طريق الصب.
  5. احتضن البيض في 100 مل من محلول إزالة الشوائب الطازج (2٪ وزن / وزن L-cysteine في الماء ، واضبطه على درجة الحموضة 8.0 باستخدام NaOH) وقم بتحريكه برفق بشكل دوري. بعد حوالي 3 دقائق ، اسكب المحلول ، وأضف 100 مل من محلول إزالة الشوائب الطازج. استمر في الحضانة حتى يتم تعبئة البيض بإحكام (لا توجد مسافة بين البيض) ، ولكن تجنب ترك البيض في محلول إزالة الشوائب لأكثر من 5 دقائق.
  6. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول إزالة الشوائب عن طريق الصب ، واغسل البيض في محلول 0.25x MMR (25 mM NaCl ، 0.5 mM KCl ، 0.25 mM MgCl 2 ، 0.5 mM CaCl2 ، 0.025 mM EDTA ، 1.25 mM HEPES ، محضر كمحلول مخزون 10x ، معدل إلى درجة الحموضة 7.8 مع NaOH ، ومخفف في ماء Milli-Q قبل الاستخدام) عن طريق إضافة المخزن المؤقت ، تحريك البيض ، ثم سكب المخزن المؤقت. كرر عدة مرات حتى يتم استخدام ما مجموعه 1 لتر من المخزن المؤقت للغسيل.
  7. اغسل البيض عدة مرات بإجمالي 400 مل من محلول تحلل البيض (250 ملي مول سكروز ، 10 مللي مول HEPES ، 50 مللي مول KCl ، 2.5 ملي متر MgCl2 ، 1 مللي مول DTT ، مصنوع طازجا ومعدلا إلى درجة الحموضة 7.7 مع KOH). قم بإزالة البيض ذي المظهر غير الطبيعي باستخدام ماصة باستور بين الغسيل.
    ملاحظة: يشير البيض ذو المظهر غير الطبيعي إلى تلك التي تشبه الكرات البيضاء المنتفخة (الشكل 1 ب) ، أو لديها تصبغ مرقش (الشكل 1 د) ، أو تتدهور مع نمو منطقة بيضاء (الشكل 1 ه) ، أو تظهر منطقة مصطبغة داكنة ومتقلصة في نصف الكرة الحيوانية (الشكل 1F).
  8. باستخدام ماصة نقل مع قطع طرفها على مصراعيها ، انقل البيض إلى أنبوب طرد مركزي دائري القاع سعة 17 مل يحتوي على 1 مل من محلول تحلل البيض. قم بتدوير الأنبوب في جهاز طرد مركزي سريري بسرعة 400 × جم لمدة 15 ثانية لتعبئة البيض.
  9. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول تحلل البيض من أعلى البيض المعبأ باستخدام ماصة باستور.
    ملاحظة: من المهم إزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت من البيض المعبأ ، من أجل تقليل تخفيف مستخلص البيض. في بعض الأحيان يكون من الضروري إزالة بعض البيض السائب مع المخزن المؤقت المتبقي لتحقيق ذلك.
  10. حدد الحجم التقريبي للبيض المعبأ ، ثم أضف 5 ميكروغرام / مل من الأبروتينين ، و 5 ميكروغرام / مل من الليوبتين ، و 5 ميكروغرام / مل من السيتوكلاسين B ، و 50 ميكروغرام / مل من سيكلوهيكسيميد مباشرة فوق البيض المعبأ.
    ملاحظة: أبروتينين وليوببتين مثبطات الأنزيم البروتيني. يمنع Cytochalasin B بلمرة الأكتين ، مما يمنع المستخلص من الانقباض والتبلور26. Cycloheximide يمنع تخليق البروتين ، وبالتالي الحفاظ على المستخلص في الطور البيني لدورة الخلية.
  11. سحق البيض عن طريق طرد الأنبوب بالطرد المركزي عند 12000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 15 دقيقة ، في دوار دلو متأرجح.
    ملاحظة: في نهاية الطرد المركزي ، يجب أن يكون البيض قد تمزق وانفصل المحللة إلى ثلاث طبقات رئيسية: طبقة دهنية صفراء في الأعلى ، ومستخلص السيتوبلازم (يسمى أيضا المستخلص الخام) في المنتصف ، وطبقة كثيفة داكنة تحتوي على حبيبات الصباغ في الأسفل (الشكل 1G).
  12. نعلق إبرة قياس 18 إلى حقنة. مع توجيه طرف الإبرة لأسفل ، قم بثقب الأنبوب من الجانب الموجود أسفل الطبقة السيتوبلازمية ، واستعد المستخلص عن طريق السحب ببطء.
    ملاحظة: ارسم المستخلص السيتوبلازمي ببطء لتجنب إدراج محتوى ملوث من طبقة الدهون الصفراء.
  13. نقل مستخلص السيتوبلازم المستعاد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد والاحتفاظ به على الجليد. استخدم المستخلص في غضون 1 ساعة.
  14. عندما تكون جاهزا للتصوير ، استكمل المستخلص بالكواشف المرغوبة ومجسات التصوير الفلوري.
    ملاحظة: تقوم مجسات التصوير الفلوري بتسمية هياكل سيتوبلازمية محددة بحيث يمكن تصورها بواسطة مجهر مضان.
  15. قم بإزالة البطانة الواقية العلوية من فاصل التصوير على الشريحة المعدة في الخطوة 1.2 ، وقم بإيداع ما يقرب من 7 ميكرولتر من المستخلص في وسط البئر. ضع على الفور غطاء FEP المطلي بالشريط بحيث يكون جانب FEP مواجها للمستخلص لإغلاق البئر. انتقل بسرعة إلى التصوير (الشكل 1H ، I).
  16. اضبط الشريحة على مجهر مقلوب أو مستقيم باستخدام منصة آلية وكاميرا رقمية. قم بتصوير المقتطفات في المواضع المكانية والفترات الزمنية المرغوبة في كل من قنوات المجال الساطع والتألق.
    ملاحظة: عادة ما يتم استخدام هدف 5x للتصوير. تتيح المرحلة الآلية الحصول الآلي على الصور في مواقع مكانية محددة متعددة. يصور الفحص المجهري ذو المجال الساطع الهياكل السيتوبلازمية بدرجات مختلفة من الشفافية. يصور الفحص المجهري الفلوري الهياكل السيتوبلازمية المسماة على وجه التحديد بواسطة مجسات التصوير الفلوري المضافة في الخطوة 2.14. تسجل الكاميرا صورا بفاصل زمني لهذه الهياكل ، وبالتالي تلتقط ديناميكيات التنظيم السيتوبلازمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن استخدام مستخلصات بيض Xenopus laevis لدراسة التنظيم الذاتي للسيتوبلازم أثناء الطور البيني. يوضح الشكل 2 أ نتائج تجربة ناجحة. قمنا باستكمال المستخلصات البينية المقبوضة بنوى الحيوانات المنوية Xenopus laevis 19 بتركيز 27 نواة / ميكرولتر و 0.38 ميكرومتر منقى GST-GFP-NLS27،28،29،30 (بروتين اندماج يتكون من الجلوتاثيون-S-transferase ، وبروتين الفلورسنت الأخضر ، وتسلسل التوطين النووي) للسماح بإعادة تكوين وتصور نوى الطور البيني. أضفنا أيضا 1 ميكرومتر من التوبولين المسمى بالفلورسنت لتصور الأنابيب الدقيقة ، و 500 نانومتر MitoTracker Red CMXRos لتصور الميتوكوندريا. بعد لحظات من وضع المستخلص في غرفة التصوير ، بدا السيتوبلازم غير منظم. خلال ال 30 دقيقة التالية في درجة حرارة الغرفة ، بدأ السيتوبلازم في التنظيم الذاتي في مقصورات تشبه الخلية. نمت زهور النجمة ذات الأنابيب الدقيقة من الجسيمات المركزية التي تم إدخالها مع نوى الحيوانات المنوية ، وشكلت مناطق حدودية مستنفدة للأنابيب الدقيقة عندما قابلت الأنابيب الدقيقة من زهور النجمة المجاورة. تم نقل بروتين GST-GFP-NLS إلى نوى الطور البيني المستديرة المجمعة ذاتيا من نوى الحيوانات المنوية المضافة المضافة. كانت المناطق المستنفدة من مكونات السيتوبلازم المبعثرة للضوء مرئية في كل من قنوات المجال الساطع والميتوكوندريا (الشكل 2 أ ، 20 دقيقة و 35 دقيقة). أصبحت الميتوكوندريا أيضا مستنفدة من الحدود التي وضعتها الأنابيب الدقيقة ، وأصبحت غنية في مقصورات معزولة تتماشى مع مقصورات الأنابيب الدقيقة. بحلول 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، يجب أن يكون النمط المكاني الذي يتكون من مقصورات تشبه الخلية راسخا ، مع الأنابيب الدقيقة التي تشكل بنية مجوفة تشبه إكليل الزهور ، والميتوكوندريا مقسمة بوضوح إلى كل حجرة (الشكل 2 أ ، 53 دقيقة).

يقارن الشكل 2B أداء الاستخراج في غرف التصوير مع وبدون أشرطة FEP على الزجاج. قمنا باستكمال المستخلصات البينية المقبوضة بنوى الحيوانات المنوية Xenopus laevis 19 بتركيز 27 نواة / ميكرولتر و 0.35 ميكرومتر GST-mCherry-NLS27،28،29،30 (بروتين اندماج يتكون من الجلوتاثيون-S-transferase ، بروتين الفلورسنت mCherry ، وتسلسل التوطين النووي) للسماح بإعادة تكوين وتصور نوى الطور البيني. أضفنا أيضا 1 ميكرومتر من التوبولين المسمى بالفلورسنت لتصور الأنابيب الدقيقة. أصبحت الاختلافات في الديناميكيات واضحة بحوالي 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في الغرفة المصنوعة من الزجاج المسجل FEP ، يتم تنظيم المستخلص ذاتيا في أنماط طبيعية تشبه الخلية (الشكل 2B ، الصور في الصفين 1 و 3). ومع ذلك ، في الغرفة حيث لم يتم تغطية الأسطح الزجاجية بشريط FEP (غير مخمل) ، أظهر المستخلص أنماطا غير طبيعية للمجال الساطع والأنابيب الدقيقة التي تعطلت بشكل متزايد بمرور الوقت (الشكل 2B ، الصور في الصفين 2 و 4). لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في الاستيراد النووي لبروتين GST-mCherry-NLS (الشكل 2B ، الصور في الصفين 5 و 6).

Figure 1
الشكل 1: المخططات والصور المتعلقة بالإجراء التجريبي . (أ) رسم تخطيطي لإعداد أغطية وشرائح زجاجية مطلية بشريط FEP. (ب) بيض Xenopus laevis المترسب في مخزن وضع البيض ، مع أمثلة على البيض ذي الجودة الرديئة المشار إليها بالسهام. السهام الصفراء ، أمثلة على البيض الذي يشبه كرات منتفخة بيضاء. السهام الحمراء ، أمثلة على البيض التي تظهر في سلسلة. ج: أمثلة على بيض Xenopus laevis ذو المظهر الطبيعي. د: أمثلة على بويضات رديئة الجودة ذات صبغة غير منتظمة أو مرقشة. ه: بيضة متدهورة مع منطقة بيضاء متنامية. (و) بويضة تظهر منطقة مصطبغة داكنة ومتقلصة، ربما بسبب التنشيط الوراثي البارثينوجيني. (G) الطبقات التي تشكلت من تمزق بيض Xenopus laevis بعد الطرد المركزي 12000 × g في الخطوة 2.11. (ح) مخططات لإعداد غرفة التصوير المستخرج في الخطوة 2.15. (ط) صورة لغرفة تصوير معدة بداخلها مستخلص بيض. يشترك الخياران ج، د، في شريط المقياس نفسه أسفل الخيار (د). يشترك الخياران ه ه و(و) في شريط المقياس نفسه أسفل (F). أشرطة المقياس في (B) (C) (D) (E) (F) و (I) تقريبية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: مستخلصات البيض المحتجزة بين الطور تنظم نفسها ذاتيا في مقصورات تشبه الخلية . (أ) مونتاج بفاصل زمني لتشكيل نمط منظم ذاتيا في طبقة رقيقة (120 ميكرومتر) من مستخلص بيض Xenopus laevis المحبوس بين الطور. تم استكمال المستخلص ب 27 نواة / ميكرولتر من نوى الحيوانات المنوية Xenopus laevis الممزقة للسماح بإعادة تكوين نوى الطور البيني. تم تصور الأنابيب الدقيقة بواسطة توبولين المسمى HiLyte 647 (كما هو موضح باللون الأرجواني) ، والميتوكوندريا بواسطة MitoTracker Red CMXRos (كما هو موضح باللون الأحمر) ، والنوى بواسطة GST-GFP-NLS (كما هو موضح باللون الأخضر). (ب) تشكيل نمط منظم ذاتيا في مستخلصات بيض Xenopus laevis البينية المحتجزة في غرف مع وبدون أسطح زجاجية مغطاة بشريط FEP. تم استكمال المستخلصات ب 27 نواة / ميكرولتر من نوى الحيوانات المنوية Xenopus laevis الممزقة للسماح بإعادة تكوين نوى الطور البيني. تم تصور الأنابيب الدقيقة بواسطة توبولين المسمى HiLyte 488 (كما هو موضح باللون الأرجواني) والنوى بواسطة GST-mCherry-NLS (كما هو موضح باللون الأخضر). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: ختم ثانوي اختياري لغرفة التصوير. مخططات لإعداد ختم ثانوي اختياري بالزيت المعدني لمنع المستخلص من ملامسة الهواء لفترة طويلة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ظهرت مستخلصات البيض Xenopus laevis كنظام نموذجي قوي للدراسات القائمة على التصوير لمختلف الهياكل تحت الخلوية10،14،15،16،17،18،21،31،32،33،34،35،36 والتنظيم السيتوبلازمي بشكل عام مقياس الخلية9. هنا وصفنا طريقة التصوير الحية المناسبة لتصور التنظيم السيتوبلازمي الديناميكي في 2D. يتم إثبات فعالية الطريقة من خلال النتائج التمثيلية.

هناك عدة خطوات حاسمة لنجاح الطريقة. جودة البيض مهمة للمستخلصات ، لذا فإن الخطوتين 2.3 و 2.7 حاسمتان. في تجربتنا ، يحتوي نصف الكرة الحيوانية للبيض عالي الجودة على تصبغ موحد ، ونقطة بيضاء مميزة في المركز (تدل على انهيار الحويصلة الجرثومية ، GVBD) ، وحدود واضحة مع نصف الكرة النباتي (الشكل 1C). تتمتع المستخلصات المصنوعة من بيض عالي الجودة بأداء أفضل في ظل ظروف التصوير لدينا. إذا كان أكثر من 5٪ من البيض يحتوي على صبغة مرقطة (الشكل 1 د) ، أو منطقة مصطبغة داكنة ومتقلصة (الشكل 1F) ، أو تبدو مثل كرات بيضاء منتفخة (الشكل 1B) ، أو تظهر في سلسلة (الشكل 1B) ، أو تظهر علامات التدهور بعد الغسيل في الخطوتين 2.6 و 2.7 (الشكل 1E) ، فيجب التخلص من مجموعة البيض بأكملها. تحتفظ المستخلصات بنشاط بيولوجي ملحوظ لأنها في الأساس سيتوبلازم غير مخفف. لذلك ، فإن الخطوة التي تهدف إلى تقليل تخفيف المستخلص (الخطوة 2.9) مهمة لنجاح التجربة. للتصوير ، يتم التعامل مع المستخلصات بكميات صغيرة جدا ، وسوف تتبخر بسرعة إذا كانت على اتصال طويل مع الهواء. هذا سوف يؤثر سلبا على نشاطهم. لذلك ، في الخطوة 2.15 ، بعد إيداع المستخلص ، يجب إغلاقه بالجانب المطلي بشريط FEP من غطاء الغطاء في أسرع وقت ممكن. يمكن تأكيد الختم بصريا من خلال تغيير النسيج في موقع التلامس بين المادة اللاصقة الموجودة على الفاصل وغطاء الغطاء. يجب أن يكون الفاصل قادرا على إنشاء ختم كامل إذا تم تطبيقه بشكل صحيح. ومع ذلك ، إذا كنت ترغب في ختم إضافي ، يمكن الاستغناء عن الزيت المعدني بين الجزء المتدلي من غطاء الغطاء والشريحة الزجاجية. يمكن أن يشكل الزيت ختما إضافيا حول الفاصل عن طريق العمل الشعري (الشكل 3). يمكن أن يقلل تخميل الأسطح الزجاجية من الامتزاز غير المحدد للجزيئات ، وهو مهم لزهور النجمة الدقيقة بين الطور في المستخلصات21,37. يبدو أن تطبيق شريط FEP على سطح زجاجي موصوف هنا يقدم فوائد مماثلة ، كما هو مقترح من خلال تجميع زهور النجمة العادية للأنابيب الدقيقة البينية (الشكل 2 ، 6 دقائق). لذلك ، الخطوة 1.1 مهمة أيضا.

لقد أظهرنا تطبيق طريقة التصوير باستخدام مستخلصات البيض البينية المحتجزة باتباع بروتوكول Deming و Kornbluth19. بشكل افتراضي ، يكمل البروتوكول المستخلصات بمثبط بلمرة الأكتين السيتوكلاسين B لمنع تقلص الهلام في المستخلصات بعد الحضانة الممتدة في درجة حرارة الغرفة26. للسماح بلمرة الأكتين ومراقبة ديناميكيات الأكتين ، يمكن للمرء استبعاد السيتوكلاسين B في الخطوة 2.10 من البروتوكول9. التعديل الذي أجريناه على بروتوكول Deming و Kornbluth هو أننا لا نكمل المستخلصات بمزيج طاقة لتجديد ATP19. هذا لأنه في أيدينا ، في المستخلصات المكملة بهذا المزيجالمجدد ل ATP 19 ونوى الحيوانات المنوية ، تشكل الأنابيب الدقيقة أحيانا شبكة متشابكة تتداخل مع تكوين النمط السيتوبلازمي. لذلك ، لا يتضمن البروتوكول الخطوة التي تضيف مزيج الطاقة إلى المستخلصات19.

يعتمد بروتوكول استخراج الطور البيني على سحق البيض في مخزن مؤقت خال من EGTA لتحريره من الاعتقال الاختزالي (CSF-arrest)37. تتقدم المستخلصات لاحقا إلى الطور البيني ، ويتم الاحتفاظ بها في الطور البيني بواسطة سيكلوهيكسيميد. هناك طرق أخرى ثابتة لإعداد مقتطفات الطور البيني. تقوم بعض الطرق أولا بإعداد المستخلصات التي تحافظ على الاعتقال الاختزالي عن طريق سحق البيض في محلول التحلل باستخدام EGTA38 ، ثم إطلاق الاعتقال بإضافة الكالسيوم ، مما يدفع المستخلص إلى الطورالبيني 21،37،39. يمكن الاحتفاظ بالمستخلصات لاحقا في الطور البيني عن طريق إضافة مثبطات تخليق البروتين مثل سيكلوهيكسيميد37،39. طرق أخرى تنشط البيض بشكل وراثي مع أيونوفور الكالسيوم (A23187) أو صدمة كهربائية لتحريرها من الاعتقال الاختزالي ، قبل سحق البيض في غياب EGTA20,28 (تمت مراجعته في Field et al.37). يمكن أن تدخل هذه المستخلصات في الطور البيني ولكنها عادة لن تبقى هناك لأنها قادرة على الخضوع لدورات خلايا متعددة. وبالمثل ، تم تطوير طرق راسخة محسنة لإعداد مقتطفات مع الهيكل الخلوي الأكتين سليمة10،37،39. قد تكون طريقة التصوير مناسبة لهذه الأنواع من المستخلصات ، لكننا لم نختبرها معهم.

لغرض تصوير التنظيم الداخلي للسيتوبلازم ، فإن نظام التصوير المقدم هنا سهل الإعداد نسبيا ، ولا يتطلب سوى تطبيق شريط FEP على الأسطح الزجاجية. يسمح بتجميع الهياكل الهيكلية الخلوية في المستخلصات9 التي تم الإبلاغ عنها في أنظمة تصوير أكثر تطورا حيث يتم تخميل الأسطح الزجاجية بمعالجة poly-L-lysine-g-polyethylene glycol (PLL-g-PEG) أو المغلفة بطبقات ثنائية دهنية مدعومة10,21. تسمح الطريقة لطبقة الاستخراج بالتشكل بسمك محدد (يحدده عمق الفاصل ، وهو 120 ميكرومتر للنظام الموضح في الشكل 1A و 1H و 1I والشكل 2). يمكننا ضبط السماكة عن طريق تكديس فواصل إضافية. لقد قمنا بتكديس ما يصل إلى 6 فواصل من هذا القبيل (بسمك 720 ميكرومتر) وتشكلت المقصورات بشكل طبيعي. تتيح هذه المرونة التطبيقات المستقبلية مثل تصوير المستخلصات في 3D باستخدام المجهر متحد البؤر أو الورقة الخفيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر ج. كامينز و Y. Chen و W. Y. C. HUANG على تعليقاتهم على المخطوطة. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM110564 و P50 GM107615 و R35 GM131792) الممنوحة لجيمس إي فيريل جونيور.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17 ml centrifuge tube Beckman Coulter 337986
22x22 mm square #1 cover glass Corning 284522
Aprotinin MilliporeSigma 10236624001 Protease inhibitor
Cycloheximide MilliporeSigma 01810 Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B MilliporeSigma C6762 Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs Nasco LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein Cytoskeleton, Inc. TL488M-A For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein Cytoskeleton, Inc. TL670M-A For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape CS Hyde company 23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG) MilliporeSigma CG10
Imaging spacer Electron Microscopy Sciences 70327-8S
Leupeptin MilliporeSigma 11017101001 Protease inhibitor
Microscope slides Fisher Scientific 12-518-100B
Mineral oil MilliporeSigma 330760
MitoTracker Red CMXRos Thermo Fisher Scientific M7512 For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) BioVendor RP1782725000
Roller applicator Amazon B07HMBJSP8 For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades Fisher Scientific 12-640 For removing excessive FEP tape
Transfer pipette Fisher Scientific 13-711-7M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
  2. Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
  3. Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
  4. Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
  5. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
  6. Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
  7. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
  8. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
  9. Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
  10. Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
  11. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
  12. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
  13. Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
  14. Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
  15. Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
  16. Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
  17. Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
  18. Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
  19. Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
  20. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  21. Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  22. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
  23. Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
  24. Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
  25. Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
  26. Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).
  27. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
  28. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
  29. Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
  30. Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
  31. Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
  32. Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
  33. Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
  34. Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
  35. Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
  36. Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
  37. Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
  38. Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  39. Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).

Tags

علم الأحياء ، العدد 172 ، Xenopus laevis ، مستخلص البيض ، تكوين النمط ، التنظيم الذاتي ، التصوير الحي ، الأنظمة الخالية من الخلايا ، بيولوجيا الخلية ، الكيمياء الحيوية ، علم الأحياء التنموي
<em>زينوبوس لايفيس</em> تحضير مستخلص البيض وطرق التصوير الحية لتصور التنظيم السيتوبلازمي الديناميكي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, X., Ferrell, Jr., J. E.… More

Cheng, X., Ferrell, Jr., J. E. Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization. J. Vis. Exp. (172), e61923, doi:10.3791/61923 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter