Summary
Descrevemos um método para a preparação e imagem ao vivo de extratos citoplasmáticos não diluídos de ovos de Xenopus laevis .
Abstract
Tradicionalmente usados para ensaios bioquímicos a granel, os extratos de ovos de Xenopus laevis surgiram como uma poderosa ferramenta baseada em imagens para estudar fenômenos citoplasmáticos, como citocinese, formação de fuso mitótico e montagem do núcleo. Com base nos primeiros métodos que visualizavam extratos fixos amostrados em pontos de tempo esparsos, abordagens recentes de extratos ao vivo de imagem usando microscopia de lapso de tempo, revelando características mais dinâmicas com resolução temporal aprimorada. Esses métodos geralmente requerem tratamentos de superfície sofisticados do vaso de imagem. Aqui apresentamos um método alternativo para imagens vivas de extratos de ovos que não requerem tratamento químico de superfície. É simples de implementar e utiliza consumíveis de laboratório produzidos em massa para imagens. Descrevemos um sistema que pode ser usado tanto para microscopia de campo amplo quanto para microscopia confocal. Ele é projetado para extratos de imagem em um campo 2-dimensional (2D), mas pode ser facilmente estendido para imagens em 3D. É bem adequado para estudar a formação de padrões espaciais dentro do citoplasma. Com dados representativos, demonstramos a organização dinâmica típica de microtúbulos, núcleos e mitocôndrias em extratos interfásicos preparados usando este método. Esses dados de imagem podem fornecer informações quantitativas sobre a dinâmica citoplasmática e a organização espacial.
Introduction
O citoplasma constitui o volume principal de uma célula e tem uma organização distinta. Os ingredientes do citoplasma eucariótico podem se auto-montar em uma ampla gama de estruturas espaciais, como as ásteres de microtúbulos e o aparelho de Golgi, que por sua vez são dinamicamente dispostos e transformados dependendo da identidade da célula e do estado fisiológico. Compreender a organização espacial do citoplasma e sua ligação com as funções celulares é, portanto, importante para entender como a célula funciona. Os extratos de ovos de Xenopus laevis têm sido tradicionalmente utilizados para ensaios bioquímicos a granel 1,2,3,4,5,6,7,8, mas trabalhos recentes os estabelecem como um poderoso sistema de imagem viva para estudos mecanicistas de estruturas citoplasmáticas e suas funções celulares 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Esses extratos não diluídos preservam muitas estruturas e funções do citoplasma, ao mesmo tempo em que permitem manipulações diretas de conteúdo citoplasmático não alcançáveis em modelos convencionais baseados em células19,20. Isso os torna ideais para caracterizar fenômenos citoplasmáticos e dissecar seus fundamentos mecanicistas.
Os métodos existentes para extratos de imagem requerem modificações químicas de superfície ou fabricação de dispositivos microfluídicos. Um método baseado em deslizamento de cobertura requer a passivação de polietilenoglicol (PEG) de coberturas de vidro21. Um método baseado em microemulsão requer a deposição de vapor de tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano em superfícies de vidro22,23. Os sistemas de base microfluídica permitem o controle preciso do volume, geometria e composição das gotículas de extrato, mas requerem instalações especializadas de microfabricação 11,12,24.
Aqui apresentamos um método alternativo para a imagem de extratos de ovos que é fácil de implementar e utiliza materiais prontamente disponíveis e de baixo custo. Isso inclui a preparação de uma câmara de imagem com uma lâmina e uma folha de cobertura revestida com fita fluorada de etileno propileno (FEP). A câmara pode ser usada para extratos de imagem com uma variedade de sistemas de microscopia, incluindo estereoscópios e microscópios verticais e invertidos. Este método não requer tratamento químico de superfícies, ao mesmo tempo em que alcança clareza óptica semelhante obtida com os métodos existentes à base de vidro discutidos acima. Ele é projetado para criar imagens de uma camada de extratos com uma espessura uniforme em um campo 2D e pode ser facilmente estendido para visualizar um volume 3D de extratos. É bem adequado para imagens de lapso de tempo do comportamento citoplasmático coletivo em um grande campo de visão.
Usamos extratos de ovos presos entre fases para demonstrar nosso método de imagem. A preparação do extrato segue o protocolo de Deming e Kornbluth19. Resumidamente, os ovos naturalmente presos na metáfase da meiose II são esmagados por um giro de baixa velocidade. Este spin libera o citoplasma da parada meiótica e permite que o extrato prossiga para a interfase. Normalmente, a citocalasina B é adicionada antes do spin de esmagamento para inibir a formação de F-actina. No entanto, pode ser omitido se a F-actina for desejada. A cicloheximida também é adicionada antes do spin de esmagamento para evitar que o extrato interfásico entre na próxima mitose. Os extratos são posteriormente colocados nas câmaras de imagem acima mencionadas e colocados em um microscópio. Finalmente, as imagens são gravadas ao longo do tempo em intervalos definidos por uma câmera conectada ao microscópio, produzindo séries de imagens de lapso de tempo que capturam o comportamento dinâmico da extração em um campo 2D.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Stanford.
1. Preparação de lâminas e folhas de cobertura
- Aplique uma camada de fita adesiva de etileno propileno fluorado (FEP) em uma lâmina de vidro com um aplicador de rolos. Corte a fita adesiva excessiva sobre as bordas com uma lâmina de barbear limpa. Prepare as coberturas revestidas com fita FEP da mesma forma (Figura 1A).
- Aplique um espaçador de imagem pegajoso de dupla face no lado revestido de fita FEP do slide. Deixe o forro protetor na parte superior descascado (Figura 1A).
NOTA: As lâminas e as folhas de cobertura devem ser preparadas antes da experiência. Eles podem ser usados imediatamente ou armazenados em caixas para evitar o acúmulo de poeira nas superfícies. O poço no espaçador de imagem tem 120 μm de profundidade e um diâmetro de 9 mm.
2. Preparação e imagem ao vivo de extratos de ovos presos entre fases
NOTA: O protocolo a seguir é adaptado de Deming e Kornbluth19, Murray20 e Smythe e Newport25 com modificações. Todas as etapas devem ser executadas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.
- Três a dez dias antes da coleta de ovos, injete rãs Xenopus laevis maduras por via subcutânea no saco linfático dorsal com 100 UI de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG).
- Dezesseis a dezoito horas antes da coleta planejada de ovos, injete as rãs da etapa 2.1 com 500 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG). Deixar as rãs a 18 °C em tampão de postura de ovos (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2 O, 2,5 mM CaCl 2·2H2O, 0,5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, preparar como solução-mãe 20x a pH 7,4 e diluir com água limpa do tanque de rãs a 1x antes da utilização) até à recolha dos ovos.
- No dia do experimento, colete ovos em uma grande placa de Petri de vidro e avalie a qualidade dos ovos. Descarte todos os ovos que se pareçam com bolas brancas inchadas ou que apareçam em uma corda (Figura 1B). Examine os ovos sob um estereoscópio, mantenha os ovos com aparência normal (Figura 1C) e descarte aqueles com pigmento irregular ou manchado (Figura 1D).
NOTA: Este protocolo funciona com ovos coletados de uma única rã, que normalmente põe 25 mL de ovos em 16 horas após a injeção de hCG. Normalmente, um total de 3 a 6 rãs são induzidas por hCG, e a rã com a mais alta qualidade de ovos é escolhida para o experimento de preparação do extrato. - Transfira os ovos para um copo de vidro de 400 mL e remova o máximo de tampão de postura de ovos possível por decantação.
- Incubar os ovos em 100 ml de solução desanimadora preparada na hora (L-cisteína a 2% p/v em água, ajustar para pH 8,0 com NaOH) e agitá-los suavemente periodicamente. Após cerca de 3 minutos, despeje a solução e adicione 100 mL de solução fresca de dejelling. Continue a incubação até que os ovos estejam bem embalados (sem espaço entre os ovos), mas evite deixar os ovos na solução desanimadora por mais de um total de 5 minutos.
- Remover o máximo possível da solução desanimadora por decantação e lavar os ovos em tampão MMR 0,25x (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, preparado como uma solução-mãe 10x, ajustado ao pH 7,8 com NaOH e diluído em água Milli-Q antes do uso) adicionando o tampão, girando os ovos e, em seguida, despejando o tampão. Repita algumas vezes até que um total de 1 L do tampão seja usado para as lavagens.
- Lave os ovos algumas vezes com um total de 400 mL de tampão de lise do ovo (250 mM de sacarose, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, feito fresco e ajustado ao pH 7,7 com KOH). Remova os ovos com aparência anormal usando uma pipeta Pasteur entre as lavagens.
NOTA: Ovos com aparência anormal referem-se àqueles que se parecem com bolas brancas inchadas (Figura 1B), têm pigmentação manchada (Figura 1D), estão se deteriorando com uma região branca crescente (Figura 1E) ou mostram área pigmentada escurecida e contraída no hemisfério animal (Figura 1F). - Usando uma pipeta de transferência com a ponta bem aberta, transfira os ovos para um tubo de centrífuga de fundo redondo de 17 mL contendo 1 mL de tampão de lise de ovos. Gire o tubo em uma centrífuga clínica a 400 x g por 15 segundos para embalar os ovos.
- Remova o máximo possível do tampão de lise do ovo do topo dos ovos embalados usando uma pipeta Pasteur.
NOTA: É importante remover o máximo de tampão possível dos ovos embalados, a fim de minimizar a diluição do extrato de ovo. Às vezes, é necessário remover alguns ovos soltos junto com o tampão residual para conseguir isso. - Determine o volume aproximado dos ovos embalados e, em seguida, adicione 5 μg/mL de aprotinina, 5 μg/mL de leupeptina, 5 μg/mL de citocalasina B e 50 μg/mL de cicloheximida diretamente sobre os ovos embalados.
NOTA: A aprotinina e a leupeptina são inibidores da protease. A citocalasina B inibe a polimerização da actina, impedindo a contração e gelificação do extrato26. A cicloheximida inibe a síntese de proteínas, mantendo assim o extrato na interfase do ciclo celular. - Esmagar os ovos centrifugando o tubo a 12.000 x g, 4 °C, durante 15 minutos, num rotor de balde oscilante.
NOTA: Ao final da centrifugação, os ovos devem ter se rompido e o lisado separado em três camadas principais: uma camada lipídica amarela no topo, o extrato citoplasmático (também chamado de extrato bruto) no meio e uma camada densa escura contendo os grânulos de pigmento na parte inferior (Figura 1G). - Ligue uma agulha de calibre 18 a uma seringa. Com o bisel da ponta da agulha voltado para cima, perfure o tubo do lado na parte inferior da camada citoplasmática e recupere o extrato desenhando lentamente.
NOTA: Desenhe o extrato citoplasmático lentamente para evitar a inclusão de conteúdo contaminante da camada lipídica amarela. - Transfira o extrato citoplasmático recuperado para um novo tubo de microcentrífuga e mantenha-o no gelo. Use o extrato dentro de 1 hora.
- Quando estiver pronto para a imagem, complemente o extrato com os reagentes desejados e sondas de imagem de fluorescência.
NOTA: As sondas de imagem de fluorescência rotulam estruturas citoplasmáticas específicas para que possam ser visualizadas por um microscópio de fluorescência. - Remova o revestimento protetor superior do espaçador de imagem na lâmina preparada na etapa 1.2 e deposite aproximadamente 7 μL de extrato no centro do poço. Aplique imediatamente a tampa revestida com fita FEP com o lado FEP voltado para o extrato para selar o poço. Prossiga rapidamente para a geração de imagens (Figura 1H,I).
- Coloque a lâmina em um microscópio invertido ou vertical com um palco motorizado e uma câmera digital. Fotografe os extratos nas posições espaciais desejadas e nos intervalos de tempo em canais de campo brilhante e fluorescência.
Observação : normalmente, um objetivo de 5x é usado para geração de imagens. O estágio motorizado permite a aquisição automatizada de imagens em várias posições espaciais definidas. A microscopia de campo brilhante visualiza estruturas citoplasmáticas com diferentes graus de transparência. A microscopia de fluorescência visualiza as estruturas citoplasmáticas especificamente marcadas pelas sondas de imagem de fluorescência adicionadas na etapa 2.14. A câmera registra imagens de lapso de tempo dessas estruturas, capturando assim a dinâmica da organização citoplasmática.
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Representative Results
Extratos de ovos de Xenopus laevis podem ser usados para estudar a auto-organização do citoplasma durante a interfase. A Figura 2A mostra os resultados de um experimento bem-sucedido. Suplementamos extratos interfaseados com núcleos de espermatozoides desembranados de Xenopus laevis 19 na concentração de 27 núcleos/μL e 0,38 μM purificados GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (proteína de fusão constituída por glutationa-S-transferase, proteína verde fluorescente e uma sequência de localização nuclear) para permitir a reconstituição e visualização de núcleos interfásicos. Também adicionamos 1 μM de tubulina marcada fluorescentemente para visualizar microtúbulos e 500 nM MitoTracker Red CMXRos para visualizar mitocôndrias. Momentos após a colocação do extrato na câmara de imagem, o citoplasma apareceu desorganizado. No decorrer dos próximos 30 minutos à temperatura ambiente, o citoplasma começou a se auto-organizar em compartimentos semelhantes a células. As ásteres microtúbulas cresceram a partir de centrossomos introduzidos com os núcleos esperminosos e formaram zonas fronteiriças empobrecidas por microtúbulos quando se encontraram com microtúbulos de asters vizinhas. Proteína GST-GFP-NLS translocada para os núcleos interfásicos redondos auto-montados a partir dos núcleos de esperma desembranados adicionados. Áreas esgotadas de componentes citoplasmáticos de dispersão de luz foram visíveis tanto em canais de campo claro quanto em mitocôndrias (Figura 2A, 20 min e 35 min). As mitocôndrias também se esgotaram das bordas estabelecidas pelos microtúbulos e se enriqueceram em compartimentos isolados que se alinhavam com os compartimentos dos microtúbulos. Por 60 min à temperatura ambiente, um padrão espacial consistindo de compartimentos semelhantes a células deve estar bem estabelecido, com microtúbulos formando uma estrutura oca semelhante a uma coroa de flores, e mitocôndrias claramente particionadas em cada compartimento (Figura 2A, 53 min).
A Figura 2B compara o desempenho do extrato em câmaras de imagem com e sem fitas FEP em vidro. Suplementamos extratos interfaseados com núcleos de espermatozoides desembranados de Xenopus laevis 19 na concentração de 27 núcleos/μL e 0,35 μM GST-mCherry-NLS27,28,29,30 (proteína de fusão consistindo de glutationa-S-transferase, proteína fluorescente mCherry e uma sequência de localização nuclear) para permitir a reconstituição e visualização de núcleos interfásicos. Também adicionamos 1 μM de tubulina marcada fluorescentemente para visualizar microtúbulos. Diferenças na dinâmica tornaram-se óbvias por aproximadamente 20 minutos à temperatura ambiente. Na câmara feita com vidro colado em FEP, o extrato se auto-organizou em padrões normais semelhantes a células (Figura 2B, imagens nas linhas 1 e 3). No entanto, na câmara onde as superfícies de vidro não estavam cobertas pela fita FEP (não passivada), o extrato mostrou padrões anormais de campo brilhante e microtúbulos que se tornaram cada vez mais interrompidos ao longo do tempo (Figura 2B, imagens nas linhas 2 e 4). Não foram observadas diferenças significativas na importação nuclear da proteína GST-mCherry-NLS (Figura 2B, imagens nas linhas 5 e 6).
Figura 1: Esquemas e fotos relacionadas ao procedimento experimental. (A) Diagrama esquemático para a preparação de lâminas e lâminas de vidro revestidas com fita FEP. B) Ovos de Xenopus laevis depositados em tampão de postura de ovos, com exemplos de ovos de baixa qualidade indicados por setas. Setas amarelas, exemplos de ovos que se parecem com bolas brancas inchadas. Setas vermelhas, exemplos de ovos que aparecem em uma cadeia de caracteres. (C) Exemplos de ovos de Xenopus laevis com aparência normal. (D) Exemplos de ovos de baixa qualidade com pigmento irregular ou manchado. (E) Um ovo em deterioração com uma região branca em crescimento. (F) Um ovo que mostra área pigmentada escurecida e contraída, possivelmente devido à ativação partenogenética. (G) As camadas formadas por ovos de Xenopus laevis rompidos após a centrifugação de 12.000 x g na etapa 2.11. (H) Esquemas para a preparação da câmara de imagem do extracto na fase 2.15. (I) Uma foto de uma câmara de imagem preparada com um extrato de ovo dentro. (C) e (D) compartilham a mesma barra de escala na parte inferior de (D). (E) e (F) compartilham a mesma barra de escala na parte inferior de (F). As barras de escala em (B) (C) (D) (E) (F) e (I) são aproximadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Extratos de ovos presos por interfase se auto-organizam em compartimentos semelhantes a células . (A)Montagem de lapso de tempo de formação de padrão auto-organizado em uma camada fina (120 μm) de extrato de ovo de Xenopus laevis preso por interfase. O extrato foi suplementado com 27 núcleos/μL de núcleos de espermatozoides de Xenopus laevis desembranados para permitir a reconstituição dos núcleos interfásicos. Os microtúbulos foram visualizados pela tubulina marcada com HiLyte 647 (mostrada em magenta), as mitocôndrias pelo MitoTracker Red CMXRos (mostradas em vermelho) e os núcleos pelo GST-GFP-NLS (mostrados em verde). (B) Formação de padrão auto-organizado em extratos de ovos de Xenopus laevis presos entre fases colocados em câmaras com e sem superfícies de vidro cobertas de fita FEP. Os extratos foram suplementados com 27 núcleos/μL de núcleos de espermatozoides de Xenopus laevis desembranados para permitir a reconstituição dos núcleos interfásicos. Os microtúbulos foram visualizados pela tubulina marcada com HiLyte 488 (mostrada em magenta) e os núcleos pela GST-mCherry-NLS (mostrada em verde). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Vedação secundária opcional para a câmara de imagem. Esquemas para preparar uma vedação secundária opcional com óleo mineral para evitar que o extrato entre em contato prolongado com o ar. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os extratos de ovos de Xenopus laevis emergiram como um poderoso sistema modelo para estudos baseados em imagens de várias estruturas subcelulares 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 e organização citoplasmática em um todo escala celular9. Aqui descrevemos um método de imagem ao vivo adequado para visualizar a organização citoplasmática dinâmica em 2D. A eficácia do método é demonstrada por resultados representativos.
Várias etapas são fundamentais para o sucesso do método. A qualidade do ovo é importante para extratos, por isso as etapas 2.3 e 2.7 são críticas. Em nossa experiência, o hemisfério animal de ovos de alta qualidade tem pigmentação uniforme, um ponto branco distinto no centro (indicativo de quebra da vesícula germinal, GVBD) e uma borda clara com o hemisfério vegetal (Figura 1C). Os extratos feitos de ovos de alta qualidade têm melhor desempenho sob nossas condições de imagem. Se mais de 5% dos ovos tiverem pigmento manchado (Figura 1D), tiverem área pigmentada escurecida e contraída (Figura 1F), parecerem bolas brancas inchadas (Figura 1B), aparecerem em uma corda (Figura 1B) ou apresentarem sinais de deterioração após as lavagens nas etapas 2.6 e 2.7 (Figura 1E), todo o lote de ovos deverá ser descartado. Os extratos retêm uma atividade biológica notável porque são essencialmente citoplasma não diluído. Portanto, a etapa que visa minimizar a diluição do extrato (etapa 2.9) é importante para o sucesso do experimento. Para imagens, os extratos são manuseados em volumes muito pequenos e evaporam rapidamente se em contato prolongado com o ar. Isso afetará negativamente sua atividade. Por conseguinte, na fase 2.15, após o depósito do extracto, este deve ser selado com o lado revestido de fita FEP da folha de cobertura o mais rapidamente possível. A vedação pode ser confirmada visualmente pela mudança de textura no local de contato entre o adesivo no espaçador e a tampa. O espaçador deve ser capaz de criar uma vedação completa se aplicado corretamente. No entanto, se uma vedação adicional for desejada, o óleo mineral pode ser dispensado entre a saliência da tampa e a lâmina de vidro. O óleo pode formar uma vedação adicional ao redor do espaçador por ação capilar (Figura 3). A passivação de superfícies de vidro pode reduzir a adsorção inespecífica de moléculas, sendo importante para asters de microtúbulos interfásicos em extratos21,37. A aplicação de fita FEP sobre uma superfície de vidro aqui descrita parece oferecer benefícios semelhantes, como sugerido pela montagem de ásteres de microtúbulos interfásicos normais (Figura 2, 6 min). Portanto, a etapa 1.1 também é crítica.
Demonstramos a aplicação de um método de imagem utilizando extratos de ovos presos entre fases seguindo o protocolo de Deming e Kornbluth19. Por padrão, o protocolo complementa os extratos com o inibidor de polimerização de actina citocalasina B para evitar a gelificação-contração nos extratos após incubação prolongada à temperatura ambiente26. Para permitir a polimerização da actina e observar a dinâmica da actina, pode-se deixar de fora a citocalasina B na etapa 2.10 do protocolo9. Uma modificação que fizemos no protocolo de Deming e Kornbluth é que não suplementamos extratos com uma mistura de energia para regenerar o ATP19. Isso ocorre porque, em nossas mãos, em extratos suplementados com essa mistura regeneradora de ATP19 e núcleos de espermatozoides, os microtúbulos ocasionalmente formam uma rede reticulada que interfere na formação do padrão citoplasmático. Portanto, o protocolo não inclui a etapa que adiciona a matriz energética aos extratos19.
O protocolo de extrato interfásico baseia-se no esmagamento de ovos em tampão livre de EGTA para liberá-los da parada meiótica (LCR-arrest)37. Os extratos subsequentemente progridem para a interfase e são mantidos em interfase pela cicloheximida. Existem outros métodos estabelecidos para a preparação de extratos interfásicos. Alguns métodos primeiro preparam extratos que mantêm a parada meiótica esmagando ovos em tampão de lise com EGTA38 e, em seguida, liberam a parada pela adição de cálcio, levando o extrato à interfase 21,37,39. Os extratos podem ser posteriormente mantidos em interfase pela adição de inibidores da síntese proteica, como a cicloheximida37,39. Outros métodos partenogeneticamente ativam ovos com ionóforo de cálcio (A23187) ou choque elétrico para liberá-los da parada meiótica, antes de esmagar os ovos na ausência de EGTA20,28 (revisado em Field et al.37). Esses extratos podem entrar em interfase, mas normalmente não permanecerão lá, pois são capazes de passar por vários ciclos celulares. Da mesma forma, métodos bem estabelecidos, otimizados para o preparo de extratos com citoesqueleto de actina intacto, têm sido desenvolvidos 10,37,39. O método de imagem pode ser adequado para esses tipos de extratos, mas não o testamos com eles.
Para fins de imagem da organização interna do citoplasma, os sistemas de imagem aqui apresentados são relativamente fáceis de configurar, exigindo apenas a aplicação de uma fita FEP nas superfícies de vidro. Permite a montagem de estruturas citoesqueléticas em extratos9 relatados em sistemas de imagem mais sofisticados, onde as superfícies de vidro são passivadas com tratamento com poli-L-lisina-g-polietilenoglicol (PLL-g-PEG) ou revestidas com bicamadas lipídicas suportadas10,21. O método permite que a camada de extração se forme com uma espessura definida (determinada pela profundidade do espaçador, que é de 120 μm para o sistema mostrado na Figura 1A, 1H, 1I e Figura 2). Podemos ajustar a espessura empilhando espaçadores adicionais. Nós empilhamos até 6 desses espaçadores (720 μm de espessura) e os compartimentos se formaram normalmente. Essa flexibilidade permite aplicações futuras, como a geração de imagens dos extratos em 3D usando microscopia confocal ou de folha de luz.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a J. Kamenz, Y. Chen e W. Y. C. Huang pelos comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por doações dos Institutos Nacionais de Saúde (R01 GM110564, P50 GM107615 e R35 GM131792) concedidas a James E. Ferrell, Jr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22x22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
References
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