Summary
Vi beskriver en metode til fremstilling og levende billeddannelse af ufortyndede cytoplasmatiske ekstrakter fra Xenopus laevis æg.
Abstract
Traditionelt anvendt til bulk biokemiske assays, Xenopus laevis ægekstrakter er opstået som et kraftfuldt billeddannelsesbaseret værktøj til at studere cytoplasmatiske fænomener, såsom cytokinesis, mitotisk spindeldannelse og samling af kernen. Baseret på tidlige metoder, der afbildede faste ekstrakter, der blev samplet på sparsomme tidspunkter, har de seneste tilgange billede live ekstrakter ved hjælp af time-lapse mikroskopi, der afslører mere dynamiske funktioner med forbedret tidsmæssig opløsning. Disse metoder kræver normalt sofistikerede overfladebehandlinger af billeddannelsesbeholderen. Her introducerer vi en alternativ metode til levende billeddannelse af ægekstrakter, der ikke kræver kemisk overfladebehandling. Det er nemt at implementere og bruger masseproducerede laboratorieforbrugsstoffer til billeddannelse. Vi beskriver et system, der kan bruges til både bredfelts- og konfokalmikroskopi. Det er designet til billeddannelsesekstrakter i et 2-dimensionelt (2D) felt, men kan let udvides til billeddannelse i 3D. Det er velegnet til at studere rumlig mønsterdannelse inden for cytoplasmaet. Med repræsentative data demonstrerer vi den typiske dynamiske organisering af mikrotubuli, kerner og mitokondrier i interfaseekstrakter fremstillet ved hjælp af denne metode. Disse billeddata kan give kvantitativ information om cytoplasmisk dynamik og rumlig organisation.
Introduction
Cytoplasmaet udgør hovedvolumenet af en celle og har en særskilt organisation. Ingredienserne i det eukaryote cytoplasma kan selv samles i en bred vifte af rumlige strukturer, såsom mikrotubulus asters og Golgi-apparatet, som igen er dynamisk arrangeret og vendt afhængigt af cellens identitet og fysiologiske tilstand. At forstå den rumlige organisation af cytoplasmaet og dets forbindelse til cellulære funktioner er således vigtigt for at forstå, hvordan cellen fungerer. Xenopus laevis ægekstrakter er traditionelt blevet brugt til bulk biokemiske assays 1,2,3,4,5,6,7,8, men nyere arbejde etablerer dem som et kraftfuldt levende billeddannelsessystem til mekanistiske undersøgelser af cytoplasmatiske strukturer og deres cellulære funktioner 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Disse ufortyndede ekstrakter bevarer mange strukturer og funktioner i cytoplasmaet, samtidig med at de tillader direkte manipulationer af cytoplasmatisk indhold, der ikke kan opnås i konventionelle cellebaserede modeller19,20. Dette gør dem ideelle til at karakterisere cytoplasmatiske fænomener og dissekere deres mekanistiske underlag.
Eksisterende metoder til billeddannelsesekstrakter kræver kemiske overflademodifikationer eller fremstilling af mikrofluidiske enheder. En coverslip-baseret metode kræver polyethylenglycol (PEG) passivering af glasdæksler21. En mikroemulsionsbaseret metode kræver dampaflejring af trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan på glasoverflader22,23. Mikrofluidbaserede systemer muliggør præcis kontrol af volumen, geometri og sammensætning af ekstraktdråber, men kræver specialiserede mikrofabrikationsfaciliteter11,12,24.
Her introducerer vi en alternativ metode til billeddannelse af ægekstrakter, der er let at implementere og bruger let tilgængelige, billige materialer. Dette omfatter fremstilling af et billeddannelseskammer med et dias og en dæksel belagt med fluoreret ethylenpropylen (FEP) tape. Kammeret kan bruges til billeddannelsesekstrakter med en række mikroskopisystemer, herunder stereoskoper og opretstående og inverterede mikroskoper. Denne metode kræver ingen kemisk behandling af overflader, samtidig med at der opnås lignende optisk klarhed opnået med eksisterende glasbaserede metoder, der er diskuteret ovenfor. Det er designet til at afbilde et lag af ekstrakter med en ensartet tykkelse over et 2D-felt og kan let udvides til at afbilde et 3D-volumen ekstrakter. Det er velegnet til time-lapse-billeddannelse af kollektiv cytoplasmisk adfærd over et stort synsfelt.
Vi har brugt interfase-arresterede ægekstrakter til at demonstrere vores billeddannelsesmetode. Ekstraktpræparatet følger protokollen for Deming og Kornbluth19. Kort fortalt knuses æg, der naturligt arresteres i metafase af meiose II, af et lavt hastighedsspin. Dette spin frigiver cytoplasmaet fra meiotisk anholdelse og tillader ekstraktet at fortsætte ind i interfase. Normalt tilsættes cytochalasin B før knusningsspin for at hæmme dannelsen af F-actin. Det kan dog udelades, hvis F-actin ønskes. Cycloheximid tilsættes også før knusningsspin for at forhindre interfaseekstraktet i at komme ind i den næste mitose. Ekstrakterne placeres efterfølgende i de førnævnte billeddannelseskamre og placeres på et mikroskop. Endelig optages billeder over tid med definerede intervaller af et kamera, der er forbundet til mikroskopet, hvilket producerer time-lapse-billedserier, der fanger ekstraktets dynamiske opførsel i et 2D-felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Stanford University.
1. Forberedelse af dias og coverslips
- Påfør et lag fluoreret ethylenpropylen (FEP) klæbebånd på et glasglas med en rulleapplikator. Afskær overdreven tape over kanterne med et rent barberblad. Forbered FEP tape-coatede dæksler på samme måde (figur 1A).
- Påfør en dobbeltsidet klæbrig billedafstandsstykke på den FEP-båndbelagte side af diaset. Lad beskyttelsesforingen på toppen være skrællet (figur 1A).
BEMÆRK: Dias og coverslips skal udarbejdes inden eksperimentet. De kan bruges med det samme eller opbevares i kasser for at forhindre støvophobning på overflader. Brønden i billedafstandsstykket er 120 μm dyb og har en diameter på 9 mm.
2. Forberedelse og levende billeddannelse af interfase-arresterede ægekstrakter
BEMÆRK: Følgende protokol er tilpasset fra Deming og Kornbluth19, Murray20 og Smythe og Newport25 med ændringer. Alle trin skal udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
- Tre til ti dage før ægopsamling injiceres modne kvindelige Xenopus laevis frøer subkutant i dorsal lymfesæk med 100 IE gravid hoppe serum gonadotropin (PMSG).
- Seksten til atten timer før planlagt ægindsamling injiceres frøerne fra trin 2.1 med 500 IE humant choriongonadotropin (hCG). Lad frøer stå ved 18 °C i æglægningsbuffer (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2O, 2,5 mM CaCl 2·2H2O, 0,5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, tilberedes som en20xstamopløsning ved pH7,4 og fortyndes med rent frøtankvand til 1x før brug) indtil ægopsamling.
- På dagen for eksperimentet samles æg i et stort glas petriskål og vurderer ægkvaliteten. Kassér æg, der ligner hvide puffede kugler eller vises i en streng (figur 1B). Undersøg æggene under et stereoskop, hold æggene med normalt udseende (figur 1C), og kassér dem med uregelmæssigt eller plettet pigment (figur 1D).
BEMÆRK: Denne protokol fungerer med æg indsamlet fra en enkelt frø, som typisk lægger 25 ml æg 16 timer efter hCG-injektion. Normalt induceres i alt 3 til 6 frøer af hCG, og frøen med den højeste ægkvalitet vælges til ekstraktpræparatforsøget. - Overfør æg til et 400 ml glasbægerglas, og fjern så meget æglægningsbuffer som muligt ved dekantering.
- Æggene inkuberes i 100 ml frisklavet dejellying opløsning (2% w/v L-cystein i vand, justeres til pH 8,0 med NaOH) og hvirvles forsigtigt med jævne mellemrum. Efter ca. 3 minutter hældes opløsningen af, og der tilsættes 100 ml frisk dejellying opløsning. Fortsæt inkubationen, indtil æggene er tæt pakket (ingen mellemrum mellem æg), men undgå at efterlade æg i dejellyopløsningen i mere end i alt 5 minutter.
- Fjern så meget af degeleringsopløsningen som muligt ved dekantering, og vask æggene i 0,25x MMR-buffer (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, fremstillet som en 10x stamopløsning, justeret til pH 7,8 med NaOH og fortyndet i Milli-Q-vand før brug) ved at tilsætte bufferen, hvirvler æggene og hælder derefter bufferen af. Gentag et par gange, indtil i alt 1 liter af bufferen er brugt til vaskene.
- Æggene vaskes et par gange med i alt 400 ml æglysebuffer (250 mM saccharose, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, frisklavet og justeret til pH 7,7 med KOH). Fjern æg med unormalt udseende ved hjælp af en Pasteur-pipette mellem vaskene.
BEMÆRK: Æg med unormalt udseende henviser til dem, der ligner hvide puffede bolde (figur 1B), har plettet pigmentering (figur 1D), forværres med et voksende hvidt område (figur 1E) eller viser mørkt og kontraheret pigmenteret område på dyrehalvkuglen (figur 1F). - Ved hjælp af en transferpipette med spidsen skåret vidt åben overføres æggene til et 17 ml rundbundet centrifugerør indeholdende 1 ml æglysebuffer. Drej røret i en klinisk centrifuge ved 400 x g i 15 sekunder for at pakke æggene.
- Fjern så meget af æglysebufferen som muligt fra toppen af pakkede æg ved hjælp af en Pasteur-pipette.
BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne så meget buffer fra de pakkede æg som muligt for at minimere fortyndingen af ægekstraktet. Nogle gange er det nødvendigt at fjerne nogle løse æg sammen med den resterende buffer for at opnå dette. - Bestem det omtrentlige volumen af de pakkede æg, og tilsæt derefter 5 μg/ml aprotinin, 5 μg/ml leupeptin, 5 μg/ml cytochalasin B og 50 μg/ml cycloheximid direkte oven på de pakkede æg.
BEMÆRK: Aprotinin og leupeptin er proteasehæmmere. Cytochalasin B hæmmer actinpolymerisation, hvilket forhindrer ekstraktet i at trække sig sammen og gelere26. Cycloheximid hæmmer proteinsyntese og derved holder ekstraktet i interfasen af cellecyklussen. - Knus æggene ved at centrifugere røret ved 12.000 x g, 4 °C, i 15 minutter i en svingende spandrotor.
BEMÆRK: Ved afslutningen af centrifugeringen skulle æggene være bristet, og lysatet adskilt i tre hovedlag: et gult lipidlag ovenpå, det cytoplasmatiske ekstrakt (også kaldet råekstrakt) i midten og et mørkt tæt lag indeholdende pigmentgranulatet i bunden (figur 1G). - Fastgør en 18-gauge nål til en sprøjte. Med nålespidsen skråt opad, punktere røret fra siden i bunden af det cytoplasmatiske lag og genvinde ekstraktet ved at trække langsomt.
BEMÆRK: Tegn det cytoplasmatiske ekstrakt langsomt for at undgå inkludering af forurenende indhold fra det gule lipidlag. - Overfør det genvundne cytoplasmatiske ekstrakt til et nyt mikrocentrifugerør og hold det på is. Brug ekstraktet inden for 1 time.
- Når du er klar til at afbilde, skal du supplere ekstraktet med ønskede reagenser og fluorescensbilledprober.
BEMÆRK: Fluorescensbilleddannelsessonder mærker specifikke cytoplasmatiske strukturer, så de kan visualiseres af et fluorescensmikroskop. - Fjern den øverste beskyttelsesforing fra billedafstandsstykket på diaset, der er forberedt i trin 1.2, og afsæt ca. 7 μL ekstrakt i midten af brønden. Påfør straks FEP tape-coated coverslip med FEP-siden vendt mod ekstraktet for at forsegle brønden. Fortsæt hurtigt til billeddannelse (figur 1H, I).
- Indstil diaset på et omvendt eller opretstående mikroskop med et motoriseret trin og et digitalt kamera. Billede ekstrakterne ved ønskede rumlige positioner og tidsintervaller i både lysfelt- og fluorescenskanaler.
BEMÆRK: Typisk bruges et 5x mål til billeddannelse. Den motoriserede fase muliggør automatiseret billedoptagelse på flere definerede rumlige positioner. Lysfeltmikroskopi visualiserer cytoplasmatiske strukturer med forskellige grader af gennemsigtighed. Fluorescensmikroskopi visualiserer de cytoplasmatiske strukturer, der specifikt er mærket af fluorescensbilledproberne tilføjet i trin 2.14. Kameraet optager time-lapse-billeder af disse strukturer og fanger derved dynamikken i cytoplasmatisk organisation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Xenopus laevis ægekstrakter kan bruges til at studere cytoplasmaets selvorganisering under interfase. Figur 2A viser resultater fra et vellykket eksperiment. Vi supplerede interfase-arresterede ekstrakter med demembranerede Xenopus laevis sædkerner19 i en koncentration på 27 kerner / μL og 0,38 μM renset GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (fusionsprotein bestående af glutathion-S-transferase, grønt fluorescerende protein og en nuklear lokaliseringssekvens) for at muliggøre rekonstitution og visualisering af interfasekerner. Vi tilføjede også 1 μM fluorescerende mærket tubulin for at visualisere mikrotubuli og 500 nM MitoTracker Red CMXRos for at visualisere mitokondrier. Øjeblikke efter ekstraktet blev anbragt i billeddannelseskammeret, syntes cytoplasmaet uorganiseret. I løbet af de næste 30 minutter ved stuetemperatur begyndte cytoplasmaet at selvorganisere sig i cellelignende rum. Microtubule asters voksede fra centrosomer introduceret med sædkernerne og dannede mikrotubuli-udtømte grænsezoner, når de blev mødt med mikrotubuli fra nabo asters. GST-GFP-NLS-protein translokeret til de runde interfasekerner, der er selvsamlet fra de tilsatte demembranerede sædkerner. Områder udtømt for lysspredende cytoplasmatiske komponenter var synlige i både lysfelt- og mitokondrier kanaler (figur 2A, 20 min og 35 min). Mitokondrier blev også udtømt fra grænserne etableret af mikrotubuli og blev beriget i isolerede rum, der var på linje med mikrotubulusrum. Ved 60 minutter ved stuetemperatur skal et rumligt mønster bestående af cellelignende rum være veletableret, med mikrotubuli, der danner en hul kranslignende struktur, og mitokondrier tydeligt opdelt i hvert rum (figur 2A, 53 min).
Figur 2B sammenligner ekstraktydelsen i billeddannende kamre med og uden FEP-bånd på glas. Vi supplerede interfase-arresterede ekstrakter med demembranerede Xenopus laevis sædkerner 19 i en koncentration på 27 kerner / μL og 0,35 μM GST-mCherry-NLS27,28,29,30 (fusionsprotein bestående af glutathion-S-transferase, mCherry fluorescerende protein og en nuklear lokaliseringssekvens) for at muliggøre rekonstitution og visualisering af interfasekerner. Vi tilføjede også 1 μM fluorescerende mærket tubulin for at visualisere mikrotubuli. Forskelle i dynamik blev tydelige med ca. 20 minutter ved stuetemperatur. I kammeret lavet med FEP-tapet glas er ekstraktet selvorganiseret i normale cellelignende mønstre (figur 2B, billeder i række 1 og 3). I kammeret, hvor glasoverflader ikke var dækket af FEP-båndet (ikke passiveret), viste ekstraktet imidlertid unormale lysfelt- og mikrotubulusmønstre, der blev mere og mere forstyrret over tid (figur 2B, billeder i række 2 og 4). Der blev ikke observeret signifikante forskelle i nuklear import af GST-mCherry-NLS-proteinet (figur 2B, billeder i række 5 og 6).
Figur 1: Skemaer og fotos relateret til den eksperimentelle procedure . (A) Skematisk diagram til fremstilling af FEP tape-coatede glasdæksler og dias. (B) Xenopus laevis æg deponeret i æglægningsbuffer med eksempler på æg af dårlig kvalitet angivet med pile. Gule pile, eksempler på æg, der ligner hvide puffede bolde. Røde pile, eksempler på æg, der vises i en streng. (C) Eksempler på Xenopus laevis æg med normalt udseende. (D) Eksempler på æg af dårlig kvalitet med uregelmæssigt eller plettet pigment. (E) Et forringet æg med et voksende hvidt område. (F) Et æg, der viser mørkt og kontraheret pigmenteret område, muligvis på grund af parthenogenetisk aktivering. (G) Lagene dannet af bristede Xenopus laevis-æg efter 12.000 x g centrifugering i trin 2.11. (H) Skemaer til forberedelse af ekstraktbilleddannelseskammer i trin 2.15. (I) Et foto af et forberedt billeddannelseskammer med et ægekstrakt indeni. (C) og (D) deler den samme skalabjælke nederst i (D). (E) og (F) deler den samme skalabjælke nederst i (F). Skalabjælkerne i (B) (C) (D) (E) (F) og (I) er omtrentlige. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Interfase-arresterede ægekstrakter selvorganiserer sig i cellelignende rum . (A) Time-lapse montage af selvorganiseret mønsterdannelse i et tyndt lag (120 μm) interfase-arresteret Xenopus laevis ægekstrakt. Ekstraktet blev suppleret med 27 kerner / μL af demembranerede Xenopus laevis sædkerner for at muliggøre rekonstitution af interfasekernerne. Mikrotubuli blev visualiseret af HiLyte 647-mærket tubulin (vist i magenta), mitokondrier af MitoTracker Red CMXRos (vist med rødt) og kerner af GST-GFP-NLS (vist med grønt). (B) Selvorganiseret mønsterdannelse i interfase-arresterede Xenopus laevis ægekstrakter placeret i kamre med og uden FEP-tape dækkede glasoverflader. Ekstrakterne blev suppleret med 27 kerner / μL af demembranerede Xenopus laevis sædkerner for at muliggøre rekonstitution af interfasekernerne. Mikrotubuli blev visualiseret af HiLyte 488-mærket tubulin (vist i magenta) og kerner af GST-mCherry-NLS (vist med grønt). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Valgfri sekundær tætning til billedkammeret. Skemaer til fremstilling af en valgfri sekundær tætning med mineralolie for at forhindre ekstraktet i langvarig kontakt med luft. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus laevis ægekstrakter er opstået som et kraftfuldt modelsystem til billeddannelsesbaserede undersøgelser af forskellige subcellulære strukturer 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 og cytoplasmatisk organisation i det hele taget celle skala9. Her har vi beskrevet en levende billeddannelsesmetode, der er egnet til visualisering af dynamisk cytoplasmatisk organisation i 2D. Metodens effektivitet demonstreres ved repræsentative resultater.
Flere trin er afgørende for metodens succes. Ægkvalitet er vigtig for ekstrakter, så trin 2.3 og 2.7 er kritiske. Efter vores erfaring har dyrehalvkuglen af æg af høj kvalitet ensartet pigmentering, en tydelig hvid prik i midten (tegn på kimblærenedbrydning, GVBD) og en klar kant med den vegetabilske halvkugle (figur 1C). Ekstrakterne fremstillet af æg af høj kvalitet har bedre ydeevne under vores billeddannelsesforhold. Hvis mere end 5% af æggene har plettet pigment (figur 1D), har mørkt og kontraheret pigmenteret område (figur 1F), ligner hvide puffede kugler (figur 1B), vises i en streng (figur 1B) eller viser tegn på forringelse efter vasken i trin 2.6 og 2.7 (figur 1E), skal hele ægpartiet kasseres. Ekstrakterne bevarer bemærkelsesværdig biologisk aktivitet, fordi de i det væsentlige er ufortyndet cytoplasma. Derfor er det trin, der sigter mod at minimere fortynding af ekstraktet (trin 2.9), vigtigt for eksperimentets succes. Til billeddannelse håndteres ekstrakter i meget små mængder og fordampes hurtigt, hvis de er i langvarig kontakt med luft. Dette vil påvirke deres aktivitet negativt. Derfor skal det i trin 2.15, efter at ekstraktet er deponeret, forsegles med den FEP-tapebelagte side af dækslippen så hurtigt som muligt. Forsegling kan bekræftes visuelt af teksturændringen på kontaktstedet mellem klæbemidlet på afstandsstykket og dækslippen. Afstandsstykket skal være i stand til at skabe en komplet tætning, hvis den påføres korrekt. Men hvis der ønskes en ekstra tætning, kan mineralolie dispenseres mellem overhænget på dækslippet og glasrutsjebanen. Olien kan danne en ekstra tætning omkring afstandsstykket ved kapillær handling (figur 3). Passivering af glasoverflader kan reducere ikke-specifik adsorption af molekyler, og det er vigtigt for interfase mikrotubuli asters i ekstrakter21,37. Anvendelsen af FEP-tape over en glasoverflade, der er beskrevet her, ser ud til at give lignende fordele, som foreslået ved samlingen af normale interfasemikrotubulusiske asters (figur 2, 6 min). Derfor er trin 1.1 også kritisk.
Vi demonstrerede anvendelsen af en billeddannelsesmetode ved hjælp af interfase-arresterede ægekstrakter efter protokollen for Deming og Kornbluth19. Som standard supplerer protokollen ekstrakterne med actinpolymerisationsinhibitoren cytochalasin B for at forhindre geleringskontraktion i ekstrakterne efter forlænget inkubation ved stuetemperatur26. For at tillade actinpolymerisation og observere actindynamik kan man udelade cytochalasin B i trin 2.10 i protokol9. En ændring, vi har foretaget i Deming- og Kornbluth-protokollen, er, at vi ikke supplerer ekstrakter med et energimix for at regenerere ATP19. Dette skyldes, at i vores hænder, i ekstrakter suppleret med denne ATP-regenererende blanding19 og sædkerner, danner mikrotubuli lejlighedsvis et tværbundet gitter, der forstyrrer cytoplasmatisk mønsterdannelse. Derfor inkluderer protokollen ikke det trin, der tilføjer energimikset til ekstrakterne19.
Interfaseekstraktprotokollen er afhængig af knusning af æg i EGTA-fri buffer for at frigøre dem fra meiotisk anholdelse (CSF-arrest)37. Ekstrakterne udvikler sig efterfølgende til interfase og holdes i interfase af cycloheximid. Der er andre etablerede metoder til fremstilling af interfaseekstrakter. Nogle metoder forbereder først ekstrakter, der opretholder meiotisk anholdelse ved at knuse æg i lysisbuffer med EGTA38, og frigiver derefter anholdelsen ved at tilføje calcium, hvilket driver ekstraktet ind i interfase 21,37,39. Ekstrakterne kan efterfølgende holdes i interfase ved tilsætning af proteinsyntesehæmmere, såsom cycloheximid37,39. Andre metoder parthenogenetisk aktiverer æg med calciumionoforer (A23187) eller elektrisk stød for at frigøre dem fra meiotisk anholdelse, før æggene knuses i fravær af EGTA20,28 (gennemgået i Field et al.37). Disse ekstrakter kan komme ind i interfase, men typisk vil ikke blive der, da de er i stand til at gennemgå flere cellecyklusser. Ligeledes er der udviklet veletablerede metoder optimeret til fremstilling af ekstrakter med intakt actincytoskelet 10,37,39. Billeddannelsesmetoden kan være egnet til disse typer ekstrakter, men vi har ikke testet den med dem.
Med henblik på at diagnosticere cytoplasmaets interne organisation er billeddannelsessystemet, der præsenteres her, relativt let at konfigurere, hvilket kun kræver påføring af et FEP-bånd på glasoverflader. Det tillader samling af cytoskeletale strukturer i ekstrakter9 rapporteret i mere sofistikerede billeddannelsessystemer, hvor glasoverflader passiveres med poly-L-lysin-g-polyethylenglycol (PLL-g-PEG) behandling eller belagt med understøttet lipid dobbeltlag10,21. Metoden gør det muligt at danne ekstraktlaget med en defineret tykkelse (bestemt af afstandsstykkets dybde, som er 120 μm for systemet vist i figur 1A, 1H, 1I og figur 2). Vi kan justere tykkelsen ved at stable yderligere afstandsstykker. Vi har stablet op til 6 sådanne afstandsstykker (720 μm tykke) og rummene dannet normalt. Denne fleksibilitet muliggør fremtidige applikationer såsom billeddannelse af ekstrakterne i 3D ved hjælp af konfokal eller lysarkmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker J. Kamenz, Y. Chen og W. Y. C. Huang for kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 og R35 GM131792) tildelt James E. Ferrell, Jr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22x22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
References
- Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
- Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
- Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
- Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
- Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
- Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
- Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
- Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
- Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
- Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
- Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
- Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
- Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
- Murray, A. W.
- Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
- Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
- Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
- Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
- Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
- Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
- Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
- Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
- Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
- Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
- Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
- Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
- Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).
