Behavior

La tâche comportementale de choix à trois chambres utilisant le poisson-zèbre comme système modèle

Published: April 14, 2021 doi: 10.3791/61934

Cassie J. Rowe^1,2, Mikayla Crowley-Perry^1,3, Elizabeth McCarthy¹, Terry L. Davidson^2,4, Victoria P. Connaughton^1,2

¹Department of Biology, American University, ²Center for Behavioral Neuroscience, American University, ³Department of Chemistry, American University, ⁴Department of Neuroscience, American University

Summary

Nous présentons une chambre comportementale conçue pour évaluer les performances cognitives. Nous fournissons des données montrant qu’une fois acquis, le poisson-zèbre se souvient de la tâche 8 semaines plus tard. Nous montrons également que les poissons-zèbres hyperglycémiques ont modifié les performances cognitives, ce qui indique que ce paradigme est applicable aux études évaluant la cognition et la mémoire.

Abstract

Les maladies neurodégénératives dépendent de l’âge, sont débilitantes et incurables. Des rapports récents ont également corrélé l’hyperglycémie avec des changements dans la mémoire et / ou des troubles cognitifs. Nous avons modifié et développé une tâche cognitive de choix à trois chambres similaire à celle utilisée avec les rongeurs pour une utilisation avec le poisson-zèbre hyperglycémique. La chambre d’essai se compose d’une chambre de départ située au centre et de deux compartiments de choix de chaque côté, avec un banc de congénères utilisé comme récompense. Nous fournissons des données montrant qu’une fois acquis, le poisson-zèbre se souvient de la tâche au moins 8 semaines plus tard. Nos données indiquent que le poisson-zèbre répond de manière robuste à cette récompense, et nous avons identifié des déficits cognitifs chez les poissons hyperglycémiques après 4 semaines de traitement. Ce test comportemental peut également être applicable à d’autres études liées à la cognition et à la mémoire.

Introduction

Les maladies neurodégénératives dépendent de l’âge, sont débilitantes et incurables. La prévalence de ces maladies augmente, ce qui entraîne un besoin urgent d’améliorer et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’apparition et la présentation de chaque maladie sont uniques, car certaines affectent les régions du langage, du moteur et du cerveau autonome, tandis que d’autres provoquent des déficits d’apprentissage et des pertes de mémoire¹. Plus particulièrement, les déficits cognitifs et/ou les déficiences sont les complications les plus répandues dans toutes les maladies neurodégénératives². Dans l’espoir de faire la lumière sur les mécanismes sous-jacents impliqués dans ces maladies neurodégénératives, l’utilisation de nombreux systèmes modèles différents (y compris des organismes unicellulaires à la drosophiles aux vertébrés d’ordre supérieur tels que les rongeurs et les humains) a été utilisée; cependant, la majorité des maladies neurodégénératives restent incurables.

L’apprentissage et la mémoire sont des processus hautement conservés parmi les organismes, car les changements constants de l’environnement nécessitent une adaptation³. L’altération de la cognition et de la plasticité synaptique a été démontrée dans plusieurs modèles de rongeurs. Plus précisément, les tests comportementaux bien établis utilisent l’apprentissage associatif pour évaluer les changements cognitifs à la suite de diverses maladies et troubles induits par les déficiences⁴. De plus, l’inversion de la discrimination de contraste évalue les déficits cognitifs car elle implique des fonctions d’apprentissage et de mémoire d’ordre supérieur, et l’inversion dépend de l’inhibition d’une association précédemment apprise. La tâche de choix à trois chambres largement utilisée élucide les déficits possibles dans les voies d’apprentissage et de mémoire du système nerveux central⁵^,⁶. Récemment, ce domaine s’est élargi pour inclure des modèles non mammifères, tels que le poisson-zèbre (Danio rerio), car plusieurs paradigmes ont été développés pour une gamme d’âges allant des larves aux adultes^7,⁸.

Le poisson-zèbre offre un équilibre de complexité et de simplicité qui est avantageux pour l’évaluation des troubles cognitifs avec des techniques comportementales. Tout d’abord, les poissons-zèbres se prêtent à un dépistage comportemental à haut débit en raison de leur petite taille et de leur nature reproductrice prolifique. Deuxièmement, le poisson-zèbre possède une structure, le pallium latéral, qui est analogue à l’hippocampe des mammifères car il a des marqueurs neuronaux et des types de cellules similaires⁷. Les poissons-zèbres sont également capables d’acquérir et de mémoriser des informations spatiales⁹ et, comme les humains, sont diurnes¹⁰. Par conséquent, il n’est pas surprenant que les poissons-zèbres soient utilisés comme modèle pour les maladies neurodégénératives avec une fréquence croissante. Cependant, l’absence de tests comportementaux appropriés a rendu difficile l’application du modèle du poisson-zèbre pour les évaluations cognitives. Les travaux publiés utilisant des tests comportementaux spécifiques au poisson-zèbre comprennent les tâches d’apprentissage associatif¹¹, le comportement anxieux¹², la mémoire 13 , la reconnaissance d’objets¹⁴et la préférence de lieu conditionné¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Bien qu’il y ait eu de nombreux développements en ce qui concerne les tests comportementaux du poisson-zèbre, des homologues pour certains tests des fonctions cognitives chez les rongeurs n’ont pas encore été développés pour une utilisation avec le poisson-zèbre¹⁸.

En nous appuyant sur des études antérieures de notre laboratoire, nous avons modélisé / développé une tâche cognitive chez le poisson-zèbre basée sur la tâche de choix à trois chambres utilisée avec les rongeurs en utilisant l’interaction sociale comme récompense. De plus, nous avons développé l’aspect d’apprentissage associatif de la tâche comportementale et incorporé l’inversion de la discrimination de contraste dans l’espoir de développer davantage cette tâche comportementale pour évaluer les troubles cognitifs. Cela nous a permis d’examiner à la fois l’acquisition initiale de l’apprentissage de la discrimination et l’inhibition ultérieure de cet apprentissage dans la phase d’inversion. Dans la présente étude, nous démontrons que cette procédure a fourni une méthode fiable pour évaluer le fonctionnement cognitif chez le poisson-zèbre après une immersion dans le glucose pendant 4 ou 8 semaines.

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Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’American University (protocole # 1606, 19-02).

1. Animaux

Élevage et entretien des animaux
1. Obtenez des poissons-zèbres adultes de type sauvage (Danio rerio) âgés de 4 à 11 mois en tant qu’embryons et élevez-les en interne.
2. Maintenir le poisson dans un système de rack aquatique à une–29 °C sur une photopériode de 14 h de lumière:10 h d’obscurité.
3. Nourrissez le poisson deux fois par jour avec des flocons commerciaux et complétez avec Artemiavivant.
4. Choisissez des poissons au hasard dans ces réservoirs de stockage pour des expériences comportementales.
À la fin de l’expérience, anesthésier les animaux par immersion dans 0,02% de tricaïne pendant 2 min ou jusqu’à ce qu’il y ait un manque de coordination motrice et une fréquence respiratoire réduite pour des analyses moléculaires et / ou neurochimiques ultérieures.

2. Chambre d’essai de choix à trois chambres

NOTE: Cette technique comportementale a été modifiée à partir de Ruhl et al.²⁰.

Construction de la chambre
1. Modifier la chambre comportementale²⁶— un aquarium de 40 L (50 x 30 x 30 cm^3)—pour avoir une chambre centrale ou de départ (10 x 30 x 30 cm^3),séparée de deux chambres de choix latérales (chacune 20 x 30 x 30 cm^3, Figure 1A).
2. Construisez les trois compartiments à l’aide d’un canal en aluminium en forme de « U » fixé aux parois vitrées intérieures avec un scellant d’aquarium, pour séparer le réservoir en trois chambres.
3. Construisez des séparateurs opaques, de 10 cm de haut, en feuille de PVC gris qui s’intègrent dans les canaux en aluminium de chaque côté. Faites chaque séparateur en 2 pièces, chacune de taille égale: une pièce inférieure fixe montée en permanence dans le réservoir et une pièce supérieure pouvant être rangée de haut en bas dans les rails en aluminium.
4. Collez des clips de liant extra-larges sur le dessus des feuilles de PVC gris pour faire office de poignées.
5. À l’aide d’un marqueur permanent, tracez de petites lignes horizontales à 10 cm au-dessus du tuyau en PVC gris collé à l’extérieur du réservoir.
  REMARQUE: Cette marque est le point auquel la feuille de PVC gris supérieure sera ouverte pour permettre l’accès de chaque côté.
6. Ajouter de l’eau de contrôle (système) au réservoir à un niveau de 25 cm du bas vers le haut du réservoir, ou ~ 30 L. Placez des radiateurs d’aquarium en verre dans chaque section de la chambre pendant 24 h avant le test pour porter la température à 28,5 ° C.
  REMARQUE: Retirez les appareils de chauffage au début de la séance de comportement et effectuez un échange d’eau complet après deux jours d’utilisation.
Configuration de la discrimination
1. Pour chaque tâche de discrimination, placez individuellement des morceaux de feutre colorés (beige, noir ou blanc) sur le dos extérieur, le côté et le bas des chambres de choix à l’aide de velcro(Figure 1B-D).
  REMARQUE: La chambre centrale ne doit pas avoir de couleur d’arrière-plan associée.
En récompense, créez un groupe de congénères (haut-fond) en plaçant 4 poissons-zèbres adultes, qui ne seront pas autrement utilisés dans l’étude, dans un petit réservoir clair dans le coin arrière de chaque chambre de choix(Figure 1B-D).
REMARQUE: Choisissez des poissons de haut-fond au hasard dans les réservoirs de stockage chaque jour, avec au moins un mâle et une femelle du même âge et de la même taille que les poissons expérimentaux dans chaque aquarium de haut-fond.

3. Tâches comportementales

Acclimatation
NOTE: L’acclimatation à la chambre de comportement consiste en trois jours de formation; deux jours d’acclimatation en groupe suivis d’une journée d’entraînement individuel.
Acclimatation en groupe
1. Fixez le fond en feutre beige (neutre) à l’extérieur des deux compartiments de choix et immergez un réservoir de haut-fond vivant dans chacun des compartiments de choix(Figure 1B).
2. Ajoutez cinq à six poissons-zèbres à la chambre de départ centrale avec les deux portes coulissantes ouvertes et laissez les poissons errer librement pendant 30 minutes.
  REMARQUE: Le poisson-zèbre expérimental devrait être en mesure d’interagir et de socialiser avec ces poissons de haut-fond à travers l’aquarium en récompense après avoir traversé l’un ou l’autre compartiment de choix pendant l’acclimatation. Un poisson est considéré comme faisant son entrée dans l’une des chambres latérales lorsque tout son corps pénètre dans la chambre.
3. Répétez cette procédure avec le même poisson expérimental pour un deuxième jour (2 jours d’acclimatation en groupe).
  REMARQUE: Ne gardez pas les mêmes groupes de poissons.
Acclimatation individuelle
1. Configuration de la chambre : Fixez le fond en feutre beige (neutre) à l’extérieur des deux compartiments de choix et immergez un réservoir de haut-fond vivant dans les deux compartiments de choix, comme dans l’acclimatation de groupe(Figure 1B, E).
  1. Placez un poisson-zèbre individuel dans la chambre de départ centrale pendant 2 minutes avec les portes coulissantes fermées et, après la période de 2 minutes, ouvrez les deux portes simultanément.
  2. Assurez-vous que chaque poisson nage de la chambre centrale à travers une porte pour un total de 10 fois, quel que soit le côté. Récompensez le poisson chaque fois qu’il entre dans l’une des chambres latérales (1 jour d’acclimatation individuelle).
    REMARQUE: Si un poisson est incapable d’accomplir cette tâche 10 fois dans une période de 30 minutes ou refuse de quitter la chambre de départ, excluez-le de l’étude.
2. Acquisition de données : Enregistrez le nombre de fois que le poisson nage de chaque côté et le temps total qu’il faut pour terminer la tâche.
Acquisition
REMARQUE: Après l’acclimatation, le poisson-zèbre a commencé une tâche d’acquisition de 3 jours.
1. Configuration de la chambre : Fixez une pièce de feutre blanc à l’extérieur d’un compartiment de choix et une pièce de feutre noir à l’extérieur de l’autre compartiment de choix(Figure 1C,F).
  REMARQUE: Alternez la couleur d’arrière-plan de chaque côté tous les jours à l’aide d’un calendrier^{pseudo-aléatoire 37}.
  1. Pendant toute la durée de cette phase d’entraînement, placez un haut-fond-récompense placé uniquement dans l’un des compartiments de choix; cela devient le côté récompensé.
  2. Pour commencer l’acquisition, placez un seul poisson expérimental dans la chambre de départ pendant une période de 2 minutes avec les compartiments de choix fermés.
  3. Après l’acclimatation de 2 minutes, ouvrez simultanément les deux portes, donnant accès aux deux compartiments de choix, et démarrez le chronomètre pour évaluer la latence du choix.
  4. À l’aide d’une conception biaisée, attribuez au hasard au poisson une préférence en noir ou en blanc (c.-à-d. W+/B- ou B+/W-), ce qui signifie que le haut-fond est placé dans le compartiment de choix noir (B+) ou blanc (W+).
2. Indiquant la réponse de choix
  1. Une fois que le poisson fait un choix en entrant dans l’un des compartiments latéraux, arrêtez la minuterie.
  2. Si le poisson choisit correctement le côté préféré, fermez immédiatement la porte entre la chambre centrale et ce côté pour limiter le poisson au côté préféré pendant 1 min, et laissez-le être récompensé en interagissant avec le réservoir de haut-fond(Figure 1C, F). Notez cet essai comme « C » pour « Correct » (récompensé).
  3. Si le poisson traverse la mauvaise porte, transférez-la dans la chambre centrale, fermez les deux portes et notez l’essai comme « I » pour « incorrect » (non récompensé).
  4. Si le poisson ne prend pas de décision dans les 2 minutes suivant l’ouverture des portes, déplacez le poisson du bon côté pendant 1 min et notez l’essai comme « M » pour « marqué » (récompense de force).
  5. Lorsque vous transférez /déplacez le poisson dans la chambre de départ, guidez doucement le poisson dans la chambre centrale à l’aide d’un filet à poisson comme outil de berger.
    REMARQUE: Ne retirez pas le poisson de l’eau et ne le remplacez pas dans la chambre de départ, car cela pourrait affecter le test comportemental.
  6. Une fois que le poisson retourne dans la chambre centrale, attendez 1 min avant d’effectuer à nouveau la tâche. Assurez-vous que chaque poisson effectue la tâche 8 fois.
3. Acquisition de données
  1. Pour chaque poisson expérimental, enregistrez le temps jusqu’à la première décision (ou la latence de choix) et les scores individuels (C, I ou M) pour chacun des 8 essais d’acquisition (section 3.4.2) dans l’ordre.
  2. Rapportez que les résultats de ces expériences ont été rapportés sous forme de moyennes de groupe pour chaque essai à chaque jour d’acquisition.
  3. Une fois qu’un poisson a terminé un essai, classez-le comme un poisson « très performant » ou un poisson « peu performant ».
    REMARQUE: Un poisson était considéré comme « très performant » s’il choisissait avec succès le bon côté de l’aquarium dans au moins 6 des 8 essais totaux de la journée. Tout poisson qui ne répond pas à ce critère est un « peu performant ».
  4. Une fois identifiés, abritez séparément les poissons les plus performants et les poissons les moins performants.
  5. Classez le poisson comme étant « très performant » ou « faible » à chacun des trois jours suivant l’acquisition, après qu’un poisson a terminé les essais.
    REMARQUE : À la fin du troisième jour d’acquisition, les poissons demeurent « très performants » ou « faibles » pendant toute la durée de l’étude.
    REMARQUE: Certains poissons qui faisaient initialement partie du groupe « peu performant » apprennent la tâche le jour d’acquisition 2 ou 3. Lorsque cela se produit, le poisson initial « peu performant » peut être déplacé dans le groupe « très performant ». Ne déplacez pas le poisson entre les groupes de cette manière après le jour 3 (la fin de l’acquisition).

4. Traitement expérimental

Après la période d’acquisition, lorsque le poisson démontre sa capacité à résoudre une simple tâche de discrimination entre le fond noir et blanc, commencez le schéma thérapeutique du poisson-zèbre expérimental.
NOTE: Pour montrer l’applicabilité de cette méthode, cette étude montre deux plans expérimentaux:
1. Étude longitudinale
  1. Renvoyer les poissons expérimentaux dans leurs bassins de rétention pendant 8 semaines. Maintenez les poissons dans des réservoirs standard avec des changements d’eau quotidiens et nourrissez-les deux fois par jour.
    REMARQUE: N’effectuez aucune formation comportementale pendant ces 8 semaines dans les réservoirs de rétention.
  2. Effectuez une évaluation de l’inversion après cette période pour évaluer si le poisson-zèbre peut résoudre la tâche d’inversion après 8 semaines sans formation.
2. Hyperglycémie: Exposer les groupes expérimentaux à l’eau (contrôle du stress de manipulation), au mannitol (1% à 3%, contrôle osmotique) ou au glucose (1% à 3%) pendant 4 ou 8 semaines²²^,²³.
  REMARQUE: N’effectuez aucun entraînement comportemental pendant ces 4 ou 8 semaines.

5. Inversion

REMARQUE: Après une manipulation expérimentale (comme à la section 4.2), les poissons sont testés dans la dernière partie du paradigme de choix à 3 chambres - l’inversion. Pour ce faire, le côté récompensé est inversé (par rapport à l’acquisition) de sorte que les poissons précédemment récompensés par un haut-fond sur le côté blanc sont maintenant récompensés par un haut-fond sur le côté noir et vice versa. De cette façon, l’inversion évalue si les poissons ont appris où se trouve la récompense (haut-fond), quelle que soit la couleur de l’arrière-plan.

Configuration de la chambre
1. Attachez le feutre noir à l’extérieur de l’une des chambres de choix et le feutre blanc à l’extérieur de l’autre, en vous assurant que les côtés noir et blanc sont les mêmes que dans les essais d’acquisition (section 3.4).
2. Immergez le réservoir de haut-fond dans le coin arrière du côté qui est à l’opposé de la chambre de choix précédemment récompensée(Figure 1D, G).
  REMARQUE: En d’autres termes, les poissons précédemment récompensés du côté blanc sont maintenant récompensés du côté noir et vice versa.
3. Tester le poisson individuellement comme au point 3.5. Commencez par placer un seul poisson expérimental dans la chambre de départ pendant une période de 2 minutes et fermez l’accès aux compartiments de choix.
4. Ouvrez simultanément les deux côtés de la chambre.
  REMARQUE : Effectuez un total de 8 essais chaque jour pendant trois jours de traitement consécutifs.
Indiquant la réponse de choix
1. Si le poisson choisit correctement la couleur préférée, fermez immédiatement la porte de la chambre centrale pendant 1 min, ce qui permet au poisson d’interagir avec la récompense du haut-fond. Notez cet essai comme « C » pour « Correct » (récompensé).
2. Si le poisson traverse la mauvaise porte, transférez-la dans la chambre centrale, fermez les deux portes et notez cet essai comme « I » pour « incorrect » (non récompensé).
3. Si le poisson ne prend pas de décision dans les 2 minutes suivant l’ouverture des portes, déplacez le poisson du bon côté et notez l’essai comme « M » pour « marqué » (récompense de force).
Acquisition de données
1. Pour chaque poisson-zèbre expérimental, enregistrez la latence de choix et les scores individuels (C, I, M), dans l’ordre, pour chaque essai.
2. Rapportez les résultats de ces expériences en tant que moyennes de groupe pour chaque bloc de deux essais sur chacun des 3 jours d’inversion.
3. Conservez les données des poissons à haut et à faible rendement séparément pour déterminer s’ils affichent le même niveau de performance lors de l’inversion que lors de l’acquisition.

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Representative Results

L’acclimatation à la chambre de comportement implique trois jours d’entraînement: 2 jours d’acclimatation en groupe suivis d'1 jour d’acclimatation individuelle. Cependant, comme nous ne pouvions pas distinguer les poissons-zèbres individuels les uns des autres, nous n’avons pu collecter des données que lors de l’acclimatation individuelle. À cette époque, les animaux de laboratoire (n = 30), conditionnés à l’aide d’une récompense basée sur le haut-fond, ont mis en moyenne 125,11 s pour parvenir à leur première décision(Figure 2A)et une moyenne de 725,34 s (12 min) pour accomplir l’ensemble de la tâche d’acclimatation individuelle(Figure 2B). Il n’y avait pas de préférence latérale significative pendant l’acclimatation (Figure 2C). Le nombre de poissons exclus était minime par rapport à d’autres types de récompenses (aliments) que nous avions précédemment évalués dans notre laboratoire(Figure 2C).

Après l’acclimatation, le poisson-zèbre a commencé la phase d’acquisition. Comme les poissons ont été testés individuellement, nous avons recueilli des données sur chaque poisson à chacun des trois jours d’acquisition. Les poissons ont été classés comme « très performants ou peu performants », les « très performants » réagissant plus rapidement et plus précisément, bien que tous les poissons aient déjà été exposés à la chambre d’essai. Seuls les poissons qui ont sélectionné le compartiment de choix récompensé dans au moins 6 des 8 essais ont été classés comme « très performants ». Les poissons qui ne répondaient pas à ce critère étaient « peu performants ». Les poissons très performants et peu performants ont été logés séparément pour distinguer leur performance dans tous les essais ultérieurs. Fait intéressant, nous avons observé que certains poissons ont changé de catégorie (c.-à-d. étaient initialement « peu performants », mais sont devenus « très performants ») au cours de l’acquisition. En fait, le nombre d’animaux très performants a augmenté chaque jour, avec des poissons plus performants le jour d’acquisition 3 par rapport au jour 1(figure 3A). Au jour 3, >50% des poissons étaient devenus « très performants ». De plus, la latence de choix initial pour tous les poissons au cours des trois jours d’acquisition (A1 à A3) a diminué, ce qui indique une amélioration des performances à chaque jour d’acquisition(figure 3B). La même tendance a également été observée lorsque seul le groupe de poissons les plus performants a été pris en compte: au jour 3, le délai de prise de décision s’est amélioré (est devenu plus rapide)(Figure 3C).

Un ratio de discrimination (essais récompensés/(récompense + essais non récompensés) a été calculé pour chaque bloc d’essai d’acquisition (moyenne de deux essais/poissons) au cours des trois jours d’acquisition (A1-A3) pour tous les animaux de laboratoire (n = 30) afin de déterminer avec quelle précision les poissons résolvaient (acquéraient) la tâche de discrimination (c.-à-d. aller du côté récompensé de l’aquarium). Ce ratio a révélé que le pourcentage de poissons se déplaçant du côté récompensé au cours de chaque essai augmentait quotidiennement (c.-à-d. entre les blocs d’essai de chaque jour individuel) et globalement (c.-à-d. au cours des trois jours d’acquisition), ce qui faisait que tous les poissons avaient un rendement supérieur au hasard à la fin de l’acquisition (ligne pointillée représentée sur le graphique; (Figure 4A) et indiquant que le poisson avait appris la tâche de discrimination.

Suite à l’acquisition de l’apprentissage de la discrimination, nous avons testé combien de temps le poisson-zèbre se souviendrait de la tâche. Pour ce faire, le poisson-zèbre testé est resté dans des réservoirs de rétention pendant 8 semaines. Après ce temps, les poissons ont été testés sur une tâche d’inversion qui a duré 3 jours (R1-R3). Nous avons constaté que les poissons présentaient un fort comportement d’inversion et une discrimination accrue au cours des trois jours d’inversion(Figure 4B),ce qui indique qu’ils étaient capables de (1) se souvenir de la relation entre la couleur de l’aquarium et la récompense et (2) d’inhiber ce qu’ils avaient précédemment appris lors de l’acquisition et d’apprendre le paradigme d’inversion / opposé. Comme le montre la figure 4B,le poisson-zèbre s’est d’abord rendu du côté non récompensé de l’aquarium, comme l’indique le ratio de discrimination inférieur au risque lors des traînées initiales le jour 1 de l’inversion. Cependant, à la fin de R1, les performances ont augmenté à plus que le hasard, un résultat qui a été maintenu sur R2 et R3, avec les scores de ratio de discrimination les plus élevés observés sur R3. Prises ensemble, ces données montrent que les animaux de laboratoire naïfs sont capables de résoudre la tâche de discrimination, même si le comportement initial a été acquis 8 semaines plus tôt, sans aucune formation supplémentaire entre les séances comportementales.

Le paradigme du choix à 3 chambres peut également être appliqué à l’examen des complications de la maladie. Dans notre étude avec le poisson-zèbre hyperglycémique, l’acclimatation et l’acquisition ont été décrites, et l’inversion a été testée après 4 ou 8 semaines d’hyperglycémie. L’hyperglycémie a été induite avec un protocole d’immersion alternatif (McCarthy et al., 2020 - ce problème), de sorte que l’entraînement a eu lieu tous les deux jours, les jours après que le poisson-zèbre ait été dans des solutions de test pendant 24 h. Au cours de l’acquisition, il y a eu un effet principal de la journée de formation sur le taux de discrimination (F (2 239) = 4,457, p = 0,012; Figure 5A), le rapport sur A1 étant significativement inférieur à celui sur A3 (p = 0,010), ce qui indique que les poissons ont amélioré la précision de leur choix au fil du temps. Au cours de l’inversion, il y avait un effet principal significatif du traitement (F (2, 326) = 3,057, p = 0,048), mais aucun autre effet ou interaction principal significatif (jour d’entraînement: (F (2, 326) = 1,602, p = 0,203); jour d’entraînement x traitement: (F (4, 326) = 0,661, p = 0,620); Figure 5A). La réponse des animaux traités au glucose était significativement réduite par rapport aux animaux traités à l’eau (p = 0,037), mais il n’y avait pas d’autres différences significatives (contrôle v. mannitol: p = 0,387; mannitol v. glucose: p = 0,524), suggérant un effet spécifique du glucose. Après 8 semaines d’hyperglycémie, aucune différence statistique n’a été notée dans les ratios de discrimination entre les formations d’acquisition (F (2 263) = 2,909, p = 0,056; Figure 5B). Cependant, il y avait des effets principaux significatifs à la fois de la journée d’entraînement (F (2, 189) = 4,721, p = 0,010) et du traitement (F (2, 189) = 7,940, p = 0,000) sur l’inversion, mais aucune interaction significative (jour d’entraînement * traitement = F (4, 189) = 0,869, p = 0,484). Les comparaisons ultérieures par paires de différences les moins significatives (LSD) ont permis d’identifier des différences significatives entre R1 et R3 (p = 0,022) et entre R2 et R3 (p = 0,003). Les comparaisons par paires de LSD ont également révélé des différences significatives entre le groupe de traitement de l’eau et les deux groupes de traitement du glucose et du mannitol (eau v. mannitol: p = 0,008; eau v. glucose: 0,000); cependant, les groupes glucose et mannitol n’étaient pas significativement différents l’un de l’autre (p = 0,265), ce qui suggère que ces différences dans le rapport de discrimination peuvent être dues à des effets osmotiques.

Figure 1 : Chambre d’essai de choix à trois chambres et configuration du comportement. (A) Schéma à 3 chambres. Les animaux de laboratoire ont été limités à la chambre de départ centrale pendant 2 minutes, puis autorisés à accéder de chaque côté du réservoir au début d’un essai. Pour ce faire, la moitié supérieure de chacune des deux cloisons a été surélevée pour créer un espace de 10 cm pour que les poissons puissent traverser dans l’un ou l’autre compartiment de choix. (B,E) L’acclimatation a été effectuée en utilisant un fond beige et un banc de congénères comme récompense. (C,F) L’acquisition a été réalisée à l’aide de fonds noirs et blancs sur les chambres de choix; la récompense n’était située que d’un côté de la chambre. G) L’inversion a été effectuée à l’aide de fonds noirs et blancs sur les compartiments de choix; la récompense n’était disponible que de l’autre côté de la chambre (par rapport à l’acquisition). (H) Image rapprochée d’un réservoir de haut-fond immergé dans l’un des compartiments de choix. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Latence et nombre d’essais marqués au cours de l’acclimatation individuelle. (A) Latence de choix de la première décision. (B) Le temps total d’acclimatation individuelle. (C) Le nombre d’entrées à gauche et à droite n’est pas différent, ce qui indique qu’il n’y a pas de préférence latérale inhérente avant le début de l’acquisition. Nous rapportons également le nombre total d’essais de marques au cours de l’acclimatation individuelle. Les valeurs sont indiquées comme moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 3 : Le pourcentage de poissons très performants et la latence de choix initial entre tous les poissons et les poissons très performants au cours des trois jours d’acquisition. (A) Les poissons très performants se déplaçaient de la chambre centrale vers le côté récompensé de la chambre dans au moins 6 essais sur 8 chaque jour d’acquisition (A1-A3). (B) Au cours des trois jours de formation à l’acquisition (A1 à A3), la latence globale du choix initial a diminué; une tendance également évidente chez les poissons très performants (C). Les valeurs sont indiquées comme moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 4 : Performance de discrimination pendant les essais d’acquisition et d’inversion. (A) Taux de discrimination (essais récompensés/(récompense + essais non récompensés) de poissons entre les jours d’acquisition (A1-A3) et (B) pendant l’apprentissage de l’inversion 8 semaines plus tard. L’inversion a également été évaluée pendant 3 jours (R1-R3). Pour les deux tâches, chaque poisson devait effectuer 8 essais, et les résultats sont présentés en deux blocs d’essais (2, 4, 6, 8). Les réponses correctes lors de l’acquisition et de l’inversion augmentaient avec le temps, avec une réponse plus rapide observée lors de l’inversion, indiquant que le poisson avait appris et s’était souvenu de la tâche. Les valeurs sont déclarées comme moyenne ± SEM. La ligne pointillée représente le hasard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Acquisition et inversion du poisson-zèbre hyperglycémique à l’aide de la tâche comportementale de choix à 3 chambres. (A) Avant le traitement, le poisson-zèbre naïf a acquis la tâche comportementale de choix à 3 chambres au cours de trois jours de formation comportementale (acquisition, A1-A3). Il y avait une différence significative entre les ratios de discrimination sur A1 et A3 indiquant que l’apprentissage avait eu lieu (p = 0,012). Après 4 semaines de traitement (symboles colorés), il y a eu un effet significatif du traitement (p = 0,048), les animaux traités au glucose présentant des rapports de discrimination significativement réduits par rapport aux animaux traités à l’eau (p = 0,037). (B) Dans une expérience distincte, le comportement avant et après 8 semaines d’hyperglycémie a été évalué. Malgré l’augmentation constante des performances au cours de chaque jour d’acquisition, il n’y avait pas de différences significatives entre le ratio de discrimination entre A1 et A3. Cependant, après 8 semaines de traitement (symboles colorés), il y avait un effet principal du traitement (p < 0,001) et un effet principal individuel du jour d’entraînement (p = 0,010). Les analyses post-hoc ont révélé une différence significative entre le groupe traité à l’eau et les groupes traités au mannitol et au glucose, suggérant un effet osmotique (eau v. mannitol: p = 0,008; eau v. glucose: p < 0,001). * désigne un effet principal significatif. Les points de données représentent la moyenne du groupe ± SEM, et les points de données avec des lettres différentes sont significativement différents les uns des autres. La ligne pointillée représente le hasard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Bien qu’il y ait eu une croissance énorme de la quantité et de la variété de la recherche en neurosciences effectuée à l’aide de poissons-zèbres au cours des 15 dernières années^24,les tests comportementaux manquent chez cette espèce par rapport aux systèmes de modèles de mammifères¹¹^,²⁵^,²⁶. Ici, nous montrons qu’une tâche de choix à trois chambres développée pour une utilisation avec des rongeurs peut être adaptée pour évaluer l’acquisition et l’inversion d’un apprentissage de discrimination visuelle chez le poisson-zèbre. En utilisant un haut-fond vivant comme récompense, cette tâche a fourni un test robuste qui peut être appliqué à une variété d’études examinant des maladies liées au comportement telles que les complications hyperglycémiques du diabète, de la maladie d’Alzheimer et de la démence.

Il a été précédemment établi que les poissons-zèbres sont capables d’apprendre et de stocker des informations car elles sont nécessaires pour prendre des décisions écologiquement pertinentes et nécessaires à leur survie dans la^{nature 3}. Nos données d’acquisition et d’inversion dans le cadre d’une étude longitudinale de 8 semaines soutiennent des preuves antérieures que les poissons-zèbres, bien que petits, sont capables d’apprendre et de se souvenir d’une simple tâche de discrimination, et que le poisson-zèbre peut également inhiber les réponses précédemment acquises. Dans l’étude longitudinale de 8 semaines, le nombre de récompenses forcées a diminué et le ratio de discrimination a augmenté, ce qui indique que les poissons choisissent mieux le bon côté récompensé et ont appris la tâche. Bien que ces changements n’aient pas été significatifs, nous avons vu une tendance générale à la baisse du nombre d’essais récompensés par la force pendant l’acquisition et une augmentation du taux de discrimination. En outre, les résultats de la tâche comportementale de choix à trois chambres avec des poissons hyperglycémiques ont révélé l’applicabilité du test aux études examinant les conditions hyperglycémiques et indiquent que ce paradigme pourrait être utilisé en combinaison avec d’autres manipulations expérimentales, telles que l’exposition à des médicaments ou des lignées mutantes, pour évaluer les effets potentiels sur la cognition.

Une limite importante de cette étude est que nous ne pouvons pas identifier les poissons individuels au fil du temps et que nous devons donc nous fier aux moyennes des groupes pour évaluer les données. L’élaboration d’un moyen de suivre individuellement les poissons dans les différents groupes de traitement, comme chez les rongeurs, pourrait résoudre ces problèmes. Pour tenter de résoudre ces différences, nous avons trié les poissons pendant la phase d’acquisition en fonction de leur performance, ce qui s’est avéré être un avantage inattendu de notre méthodologie. Les « poissons très performants » ont obtenu ≥ 6/8 chaque jour d’entraînement, tandis que les poissons ayant des scores plus faibles étaient des « poissons peu performants ». Lorsqu’on les compte chaque jour, le nombre de « personnes très performantes » a augmenté dans le groupe des hauts-fonds récompensés, de sorte qu’au jour 3, il y avait beaucoup plus de poissons dans cette catégorie que dans le traitement récompensé par les poissons. Les tendances de latence de choix observées chez tous les poissons (« très performants + faibles ») sont similaires à celles observées uniquement dans le groupe « très performant », ce qui suggère que les fortes réponses de ce groupe ont conduit à des réponses globales.

En résumé, ces résultats indiquent que l’apprentissage de la discrimination basé sur les hauts-fonds chez le poisson-zèbre fournit un modèle rentable réalisable pour l’étude du fonctionnement cognitif normal et altéré.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Sabrina Jones pour son aide à adapter un paradigme de choix à trois chambres de rongeur au modèle du poisson-zèbre et Jeremy Popowitz et Allison Murk pour leur aide lors des journées de collecte du comportement, leur aide aux essais, aux soins aux animaux et à la mise en place des réservoirs. Un merci spécial également à James M. Forbes (ingénieur en mécanique) pour son aide dans la conception et la construction du réservoir à 3 chambres.

Financement : VPC et TLD ont reçu une subvention conjointe de soutien à la recherche du corps professoral (FRSG) de l’American University College of Arts and Sciences. CJR a reçu le soutien de l’American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support.

Materials

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Behavior

La tâche comportementale de choix à trois chambres utilisant le poisson-zèbre comme système modèle

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