Behavior

Beteendeuppgiften med tre kammares val med zebrafisk som modellsystem

Published: April 14, 2021 doi: 10.3791/61934

Cassie J. Rowe^1,2, Mikayla Crowley-Perry^1,3, Elizabeth McCarthy¹, Terry L. Davidson^2,4, Victoria P. Connaughton^1,2

¹Department of Biology, American University, ²Center for Behavioral Neuroscience, American University, ³Department of Chemistry, American University, ⁴Department of Neuroscience, American University

Summary

Vi presenterar en beteendekammare utformad för att bedöma kognitiv prestanda. Vi tillhandahåller data som visar att när zebrafisken har förvärvats kommer vi ihåg uppgiften 8 veckor senare. Vi visar också att hyperglykemisk zebrafisk har förändrat kognitiv prestanda, vilket indikerar att detta paradigm är tillämpligt på studier som bedömer kognition och minne.

Abstract

Neurodegenerativa sjukdomar är åldersberoende, försvagande och obotliga. Nya rapporter har också korrelerat hyperglykemi med förändringar i minne och/eller kognitiv svikt. Vi har modifierat och utvecklat en kognitiv uppgift med tre kammare som liknar den som används med gnagare för användning med hyperglykemisk zebrafisk. Testkammaren består av en centralt placerad startkammare och två valutrymmen på vardera sidan, med ett stim av conspecifics som belöning. Vi tillhandahåller data som visar att när zebrafisken har förvärvats kommer vi ihåg uppgiften minst 8 veckor senare. Våra data indikerar att zebrafisk svarar kraftfullt på denna belöning, och vi har identifierat kognitiva underskott i hyperglykemisk fisk efter 4 veckors behandling. Denna beteendemässiga analys kan också vara tillämplig på andra studier relaterade till kognition och minne.

Introduction

Neurodegenerativa sjukdomar är åldersberoende, försvagande och obotliga. Dessa sjukdomar ökar i prevalens, vilket resulterar i ett brådskande behov av att förbättra och utveckla nya terapeutiska strategier. Uppkomsten och presentationen av varje sjukdom är unik, eftersom vissa påverkar språk-, motor- och autonoma hjärnregioner, medan andra orsakar inlärningsunderskott och minnesförlust¹. Framför allt är kognitiva underskott och/eller svikt de vanligaste komplikationerna i alla neurodegenerativa sjukdomar². I hopp om att belysa de underliggande mekanismerna i dessa neurodegenerativa sjukdomar har användningen av många olika modellsystem (inklusive encelliga organismer till Drosophila till högre beställdjur som gnagare och människor) använts. majoriteten av neurodegenerativa sjukdomar är dock fortfarande obotliga.

Lärande och minne är mycket bevarade processer bland organismer eftersom ständiga förändringar i miljön kräver anpassning³. Försämring av både kognition och synaptisk plasticitet har visats i flera gnagare modeller. Specifikt använder väletablerade beteendeanalyser associativt lärande för att bedöma kognitiva förändringar efter olika sviktinducerade sjukdomar och störningar⁴. Dessutom bedömer kontrastdiskriminering omvänd kognitiva underskott eftersom det innebär högre ordning lärande och minnesfunktioner, och återföring beror på hämning av en tidigare lärd associering. Den allmänt använda trekammarvalet uppgift belyser möjliga underskott i lärande och minnesvägar i centrala nervsystemet⁵^,⁶. Nyligen har detta område utvidgats till att omfatta icke-däggdjursmodeller, såsom zebrafisk (Danio rerio), eftersom flera paradigm har utvecklats för en rad åldrar från larver till vuxna^7,⁸.

Zebrafisk ger en balans mellan komplexitet och enkelhet som är fördelaktig för bedömning av kognitiva funktionsnedsättningar med beteendetekniker. För det första är zebrafisk mottagliga för beteendescreening med hög genomströmning med tanke på deras lilla storlek och produktiva reproduktiva natur. För det andra har zebrafisk en struktur, det laterala pallietet, som är analogt med däggdjurs hippocampus eftersom det har liknande neuronala markörer och celltyper⁷. Zebrafisk kan också förvärva och komma ihåg rumslig information⁹ och, liksom människor, är dagliga¹⁰. Därför är det inte förvånande att zebrafisk används som modell för neurodegenerativa sjukdomar med ökande frekvens. Frånvaron av lämpliga beteendemässiga analyser har dock gjort det svårt att tillämpa zebrafiskmodellen för kognitiva bedömningar. Publicerat arbete med zebrafiskspecifika beteendeanalyser inkluderar associativa^{inlärningsuppgifter 11}, ångestbeteende¹², minne¹³,^{objektigenkänning 14}, och konditionerad plats-preferens¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Även om det har skett många utvecklingar när det gäller zebrafisk beteendemässiga analyser, har motsvarigheter för vissa tester av kognitiva funktioner hos gnagare ännu inte utvecklats för användning med zebrafisk¹⁸.

Baserat på tidigare studier från vårt labb modellerade/utvecklade vi en kognitiv uppgift inom zebrafisk baserat på den trekammaruppgift som används med gnagare med social interaktion som belöning. Dessutom utvidgade vi den associativa inlärningsaspekten av beteendeuppgiften och införlivade kontrastdiskrimineringsåterföring i hopp om att vidareutveckla denna beteendeuppgift för att bedöma kognitiv försämring. Detta gjorde det möjligt för oss att undersöka både det första förvärvet av diskrimineringsinlärning och den efterföljande hämningen av detta lärande i reverseringsfasen. I den aktuella studien visar vi att denna procedur gav en tillförlitlig metod för att bedöma kognitiv funktion hos zebrafisk efter glukossänkning i 4 eller 8 veckor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella förfaranden godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid American University (protokoll # 1606, 19-02).

1. Djur

Djuruppfödning och djurunderhåll
1. Få vuxna zebrafiskar av vildtyp (Danio rerio) i åldern 4-11 månader som embryon och baka dem internt.
2. Håll fisken i ett vattenställssystem vid 28–29 °C på en 14-h ljus:10-h mörk fotoperiod.
3. Mata fisken två gånger per dag med kommersiella flingor och komplettera med levande Artemia.
4. Välj fisk slumpmässigt från dessa lagertankar för beteendeexperiment.
När experimentet är klart, bedöva djuren genom nedsänkning i 0,02% trikain i 2 minuter eller tills det finns brist på motorisk koordination och minskad andningshastighet för senare molekylära och/eller neurokemiska analyser.

2. Provningskammare med val av tre kammare

OBS: Denna beteendemässiga teknik ändrades från Ruhl et al.²⁰.

Kammarkonstruktion
1. Modifiera beteendekammaren²⁶– ett akvarium på 40 L (50 x 30 x 30 cm³) – för att ha en central eller startkammare (10 x 30 x 30 cm³), separerad från två sidorevalskammare (var och en 20 x 30 x 30 cm³, figur 1A).
2. Konstruera de tre facken med hjälp av en "U-formad" kanal i aluminium fäst på de inre glasväggarna med akvarietätningsmedel, för att separera tanken i tre kammare.
3. Konstruera ogenomskinliga avdelare, 10 cm höga, av grå PVC-plåt som passar in i aluminiumkanalerna på vardera sidan. Gör varje avdelare av 2 stycken, var och en lika stor: en stationär bottenpjäs permanent monterad i tanken och en flyttbar toppdel som rör sig upp och ner i aluminiumspåren.
4. Limma extra stora bindemedelsklämmor på toppen av de grå PVC-arken för att fungera som handtag.
5. Rita små horisontella linjer 10 cm ovanför det vidhäftade grå PVC-röret på tankens utsida med hjälp av en permanent markör.
  OBS: Detta märke är den punkt till vilken den översta grå PVC-arket öppnas för att ge tillgång till båda sidor.
6. Tillsätt kontrollvatten (system) till tanken till en nivå av 25 cm från botten till toppen av tanken, eller ~ 30 L. Placera akvarievärmare i glas i varje del av kammaren i 24 timmar före provning för att få temperaturen till 28,5 °C.
  OBS: Ta bort värmaren i början av beteendesessionen och utför ett fullständigt vattenutbyte efter två dagars användning.
Inställning till diskriminering
1. För varje diskrimineringsuppgift placerar du färgade filtstycken (beige, svart eller vitt) på den yttre baksidan, sidan och botten av valkamrarna med kardborreband (figur 1B-D).
  OBS: Den centrala kammaren bör inte ha någon bakgrundsfärg associerad med den.
Som belöning, skapa en grupp konspecifics (stim) genom att placera 4 vuxna zebrafiskar, som annars inte kommer att användas i studien, i en liten, klar tank längst bak i varje valkammare (Figur 1B-D).
OBS: Välj stimfisk slumpmässigt från buljongtankar varje dag, med minst en hane och en hona i samma ålder och storlek som den experimentella fisken i varje stimtank.

3. Beteendeuppgifter

Acklimatisering
OBS: Acklimatisering till beteendekammaren består av tre dagars träning; två dagars gruppacklimatisering följt av en dag av individuell träning.
Gruppacklimatisering
1. Fäst beige (neutral) filtbakgrund på utsidan av båda valfacken och sänk ner en levande stimtank i vart och ett av valfacken (figur 1B).
2. Tillsätt fem-sex zebrafiskar till mittenstartkammaren med båda skjutdörrarna öppna och låt fisken ströva fritt i 30 minuter.
  OBS: Den experimentella zebrafisken bör kunna interagera och umgås med dessa stimfiskar genom tanken som belöning efter att ha korsat in i något av valutrymmena under acklimatisering. En fisk anses ha gått in i en av sidokamrarna när hela kroppen kommer in i kammaren.
3. Upprepa detta förfarande med samma experimentella fisk för en andra dag (2 dagars gruppacklimatisering).
  OBS: Förvara inte samma grupper av fisk.
Individuell acklimatisering
1. Kammarens inställning: Fäst beige (neutral) filtbakgrunden på utsidan av båda valfacken och dränk en levande stimtank i båda valfacken, som i gruppacklimat(figur 1B,E).
  1. Placera en enskild zebrafisk i den centrala startkammaren i 2 minuter med skjutdörrarna stängda och öppna båda dörrarna samtidigt efter 2-minutersperioden.
  2. Se till att varje fisk simmar från den centrala kammaren genom en dörr i totalt 10 gånger, oavsett vilken sida. Belöna fisken varje gång den kommer in i en av sidokamrarna (1 dag av individuell acklimatisering).
    OBS: Om en fisk inte kan slutföra denna uppgift 10 gånger inom en 30-minuters period eller vägrar att lämna startkammaren alls, uteslut den från studien.
2. Datainsamling: Registrera antalet gånger fisken simmar in på vardera sidan och den totala tiden det tar att slutföra uppgiften.
Förvärv
OBS: Efter acklimatisering började zebrafisk en 3-dagars förvärvsuppgift.
1. Kammarens inställning: Fäst en vit filtbit på utsidan av ett valfack och en svart filtbit på utsidan av det andra valfacket(bild 1C,F).
  Obs: Varva bakgrundsfärgen på varje sida dagligen med hjälp av ett pseudorandomschema³⁷.
  1. Under denna utbildningsfas, placera en stimbelöning som endast placeras i ett av de valfria utrymmena; detta blir den belönade sidan.
  2. För att börja förvärvet, placera en enda experimentell fisk i startkammaren under en 2-minuters period med valfacken stängda.
  3. Efter 2-minuters acklimatisering öppnar du samtidigt båda dörrarna, ger tillgång till båda valfacken och startar stoppuret för att bedöma valfördröjningen.
  4. Använd en vinklad design och tilldela slumpmässigt fisken antingen en svart eller vit preferens (dvs. antingen W+/B- eller B+/W-), vilket innebär att stimmen placeras i antingen det svarta (B+) eller vita (W+) valfacket.
2. Beteckna valsvaret
  1. När fisken har valt genom att gå in i ett av sidofacken, stoppa timern.
  2. Om fisken väljer den föredragna sidan på rätt sätt, stäng omedelbart dörren mellan centralkammaren och den sidan för att begränsa fisken till önskad sida i 1 minut och låt den belönas genom att interagera med stimtanken (figur 1C,F). Poäng poäng denna rättegång som "C" för "Korrekt" (belönad).
  3. Om fisken simmar genom den felaktiga dörren, överför den tillbaka till den centrala kammaren, stäng båda dörrarna och poäng rättegången som "jag" för "felaktig" (icke-belönad).
  4. Om fisken inte fattar ett beslut inom 2 minuter efter att dörrarna öppnats, flytta fisken till rätt sida i 1 min och poäng rättegången som "M" för "märkt" (kraftbelönad).
  5. När du överför/flyttar tillbaka fisken till startkammaren, led försiktigt fisken in i den centrala kammaren med hjälp av ett fisknät som herdeverktyg.
    OBS: Skopa inte fisken ur vattnet och sätt tillbaka den i startkammaren eftersom detta kan påverka beteendeanalysen.
  6. När fisken återvänder till den centrala kammaren, vänta i 1 minut innan du utför uppgiften igen. Se till att varje fisk utför uppgiften 8 gånger.
3. Datainsamling
  1. För varje experimentell fisk, registrera tiden till första beslutet (eller valfördröjning) och de enskilda poängen (C, I eller M) för var och en av de 8 förvärvsförsöken (avsnitt 3.4.2) i ordning.
  2. Rapportera resultaten för dessa experiment rapporterades som gruppgenomsnitt för varje försök på varje förvärvsdag.
  3. När en fisk har slutfört en studie kategoriserar den som antingen en "högpresterande" fisk eller en "lågpresterande" fisk.
    OBS: En fisk ansågs vara "högpresterande" om den lyckades valde rätt sida av tanken i minst 6 av de 8 totala försöken för dagen. Alla fiskar som inte uppfyller detta kriterium är en "låg presterande".
  4. När de identifierats, hus högpresterande och lågpresterande fisk separat.
  5. Kategorisera fisken som "hög" eller "låg" utförare under var och en av de tre förvärvsdagarna, efter att en fisk har slutfört försöken.
    OBS: I slutet av den tredje förvärvsdagen förblir fisken antingen "hög" eller "låg" under studiens löptid.
    OBS: Vissa fiskar som ursprungligen var i gruppen "lågpresterande" lär sig uppgiften på förvärvsdag 2 eller 3. När detta händer kan den ursprungliga "lågpresterande" fisken flyttas till den "högpresterande" gruppen. Flytta inte fisken mellan grupper på detta sätt efter dag 3 (slutet av förvärvet).

4. Experimentell behandling

Efter förvärvsperioden, när fisken visar förmågan att lösa en enkel diskrimineringsuppgift mellan den svartvita bakgrunden, starta behandlingsregimen för den experimentella zebrafisken.
Obs: För att visa tillämpligheten av denna metod visar denna studie två experimentella mönster:
1. Longitudinell studie
  1. Returnera den experimentella fisken till deras avloppstankar i 8 veckor. Underhåll fisken i standardtankar med dagliga vattenförändringar och mata dem två gånger dagligen.
    OBS: Utför ingen beteendeträning under dessa 8 veckor i avloppstankarna.
  2. Utför återföringsbedömning efter denna period för att bedöma om zebrafisken kan lösa återföringsuppgiften efter 8 veckor utan träning.
2. Hyperglykemi: Exponera de experimentella grupperna för vatten (hantering av stresskontroll), mannitol (1%–3%, osmotisk kontroll) eller glukos (1%–3%) i 4 eller 8 veckor²²^,²³.
  OBS: Utför ingen beteendeträning under dessa 4 eller 8 veckor.

5. Återföring

OBS: Efter experimentell manipulering (som i avsnitt 4.2) testas fisken i den sista delen av 3-kammarvalsparadigmet – omvändning. För att göra detta är den belönade sidan omvänd (jämfört med förvärv) så att fisk som tidigare belönats med ett stim på den vita sidan nu belönas med ett stim på den svarta sidan och vice versa. På detta sätt bedömer reversering om fisken har lärt sig var belöningen (stim) ligger, oavsett bakgrundens färg.

Kammare inställning
1. Fäst svart filt på utsidan av en av valkamrarna och den vita filten på utsidan av den andra, se till att de svartvita sidorna är på samma sidor som i förvärvsförsöken (avsnitt 3.4).
2. Sänk ner stimtanken i det bortre hörnet av sidan som är motsatsen till den tidigare belönade valkammaren (Figur 1D,G).
  OBS: Med andra ord belönas nu fisk som tidigare belönats på den vita sidan på den svarta sidan och vice versa.
3. Testa fisken individuellt enligt avsnitt 3.5. Börja med att placera en enda experimentell fisk i startkammaren under en 2-minuters period och stäng tillgången till valfacken.
4. Öppna samtidigt kammarens båda sidor.
  OBS: Slutför totalt 8 studier varje dag under tre på varandra följande behandlingsdagar.
Beteckna valsvaret
1. Om fisken korrekt väljer önskad färg, stäng omedelbart dörren till den centrala kammaren i 1 min, så att fisken kan interagera med stimbelöning. Poäng poäng denna rättegång som "C" för "Korrekt" (belönad).
2. Om fisken simmar genom den felaktiga dörren, överför den tillbaka till den centrala kammaren, stäng båda dörrarna och poäng denna rättegång som "jag" för "felaktig" (icke-belönad).
3. Om fisken inte fattar ett beslut inom 2 minuter efter att dörrarna öppnats, flytta fisken till rätt sida och poäng rättegången som "M" för "märkt" (tvångsbelönad).
Datainsamling
1. För varje experimentell zebrafisk, registrera valfördröjningen och de individuella poängen (C, I, M), i ordning för varje försök.
2. Rapportera resultaten för dessa experiment som gruppgenomsnitt för varje tvåtestblock under var och en av de tre återföringsdagarna.
3. Håll data för högpresterande och lågpresterande fiskar åtskilda för att avgöra om de visar samma prestandanivå under återföring som de gjorde under förvärvet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Acklimatisering till beteendekammaren innebär tre dagars träning: 2 dagars gruppacklimatisering följt av 1 dag av individuell acklimatisering. Men eftersom vi inte kunde skilja enskilda zebrafiskar från varandra kunde vi bara samla in data under individuell acklimatisering. Vid denna tidpunkt tog försöksdjur (n = 30), betingade med hjälp av en stimbaserad belöning, i genomsnitt 125,11 s för att nå sitt första beslut (figur 2A) och i genomsnitt 725,34 s (12 minuter) för att slutföra hela den individuella acklimatiseringsuppgiften (figur 2B). Det fanns ingen signifikant sidopreferens under acklimatisering (figur 2C). Antalet uteslutna fiskar var minimalt jämfört med andra belöningstyper (livsmedel) som vi tidigare hade bedömt i vårt laboratorium (Figur 2C).

Efter acklimatisering började zebrafisk förvärvsfasen. Eftersom fisk testades individuellt samlade vi in data från varje fisk under var och en av de tre förvärvsdagarna. Fisken klassificerades som antingen "högpresterande eller lågpresterande", med "högpresterande" som svarade snabbare och mer exakt, trots att all fisk hade samma tidigare exponering för testkammaren. Endast fisk som valde det belönade valutrymmet i minst 6 av de 8 försöken klassificerades som "högpresterande". Fisk som inte uppfyllde detta kriterium var "lågpresterande". Hög och lågpresterande fisk inrymdes separat för att skilja deras prestanda i alla efterföljande försök. Intressant nog konstaterade vi att vissa fiskar bytte kategori (dvs. ursprungligen var "lågpresterande", men blev "högpresterande") under förvärvet. Faktum är att antalet högpresterande djur ökade varje dag, med mer högpresterande fisk på förvärvsdag 3 jämfört med dag 1 (Figur 3A). Dag 3 hade >50% av fisken blivit "högpresterande". Dessutom minskade den ursprungliga svarstiden för alla fiskar under de tre förvärvsdagarna (A1–A3), vilket indikerar en förbättrad prestanda för varje förvärvsdag (figur 3B). Samma trend sågs också när endast den högpresterande fiskgruppen övervägdes: dag 3 förbättrades tiden till det första beslutet (blev snabbare) (figur 3C).

Ett diskrimineringsförhållande (belönade försök/(belöning + icke-återanmärkade försök) beräknades för varje försöksblock för förvärv (i genomsnitt två försök/fisk) under de tre förvärvsdagarna (A1–A3) för alla försöksdjur (n = 30) för att avgöra hur exakt fisken löste (förvärvade) diskrimineringsuppgiften (dvs. att gå till den belönade sidan av tanken). Detta förhållande visade att andelen fisk som flyttade till den belönade sidan under varje försök ökade dagligen (dvs. över försöksblock varje enskild dag) och totalt sett (dvs. under de tre förvärvsdagarna) vilket resulterade i att all fisk presterade över chansen i slutet av förvärvet (prickad linje representerad i diagrammet; (Figur 4A) och som anger att fisken hade lärt sig diskrimineringsuppgiften.

Efter förvärvet av diskrimineringsinlärning testade vi hur länge zebrafisk skulle komma ihåg uppgiften. För att göra det, testade zebrafisk kvar i hålla tankar i 8 veckor. Efter denna tid testades fisk på en reverseringsuppgift som varade i 3 dagar (R1-R3). Vi fann att fisken visade starkt reverseringsbeteende och ökad diskriminering under de tre dagarna av omvändning (Figur 4B), vilket indikerar att de kunde (1) komma ihåg förhållandet mellan tankens färg och belöningen och (2) hämma vad de tidigare hade lärt sig under förvärvet och lära sig omsvängningen / motsatta paradigmet. Som visas i figur 4Bgick zebrafisken ursprungligen till den icke-belönade sidan av tanken, vilket framgår av att diskrimineringsförhållandet var under slumpen under de första spåren på omsvängning dag 1. I slutet av R1 ökade dock prestandan till större än slumpen, ett resultat som bibehölls på R2 och R3, med de högsta diskrimineringskvotpoängen observerade på R3. Sammantaget visar dessa data att naiva försöksdjur kan lösa diskrimineringsuppgiften, även om det ursprungliga beteendet förvärvades 8 veckor tidigare, utan någon ytterligare utbildning mellan beteendesessioner.

3-kammarval paradigmet kan också tillämpas på undersökning av sjukdomskomplikationer. I vår studie med hyperglykemisk zebrafisk var acklimatisering och förvärv som beskrivits, och reversering testades efter antingen 4 eller 8 veckors hyperglykemi. Hyperglykemi inducerades med ett alternativt nedsänkningsprotokoll (McCarthy et al., 2020 - detta problem), så att träning inträffade varannan dag, dagar efter zebrafisk hade varit i testlösningar i 24 h. Under förvärvet fanns det en huvudsaklig effekt av utbildningsdagen på diskrimineringsförhållandet (F (2, 239) = 4,457, p = 0,012; Figur 5A), där förhållandet på A1 är betydligt lägre än på A3 (p = 0,010), vilket indikerar att fisken förbättrade sin valnoggrannhet över tid. Under återföringen fanns det en signifikant huvudeffekt av behandlingen (F (2, 326) = 3,057, p = 0,048), men inga andra signifikanta huvudeffekter eller interaktioner (träningsdag: (F (2, 326) = 1,602, p = 0,203); träningsdag x behandling: (F (4, 326) = 0,661, p = 0,620); Figur 5A). Svaret från glukosbehandlade djur minskade signifikant jämfört med de vattenbehandlade djuren (p = 0, 037), men det fanns inga andra signifikanta skillnader (kontroll v. mannitol: p = 0, 387; mannitol v. glukos: p = 0, 524), vilket tyder på en glukosspecifik effekt. Efter 8 veckors hyperglykemi noterades inga statistiska skillnader i diskrimineringskvoter mellan förvärvsutbildning (F (2 263) = 2 909, p = 0, 056; Figur 5B). Det fanns dock betydande huvudsakliga effekter av båda träningsdagarna (F (2, 189) = 4,721, p = 0,010) och behandling (F (2, 189) = 7,940, p = 0,000) vid reversering, men ingen signifikant interaktion (träningsdag * behandling = F (4, 189) = 0,869, p = 0,484). Efterföljande minst signifikanta jämförelser (LSD) visade signifikanta skillnader mellan R1 och R3 (p = 0,022) och mellan R2 och R3 (p = 0,003). LSD parvis jämförelser visade också betydande skillnader mellan vattenbehandlingsgruppen och både glukos och mannitol behandling grupper (vatten v. mannitol: p = 0,008; vatten v. glukos: 0,000); Glukos- och mannitolgrupperna var dock inte signifikant olika varandra (p = 0, 265), vilket tyder på att dessa skillnader i diskrimineringsförhållande kan bero på osmotiska effekter.

Figur 1: Testkammare med tre kammare och beteendeinställningar. A) 3-kammarschema. Försöksdjur begränsades till den centrala startkammaren i 2 minuter och tillät sedan tillgång till vardera sidan av tanken i början av en studie. För att göra det höjdes den övre halvan av var och en av de två skiljeväggarna för att skapa ett 10 cm utrymme för fisk att korsa in i något av valfacken. B,E) Acklimatisering utfördes med hjälp av en beige bakgrund och stim av conspecifics som belöning. C,F) I artikel 3.1 skall Förvärvet utfördes med svartvit bakgrund på valkamrarna; belöningen endast fanns på ena sidan av kammaren. G) Reversering utfördes med svartvit bakgrund på valfacken. belöningen endast var tillgänglig på motsatt sida av kammaren (jämfört med förvärvet). (H) På nära håll nedsänkt bild av stimtanken i ett av valfacken. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Svarstid och antal markerade försök under individuell acklimatisering. A) Valfördröjning för det första beslutet. b) Den totala tiden för att slutföra individuell acklimatisering. C) Antalet poster till vänster och höger är inte annorlunda, vilket tyder på att det inte fanns någon inneboende sidopreferens före förvärvsstarten. Vi rapporterar också det totala antalet markförsök under individuell acklimatisering. Värden rapporteras som Mean ± SEM. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 3: Andelen högpresterande fisk och det ursprungliga valet av latens bland all fisk och högpresterande fisk under de tre förvärvsdagarna. A) Högpresterande fisk flyttades från den centrala kammaren till den belönade sidan av kammaren i minst 6 av 8 försök varje förvärvsdag (A1–A3). (B) Under tre dagars förvärvsutbildning (A1–A3) minskade den totala svarstiden för det ursprungliga valet. en trend som också är tydlig i högpresterande fisk (C). Värden rapporteras som Mean ± SEM. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 4: Diskriminering under förvärvs- och återföringsförsök. (A) Diskrimineringskvot (belönade försök/(belöning + icke-återförda försök) av fisk under förvärvsdagarna (A1–A3) och (B) under omsvängning 8 veckor senare. Återföring bedömdes också i 3 dagar (R1–R3). För båda uppgifterna var varje fisk tvungen att slutföra 8 försök, och resultaten presenteras i två-försöksblock (2, 4, 6, 8). Korrekta svar under både förvärv och återföring ökade med tiden, med ett snabbare svar observerat under reversering, vilket indikerar fisken lärt sig och kom ihåg uppgiften. Värden rapporteras som Medelvärde ± SEM. Den prickade linjen representerar slumpen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 5: Förvärv och återföring av hyperglykemisk zebrafisk med hjälp av beteendeuppgiften med 3 kammare. (A) Före behandlingen förvärvade naiv zebrafisk beteendeuppgiften med 3 kammare under tre dagars beteendeträning (förvärv, A1–A3). Det fanns en betydande skillnad mellan diskrimineringskvoterna på A1 och A3 som tydde på att lärande ägde rum (p = 0,012). Efter 4 veckors behandling (färgade symboler) fanns en signifikant effekt av behandlingen (p = 0, 048), där glukosbehandlade djur uppvisade betydligt reducerade diskrimineringsförhållanden jämfört med vattenbehandlade djur (p = 0, 037). (B) I ett separat experiment bedömdes beteende före och efter 8 veckors hyperglykemi. Trots den stadiga resultatökningen under varje förvärvsdag fanns det inga betydande skillnader i diskrimineringsförhållandet mellan A1 och A3. Efter 8 veckors behandling (färgade symboler) fanns det dock en huvudeffekt av behandlingen (p < 0,001) och en individuell huvudeffekt av träningsdagen (p = 0,010). Post hoc-analyser visade en signifikant skillnad mellan den vattenbehandlade gruppen och både mannitol- och glukosbehandlade grupper, vilket tyder på en osmotisk effekt (vatten v. mannitol: p = 0, 008; vatten mot glukos: p < 0, 001). * betecknar en betydande huvudeffekt. Datapunkter representerar grupp ± SEM, och datapunkter med olika bokstäver skiljer sig avsevärt från varandra. Den prickade linjen representerar slumpen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även om det har skett en enorm tillväxt i mängden och variationen av neurovetenskaplig forskning som utförts med zebrafisk under de senaste 15^{åren 24,}saknas beteendemässiga analyser i denna art jämfört med däggdjursmodellsystem¹¹^,²⁵^,²⁶. Här visar vi att en trekammarvalsuppgift utvecklad för användning med gnagare kan anpassas för att bedöma förvärv och omsvängning av ett visuellt diskrimineringsinlärning hos zebrafisk. Med hjälp av ett levande stim som belöning gav denna uppgift en robust analys som kan tillämpas på en mängd olika studier som undersöker beteenderelaterade sjukdomar som hyperglykemiska komplikationer av diabetes, Alzheimers och demens.

Det har tidigare fastställts att zebrafisk kan lära sig och lagra information eftersom det krävs för att fatta ekologiskt relevanta beslut och nödvändigt för överlevnad i naturen³. Våra förvärvs- och reverseringsdata i en 8-veckors longitudinell studie stöder tidigare bevis för att zebrafisk, även om den är liten, kan lära sig och komma ihåg en enkel diskrimineringsuppgift, och att zebrafisk också kan hämma tidigare förvärvade svar. I den longitudinella 8-veckorsstudien minskade antalet tvångsbelöningar och diskrimineringskvoten ökade, vilket indikerar att fisken blir bättre på att välja rätt, belönad sida och har lärt sig uppgiften. Även om dessa förändringar inte var betydande såg vi en övergripande nedåtgående trend i antalet tvångsbelönade försök under förvärvet och en ökning av diskrimineringskvoten. Resultaten av tre-kammare val beteendeuppgift med hyperglycemic fisk visade tillämpligheten av testet till studier som undersöker hyperglykemiska villkor och indikerar att detta paradigm kan användas i kombination med andra experimentella manipuleringar, såsom läkemedelsexponeringar eller mutanta linjer, för att bedöma potentiella effekter på kognition.

En viktig begränsning av denna studie är att vi inte kan identifiera enskilda fiskar över tid och därför måste förlita oss på gruppgenomsnitt för att bedöma uppgifterna. Att utveckla ett sätt att individuellt spåra fisk i de olika behandlingsgrupperna, som hos gnagare, skulle kunna ta itu med dessa frågor. I ett försök att lösa dessa skillnader sorterade vi fisken under förvärvsfasen baserat på deras prestanda, vilket visade sig vara en oväntad fördel med vår metodik. "Högpresterande fisk" ≥ 6/8 på varje träningsdag, medan fisk med lägre poäng var "lågpresterande fisk". När det räknades varje dag ökade antalet "högpresterande" i den yliga belönade gruppen så att det vid dag 3 fanns betydligt mer fisk i denna kategori jämfört med den fiskbelönade behandlingen. Valfrihetstrender som observerats för alla ("högpresterande + lågpresterande") fiskar liknar de som endast observerats i gruppen "högpresterande", vilket tyder på att de starka reaktionerna från denna grupp drev övergripande svar.

Sammanfattningsvis visar dessa resultat att stimbaserad diskriminering lärande i zebrafisk ger en genomförbar kostnadseffektiv modell för studier av normala och nedsatt kognitiva funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Sabrina Jones för hennes hjälp med att anpassa ett gnagarparadigm med tre kammare till zebrafiskmodellen och Jeremy Popowitz och Allison Murk för deras hjälp med beteendeinsamlingsdagar, hjälp med att köra försök, djurvård och tankuppsättning. Särskilt tack också till James M. Forbes (Mekanisk ingenjör) för hans hjälp med 3-kammarval tank design och konstruktion.

Finansiering: VPC och TLD fick ett gemensamt fakultetsforskningsstöd (FRSG) från American University College of Arts and Sciences. CJR fick stöd från American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Champion Sports Stopwatch Timer Set: Waterproof, Handheld Digital Clock Sport Stopwatches with Large Display for Kids or Coach - Bright Colored 6 Pack	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Champion-Sports-910SET-Stopwatch-Timer/dp/B001CD9LJK/ref=sr_1_17?dchild=1&keywords=stopwatch+for+sports&qid=1597081570&sr=8-17 Recommend two of different colors; one for choice latency and one for time to completion
Coofficer Extra Large Binder Clips 2-Inch (24 Pack), Big Paper Clamps for Office Supplies, Black	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Coofficer-Binder-2-Inch-Clamps-Supplies/dp/B07C94YCR5/ref=sr_1_3_sspa?dchild=1&keywords=large+binder+clips&qid=1597081521&sr=8-3-spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVyPUExUENWUTRZVjlIWEVPJmVuY3J5cHRlZElkPUEwNDQ5NDU0MlpSREkwTFlLSThVQiZlbmNyeXB0ZWRBZElkPUEwMTg5NDI3MllRV1EzOUdWTVpSOCZ3aWRnZXROYW1lPXNwX2F0ZiZhY3Rpb249Y2xpY2tSZWRpcmVjdCZkb05vdExvZ0NsaWNrPXRydWU=
Marineland® Silicone Aquarium Sealant	Petsmart	Item #2431002
PVC (Polyvinyl Chloride) Sheet, Opaque Gray, Standard Tolerance, UL 94/ASTM D1784, 0.125" Thickness, 12" Width, 24" Length	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Polyvinyl-Chloride-Standard-Tolerance-Thickness/dp/B000MAMGEQ/ref=sr_1_2?dchild=1&keywords=grey+PVC+sheet&qid=1597081440&sr=8-2
Steelworks 1/4-in W x 8-ft L Mill Finished Aluminum Weldable Trim U-shaped Channel	Lowes	Item #55979Model #11377	https://www.lowes.com/pd/Steelworks-1-4-in-W-x-8-ft-L-Mill-Finished-Aluminum-Weldable-Trim-Channel/3058181
Tetra 10 Gallon Fish tank	Petsmart	Item #5271256
Top Fin Fine Mesh Fish Net (3 in)	Petsmart	Item #5175115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Gitler, A. D., Dhillon, P., Shorter, J. Neurodegenerative disease: models, mechanisms, and a new hope. Disease Models & Mechanisms. 10, 499-502 (2017).
Perry, R. J., Watson, P., Hodges, J. R. The nature and staging of attention dysfunction in early (minimal and mild) Alzheimer's disease: relationship to episodic and semantic memory impairment. Neuropsychologia. 38, 252-271 (2000).
Gerlai, R. Learning and memory in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 134, Elsevier Ltd. (2016).
Davidson, T. L., et al. The effects of a high-energy diet on hippocampal-dependent discrimination performance and blood-brain barrier integrity differ for diet-induced obese and diet-resistant rats. Physiology and Behavior. 107, 26-33 (2012).
Yang, M., Silverman, J. L., Crawley, J. N. Automated three-chambered social approach task for mice. Current Protocols in Neuroscience. 56 (1), (2011).
Remmelink, E., Smit, A. B., Verhage, M., Loos, M. Measuring discrimination- and reversal learning in mouse models within 4 days and without prior food deprivation. Learning and Memory. 23, 660-667 (2016).
Salas, C., et al. Neuropsychology of learning and memory in teleost fish. Zebrafish. 3, 157-171 (2006).
Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10, 70-86 (2013).
Luchiaria, A. C., Salajanb, D. C., Gerlai, R. Acute and chronic alcohol administration: Effects on performance of zebrafish in a latent learning task. Behavior Brain Research. 282, 76-83 (2015).
Fadool, J., Dowling, J. Zebrafish: A model system for the study of eye genetics. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 89-110 (2008).
Fernandes, Y. M., Rampersad, M., Luchiari, A. C., Gerlai, R. Associative learning in the multichamber tank: A new learning paradigm for zebrafish. Behavioural Brain Research. 312, 279-284 (2016).
Reider, M., Connaughton, V. P. Developmental exposure to methimazole increases anxiety behavior in zebrafish. Behavioral Neuroscience. , (2015).
Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
May, Z., et al. Object recognition memory in zebrafish. Behavioural Brain Research. 296, 199-210 (2016).
Mathur, P., Lau, B., Guo, S. Conditioned place preference behavior in zebrafish. Nature Protocols. 6, 338-345 (2011).
Guo, S. Linking genes to brain, behavior and neurological diseases: What can we learn from zebrafish. Genes, Brain and Behavior. 3, 63-74 (2004).
Kily, L. J. M., et al. Gene expression changes in a zebrafish model of drug dependency suggest conservation of neuro-adaptation pathways. Journal of Experimental Biology. 211, 1623-1634 (2008).
Webb, K. J., et al. Zebrafish reward mutants reveal novel transcripts mediating the behavioral effects of amphetamine. Genome Biology. 10, (2009).
Clayman, C. L., Malloy, E. J., Kearns, D. N., Connaughton, V. P. Differential behavioral effects of ethanol pre-exposure in male and female zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 335, 174-184 (2017).
Ruhl, T., et al. Acute administration of THC impairs spatial but not associative memory function in zebrafish. Psychopharmacology. 231, 3829-3842 (2014).
Gellermann, L. W. Chance orders of alternating stimuli in visual discrimination experiments. The Pedagogical Seminary and Journal of Genetic Psychology. 42, 206-208 (1933).
Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44, 157-163 (2007).
Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13, 87-94 (2016).
Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: Zebrafish as a model system of human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 817341 (2012).
Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R., Court, P. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35, 63-75 (2014).
Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in cell biology. 101, 249-270 (2011).

Behavior

Beteendeuppgiften med tre kammares val med zebrafisk som modellsystem

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.