Summary
우리는 인지 성능을 평가하기 위해 설계된 행동 챔버를 제시한다. 우리는 일단 인수한 후, 제브라피쉬가 8주 후에 그 일을 기억한다는 것을 보여주는 데이터를 제공합니다. 우리는 또한 고혈당 얼룩말 물고기인지 성능을 변경 했다 보여줍니다., 이 패러다임 인식 및 메모리를 평가 하는 연구에 적용 할 수 있음을 나타내는.
Abstract
신경 퇴행성 질환은 연령에 따라 다르고 쇠약하며 불치입니다. 최근 보고서는 또한 기억 및 인지 장애의 변화와 고혈당증을 상관. 우리는 고혈당 제브라피시와 함께 사용하기 위해 설치류와 유사한 3 챔버 선택 인지 작업을 수정하고 개발했습니다. 테스트 챔버는 중앙에 위치한 시작 챔버와 양쪽에 두 개의 선택 구획으로 구성되어 있으며, 보상으로 사용되는 동특화 의 숄. 우리는 일단 인수한 후, 제브라피쉬가 적어도 8주 후에 작업을 기억한다는 것을 보여주는 데이터를 제공합니다. 우리의 데이터는 제브라피쉬가 이 보상에 강력하게 반응한다는 것을 표시하고, 우리는 처리의 4 주 후에 고혈당 물고기에 있는 인식 적자를 확인했습니다. 이 행동 분석은 또한 인식 및 기억과 관련 있는 그밖 연구 결과에 적용될 수 있습니다.
Introduction
신경 퇴행성 질환은 연령에 따라 다르고 쇠약하며 불치입니다. 이 질병은 보급에서 증가하고, 새로운 치료 전략을 개선하고 개발하는 긴급한 필요의 결과로. 각 질병의 발병 및 프리젠 테이션은 독특하며, 일부는 언어, 모터 및 자율 뇌 영역에 영향을 미치며 다른 질병은 학습 적자 및 기억 상실1을유발합니다. 가장 주목할 만한 것은, 인지 적자 및/또는 손상은 모든 신경 퇴행성 질환2에걸쳐 가장 널리 퍼진 합병증입니다. 이러한 신경 퇴행성 질환에 관여하는 근본적인 메커니즘에 빛을 흘리기 위해, 많은 다른 모델 시스템 (설치류와 인간과 같은 고차 척추 동물에 Drosophila에 단세포 유기체를 포함)의 사용이 사용되었습니다; 그러나, 신경 퇴행성 질환의 대부분은 불치의 남아.
학습과 기억은 환경에 대한 지속적인 변화로 인해 적응3이필요하기 때문에 유기체 들 사이에서 매우 보존된 과정입니다. 인지 및 시 냅 스 가소성 모두에서 손상 여러 설치류 모델에서 입증 되었습니다. 구체적으로, 잘 확립된 행동적 인약은 다양한 장애 유발 질환 및 장애4에따른 인지 변화를 평가하기 위해 연관 학습을 사용한다. 또한, 대조 차별 반전 은 높은 순서 학습 및 메모리 기능을 포함 하기 때문에 인지 적자를 평가, 반전 이전에 배운 협회의 억제에 따라 달라 집니다. 널리 사용되는 3 챔버 선택 작업은 중추신경계의학습 및 메모리 경로에서 가능한 적자를 해명5,6. 최근에는 유충에서성인7,8까지다양한 연령대의 패러다임이 개발됨에 따라 제브라피쉬(Daniorerio)와같은 비포유류 모델을 포함하도록 확장되고 있다.
Zebrafish는 행동 기술로 인지 장애의 평가에 유리한 복잡성과 단순성의 균형을 제공합니다. 첫째, 제브라피쉬는 작은 크기와 다작 생식 특성을 감안할 때 높은 처리량 행동 검진에 순종합니다. 둘째, 제브라피쉬는 유사한 뉴런 마커및 세포유형7을가지므로 포유류 해마와 유사한 구조, 측면 팔륨을 갖는다. Zebrafish는 또한 공간 정보9를 획득하고 기억할 수 있으며, 인간과 마찬가지로10개입니다. 따라서, 제브라피쉬가 빈도가 증가하는 신경퇴행성 질환의 모델로 사용되고 있다는 것은 놀라운 일이 아니다. 그러나 적절한 행동 적 실험이 없으면 인지 평가를 위해 제브라피시 모델을 적용하기가 어려워졌습니다. 제브라피쉬특이적 행동적 작용제는 연관학습작업(11, 불안행동12개,기억13,개체인식14,조건부-장소 선호도15,16,17,18,19)등이 있다. 제브라피쉬 행동 실험과 관련하여 많은 발전이 있었지만, 설치류에서 인지 기능의 일부 테스트에 대한 대응은 아직 제브라피시18과함께 사용하기 위해 개발되지 않았습니다.
우리의 실험실에서 이전 연구를 기반으로, 우리는 모델링 / 보상으로 사회적 상호 작용을 사용하여 설치류와 함께 사용되는 세 챔버 선택 작업을 기반으로 제브라피시에 인지 작업을 개발. 또한, 우리는 행동 작업의 연관 학습 측면에 확장하고 인지 장애를 평가하기 위해이 행동 작업을 더 개발하기 위해 대비 차별 반전을 통합. 이를 통해 차별 학습의 초기 인수와 반전 단계에서 그 학습의 후속 억제를 모두 검토할 수 있었습니다. 현재 연구에서는, 우리는 이 절차가 4 또는 8 주 동안 포도당 침수 다음 제브라피시에서 인지 기능을 평가하기위한 신뢰할 수있는 방법을 제공 한다는 것을 보여줍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 실험 절차는 미국 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 # 1606, 19-02).
1. 동물
- 동물 사육 및 유지 보수
- 4-11개월 된 성인 야생형 제브라피쉬(Daniorerio)를배아로 획득하고 사내에서 사육합니다.
- 14h 광:10-h 어두운 광기간에 28-29°C에서 수중 랙 시스템에서 물고기를 유지합니다.
- 상업용 플레이크로 하루에 두 번 물고기를 먹이고 살아있는 아르테미아로보충하십시오.
- 행동 실험을 위해 이러한 스톡 탱크에서 무작위로 물고기를 선택하십시오.
- 실험 이 완료되면, 2 분 동안 0.02 % 트리카인에 침수하여 동물을 마취하거나 모터 조정이 부족하고 나중에 분자 및 / 또는 신경 화학 적 분석을위한 호흡 속도를 감소시킬 때까지.
2. 3 챔버 선택 테스트 챔버
참고:이 행동 기술은 Ruhl 외20에서수정되었습니다.
- 챔버 건설
- 행동챔버(26)를수정하여 40L 수족관(50 x 30 x 30cm3)-중앙또는 시작 챔버(10 x 30 x 30cm3)를가지도록, 두 개의 측면 선택 챔버(각 20 x 30 x 30cm3,그림 1A)에서분리된다.
- 수족관 실란트가 있는 내부 유리 벽에 부착된 알루미늄 "U자형" 채널을 사용하여 3개의 구획을 구성하여 탱크를 3개의 챔버로 분리합니다.
- 양쪽의 알루미늄 채널에 맞는 회색 PVC 시트에서 10cm 높이의 불투명 한 칸막이를 구성합니다. 각 칸막이를 2개 조각으로 만들어 각 크기의 크기와 동일하게 만듭니다: 탱크 내에 영구적으로 장착된 고정된 바닥 조각과 알루미늄 트랙에서 위아래로 움직이는 움직이는 이동 가능한 탑 피스.
- 초대형 바인더 클립을 회색 PVC 시트 의 상단에 접착제로 고정하여 핸들 역할을 합니다.
- 영구 마커를 사용하여 탱크 바깥쪽에 부착된 회색 PVC 파이프 위에 10cm 높이의 작은 수평 선을 그립니다.
참고: 이 표시는 양쪽에 액세스할 수 있도록 상단 회색 PVC 시트를 열 수 있는 지점입니다. - 탱크에 제어(system) 물을 탱크의 바닥에서 위로 25cm 수준으로 추가하거나, ~ 30 L. 유리 수족관 히터를 챔버의 각 섹션에 24시간 동안 챔버의 각 섹션에 넣고 28.5°C로 온도를 가져오는 테스트를 한다.
참고: 동작 세션이 시작될 때 히터를 제거하고 2일 사용 후 전체 물 교환을 수행합니다.
- 차별 설정
- 각 차별 작업에 대해 벨크로(그림1B-D)를사용하여 선택 챔버의 바깥쪽, 측면 및 하단에 각각 색펠트 조각(베이지색, 검은색 또는 흰색)을 배치합니다.
참고: 중앙 챔버에는 배경색과 관련된 배경색이 없어야 합니다.
- 각 차별 작업에 대해 벨크로(그림1B-D)를사용하여 선택 챔버의 바깥쪽, 측면 및 하단에 각각 색펠트 조각(베이지색, 검은색 또는 흰색)을 배치합니다.
- 보상으로, 각 선택 챔버의 먼 뒷모서리에 작고 명확한 탱크에서 연구에서 달리 사용되지 않는 4 명의 성인 얼룩말 피시 (그림 1 B-D)를 배치하여 동특이성 (shoal)의 그룹을 만듭니다(도 1B-D).
참고: 각 숄 탱크의 실험어와 같은 연령과 크기의 남성 1명과 암컷 1마리를 매일 스톡 탱크에서 무작위로 삽 물고기를 선택합니다.
3. 행동 작업
- 적응
참고: 행동 챔버에 적응하는 것은 3 일간의 훈련으로 구성됩니다. 그룹 적응의 이틀 다음 개별 훈련의 하루. - 그룹 적응
- 베이지색(중립)을 두 선택 구획의 외부에 배경이 부착하고, 각 선택구(도1B)에라이브 숄 탱크를 침수한다.
- 슬라이딩 도어가 모두 열려 있는 가운데 시작 챔버에 5-6개의 얼룩말어를 추가하고 물고기가 30분 동안 자유롭게 돌아다닐 수 있도록 합니다.
참고 : 실험 적인 얼룩말 물고기는 적응 하는 동안 어느 선택 된 구획으로 교차 후 보상으로 탱크를 통해 이러한 shoal 물고기와 상호 작용 하 고 사교 수 있어야 합니다. 물고기는 전신이 챔버에 들어갈 때 측면 챔버 중 하나에 들어간 것으로 간주됩니다. - 두 번째 날 (그룹 적응의 2 일)에 대한 동일한 실험 물고기와이 절차를 반복합니다.
참고: 동일한 물고기 그룹을 유지하지 마십시오.
- 개별 적응
- 챔버 설정: 베이지색(중립)을 선택 구획의 외부에 배경이 부착하고, 그룹적응(도 1B, E)과같이 선택 구획 모두에 라이브 숄 탱크를 침수한다.
- 슬라이딩 도어가 닫혀 있는 가운데 시작 챔버에 개별 얼룩말어를 2분 간 배치하고, 2분 후 두 문을 동시에 엽니다.
- 각 물고기가 어느 쪽에 관계없이 총 10 번 문을 통해 중앙 챔버에서 수영하는지 확인하십시오. 측면 챔버 중 하나에 들어갈 때마다 물고기를 보상하십시오 (개별 적응의 1 일).
참고: 물고기가 30분 이내에 이 작업을 10번 완료할 수 없거나 시작 챔버를 전혀 떠나기를 거부하는 경우 연구에서 제외하십시오.
- 데이터 수집: 물고기가 어느 쪽으로 수영하는 횟수와 작업을 완료하는 데 걸리는 총 시간을 기록합니다.
- 챔버 설정: 베이지색(중립)을 선택 구획의 외부에 배경이 부착하고, 그룹적응(도 1B, E)과같이 선택 구획 모두에 라이브 숄 탱크를 침수한다.
- 획득
참고: 적응 후, 제브라피쉬는 3일 간의 인수 작업을 시작했습니다.- 챔버 설정: 한 선택 구획의 외부에 흰색 펠트 피스를 부착하고 다른 선택 구획의 외부에 검은 펠트 조각을 부착합니다(그림1C, F).
참고: 의사 랜덤스케줄(37)을사용하여 매일 각 면의 배경색을 번갈아 가세요.- 훈련의이 단계의 기간 동안, 만 선택 구획 중 하나에 배치 된 신발 보상을 배치; 이것은 보상측이 됩니다.
- 인수를 시작하려면 선택 구획이 닫히면서 2분 동안 시작 챔버에 실험용 물고기를 하나 만 배치합니다.
- 2분 순응 후, 두 도어를 동시에 열어 두 개의 선택 구획에 접근할 수 있으며 스톱워치를 시작하여 선택 대기 시간을 평가합니다.
- 편향된 디자인을 사용하여 물고기에게 흑백 기본 설정(즉, W+/B 또는 B+/W-)을 임의로 할당하여 숄이 검은색(B+) 또는 흰색(W+) 선택 구획에 배치됨을 의미합니다.
- 선택 응답 표시
- 물고기가 사이드 컴파트먼트 중 하나에 들어가서 선택하면 타이머를 중지하십시오.
- 물고기가 올바르게 선호하는 쪽을 선택하는 경우, 즉시 중앙 챔버와 그 측 사이의 문을 닫아 물고기를 선호하는 쪽으로 1 분 동안 제한하고, 상기 숄 탱크(도 1C, F)와상호 작용하여 보상을 받을 수 있도록한다. 이 시험을 "올바른"(보상)에 대해 "C"로 점수가 매려있습니다.
- 물고기가 잘못된 문을 통해 수영하는 경우, 중앙 챔버로 다시 전송, 두 문을 닫고, "잘못된"에 대한 "I"로 재판을 점수 (비 보상).
- 물고기가 문을 연 후 2 분 이내에 결정을내리지 않으면 물고기를 올바른 쪽으로 1 분 동안 이동하고 "표시"(강제 보상)에 대한 "M"로 재판을 점수.
- 물고기를 다시 출발실로 옮기고 옮길 때, 물고기를 양치기 도구로 사용하여 물고기를 중앙 챔버로 부드럽게 안내합니다.
참고: 물고기가 물 밖으로 떠서 행동 분석에 영향을 줄 수 있으므로 시작 챔버로 교체하지 마십시오. - 물고기가 중앙 챔버로 돌아오면 다시 작업을 수행하기 전에 1 분 동안 기다립니다. 각 물고기가 작업을 8번 수행하도록 합니다.
- 데이터 수집
- 각 실험어에 대해 8개의 취득 시험(섹션 3.4.2)에 대해 첫 번째 결정(또는 선택 대기 시간)과 개별 점수(C, I 또는 M)를 순서대로 기록합니다.
- 이러한 실험의 결과를 각 평가판에 대한 그룹 평균으로 보고하였다.
- 물고기가 시험을 마치면 "고성능" 물고기 또는 "성능이 낮은" 물고기로 분류합니다.
참고: 하루에 8번의 총 시험 중 최소 6개에서 탱크의 올바른 면을 선택한 물고기는 "고성능"으로 간주되었습니다. 이 기준을 충족하지 않는 모든 물고기는 "낮은 연기자"입니다. - 일단 확인되면, 집 높은 성능과 낮은 성능의 물고기별도로.
- 물고기가 시험을 마친 후, 수집 3 일 의 각각에 "높은"또는 "낮은"공연으로 물고기를 분류합니다.
참고: 수집 사흘이 되면 생선은 연구 기간 동안 "높음" 또는 "낮은" 공연자로 유지됩니다.
참고: 처음에는 '저조한' 그룹에 있던 일부 물고기가 2일 또는 3일에 작업을 학습합니다. 이 경우 초기 '저조한' 물고기가 '고성능' 그룹으로 이동할 수 있습니다. 3일째(인수 종료) 이후에는 그룹 간에 물고기를 이동하지 마십시오.
- 챔버 설정: 한 선택 구획의 외부에 흰색 펠트 피스를 부착하고 다른 선택 구획의 외부에 검은 펠트 조각을 부착합니다(그림1C, F).
4. 실험적 치료
- 획득 기간 이후에, 물고기가 흑백 배경 사이의 단순한 차별 작업을 해결할 수있는 능력을 입증할 때, 실험 제브라피시에 대한 치료 요법을 시작합니다.
참고: 이 방법의 적용 가능성을 보여주기 위해 이 연구는 두 가지 실험 설계를 보여줍니다.- 경도 연구
- 실험용 물고기를 8주 동안 들고 있는 탱크에 반품합니다. 매일 물이 바뀌는 표준 탱크에서 물고기를 유지하고 매일 두 번 먹입니다.
참고: 홀딩 탱크에서 8주 동안 행동 훈련을 실시하지 마십시오. - 이 기간 이후에 반전 평가를 수행하여 제브라피쉬가 훈련 없이 8주 후에 반전 과제를 해결할 수 있는지 여부를 평가합니다.
- 실험용 물고기를 8주 동안 들고 있는 탱크에 반품합니다. 매일 물이 바뀌는 표준 탱크에서 물고기를 유지하고 매일 두 번 먹입니다.
- 고혈당증: 실험군을 물(응력 조절 처리), 매니톨(1%-3%, 삼투성 조절), 또는 포도당(1%-3%)에 4또는 8주22,23에노출한다.
참고: 4주 또는 8주 동안행동교육을 실시하지 마십시오.
- 경도 연구
5. 반전
참고: 실험 조작(섹션 4.2과 같이)에 따라 물고기는 3챔버 선택 패러다임의 마지막 부분에서 테스트됩니다. 이를 위해, 보상 측은 이전에 흰색 측면에 신발로 보상 물고기가 지금 검은 면에 신발로 보상하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다 등 (인수에 비해) 반전된다. 이러한 방식으로 반전은 배경의 색상에 관계없이 물고기가 보상(shoal)이 있는 위치를 배웠는지 여부를 평가합니다.
- 챔버 설정
- 선택 챔버 중 하나의 외부에 펠트 검은 색을 부착하고 흰색은 다른 쪽으로 느꼈으며, 흑백 면이 인수 시험 (섹션 3.4)과 동일한 측면인지 확인합니다.
- 이전에 보상받은 선택챔버(도 1D, G)와반대되는 측면의 먼 뒤쪽 모서리에 있는 숄 탱크를 침수한다.
참고 : 즉, 이전에 흰색 측면에 보상 물고기는 이제 검은 면에 보상하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. - 3.5절과 같이 물고기를 개별적으로 테스트합니다. 시작 챔버에 실험어 1개를 2분 동안 배치하고 선택 구획에 대한 액세스를 차단합니다.
- 동시에 챔버의 양쪽을 엽니 다.
참고: 3일 연속 치료일 동안 매일 총 8건의 시험을 완료합니다.
- 선택 응답 표시
- 물고기가 원하는 색상을 올바르게 선택하면 즉시 중앙 챔버에 문을 닫고 1 분 동안 물고기를 밀어 넣습니다. 이 시험을 "올바른"(보상)에 대해 "C"로 점수가 매려있습니다.
- 물고기가 잘못된 문을 통해 수영하는 경우, 중앙 챔버로 다시 전송, 두 문을 닫고,이 시험을 점수 "잘못된"에 대한 (비 보상).
- 물고기가 문을 연 후 2 분 이내에 결정을내리지 않으면 물고기를 올바른 쪽으로 옮기고 "표시"(강제 보상)에 대한 "M"로 재판을 점수.
- 데이터 수집
- 각 실험 제브라피쉬에 대해 각 시험마다 선택 대기 시간과 개별 점수(C, I, M)를 순서대로 기록합니다.
- 이러한 실험의 결과를 각 2심판 블록에 대해 3개의 반전 일별로 그룹 평균으로 보고합니다.
- 고성능 및 저성능 어류에 대한 데이터를 별도로 유지하여 획득 하는 동안과 동일한 수준의 성능이 반전되는 동안 성능을 표시했는지 여부를 결정합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
행동 챔버에 적응하는 것은 훈련의 3 일을 포함: 그룹 적응의 2 일 다음 1 개인 적응의 일. 그러나 개별 제브라피쉬를 서로 구별할 수 없기 때문에 개별 적응 중에만 데이터를 수집할 수 있었습니다. 이때, 동물(n=30)은 삽계 보상을 이용하여 컨디셔닝하여, 첫 번째결정(그림 2A)과평균 725.34s(12분)의 평균을 받아 전체 개별 적응태스크(그림2B)를완료하였다. 적응 시 중요한 측면 선호도가없었다(도 2C). 제외된 생선의 수는 이전에 실험실에서 평가한 다른 보상 유형(음식)과 비교하여 최소하였다(그림2C).
적응 후, 제브라피쉬는 인수 단계를 시작했다. 물고기가 개별적으로 테스트됨에 따라, 우리는 3 개의 수집 일에 각 물고기의 데이터를 수집했습니다. 물고기는 '높거나 낮은 공연자'로 분류되었으며, 모든 물고기가 테스트 챔버에 동일한 이전 노출을 했음에도 불구하고 '높은 공연자'가 빠르고 정확하게 반응했습니다. 8번의 시험 중 최소 6개에서 보상받은 선택구를 선택한 물고기만 '고공연'으로 분류되었다. 이 기준을 충족하지 못한 물고기는 '낮은 공연자'였다. 고성능 과 낮은 성능의 물고기는 모든 후속 시험에서 자신의 성능을 구별하기 위해 별도로 보관되었다. 흥미롭게도, 우리는 일부 물고기변경 카테고리 (즉, 처음에는 '낮은 공연'이었지만, '높은 공연자'가되었다)를 관찰했습니다. 실제로, 고성능 동물의 수는 매일 증가, 취득 일에 더 높은 성능 물고기와 함께 3 일(그림 3A)에비해. 3일째에는 생선의 >50%가 '높은 공연자'가 되었습니다. 또한, 3일간의 모든 어류에 대한 초기 선택 대기 시간이 감소하여 매일 의 취득(그림3B)을통해 향상된 성능을 나타냅니다. 같은 경향은 또한 높은 성능의 물고기 그룹만 고려 될 때 보였다: 3 일째에 의해, 첫 번째 결정이 개선 될 시간 (더 빨리되었다)(그림 3C).
모든 실험 동물(n =30)에 대한 각 획득 시험 블록(평균 2개의 시험/물고기)에 대해 차별 비율(보상 시험/보상 + 비보상 시험)을 계산하여 물고기가 차별 과제를 얼마나 정확하게 해결(취득)했는지 를 결정합니다(즉, 탱크의 보상측으로 가는). 이 비율은 각 시험 기간 동안 보상측으로 이동하는 물고기의 비율이 매일 증가(즉, 각 개인의 날에 시험 블록에 걸쳐) 및 전체 (즉, 3 취득 일에 걸쳐) 획득의 끝에 의해 모든 물고기가 확률 위에 수행결과 (그래프에 표현 된 점선; (그림4A)물고기가 차별 과제를 배웠다는 것을 나타낸다.
차별 학습을 인수한 후, 우리는 제브라피쉬가 그 일을 얼마나 기억할 지 테스트했습니다. 이를 위해 테스트된 제브라피쉬는 8주 동안 탱크를 들고 있었습니다. 이 시간 후, 물고기는 3 일 지속 반전 작업에 테스트 (R1-R3). 우리는 물고기가 강한 반전 행동과 반전(그림 4B)의3 일 동안 차별증가 를 입증 발견, 그들은 (1) 탱크의 색상과 보상 사이의 관계를 기억하고 (2) 그들이 이전에 획득 하는 동안 배운 것을 억제 하 고 반전/반대 패러다임을 배울 수 있었다. 그림 4B에나타난 바와 같이, 제브라피쉬는 처음에 반전 첫날 에 초기 트레일 에서 차별 비율이 확률보다 낮은 것으로 나타난 바와 같이, 탱크의 비 보상 측면에 갔다. 그러나 R1이 끝날 무렵, R2와 R3에서 유지된 결과, R3에서 가장 높은 차별비율 점수가 관찰된 결과인 확률보다 성능이 향상되었습니다. 종합하면, 이러한 데이터는 순진한 실험 동물이 행동 세션 사이에 추가 교육없이 8 주 전에 초기 행동을 획득했음에도 불구하고 차별 작업을 해결할 수 있음을 보여줍니다.
3 챔버 선택 패러다임은 질병 합병증의 검사에도 적용 될 수있다. 고혈당 제브라피쉬를 대상으로 한 연구에서는 적응과 획득이 설명된 대로, 4주 또는 8주 간의 고혈당증에 따라 반전을 테스트했습니다. 고혈당증은 대체 침수 프로토콜 (McCarthy et al., 2020 - 이 문제)으로 유도되어 제브라피시가 24 h의 테스트 솔루션에 있었던 후 며칠 동안 훈련이 매일 발생했습니다. 취득 하는 동안, 차별 비율에 훈련 일의 주요 효과 있었다 (F (2, 239) = 4.457, p = 0.012; 도 5A)A1의 비율이 A3(p = 0.010)보다 현저히 낮음으로, 물고기가 시간이 지남에 따라 선택 정확도를 향상했음을 나타냅니다. 반전 하는 동안, 치료의 중요 한 주요 효과 (F (2, 326) = 3.057, p = 0.048), 하지만 다른 중요 한 주요 효과 또는 상호 작용 (훈련 일: (F (2, 326) = 1.602, p = 0.203); 훈련 일 x 치료: (F (4, 326) 0.61); 그림 5A). 포도당 처리된 동물의 반응은 수처리 동물(p = 0.037)에 비해 현저히 감소되었지만, 다른 유의한 차이(대조군 v. mannitol: p = 0.387; mannitol v. 포도당: p = 0.524), 포도당 특이적 효과를 시사한다. 8주 간의 고혈당증 후, 취득 교육(F(2,263) = 2.909, p = 0.056에 걸쳐 차별비율에서 통계적 차이가 지적되지 않았다. 그림 5B). 그러나, 두 훈련일(F(2, 189) = 4.721, p=0.010) 및 치료(F(2, 189) = 7.940, p = 0.000) 반전의 중요한 주요 효과가 있었지만, 유의한 상호작용(훈련일 * 치료 = F(4, 189) = 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869p=0.89=0.89= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869= 0.869. 후속 최소 유의차이(LSD) 쌍방향 비교는 R1과 R3(p = 0.022)와 R2와 R3(p= 0.003) 사이의 상당한 차이를 확인하였다. LSD 쌍별 비교는 또한 수처리 단과 포도당 과 매니톨 처리 단 둘 다 사이 중요한 다름을 밝혔습니다 (물 v. mannitol: p = 0.008; 물 v. 포도당: 0.000); 그러나, 포도당 및 매니톨 그룹은 서로 크게 다르지 않았다 (p = 0.265), 차별 비율의 이러한 차이는 삼투 효과 때문일 수 있음을 시사.
그림 1: 3 챔버 선택 테스트 챔버 및 동작 설정. (A) 3 챔버 회로도. 실험동물은 중앙 시동 챔버로 2분 동안 제한된 후 시험 시작 시 탱크 의 양쪽에 접근할 수 있었습니다. 이렇게 하려면 두 칸막이의 상단 절반이 제기되어 물고기가 어느 선택든 구획으로 교차할 수 있는 10cm 공간을 만들었습니다. (B,E) 응착은 베이지색 배경과 동특이성의 숄을 보상으로 사용하여 수행되었다. (C,F) 획득은 선택 챔버에 흑백 배경을 사용하여 수행되었다; 보상은 챔버의 한쪽에만 있었습니다. (G) 선택 구획에 흑백 배경을 사용하여 반전이 수행되었다; 보상은 챔버의 반대편에만 사용할 수 있었다 (대 취득). (H) 선택 구획 중 하나에 잠긴 숄 탱크의 상한 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 개별 적응 시 대기 시간 및 표시된 시험 수입니다. (A) 첫 번째 결정의 선택 대기 시간. (B) 개별 적응을 완료하는 데 걸리는 총 시간입니다. (C) 왼쪽과 오른쪽에 있는 항목 수는 다르지 않아 인수 시작 전에 고유한 측면 선호도가 없음을 나타냅니다. 또한 개별 적응 중에 총 마크 시험 횟수를 보고합니다. 값은 평균 ± SEM으로 보고됩니다.
그림 3: 3일 동안 모든 물고기와 고성능 어류 중에서 성능이 높은 물고기의 백분율과 초기 선택 대기 시간. (A) 고성능 어류는 중앙 챔버에서 챔버의 보상쪽으로 이동하여 8번의 시험 중 적어도 6개(A1-A3)를 획득했습니다. (B) 인수 교육(A1-A3)의 3일 동안 전반적인 초기 선택 대기 시간이 감소했습니다. 고성능 생선(C)에서도 볼 수 있는 추세입니다. 값은 평균 ± SEM으로 보고됩니다.
그림 4: 인수 및 반전 시험 중 차별 성과. (A) 취득일(A1-A3) 및 (B) 8주 후 반전 학습 중 물고기의 차별비율(보상 시험/(보상+ 비보상 시험) 반전은 또한 3 일 동안 평가되었다 (R1-R3). 두 작업 모두 각 물고기는 8 번의 시험을 완료해야했으며 결과는 2 개의 시험 블록 (2, 4, 6, 8)으로 제시됩니다. 획득 과 반전 동안 올바른 응답은 시간이 지남에 따라 증가, 빠른 응답은 반전 동안 관찰, 물고기가 배우고 작업을 기억 나타내는. 값은 평균 ± SEM으로 보고됩니다. 점선은 기회를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 3 챔버 선택 행동 작업을 사용하여 고혈당 제브라피시의 획득 및 반전. (A) 치료 전에 순진한 제브라피쉬는 3일간의 행동 훈련(취득, A1-A3)에 걸쳐 3챔버 선택 행동 과제를 인수했습니다. A1과 A3의 차별 비율 사이에는 학습이 일어났다는 것을 나타내는 차별 비율 사이에는 상당한 차이가 있었습니다(p = 0.012). 4주 간의 치료(컬러 심볼)에 이어 포도당 처리동물(p= 0.048)이 처리된 동물(p= 0.037)에 비해 차별비율이 현저히 감소하였다. (B) 별도의 실험에서 8주 전과 후에 고혈당증을 평가하였다. 매 인수 일마다 꾸준한 실적 증가에도 불구하고 A1-A3 에 걸쳐 차별 비율에 큰 차이가 없었습니다. 그러나 8주 간의 치료(유색 기호) 후, 치료의 주요 효과(p < 0.001)와 훈련일의 개별적인 주요 효과(p= 0.010)가 있었다. 후크 후 분석은 수중 처리된 단과 매니톨 과 포도당 처리단 둘 다 사이 중요한 다름을 제시했습니다, 삼투성 효력을 건의합니다 (물 v. mannitol: p = 0.008; 물 v. 포도당: p < 0.001). * 중요한 주요 효과를 나타냅니다. 데이터 포인트는 그룹 ± SEM을 나타내며 문자가 다른 데이터 포인트는 서로 크게 다릅니다. 점선은 기회를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
지난 15년 동안 제브라피쉬를 이용한 신경과학 연구의 양과 다양성이 엄청나게 증가했지만, 포유류 모델시스템(11,25,26)에비해 이 종에서는 행동적 실험이 부족하다. 여기서는 설치류와 함께 사용하기 위해 개발된 3챔버 선택 과제를 제브라피시에서 시각적 차별 학습의 획득 및 반전을 평가하기 위해 조정할 수 있음을 보여줍니다. 살아있는 삽을 보상으로 사용하여, 이 작업은 당뇨병, 알츠하이머 병 및 치매의 고혈당 합병증과 같은 행동적으로 연결된 질병을 검토하는 다양한 연구에 적용 될 수있는 강력한 분석결과를 제공했습니다.
그것은 이전에 제브라피쉬가 생태학적으로 관련된 결정을 내리고 야생3에서생존을 위해 필요하기 때문에 정보를 학습하고 저장할 수 있다는 것이 확립되었습니다. 8주 간의 경도 연구에서 얻은 데이터 및 반전 데이터는 제브라피쉬가 작은 반면 단순한 차별 과제를 배우고 기억할 수 있다는 사전 증거를 뒷받침하며, 제브라피쉬는 이전에 획득한 응답을 억제할 수 있습니다. 8주 간의 연구에서 강제 보상 횟수가 감소하고 차별비율이 증가하여 물고기가 정확하고 보상받는 쪽을 선택하는 것이 더 좋아지고 그 과제를 배웠습니다. 이러한 변화는 중요하지 않았지만, 인수 시 강제 보상 시험 건수와 차별 비율 의 증가로 전반적으로 하락 추세를 보였습니다. 또한, 고혈당어를 이용한 3챔버 선택 행동 작업의 결과는 고혈당 상태를 조사한 연구에 대한 시험의 적용성을 밝혀내고, 이 패러다임이 약물 노출 또는 돌연변이 선과 같은 다른 실험 조작과 함께 사용될 수 있음을 나타내며, 이는 인지에 대한 잠재적 효과를 평가한다.
이 연구의 중요한 한계는 시간이 지남에 따라 개별 물고기를 식별 할 수 없으므로 데이터를 평가하기 위해 그룹 평균에 의존해야한다는 것입니다. 설치류와 같이 다른 치료 그룹에서 물고기를 개별적으로 추적하는 방법을 개발하는 것은 이러한 문제를 해결할 수 있습니다. 이러한 차이를 해결하기 위해, 우리는 우리의 방법론의 예기치 않은 이점으로 밝혀졌다 자신의 성능에 따라 획득 단계에서 물고기를 정렬. '고성능 생선'은 훈련 당일 6/8≥ 득점한 반면, 점수가 낮은 생선은 '저성능 물고기'였다. 매일 계산하면, '높은 연기자'의 수는 3 일째까지, 물고기 보상 치료에 비해이 범주에 훨씬 더 많은 물고기가 있었다 있도록, shoal 보상 그룹에서 증가. 모든 ('높은 + 낮은 공연') 물고기에서 관찰 된 선택 대기 시간 동향은 '고성능'그룹에서만 관찰 된 것과 유사하며,이 그룹의 강력한 반응이 전반적인 반응을 주도하고 있음을 시사합니다.
요약하자면, 이러한 연구 결과는 제브라피시의 암초 기반 차별 학습이 정상적이고 손상된 인지 기능의 연구를 위한 실행 가능한 비용 효율적인 모델을 제공한다는 것을 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 제브라피쉬 모델과 제레미 포포비츠와 앨리슨 머크가 행동 수집 일에 도움을 준 후, 달리기 시험, 동물 관리 및 탱크 셋업에 도움을 준 설치류 3 챔버 선택 패러다임을 조정한 그녀의 도움을 준 사브리나 존스에게 감사드립니다. 제임스 M. 포브스 (기계 엔지니어)에게 3 챔버 선택 탱크 설계 및 건설에 대한 그의 지원에 대한 특별한 감사.
자금: VPC와 TLD는 미국 예술 과학 대학으로부터 공동 교수 연구 지원 보조금 (FRSG)을 받았습니다. CJR은 미국 예술 과학 대학 대학원 학생 지원에서 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Champion Sports Stopwatch Timer Set: Waterproof, Handheld Digital Clock Sport Stopwatches with Large Display for Kids or Coach - Bright Colored 6 Pack | Amazon | N/A | https://www.amazon.com/Champion-Sports-910SET-Stopwatch-Timer/dp/B001CD9LJK/ref=sr_1_17?dchild=1&keywords=stopwatch+for+sports&qid=1597081570&sr=8-17 Recommend two of different colors; one for choice latency and one for time to completion |
| Coofficer Extra Large Binder Clips 2-Inch (24 Pack), Big Paper Clamps for Office Supplies, Black | Amazon | N/A | https://www.amazon.com/Coofficer-Binder-2-Inch-Clamps-Supplies/dp/B07C94YCR5/ref=sr_1_3_sspa?dchild=1&keywords=large+binder+clips&qid=1597081521&sr=8-3-spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVyPUExUENWUTRZVjlIWEVPJmVuY3J5cHRlZElkPUEwNDQ5NDU0MlpSREkwTFlLSThVQiZlbmNyeXB0ZWRBZElkPUEwMTg5NDI3MllRV1EzOUdWTVpSOCZ3aWRnZXROYW1lPXNwX2F0ZiZhY3Rpb249Y2xpY2tSZWRpcmVjdCZkb05vdExvZ0NsaWNrPXRydWU= |
| Marineland® Silicone Aquarium Sealant | Petsmart | Item #2431002 | |
| PVC (Polyvinyl Chloride) Sheet, Opaque Gray, Standard Tolerance, UL 94/ASTM D1784, 0.125" Thickness, 12" Width, 24" Length | Amazon | N/A | https://www.amazon.com/Polyvinyl-Chloride-Standard-Tolerance-Thickness/dp/B000MAMGEQ/ref=sr_1_2?dchild=1&keywords=grey+PVC+sheet&qid=1597081440&sr=8-2 |
| Steelworks 1/4-in W x 8-ft L Mill Finished Aluminum Weldable Trim U-shaped Channel | Lowes | Item #55979Model #11377 | https://www.lowes.com/pd/Steelworks-1-4-in-W-x-8-ft-L-Mill-Finished-Aluminum-Weldable-Trim-Channel/3058181 |
| Tetra 10 Gallon Fish tank | Petsmart | Item #5271256 | |
| Top Fin Fine Mesh Fish Net (3 in) | Petsmart | Item #5175115 |
References
- Gitler, A. D., Dhillon, P., Shorter, J. Neurodegenerative disease: models, mechanisms, and a new hope. Disease Models & Mechanisms. 10, 499-502 (2017).
- Perry, R. J., Watson, P., Hodges, J. R. The nature and staging of attention dysfunction in early (minimal and mild) Alzheimer's disease: relationship to episodic and semantic memory impairment. Neuropsychologia. 38, 252-271 (2000).
- Gerlai, R. Learning and memory in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 134, Elsevier Ltd. (2016).
- Davidson, T. L., et al. The effects of a high-energy diet on hippocampal-dependent discrimination performance and blood-brain barrier integrity differ for diet-induced obese and diet-resistant rats. Physiology and Behavior. 107, 26-33 (2012).
- Yang, M., Silverman, J. L., Crawley, J. N. Automated three-chambered social approach task for mice. Current Protocols in Neuroscience. 56 (1), (2011).
- Remmelink, E., Smit, A. B., Verhage, M., Loos, M. Measuring discrimination- and reversal learning in mouse models within 4 days and without prior food deprivation. Learning and Memory. 23, 660-667 (2016).
- Salas, C., et al. Neuropsychology of learning and memory in teleost fish. Zebrafish. 3, 157-171 (2006).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10, 70-86 (2013).
- Luchiaria, A. C., Salajanb, D. C., Gerlai, R. Acute and chronic alcohol administration: Effects on performance of zebrafish in a latent learning task. Behavior Brain Research. 282, 76-83 (2015).
- Fadool, J., Dowling, J. Zebrafish: A model system for the study of eye genetics. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 89-110 (2008).
- Fernandes, Y. M., Rampersad, M., Luchiari, A. C., Gerlai, R. Associative learning in the multichamber tank: A new learning paradigm for zebrafish. Behavioural Brain Research. 312, 279-284 (2016).
- Reider, M., Connaughton, V. P. Developmental exposure to methimazole increases anxiety behavior in zebrafish. Behavioral Neuroscience. , (2015).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
- May, Z., et al.
- Mathur, P., Lau, B., Guo, S. Conditioned place preference behavior in zebrafish. Nature Protocols. 6, 338-345 (2011).
- Guo, S. Linking genes to brain, behavior and neurological diseases: What can we learn from zebrafish. Genes, Brain and Behavior. 3, 63-74 (2004).
- Kily, L. J. M., et al. Gene expression changes in a zebrafish model of drug dependency suggest conservation of neuro-adaptation pathways. Journal of Experimental Biology. 211, 1623-1634 (2008).
- Webb, K. J., et al. Zebrafish reward mutants reveal novel transcripts mediating the behavioral effects of amphetamine. Genome Biology. 10, (2009).
- Clayman, C. L., Malloy, E. J., Kearns, D. N., Connaughton, V. P. Differential behavioral effects of ethanol pre-exposure in male and female zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 335, 174-184 (2017).
- Ruhl, T., et al. Acute administration of THC impairs spatial but not associative memory function in zebrafish. Psychopharmacology. 231, 3829-3842 (2014).
- Gellermann, L. W. Chance orders of alternating stimuli in visual discrimination experiments. The Pedagogical Seminary and Journal of Genetic Psychology. 42, 206-208 (1933).
- Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44, 157-163 (2007).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13, 87-94 (2016).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: Zebrafish as a model system of human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 817341 (2012).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R., Court, P. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35, 63-75 (2014).
- Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in cell biology. 101, 249-270 (2011).
