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Behavior

La tarea de comportamiento de elección de tres cámaras utilizando el pez cebra como sistema modelo

Published: April 14, 2021 doi: 10.3791/61934
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 2,4, 1,2
1Department of Biology, American University, 2Center for Behavioral Neuroscience, American University, 3Department of Chemistry, American University, 4Department of Neuroscience, American University

Summary

Presentamos una cámara conductual diseñada para evaluar el rendimiento cognitivo. Proporcionamos datos que muestran que una vez adquirido, el pez cebra recuerda la tarea 8 semanas después. También mostramos que el pez cebra hiperglucémico ha alterado el rendimiento cognitivo, lo que indica que este paradigma es aplicable a los estudios que evalúan la cognición y la memoria.

Abstract

Las enfermedades neurodegenerativas dependen de la edad, son debilitantes e incurables. Informes recientes también han correlacionado la hiperglucemia con cambios en la memoria y / o deterioro cognitivo. Hemos modificado y desarrollado una tarea cognitiva de elección de tres cámaras similar a la utilizada con roedores para su uso con peces cebra hiperglucémicos. La cámara de prueba consta de una cámara de partida ubicada en el centro y dos compartimentos de elección a cada lado, con un banco de conespecíficos utilizados como recompensa. Proporcionamos datos que muestran que una vez adquirido, el pez cebra recuerda la tarea al menos 8 semanas después. Nuestros datos indican que el pez cebra responde de manera robusta a esta recompensa, y hemos identificado déficits cognitivos en peces hiperglucémicos después de 4 semanas de tratamiento. Este ensayo conductual también puede ser aplicable a otros estudios relacionados con la cognición y la memoria.

Introduction

Las enfermedades neurodegenerativas dependen de la edad, son debilitantes e incurables. Estas enfermedades están aumentando en prevalencia, lo que resulta en una necesidad urgente de mejorar y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. El inicio y la presentación de cada enfermedad es única, ya que algunas afectan a las regiones del lenguaje, motoras y del cerebro autónomo, mientras que otras causan déficits de aprendizaje y pérdida de memoria1. En particular, los déficits cognitivos y/o el deterioro son las complicaciones más prevalentes en todas las enfermedades neurodegenerativas2. Con la esperanza de arrojar luz sobre los mecanismos subyacentes involucrados en estas enfermedades neurodegenerativas, se ha empleado el uso de muchos sistemas modelo diferentes (incluidos organismos unicelulares a Drosophila a vertebrados de orden superior como roedores y humanos); sin embargo, la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas siguen siendo incurables.

El aprendizaje y la memoria son procesos altamente conservados entre los organismos, ya que los cambios constantes en el medio ambiente requieren adaptación3. El deterioro tanto en la cognición como en la plasticidad sináptica se ha demostrado en varios modelos de roedores. Específicamente, los ensayos conductuales bien establecidos utilizan el aprendizaje asociativo para evaluar los cambios cognitivos después de diversas enfermedades y trastornos inducidos por el deterioro4. Además, la reversión de la discriminación de contraste evalúa los déficits cognitivos porque involucra funciones de aprendizaje y memoria de orden superior, y la reversión depende de la inhibición de una asociación previamente aprendida. La tarea de elección de tres cámaras ampliamente utilizada aclara posibles déficits en las vías de aprendizaje y memoria del sistema nervioso central5,6. Recientemente, este campo se ha expandido para incluir modelos no mamíferos, como el pez cebra(Danio rerio),ya que se han desarrollado varios paradigmas para un rango de edades desde larvas hasta adultos7,8.

El pez cebra proporciona un equilibrio de complejidad y simplicidad que es ventajoso para la evaluación de deficiencias cognitivas con técnicas conductuales. En primer lugar, el pez cebra es susceptible de un cribado conductual de alto rendimiento dado su pequeño tamaño y su prolífica naturaleza reproductiva. En segundo lugar, el pez cebra posee una estructura, el palio lateral, que es análogo al hipocampo de los mamíferos, ya que tiene marcadores neuronales y tipos de células similares7. Los peces cebra también son capaces de adquirir y recordar información espacial9 y, al igual que los humanos, son diurnos10. Por lo tanto, no es sorprendente que el pez cebra se esté utilizando como modelo para enfermedades neurodegenerativas con una frecuencia cada vez mayor. Sin embargo, la ausencia de ensayos conductuales apropiados ha dificultado la aplicación del modelo de pez cebra para las evaluaciones cognitivas. El trabajo publicado utilizando ensayos de comportamiento específicos del pez cebra incluye tareas de aprendizaje asociativo11,comportamiento de ansiedad12,memoria13,reconocimientode objetos 14y preferencia de lugar condicionado15,16,17,18,19. Aunque ha habido muchos desarrollos con respecto a los ensayos de comportamiento del pez cebra, las contrapartes para algunas pruebas de funciones cognitivas en roedores aún no se han desarrollado para su uso con el pez cebra18.

Basándonos en estudios previos de nuestro laboratorio, modelamos / desarrollamos una tarea cognitiva en pez cebra basada en la tarea de elección de tres cámaras utilizada con roedores que utilizan la interacción social como recompensa. Además, ampliamos el aspecto de aprendizaje asociativo de la tarea conductual e incorporamos la inversión de la discriminación por contraste con la esperanza de desarrollar aún más esta tarea conductual para evaluar el deterioro cognitivo. Esto nos permitió examinar tanto la adquisición inicial del aprendizaje de la discriminación como la posterior inhibición de ese aprendizaje en la fase de reversión. En el estudio actual, demostramos que este procedimiento proporcionó un método confiable para evaluar el funcionamiento cognitivo en el pez cebra después de la inmersión en glucosa durante 4 u 8 semanas.

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Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la American University (protocolo # 1606, 19-02).

1. Animales

  1. Cría y mantenimiento de animales
    1. Obtener peces cebra adultos de tipo salvaje(Danio rerio)de 4 a 11 meses de edad como embriones y criarlos internamente.
    2. Mantenga a los peces en un sistema de bastidor acuático a 28-29 °C en un fotoperíodo oscuro de 14 h: 10 horas.
    3. Alimente a los peces dos veces al día con copos comerciales y complemente con Artemiaviva.
    4. Elija peces al azar de estos tanques de stock para experimentos de comportamiento.
  2. Al finalizar el experimento, anestesiar a los animales por inmersión en tricaína al 0,02% durante 2 min o hasta que haya una falta de coordinación motora y una tasa de respiración reducida para análisis moleculares y / o neuroquímicos posteriores.

2. Cámara de prueba de elección de tres cámaras

NOTA: Esta técnica conductual fue modificada a partir de Ruhl et al.20.

  1. Construcción de cámaras
    1. Modificar la cámara de comportamiento26—un acuario de 40 L (50 x 30 x 30 cm3)—para tener una cámara central o de partida (10 x 30 x 30 cm3),separada de dos cámaras laterales de elección (cada una de 20 x 30 x 30 cm3, Figura 1A).
    2. Construya los tres compartimentos utilizando un canal de aluminio en forma de "U" fijado a las paredes de vidrio interiores con sellador de acuario, para separar el tanque en tres cámaras.
    3. Construya divisores opacos, de 10 cm de altura, de lámina de PVC gris que encajan en los canales de aluminio a ambos lados. Haga cada divisor de 2 piezas, cada una de igual en tamaño: una pieza inferior estacionaria montada permanentemente dentro del tanque y una pieza superior móvil que se mueve hacia arriba y hacia abajo en las orugas de aluminio.
    4. Pegue clips de aglutinante extra grandes en la parte superior de las láminas de PVC gris para que actúen como mangos.
    5. Usando un marcador permanente, dibuje pequeñas líneas horizontales 10 cm por encima de la tubería de PVC gris adherida en el exterior del tanque.
      NOTA: Esta marca es el punto al que se abrirá la lámina superior de PVC gris para permitir el acceso a ambos lados.
    6. Agregue agua de control (sistema) al tanque a un nivel de 25 cm de abajo hacia arriba del tanque, o ~ 30 L. Coloque calentadores de acuario de vidrio en cada sección de la cámara durante 24 h antes de la prueba para llevar la temperatura a 28.5 ° C.
      NOTA: Retire los calentadores al inicio de la sesión de comportamiento y realice un intercambio completo de agua después de dos días de uso.
  2. Configuración de discriminación
    1. Para cada tarea de discriminación, coloque individualmente piezas de fieltro de colores (beige, negro o blanco) en la parte posterior exterior, el lado y la parte inferior de las cámaras de elección utilizando Velcro(Figura 1B-D).
      NOTA: La cámara central no debe tener ningún color de fondo asociado con ella.
  3. Como recompensa, cree un grupo de conespecíficos (cardúmenes) colocando 4 peces cebra adultos, que de otro modo no se utilizarán en el estudio, en un tanque pequeño y transparente en la esquina posterior de cada cámara deelección (Figura 1B-D).
    NOTA: Elija peces de banco al azar de tanques de stock cada día, con al menos un macho y una hembra de la misma edad y tamaño que los peces experimentales en cada tanque de banco.

3. Tareas de comportamiento

  1. Aclimatación
    NOTA: La aclimatación a la cámara de comportamiento consiste en tres días de entrenamiento; dos días de aclimatación grupal seguidos de un día de entrenamiento individual.
  2. Aclimatación grupal
    1. Coloque el fondo de fieltro beige (neutro) en el exterior de ambos compartimentos de elección y sumerja un tanque de cardumen vivo en cada uno de los compartimentos deelección (Figura 1B).
    2. Agregue cinco o seis peces cebra a la cámara de inicio central con ambas puertas correderas abiertas y permita que los peces deambulen libremente durante 30 minutos.
      NOTA: El pez cebra experimental debe poder interactuar y socializar con estos peces de banco a través del tanque como recompensa después de cruzar a cualquiera de los compartimentos de elección durante la aclimatación. Se considera que un pez ha entrado en una de las cámaras laterales cuando todo su cuerpo entra en la cámara.
    3. Repita este procedimiento con el mismo pez experimental durante un segundo día (2 días de aclimatación grupal).
      NOTA: No mantenga los mismos grupos de peces.
  3. Aclimatación individual
    1. Configuración de la cámara: Coloque el fondo de fieltro beige (neutro) al exterior de ambos compartimentos de elección y sumerja un tanque de banco vivo en ambos compartimentos de elección, como en la aclimatación grupal(Figura 1B, E).
      1. Coloque un pez cebra individual en la cámara de arranque central durante 2 minutos con las puertas correderas cerradas, y después del período de 2 minutos, abra ambas puertas simultáneamente.
      2. Asegúrese de que cada pez nade desde la cámara central a través de una puerta por un total de 10 veces, independientemente de qué lado. Recompense al pez cada vez que entre en una de las cámaras laterales (1 día de aclimatación individual).
        NOTA: Si un pez no puede completar esta tarea 10 veces dentro de un período de 30 minutos o se niega a abandonar la cámara de partida, excluirlo del estudio.
    2. Adquisición de datos: Registre el número de veces que el pez nada hacia cada lado y el tiempo total que tarda en completar la tarea.
  4. Adquisición
    NOTA: Después de la aclimatación, el pez cebra comenzó una tarea de adquisición de 3 días.
    1. Configuración de la cámara: Coloque una pieza de fieltro blanco en el exterior de un compartimento de elección y una pieza de fieltro negro en el exterior del otro compartimento de elección(Figura 1C, F).
      NOTA: Alterne el color de fondo de cada lado diariamente usando un programa pseudoaleatorio37.
      1. Durante la duración de esta fase de entrenamiento, coloque un banco de recompensa solo colocado en uno de los compartimentos de elección; esto se convierte en el lado recompensado.
      2. Para comenzar la adquisición, coloque un solo pez experimental en la cámara de inicio durante un período de 2 minutos con los compartimentos de elección cerrados.
      3. Después de la aclimatación de 2 minutos, abra simultáneamente ambas puertas, dando acceso a ambos compartimentos de elección, e inicie el cronómetro para evaluar la latencia de elección.
      4. Usando un diseño sesgado, asigne aleatoriamente al pez una preferencia en blanco o negro (es decir, W + / B- o B + / W-), lo que significa que el banco se coloca en el compartimiento de elección negro (B +) o blanco (W +).
    2. Denotando la respuesta de elección
      1. Una vez que el pez haga una elección al ingresar a uno de los compartimentos laterales, detenga el temporizador.
      2. Si el pez elige correctamente el lado preferido, cierre inmediatamente la puerta entre la cámara central y ese lado para restringir al pez al lado preferido durante 1 minuto, y permita que sea recompensado interactuando con el tanque de cardúmenes(Figura 1C, F). Puntúe esta prueba como "C" por "Correcto" (recompensado).
      3. Si el pez nada a través de la puerta incorrecta, transfiérala de nuevo a la cámara central, cierre ambas puertas y puntúe la prueba como "I" por "incorrecta" (no recompensada).
      4. Si el pez no toma una decisión dentro de los 2 minutos posteriores a la apertura de las puertas, mueva el pez al lado correcto durante 1 minuto y puntúe la prueba como "M" para "marcado" (recompensado por la fuerza).
      5. Al transferir / mover peces de regreso a la cámara de inicio, guíe suavemente a los peces a la cámara central usando una red de pesca como herramienta de pastoreo.
        NOTA: No saque el pescado del agua y reemplácelo en la cámara de inicio, ya que esto podría afectar el ensayo de comportamiento.
      6. Una vez que el pez regrese a la cámara central, espere 1 minuto antes de realizar la tarea nuevamente. Asegúrese de que cada pez realice la tarea 8 veces.
    3. Adquisición de datos
      1. Para cada pez experimental, registre el tiempo hasta la primera decisión (o latencia de elección) y las puntuaciones individuales (C, I o M) para cada uno de los 8 ensayos de adquisición (sección 3.4.2) en orden.
      2. Los resultados de estos experimentos se informaron como promedios de grupo para cada ensayo en cada día de adquisición.
      3. Una vez que un pez ha completado un ensayo, clasifíquelo como un pez de "alto rendimiento" o un pez de "bajo rendimiento".
        NOTA: Un pez fue considerado de "alto rendimiento" si eligió con éxito el lado correcto del tanque en al menos 6 de los 8 ensayos totales del día. Cualquier pez que no cumpla con este criterio es un "bajo rendimiento".
      4. Una vez identificado, aloja los peces de alto rendimiento y bajo rendimiento por separado.
      5. Clasifique a los peces como de rendimiento "alto" o "bajo" en cada uno de los tres días de adquisición, después de que un pez haya completado los ensayos.
        NOTA: Al final del tercer día de adquisición, los peces permanecen como de "alto" o "bajo" rendimiento durante la duración del estudio.
        NOTA: Algunos peces que inicialmente estaban en el grupo de "bajo rendimiento" aprenden la tarea el día de adquisición 2 o 3. Cuando esto sucede, el pez inicial de "bajo rendimiento" puede ser trasladado al grupo de "alto rendimiento". No mueva el pez entre grupos de esta manera después del día 3 (el final de la adquisición).

4. Tratamiento experimental

  1. Después del período de adquisición, cuando los peces demuestren la capacidad de resolver una tarea de discriminación simple entre el fondo blanco y negro, comience el régimen de tratamiento para el pez cebra experimental.
    NOTA: Para mostrar la aplicabilidad de este método, este estudio muestra dos diseños experimentales:
    1. Estudio longitudinal
      1. Devuelva los peces experimentales a sus tanques de retención durante 8 semanas. Mantenga a los peces en tanques estándar con cambios diarios de agua y aliméntelos dos veces al día.
        NOTA: No realice ningún entrenamiento conductual durante estas 8 semanas en los tanques de retención.
      2. Realice una evaluación de reversión después de este período para evaluar si el pez cebra puede resolver la tarea de reversión después de 8 semanas sin entrenamiento.
    2. Hiperglucemia: Exponer a los grupos experimentales al agua (manejo del control del estrés), manitol (1%-3%, control osmótico) o glucosa (1%-3%) durante 4 u 8 semanas22,23.
      NOTA: No realice ningún entrenamiento conductual durante estas 4 u 8 semanas.

5. Reversión

NOTA: Después de la manipulación experimental (como en la sección 4.2), los peces se prueban en la parte final del paradigma de elección de 3 cámaras: la inversión. Para hacer esto, el lado recompensado se invierte (en comparación con la adquisición) de tal manera que los peces previamente recompensados con un banco en el lado blanco ahora son recompensados con un banco en el lado negro y viceversa. De esta manera, la inversión evalúa si los peces han aprendido dónde se encuentra la recompensa (banco), independientemente del color del fondo.

  1. Configuración de la cámara
    1. Coloque el fieltro negro en el exterior de una de las cámaras de elección y el fieltro blanco en el exterior de la otra, asegurándose de que los lados blanco y negro sean los mismos que en los ensayos de adquisición (sección 3.4).
    2. Sumerja el tanque de cardúmenes en la esquina posterior del lado que es lo opuesto a la cámara de elección previamente recompensada(Figura 1D, G).
      NOTA: En otras palabras, los peces anteriormente recompensados en el lado blanco ahora son recompensados en el lado negro y viceversa.
    3. Pruebe los peces individualmente como en la sección 3.5. Comience colocando un solo pez experimental en la cámara de inicio durante un período de 2 minutos y cierre el acceso a los compartimentos de elección.
    4. Abra simultáneamente ambos lados de la cámara.
      NOTA: Complete un total de 8 ensayos cada día durante tres días consecutivos de tratamiento.
  2. Denotando la respuesta de elección
    1. Si el pez elige correctamente el color preferido, cierre inmediatamente la puerta de la cámara central durante 1 minuto, permitiendo que el pez interactúe con la recompensa del banco. Puntúe esta prueba como "C" por "Correcto" (recompensado).
    2. Si el pez nada a través de la puerta incorrecta, transfiérala de nuevo a la cámara central, cierre ambas puertas y puntúe esta prueba como "I" por "incorrecta" (no recompensada).
    3. Si el pez no toma una decisión dentro de los 2 minutos posteriores a la apertura de las puertas, mueva el pez al lado correcto y puntúe la prueba como "M" para "marcado" (recompensado por la fuerza).
  3. Adquisición de datos
    1. Para cada pez cebra experimental, registre la latencia de elección y las puntuaciones individuales (C, I, M), en orden, para cada ensayo.
    2. Informe los resultados de estos experimentos como promedios de grupo para cada bloque de dos ensayos en cada uno de los 3 días de reversión.
    3. Mantenga separados los datos de los peces de alto y bajo rendimiento para determinar si muestran el mismo nivel de rendimiento durante la reversión que durante la adquisición.

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Representative Results

La aclimatación a la cámara de comportamiento implica tres días de entrenamiento: 2 días de aclimatación grupal seguidos de 1 día de aclimatación individual. Sin embargo, debido a que no pudimos distinguir el pez cebra individual entre sí, solo pudimos recopilar datos durante la aclimatación individual. En este momento, los animales de experimentación (n = 30), condicionados utilizando una recompensa basada en cardúmenes, tardaron un promedio de 125.11 s en llegar a su primera decisión(Figura 2A)y un promedio de 725.34 s (12 min) para completar toda la tarea de aclimatación individual(Figura 2B). No hubo preferencia lateral significativa durante la aclimatación(Figura 2C). El número de peces excluidos fue mínimo en comparación con otros tipos de recompensa (alimentos) que habíamos evaluado previamente en nuestro laboratorio(Figura 2C).

Después de la aclimatación, el pez cebra comenzó la fase de adquisición. A medida que los peces se probaron individualmente, recopilamos datos de cada pez en cada uno de los tres días de adquisición. Los peces se clasificaron como "de alto o bajo rendimiento", con "alto rendimiento" que responden más rápido y con mayor precisión, a pesar de que todos los peces tienen la misma exposición previa a la cámara de prueba. Solo los peces que seleccionaron el compartimento de elección recompensada en al menos 6 de los 8 ensayos se clasificaron como "de alto rendimiento". Los peces que no cumplían con este criterio eran "de bajo rendimiento". Los peces de alto y bajo rendimiento se alojaron por separado para distinguir su rendimiento en todos los ensayos posteriores. Curiosamente, observamos que algunos peces cambiaron de categoría (es decir, inicialmente eran "de bajo rendimiento", pero se convirtieron en "de alto rendimiento") durante el curso de la adquisición. De hecho, el número de animales de alto rendimiento aumentó cada día, con más peces de alto rendimiento en el día de adquisición 3 en comparación con el día 1(Figura 3A). Para el día 3, >50% de los peces se habían convertido en "peces de alto rendimiento". Además, la latencia de elección inicial para todos los peces a lo largo de los tres días de adquisición (A1-A3) disminuyó, lo que indica un mejor rendimiento con cada día de adquisición(Figura 3B). La misma tendencia también se observó cuando solo se consideró el grupo de peces de alto rendimiento: para el día 3, el tiempo hasta la primera decisión mejoró (se hizo más rápido)(Figura 3C).

Se calculó una relación de discriminación (ensayos recompensados / (recompensa + ensayos no recompensados) para cada bloque de ensayo de adquisición (promedio de dos ensayos / peces) a lo largo de los tres días de adquisición (A1-A3) para todos los animales de experimentación (n = 30) para determinar con qué precisión los peces estaban resolviendo (adquiriendo) la tarea de discriminación (es decir, yendo al lado recompensado del tanque). Esta relación reveló que el porcentaje de peces que se movían hacia el lado recompensado durante cada ensayo aumentaba diariamente (es decir, a través de bloques de prueba en cada día individual) y en general (es decir, a lo largo de los tres días de adquisición), lo que resultó en que todos los peces se desempeñaran por encima del azar al final de la adquisición (línea punteada representada en el gráfico; (Figura 4A) e indicando que el pez había aprendido la tarea de discriminación.

Después de la adquisición del aprendizaje de la discriminación, probamos cuánto tiempo recordaría el pez cebra la tarea. Para hacer eso, el pez cebra probado permaneció en tanques de retención durante 8 semanas. Después de este tiempo, los peces fueron probados en una tarea de reversión que duró 3 días (R1-R3). Encontramos que los peces demostraron un fuerte comportamiento de reversión y una mayor discriminación durante los tres días de reversión(Figura 4B),lo que indica que pudieron (1) recordar la relación entre el color del tanque y la recompensa y (2) inhibir lo que habían aprendido previamente durante la adquisición y aprender el paradigma inverso / opuesto. Como se muestra en la Figura 4B,el pez cebra inicialmente fue al lado no recompensado del tanque, como lo indica la relación de discriminación que está por debajo de la probabilidad durante los senderos iniciales en el día 1 de reversión. Sin embargo, al final de R1, el rendimiento aumentó a mayor que el azar, un resultado que se mantuvo en R2 y R3, con los puntajes de relación de discriminación más altos observados en R3. Tomados en conjunto, estos datos muestran que los animales de experimentación ingenuos son capaces de resolver la tarea de discriminación, a pesar de que el comportamiento inicial se adquirió 8 semanas antes, sin ningún entrenamiento adicional entre las sesiones de comportamiento.

El paradigma de elección de 3 cámaras también se puede aplicar al examen de las complicaciones de la enfermedad. En nuestro estudio con pez cebra hiperglucémico, la aclimatación y la adquisición fueron las descritas, y la reversión se probó después de 4 u 8 semanas de hiperglucemia. La hiperglucemia se indujo con un protocolo de inmersión alternativo (McCarthy et al., 2020 - este problema), de modo que el entrenamiento se produjo cada dos días, en días posteriores a que el pez cebra hubiera estado en soluciones de prueba durante 24 h. Durante la adquisición, hubo un efecto principal del día de entrenamiento sobre la relación de discriminación (F (2, 239) = 4,457, p = 0,012; Figura 5A), con la relación en A1 siendo significativamente menor que en A3 (p = 0,010), lo que indica que los peces mejoraron su precisión de elección con el tiempo. Durante la reversión, hubo un efecto principal significativo del tratamiento (F (2, 326) = 3,057, p = 0,048), pero no otros efectos o interacciones principales significativos (día de entrenamiento: (F (2, 326) = 1,602, p = 0,203); día de entrenamiento x tratamiento: (F (4, 326) = 0,661, p = 0,620); Figura 5A). La respuesta de los animales tratados con glucosa se redujo significativamente en comparación con los animales tratados con agua (p = 0,037), pero no hubo otras diferencias significativas (control v. manitol: p = 0,387; manitol v. glucosa: p = 0,524), lo que sugiere un efecto específico de la glucosa. Después de 8 semanas de hiperglucemia, no se observaron diferencias estadísticas en las relaciones de discriminación entre el entrenamiento de adquisición (F (2,263) = 2,909, p = 0,056; Figura 5B). Sin embargo, hubo efectos principales significativos tanto del día de entrenamiento (F (2, 189) = 4,721, p = 0,010) como del tratamiento (F (2, 189) = 7,940, p = 0,000) en la reversión, pero ninguna interacción significativa (día de entrenamiento * tratamiento = F (4, 189) = 0,869, p = 0,484). Las comparaciones por pares posteriores de diferencia menos significativa (LSD) identificaron diferencias significativas entre R1 y R3 (p = 0,022) y entre R2 y R3 (p = 0,003). Las comparaciones por pares de LSD también revelaron diferencias significativas entre el grupo de tratamiento de agua y los grupos de tratamiento de glucosa y manitol (agua v. manitol: p = 0,008; agua v. glucosa: 0,000); sin embargo, los grupos de glucosa y manitol no fueron significativamente diferentes entre sí (p = 0,265), lo que sugiere que estas diferencias en la relación de discriminación pueden deberse a efectos osmóticos.

Figure 1
Figura 1: Cámara de prueba de elección de tres cámaras y configuración de comportamiento. (A) Esquema de 3 cámaras. Los animales de experimentación se restringieron a la cámara de arranque central durante 2 minutos y luego se les permitió el acceso a ambos lados del tanque al comienzo de un ensayo. Para hacerlo, la mitad superior de cada una de las dos particiones se levantó para crear un espacio de 10 cm para que los peces cruzaran a cualquiera de los compartimentos de elección. (B,E) La aclimatación se realizó utilizando un fondo beige y un banco de conespecíficos como recompensa. (C,F) La adquisición se realizó utilizando fondos en blanco y negro en las cámaras de elección; la recompensa solo se encontraba en un lado de la cámara. (G) La inversión se realizó utilizando fondos en blanco y negro en los compartimentos de elección; la recompensa solo estaba disponible en el lado opuesto de la cámara (vs. adquisición). (H) Imagen de cerca del tanque de bajío sumergido en uno de los compartimentos de elección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Latencia y número de ensayos marcados durante la aclimatación individual. (A) Latencia de elección de la primera decisión. (B) La cantidad total de tiempo para completar la aclimatación individual. (C) El número de entradas en el lado izquierdo y derecho no son diferentes, lo que indica que no hay preferencia de lado inherente antes del inicio de la adquisición. También se informó el número total de ensayos de marcas durante la aclimatación individual. Los valores se informan como Media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: El porcentaje de peces de alto rendimiento y la latencia de elección inicial entre todos los peces y peces de alto rendimiento a lo largo de los tres días de adquisición. (A) Los peces de alto rendimiento se movieron de la cámara central al lado recompensado de la cámara en al menos 6 de los 8 ensayos cada día de adquisición (A1-A3). (B) A lo largo de tres días de capacitación en adquisición (A1–A3), la latencia general de la elección inicial disminuyó; una tendencia también evidente en peces de alto rendimiento (C). Los valores se informan como Media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Desempeño de la discriminación durante los ensayos de adquisición y reversión. (A) Relación de discriminación (ensayos recompensados / (recompensa + ensayos no recompensados) de peces a través de los días de adquisición (A1-A3) y (B) durante el aprendizaje de reversión 8 semanas después. La reversión también se evaluó durante 3 días (R1-R3). Para ambas tareas, cada pez tuvo que completar 8 ensayos, y los resultados se presentan en bloques de dos ensayos (2, 4, 6, 8). Las respuestas correctas durante la adquisición y la reversión aumentaron con el tiempo, con una respuesta más rápida observada durante la inversión, lo que indica que los peces aprendieron y recordaron la tarea. Los valores se reportan como Media ± SEM. La línea punteada representa el azar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Adquisición y reversión del pez cebra hiperglucémico utilizando la tarea de comportamiento de elección de 3 cámaras. (A) Antes del tratamiento, el pez cebra ingenuo adquirió la tarea conductual de elección de 3 cámaras durante tres días de entrenamiento conductual (adquisición, A1-A3). Hubo una diferencia significativa entre las proporciones de discriminación en A1 y A3 que indicaron que el aprendizaje tuvo lugar (p = 0,012). Después de 4 semanas de tratamiento (símbolos de colores) hubo un efecto significativo del tratamiento (p = 0,048), con animales tratados con glucosa que mostraron proporciones de discriminación significativamente reducidas en comparación con los animales tratados con agua (p = 0,037). (B) En un experimento separado, se evaluó el comportamiento antes y después de 8 semanas de hiperglucemia. A pesar del aumento constante en el rendimiento a lo largo de cada día de adquisición, no hubo diferencias significativas en la relación de discriminación entre A1 y A3. Sin embargo, después de 8 semanas de tratamiento (símbolos de colores), hubo un efecto principal del tratamiento (p < 0,001) y un efecto principal individual del día de entrenamiento (p = 0,010). Los análisis post-hoc revelaron una diferencia significativa entre el grupo tratado con agua y los grupos tratados con manitol y glucosa, lo que sugiere un efecto osmótico (agua v. manitol: p = 0,008; agua v. glucosa: p < 0,001). * denota un efecto principal significativo. Los puntos de datos representan la media del grupo ± SEM, y los puntos de datos con diferentes letras son significativamente diferentes entre sí. La línea punteada representa el azar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aunque ha habido un tremendo crecimiento en la cantidad y variedad de investigaciones de neurociencia realizadas con peces cebra en los últimos 15 años24,faltan ensayos de comportamiento en esta especie en comparación con los sistemas modelo de mamíferos11,25,26. Aquí, mostramos que una tarea de elección de tres cámaras desarrollada para su uso con roedores se puede adaptar para evaluar la adquisición y reversión de un aprendizaje de discriminación visual en el pez cebra. Usando un banco vivo como recompensa, esta tarea proporcionó un ensayo robusto que se puede aplicar a una variedad de estudios que examinan enfermedades relacionadas con el comportamiento, como las complicaciones hiperglucémicas de la diabetes, el Alzheimer y la demencia.

Se ha establecido previamente que el pez cebra es capaz de aprender y almacenar información, ya que se requiere para tomar decisiones ecológicamente relevantes y necesarias para la supervivencia en la naturaleza3. Nuestros datos de adquisición y reversión a través de un estudio longitudinal de 8 semanas respaldan la evidencia previa de que el pez cebra, aunque pequeño, puede aprender y recordar una tarea de discriminación simple, y que el pez cebra también puede inhibir las respuestas adquiridas previamente. En el estudio longitudinal de 8 semanas, el número de recompensas forzadas disminuyó y la proporción de discriminación aumentó, lo que indica que los peces mejoran en la elección del lado correcto y recompensado y han aprendido la tarea. Si bien estos cambios no fueron significativos, sí se vio una tendencia general a la baja en el número de ensayos recompensados por la fuerza durante la adquisición y un aumento en la proporción de discriminación. Además, los resultados de la tarea conductual de elección de tres cámaras con peces hiperglucémicos revelaron la aplicabilidad de la prueba a estudios que examinan las condiciones hiperglucémicas e indican que este paradigma podría usarse en combinación con otras manipulaciones experimentales, como exposiciones a medicamentos o líneas mutantes, para evaluar los posibles efectos sobre la cognición.

Una limitación importante de este estudio es que no podemos identificar peces individuales a lo largo del tiempo y, por lo tanto, debemos confiar en los promedios grupales para evaluar los datos. El desarrollo de una forma de rastrear individualmente los peces en los diferentes grupos de tratamiento, como en los roedores, podría abordar estos problemas. En un intento de resolver estas diferencias, clasificamos los peces durante la fase de adquisición en función de su rendimiento, lo que resultó ser un beneficio inesperado de nuestra metodología. Los "peces de alto rendimiento" obtuvieron una puntuación de ≥ 6/8 en cada día de entrenamiento, mientras que los peces con puntuaciones más bajas fueron "peces de bajo rendimiento". Cuando se contó cada día, el número de "alto rendimiento" aumentó en el grupo recompensado por el banco de arena, de modo que para el día 3, había significativamente más peces en esta categoría en comparación con el tratamiento recompensado con peces. Las tendencias de latencia de elección observadas en todos los peces ('alto + bajo rendimiento') son similares a las observadas solo en el grupo de 'alto rendimiento', lo que sugiere que las fuertes respuestas de este grupo estaban impulsando las respuestas generales.

En resumen, estos hallazgos indican que el aprendizaje de la discriminación basada en bancos de arena en el pez cebra proporciona un modelo rentable factible para el estudio del funcionamiento cognitivo normal y deteriorado.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Sabrina Jones por su ayuda para adaptar un paradigma de elección de roedores de tres cámaras al modelo de pez cebra y a Jeremy Popowitz y Allison Murk por su ayuda en los días de recolección de comportamiento, asistencia con las pruebas de ejecución, cuidado de animales y configuración de tanques. Un agradecimiento especial también a James M. Forbes (Ingeniero Mecánico) por su ayuda con el diseño y la construcción del tanque de 3 cámaras.

Financiamiento: VPC y TLD recibieron una subvención conjunta de Apoyo a la Investigación de la Facultad (FRSG) de la Facultad de Artes y Ciencias de la Universidad Americana. CJR recibió el apoyo de American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support.

Materials

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Comportamiento Número 170 Discriminación reversión aprendizaje memoria Danio rerio refuerzo hiperglucemia
La tarea de comportamiento de elección de tres cámaras utilizando el pez cebra como sistema modelo
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Rowe, C. J., Crowley-Perry, M.,… More

Rowe, C. J., Crowley-Perry, M., McCarthy, E., Davidson, T. L., Connaughton, V. P. The Three-Chamber Choice Behavioral Task using Zebrafish as a Model System. J. Vis. Exp. (170), e61934, doi:10.3791/61934 (2021).

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