Summary
Bilişsel performansı değerlendirmek için tasarlanmış bir davranış odası sunuyoruz. Zebra balıklarının elde edildikten sonra 8 hafta sonra görevi hatırladığını gösteren veriler sunuyoruz. Ayrıca hipergliplik zebra balıklarının bilişsel performansı değiştirdiğini ve bu paradigmanın biliş ve hafızayı değerlendiren çalışmalar için geçerli olduğunu gösteriyoruz.
Abstract
Nörodejeneratif hastalıklar yaşa bağlı, zayıflatıcı ve tedavi edilemez. Son raporlar ayrıca hiperglisemi ile hafızadaki değişiklikler ve/veya bilişsel bozukluk ile ilişkilidir. Hipergliplik zebra balığı ile kullanılmak üzere kemirgenlerle kullanılana benzer üç odalı bir bilişsel görevi değiştirdik ve geliştirdik. Test odası, merkezi bir başlangıç odası ve her iki tarafta iki seçim bölmesinden oluşur ve ödül olarak kullanılan bir takımdır. Zebra balıklarının elde edildikten sonra en az 8 hafta sonra görevi hatırladığını gösteren veriler sunuyoruz. Verilerimiz zebra balıklarının bu ödüle sağlam bir şekilde yanıt verdiğini gösteriyor ve 4 haftalık tedaviden sonra hiperglemik balıklarda bilişsel eksiklikler tespit ettik. Bu davranışsal tahlil biliş ve hafıza ile ilgili diğer çalışmalar için de geçerli olabilir.
Introduction
Nörodejeneratif hastalıklar yaşa bağlı, zayıflatıcı ve tedavi edilemez. Bu hastalıkların yaygınlığı artmaktadır ve bu da yeni terapötik stratejilerin iyileştirilmesi ve geliştirilmesi için acil bir ihtiyaçla sonuçlanmaktadır. Her hastalığın başlangıcı ve sunumu benzersizdir, çünkü bazıları dil, motor ve otonomik beyin bölgelerini etkilerken, diğerleri öğrenme açıklarına ve hafıza kaybına neden olur1. En önemlisi, bilişsel eksiklikler ve/ veya bozukluk tüm nörodejeneratif hastalıklarda en yaygın komplikasyonlardır2. Bu nörodejeneratif hastalıklarda yer alan altta yatan mekanizmalara ışık açma umuduyla, birçok farklı model sistemin (tek hücreli organizmalar dahil, Drosophila'dan kemirgenler ve insanlar gibi daha yüksek dereceli omurgalılara) kullanılması; bununla birlikte, nörodejeneratif hastalıkların çoğu tedavi edilemez olmaya devam etmektedir.
Çevreye sürekli değişiklikler adaptasyon gerektirdiği için organizmalar arasında öğrenme ve hafıza son derece korunmuş süreçlerdir3. Hem biliş hem de sinaptik plastisitede bozukluk birkaç kemirgen modelinde gösterilmiştir. Özellikle, köklü davranışsal tahliller, çeşitli bozukluk kaynaklı hastalık ve bozuklukların ardından bilişsel değişiklikleri değerlendirmek için ilişkilendirilebilir öğrenmeyi kullanır4. Ek olarak, kontrast ayrımcılığı tersine çevirme bilişsel açıkları değerlendirir, çünkü daha yüksek sıralı öğrenme ve hafıza işlevleri içerir ve tersine çevirme daha önce öğrenilen bir ilişkinin engellenmesine bağlıdır. Yaygın olarak kullanılan üç oda seçimi görevi, merkezi sinir sisteminin öğrenme ve hafıza yollarında olası açıkları ortaya çıkarır5,6. Son zamanlarda, bu alan zebra balığı (Danio rerio) gibi memeli olmayan modelleri içerecek şekilde genişlemiştir, çünkü larvalardan yetişkinlere kadar çeşitli yaşlar için çeşitli paradigmalar geliştirilmiştir7,8.
Zebra balığı, bilişsel bozuklukların davranış teknikleri ile değerlendirilmesi için avantajlı olan karmaşıklık ve basitlik dengesini sağlar. İlk olarak, zebra balıkları küçük boyutları ve üretken üreme doğaları göz önüne alındığında yüksek verimli davranışsal taramaya hazırdır. İkincisi, zebra balığı bir yapıya sahiptir, lateral pallyum, benzer nöronal belirteçlere ve hücre tiplerine sahip olduğu için memeli hipokampusabenzerdir 7. Zebra balıkları ayrıca mekansal bilgileri elde edebilir ve hatırlayabilir9 ve insanlar gibi, diurnal10. Bu nedenle, zebra balıklarının artan sıklıkta nörodejeneratif hastalıklar için bir model olarak kullanılması şaşırtıcı değildir. Bununla birlikte, uygun davranışsal testlerin olmaması, bilişsel değerlendirmeler için zebra balığı modelinin uygulanmasını zorlaştırmıştır. Zebra balığına özgü davranışsal tahliller kullanılarak yayınlanan çalışma ilişkilendirilebilir öğrenme görevleri11, anksiyete davranışı12, bellek13, nesne tanıma14ve koşullandırılmış yer tercihi15,16,17,18,19içerir. Zebra balığı davranışsal tahlilleri ile ilgili birçok gelişme olmasına rağmen, kemirgenlerdeki bilişsel işlevlerin bazı testleri için muadilleri henüz zebra balığı ile kullanılmak üzere geliştirilmemiştir18.
Laboratuvarımızın önceki çalışmalarına dayanarak, zebra balıklarında sosyal etkileşimi ödül olarak kullanan kemirgenlerle kullanılan üç odalı seçim görevine dayanarak bilişsel bir görev modelledik / geliştirdik. Ek olarak, davranışsal görevin ilişkilendirilebilir öğrenme yönünü genişlettik ve bilişsel bozukluğu değerlendirmek için bu davranışsal görevi daha da geliştirme umuduyla kontrast ayrımcılığının tersine çevrilmesini dahil ettik. Bu, hem ayrımcılık öğreniminin ilk edinimini hem de bu öğrenmenin tersine çevirme aşamasında daha sonraki inhibisyonunu incelememizi sağladı. Mevcut çalışmada, bu prosedürün 4 veya 8 hafta boyunca glikoz daldırma sonrasında zebra balıklarında bilişsel işleyişi değerlendirmek için güvenilir bir yöntem sağladığını gösteriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler Amerikan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (protokol # 1606, 19-02).
1. Hayvanlar
- Hayvan yetiştirme ve bakımı
- Embriyo olarak 4-11 aylık yetişkin vahşi tip zebra balığı(Danio rerio)elde edin ve bunları şirket içinde yetiştirin.
- Balığı 14 saat açık:10-h koyu fotoperiyod üzerinde 28-29 °C'de bir su rafı sisteminde saklayın.
- Balıkları günde iki kez ticari pullarla besleyin ve canlı Artemia ile takviye edin.
- Davranış deneyleri için bu stok tanklarından rastgele balık seçin.
- Deney tamamlandıktan sonra, hayvanları 2 dakika boyunca% 0.02 trikaine daldırarak veya daha sonraki moleküler ve / veya nörokimyasal analizler için motor koordinasyon eksikliği ve solunum oranını azaltana kadar uyuşturun.
2. Üç odalı seçim test odası
NOT: Bu davranış tekniği Ruhl ve ark.20'den değiştirilmiştir.
- Oda inşaatı
- Davranış odasını26—40 L'lik bir akvaryum (50 x 30 x 30 cm3)— iki yan seçenek odasından (her biri 20 x 30 x 30 cm 3 , Şekil 1A)ayrılmış merkezi veya başlangıç odasına(10x 30 x 30 cm3)sahip olacak şekilde değiştirin.
- Tankı üç 10 küt küseye ayırmak için üç bölmeyi akvaryum dolgu macunlu iç cam duvarlara yapıştırılmış alüminyum "U şeklinde" bir kanal kullanarak inşa edin.
- Her iki taraftaki alüminyum kanallara sığan gri PVC levhadan 10 cm yüksekliğinde opak bölücüler inşa edin. Her bölücüyü, her biri eşit boyutta olan 2 parçadan yapın: tankın içine kalıcı olarak monte edilmiş sabit bir alt parça ve alüminyum raylarda yukarı ve aşağı hareket eden hareket ettirilebilir bir üst parça.
- Tutamak görevi görmek için ekstra büyük bağlayıcı klipsleri gri PVC levhaların üstüne yapıştırın.
- Kalıcı bir işaretleyici kullanarak, tankın dışına yapışan gri PVC borunun 10 cm yukarısına küçük yatay çizgiler çizin.
NOT: Bu işaret, her iki tarafa da erişime izin vermek için üst gri PVC levhanın açılacağı noktadır. - Tanka tankın altından üstüne 25 cm veya ~ 30 L'ye kadar kontrol (sistem) suyu ekleyin veya sıcaklığı 28,5 °C'ye getirmek için testten önce odanın her bölümüne 24 saat boyunca cam akvaryum ısıtıcıları yerleştirin.
NOT: Davranış seansının başında ısıtıcıları çıkarın ve iki günlük kullanımdan sonra tam bir su değişimi gerçekleştirin.
- Ayrımcılık kurulumu
- Her ayrımcılık görevi için, cırt cırt(Şekil 1B–D)kullanarak seçim odalarının dış arkasına, yanına ve altına renkli keçe parçalarını (bej, siyah veya beyaz) ayrı ayrı yerleştirin.
NOT: Orta bölmenin onunla ilişkili arka plan rengi olmamalıdır.
- Her ayrımcılık görevi için, cırt cırt(Şekil 1B–D)kullanarak seçim odalarının dış arkasına, yanına ve altına renkli keçe parçalarını (bej, siyah veya beyaz) ayrı ayrı yerleştirin.
- Ödül olarak, çalışmada başka türlü kullanılmayacak 4 yetişkin zebra balığını her seçim odasının en arka köşesindeki küçük, berrak bir tanka yerleştirerek bir grup conspecifics (sürü) oluşturun (Şekil 1B-D).
NOT: Her gün stok tanklarından rastgele sürü balığı seçin, her sürü tankındaki deneysel balıkla aynı yaşta ve boyutta en az bir erkek ve bir dişi.
3. Davranışsal görevler
- Alışma
NOT: Davranış odasına alışma üç günlük eğitimden oluşur; iki günlük grup alışma ve ardından bir günlük bireysel eğitim. - Grup alışma
- Bej (nötr) keçe arka planını her iki seçim bölmesinin dışına takın ve seçim bölmelerinin her birine canlı bir sürü tankı batırın (Şekil 1B).
- Her iki sürsürme kapısı açık olan merkez başlangıç odasına beş-altı zebra balığı ekleyin ve balığın 30 dakika boyunca serbestçe dolaşmasına izin verin.
NOT: Deneysel zebra balığı, alışma sırasında her iki seçim bölmesine geçtikten sonra ödül olarak tank aracılığıyla bu sürü balıklarıyla etkileşime girebilmeli ve sosyalleşebilmelidir. Bir balığın, tüm vücudu odaya girdiğinde yan odalardan birine girdiği kabul edilir. - Bu prosedürü ikinci bir gün boyunca aynı deneysel balıkla tekrarlayın (2 günlük grup alışma).
NOT: Aynı balık gruplarını tutmayın.
- Bireysel alışma
- Oda kurulumu: Bej (nötr) keçe arka planını her iki seçim bölmesinin dışına takın ve grup iklimlendirmesinde olduğu gibi her iki seçim bölmesine de canlı bir sürü tankı batırın (Şekil 1B,E).
- Kayar kapılar kapalıyken 2 dakika boyunca merkezi başlangıç odasına ayrı bir zebra balığı yerleştirin ve 2 dakikalık süreden sonra her iki kapıyı da aynı anda açın.
- Her balığın, hangi taraftan olursa olsun, toplam 10 kez bir kapıdan orta odadan yüzdüğünden emin olun. Balıkları yan odalardan birine her girdiğinde ödüllendirin (1 günlük bireysel alışma).
NOT: Bir balık bu görevi 30 dakikalık bir süre içinde 10 kez tamamlayamazsa veya başlangıç odasından çıkmayı reddederse, çalışmanın dışında tutun.
- Veri toplama: Balığın her iki tarafa da kaç kez yüzdüğünü ve görevi tamamlamak için gereken toplam süreyi kaydedin.
- Oda kurulumu: Bej (nötr) keçe arka planını her iki seçim bölmesinin dışına takın ve grup iklimlendirmesinde olduğu gibi her iki seçim bölmesine de canlı bir sürü tankı batırın (Şekil 1B,E).
- Edinim
NOT: Alıştıktan sonra zebra balığı 3 günlük bir satın alma görevine başladı.- Oda ayarı: Bir seçim bölmesinin dışına beyaz bir keçe parçası ve diğer seçim bölmesinin dışına siyah bir keçe parçası takın(Şekil 1C,F).
NOT: Psödorandom zamanlaması kullanarak her iki tarafın arka plan rengini günlük olarak değiştirin37.- Bu eğitim aşaması boyunca, sadece seçim bölmelerinden birine yerleştirilmiş bir sürü ödülü yerleştirin; bu ödüllendirilen taraf haline gelir.
- Edinime başlamak için, seçim bölmeleri kapalı olacak şekilde 2 dakikalık bir süre için başlangıç odasına tek bir deneysel balık yerleştirin.
- 2 dakikalık alışmadan sonra, her iki kapıyı da aynı anda açın, her iki seçim bölmesine de erişim sağlar ve seçim gecikmesini değerlendirmek için kronometreyi başlatın.
- Önyargılı bir tasarım kullanarak, balığa rastgele siyah veya beyaz bir tercih atayın (örneğin, W+/B- veya B+/W-), yani sürü siyah (B+) veya beyaz (W+) seçim bölmesine yerleştirilir.
- Seçim yanıtını açıklama
- Balık yan bölmelerden birine girerek bir seçim yaptıktan sonra zamanlayıcıyı durdurun.
- Balık tercih edilen tarafı doğru seçerse, balığı 1 dakika boyunca tercih edilen tarafla sınırlamak için merkez oda ile o taraf arasındaki kapıyı hemen kapatın ve sürü tankı ile etkileşime girerek ödüllendirilmesine izin verin (Şekil 1C,F). Bu deneme sürümünü "Doğru" (ödüllendirildi) için "C" olarak puanla.
- Balık yanlış kapıdan yüzerse, merkez odaya geri aktarın, her iki kapıyı da kapatın ve denemeyi "yanlış" (ödülsüz) için "I" olarak puanleyin.
- Balık, kapılar açıldıktan sonra 2 dakika içinde bir karar vermiyorsa, balığı 1 dakika boyunca doğru tarafa hareket ettirin ve denemeyi "işaretli" (kuvvetle ödüllendirilmiş) için "M" olarak puanlayın.
- Balıkları başlangıç odasına geri aktarırken/ taşırken, çobanlık aracı olarak bir balık ağı kullanarak balığı yavaşça merkez odaya yönlendirin.
NOT: Davranışı etkileyebileceğinden, balığı sudan çıkarmayın ve başlangıç odasına değiştirmeyin. - Balık merkez odaya döndükten sonra, görevi tekrar gerçekleştirmeden önce 1 dakika bekleyin. Her balığın görevi 8 kez yerine getirtmesini sağlayın.
- Veri toplama
- Her deneysel balık için, 8 alım denemesinin (bölüm 3.4.2) her biri için ilk karar verme (veya seçim gecikmesi) ve bireysel puanları (C, I veya M) kaydetme süresi.
- Bu denemelerin sonuçlarının her edinme gününde her deneme için grup ortalamaları olarak raporlandığını bildirin.
- Bir balık denemeyi tamamladıktan sonra, "yüksek performanslı" bir balık veya "düşük performanslı" bir balık olarak kategorize edin.
NOT: Bir balık, günün toplam 8 denemesinin en az 6'sında tankın doğru tarafını seçerse "yüksek performanslı" olarak kabul edildi. Bu kriteri karşılamayan herhangi bir balık "düşük performans gösteren" dir. - Tanımlandıktan sonra, yüksek performanslı ve düşük performanslı balıkları ayrı ayrı barındır.
- Bir balık denemeleri tamamladıktan sonra, üç günlük satın alma gününün her birinde balığı "yüksek" veya "düşük" sanatçılar olarak kategorize edin.
NOT: Satın almanın üçüncü gününün sonunda, balıklar çalışma süresince "yüksek" veya "düşük" performans gösterenler olarak kalır.
NOT: Başlangıçta 'düşük performanslı' grupta olan bazı balıklar görevi edinme günü 2 veya 3'te öğrenir. Bu olduğunda, ilk 'düşük performanslı' balık 'yüksek performanslı' gruba taşınabilir. Balıkları 3. günden sonra (edinmenin sonu) gruplar arasında bu şekilde hareket ettirmeyin.
- Oda ayarı: Bir seçim bölmesinin dışına beyaz bir keçe parçası ve diğer seçim bölmesinin dışına siyah bir keçe parçası takın(Şekil 1C,F).
4. Deneysel tedavi
- Satın alma döneminden sonra, balıklar siyah ve beyaz arka plan arasındaki basit bir ayrımcılık görevini çözme yeteneğini gösterdiğinde, deneysel zebra balığı için tedavi rejimine başlayın.
NOT: Bu yöntemin uygulanabilirliğini göstermek için, bu çalışma iki deneysel tasarım göstermektedir:- Boyuna çalışma
- Deneysel balıkları 8 hafta boyunca tutma tanklarına geri verin. Balıkları günlük su değişimleri ile standart tanklarda muhafaza edin ve günde iki kez besleyin.
NOT: Bu 8 hafta boyunca tutma tanklarında herhangi bir davranışsal eğitim yapmayın. - Zebra balığının eğitim almadan 8 hafta sonra tersine çevirme görevini çözüp çözemeyeceği konusunda değerlendirmek için bu süreden sonra ters değerlendirme gerçekleştirin.
- Deneysel balıkları 8 hafta boyunca tutma tanklarına geri verin. Balıkları günlük su değişimleri ile standart tanklarda muhafaza edin ve günde iki kez besleyin.
- Hiperglisemi: Deney gruplarını 4 veya 8 hafta boyunca suya (stres kontrolü kullanımı), mannitole (%1-%3, ozmotik kontrol) veya glikoza (%1-%3) maruz bırakmak22,23.
NOT: Bu 4 veya 8 hafta boyunca herhangi bir davranış eğitimi yapmayın.
- Boyuna çalışma
5. Tersine Çevirme
NOT: Deneysel manipülasyonun ardından (bölüm 4.2'de olduğu gibi), balıklar 3 oda seçimi paradigmasının son bölümünde test edilir - tersine çevirme. Bunu yapmak için, ödüllendirilen taraf tersine çevrilir (edinime kıyasla), daha önce beyaz tarafta bir sürü ile ödüllendirilen balıklar şimdi siyah tarafta bir sürü ile ödüllendirilir ve bunun tersi de olur. Bu şekilde, ters çevirme, arka planın renginden bağımsız olarak, balığın ödülün (sürünün) nerede olduğunu öğrenip öğrenmediğini değerlendirir.
- Oda kurulumu
- Seçim odalarından birinin dışına siyah keçe, diğerinin dışına beyaz keçe takarak siyah ve beyaz tarafların alım denemelerindekiyle aynı yanlar olduğundan emin olun (bölüm 3.4).
- Sürü tankını, daha önce ödüllendirilen seçim odasının tam tersi olan tarafın en arka köşesine batırın (Şekil 1D,G).
NOT: Başka bir deyişle, daha önce beyaz tarafta ödüllendirilen balıklar artık siyah tarafta ödüllendirilir ve bunun tersi de yüksektir. - Balıkları bölüm 3.5'te olduğu gibi ayrı ayrı test edin. Başlangıç odasına 2 dakikalık bir süre için tek bir deneysel balık yerleştirerek başlayın ve seçim bölmelerine erişimi kapatın.
- Aynı anda odanın her iki tarafını da açın.
NOT: Ardışık üç tedavi günü boyunca her gün toplam 8 denemeyi tamamlayın.
- Seçim yanıtını açıklama
- Balık tercih edilen rengi doğru seçerse, hemen merkezi odaya kapıyı 1 dakika kapatın ve balığın sürü ödülüyle etkileşime girmesini sağlar. Bu deneme sürümünü "Doğru" (ödüllendirildi) için "C" olarak puanla.
- Balık yanlış kapıdan yüzerse, merkez odaya geri aktarın, her iki kapıyı da kapatın ve bu denemeyi "yanlış" (ödülsüz) için "ben" olarak puanleyin.
- Balık, kapılar açıldıktan sonra 2 dakika içinde bir karar vermezse, balığı doğru tarafa taşıyın ve denemeyi "işaretli" (zorla ödüllendirilmiş) için "M" olarak puanlayın.
- Veri toplama
- Her deneysel zebra balığı için, her deneme için seçim gecikmesini ve bireysel puanları (C, I, M) sırayla kaydedin.
- Bu denemelerin sonuçlarını, 3 ters günün her birinde her iki deneme bloğu için grup ortalamaları olarak bildirin.
- Yüksek ve düşük performanslı balıklar için verileri ayrı tutarak, geri dönüş sırasında, satın alma sırasında sergiledikleri performansın aynısını görüntüleyip göstermediklerini belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Davranış odasına alışma üç günlük eğitim içerir: 2 günlük grup alışma ve ardından 1 günlük bireysel alışma. Ancak, bireysel zebra balıklarını birbirinden ayırt edemediğimiz için, yalnızca bireysel alışma sırasında veri toplayabildik. Şu anda, sürü bazlı bir ödül kullanılarak koşullandırılmış deney hayvanları (n = 30), ilk kararlarına ulaşmak için ortalama 125,11 sn (Şekil 2A) ve tüm bireysel alışma görevini tamamlamak için ortalama 725,34 s (12 dk) aldı (Şekil 2B). Alışma sırasında önemli bir yan tercih yoktu (Şekil 2C). Hariç tutulan balık sayısı, laboratuvarımızda daha önce değerlendirdiğimiz diğer ödül türlerine (yiyecekler) kıyasla minimumdu(Şekil 2C).
Alışmadan sonra zebra balığı satın alma aşamasına başladı. Balıklar ayrı ayrı test edildikçe, üç alım gününün her birinde her balıktan veri topladık. Balıklar ya 'yüksek ya da düşük performans gösterenler' olarak sınıflandırıldı, 'yüksek performans gösterenler' test odasına daha önce aynı şekilde maruz kalmalarına rağmen daha hızlı ve daha doğru yanıt verdi. Sadece 8 denemenin en az 6'sında ödüllü seçim bölmesini seçen balıklar 'yüksek performans gösterenler' olarak sınıflandırıldı. Bu kritere uymayan balıklar 'düşük performans gösterenler'di. Yüksek ve düşük performanslı balıklar, sonraki tüm denemelerdeki performanslarını ayırt etmek için ayrı ayrı barındırıldı. İlginçtir ki, bazı balıkların satın alma sırasında kategori değiştirdiğini (yani başlangıçta 'düşük performans gösteren' olduklarını, ancak 'yüksek performans gösterenler' olduklarını) gözlemledik. Aslında, yüksek performanslı hayvan sayısı her geçen gün arttı, alım günü 3'te 1 güne kıyasla daha yüksek performanslı balıklar (Şekil 3A). 3. güne gelindiğinde, balıkların %>50'si 'yüksek performanslı' hale gelmişti. Ayrıca, üç alım günü boyunca tüm balıklar için ilk tercih gecikme süresi azaldı (A1-A3), her alım gününde daha iyi bir performansa işaret etti (Şekil 3B). Aynı eğilim sadece yüksek performanslı balık grubu düşünüldüğünde de görüldü: 3. güne gelindiğinde, ilk karar verme süresi iyileşti (daha hızlı hale geldi) (Şekil 3C).
Balıkların ayrımcılık görevini ne kadar doğru çözdüklerini (edindiğini) belirlemek için üç edinme günü boyunca (A1–A3) her bir edinme deneme bloğu (ortalama iki deneme/balık) için bir ayrımcılık oranı (ödüllü denemeler /(ödül + nonrewarded denemeler) hesaplandı (n = 30). Bu oran, her deneme sırasında ödüllendirilen tarafa geçen balık yüzdesinin günlük olarak (yani, her bir günde deneme blokları arasında) ve genel olarak (yani üç edinme günü boyunca) arttığını ve tüm balıkların satın alma sonunda (grafikte temsil edilen noktalı çizgi) şansın üzerinde performans gösterdiğini ortaya koydu; (Şekil 4A) ve balığın ayrımcılık görevini öğrendiğini gösterir.
Ayrımcılık öğreniminin kazanılmasından sonra, zebra balıklarının görevi ne kadar süre hatırlayacağını test ettik. Bunu yapmak için, test edilen zebra balıkları 8 hafta boyunca tanklarda kaldı. Bu süreden sonra, balıklar 3 gün süren bir ters görevde test edildi (R1-R3). Balıkların üç günlük geri dönüş sırasında güçlü bir geri dönüş davranışı ve artan ayrımcılık gösterdiğini gördük (Şekil 4B), (1) tankın rengi ile ödül arasındaki ilişkiyi hatırlayabildiklerini ve (2) daha önce edinim sırasında öğrendiklerini engelleyebildiklerini ve tersine çevirme / zıt paradigmayı öğrendiklerini gösterdik. Şekil 4B'degösterildiği gibi, zebra balığı başlangıçta tankın ödülsüz tarafına gitti, ayrımcılık oranının 1. Bununla birlikte, R1'in sonunda performans şanstan daha fazlaya yükseldi ve bu sonuç R2 ve R3'te korundu ve en yüksek ayrımcılık oranı puanları R3'te gözlendi. Birlikte ele alındığında, bu veriler, naif deney hayvanlarının, ilk davranış 8 hafta önce, davranışsal oturumlar arasında herhangi bir ek eğitim almadan kazanılmış olmasına rağmen, ayrımcılık görevini çözebildiğini göstermektedir.
3 oda seçimi paradigması hastalık komplikasyonlarının incelenmesi için de uygulanabilir. Hiperglisemik zebra balığı ile yaptığımız çalışmada, iklimlendirme ve edinim açıklandığı gibi yapıldı ve 4 veya 8 haftalık hiperglisemi sonrasında tersine dönüş test edildi. Hiperglisemi alternatif bir daldırma protokolü ile indüklendi (McCarthy ve ark., 2020 - bu sorun), böylece zebra balığı 24 saat boyunca test çözümlerinde bulunduktan sonraki günlerde, her gün eğitim gerçekleşti. Satın alma sırasında, eğitim gününün ayrımcılık oranı üzerindeki ana etkisi vardı (F (2, 239) = 4.457, p = 0.012; Şekil 5A), A1'deki oranın A3'ten (p = 0.010) önemli ölçüde daha düşük olması, balığın zaman içinde seçim doğruluğunu artırdığını gösterir. Tersine çevirme sırasında tedavinin önemli bir ana etkisi vardı (F (2, 326) = 3.057, p = 0.048), ancak başka önemli ana etki veya etkileşim yoktur (eğitim günü: (F (2, 326) = 1.602, p = 0.203); eğitim günü x tedavisi: (F (4, 326) = 0.661, p = 0.620); Şekil 5A). Glikozla tedavi edilen hayvanların yanıtı su ile tedavi edilen hayvanlara kıyasla önemli ölçüde azaldı (p = 0.037), ancak başka önemli bir fark yoktu (kontrol v. mannitol: p = 0.387; mannitol v. glikoz: p = 0.524), glikoz spesifik bir etki düşündürmektedir. 8 haftalık hiperglisemiden sonra, edinim eğitimi genelinde ayrımcılık oranlarında istatistiksel farklılıklara dikkat edilmemiştir (F (2.263) = 2.909, p = 0.056; Şekil 5B). Bununla birlikte, her iki antrenman gününün de önemli ana etkileri vardı (F (2, 189) = 4.721, p = 0.010) ve tedavi (F (2, 189) = 7.940, p = 0.000) ters yöndedir, ancak önemli bir etkileşim yoktur (eğitim günü * tedavi = F (4, 189) = 0.869, s = 0.484). Sonraki en az anlamlı fark (LSD) çift yönlü karşılaştırmalar R1 ve R3 (p = 0.022) ve R2 ve R3 (p = 0.003) arasında önemli farklar tanımlamıştır. LSD çift yönlü karşılaştırmalar ayrıca su arıtma grubu ile hem glikoz hem de mannitol tedavi grupları arasında önemli farklılıklar olduğunu ortaya koydu (su v. mannitol: p = 0.008; su v. glikoz: 0.000); bununla birlikte, glikoz ve mannitol grupları bir bir birinden önemli ölçüde farklı değildi (p = 0.265), ayrımcılık oranındaki bu farklılıkların ozmotik etkilerden kaynaklanabileceğini düşündürmektedir.
Şekil 1: Üç odalı seçim test odası ve davranış kurulumu. (A) 3 odalı şematik. Deney hayvanları 2 dakika boyunca merkezi başlangıç odasıyla sınırlandırıldı ve daha sonra denemenin başlangıcında tankın her iki tarafına erişime izin verildi. Bunu yapmak için, iki bölümün her birinin üst yarısı, balıkların her iki seçim bölmesine geçmesi için 10 cm'lik bir alan oluşturmak için yükseltildi. (B,E) Acclimation ödül olarak bej bir arka plan ve conspecifics sürüsü kullanılarak gerçekleştirildi. (C,F) Satın alma, seçim odalarında siyah beyaz arka planlar kullanılarak gerçekleştirildi; ödül odanın sadece bir tarafında bulunuyordu. (G) Seçim bölmelerinde siyah beyaz arka planlar kullanılarak geri dönüş gerçekleştirildi; ödül sadece odanın karşı tarafında mevcuttu (satın alma ile karşıt). (H) Seçim bölmelerinden birine batırılmış sürü tankının yakın görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bireysel alışma sırasında gecikme süresi ve işaretli deneme sayısı. (A) İlk kararın seçim gecikmesi. (B) Bireysel alışmayı tamamlamak için toplam süre. (C) Sol ve sağ tarafa giriş sayısı farklı değildir, bu da alım başlangıcından önce doğal bir yan tercih olmadığını gösterir. Ayrıca, bireysel alışma sırasındaki toplam marka denemesi sayısını da rapor ediyoruz. Değerler Ortalama ± SEM olarak bildirilmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Üç alım günü boyunca tüm balıklar ve yüksek performanslı balıklar arasında yüksek performanslı balıkların yüzdesi ve ilk tercih gecikme süresi. (A) Yüksek performanslı balıklar, her alım günü (A1-A3) 8 denemeden en az 6'sında merkez odadan odanın ödüllü tarafına taşındı. (B) Üç günlük satın alma eğitimi (A1-A3) boyunca, genel ilk tercih gecikme süresi azaldı; yüksek performanslı balıklarda (C) da belirgin bir eğilim. Değerler Ortalama ± SEM olarak bildirilmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Satın alma ve tersine çevirme denemeleri sırasında ayrımcılık performansı. (A) 8 hafta sonra tersine öğrenme sırasında satın alma günleri (A1-A3) ve (B) boyunca balıkların ayrımcılık oranı (ödüllü denemeler /(ödül + nonrewarded denemeleri). Reversal da 3 gün boyunca değerlendirildi (R1–R3). Her iki görev için de, her balık 8 denemeyi tamamlamak zorunda kaldı ve sonuçlar iki deneme bloğunda (2, 4, 6, 8) sunuldu. Hem edinme hem de tersine çevirme sırasında doğru yanıtlar zamanla arttı, geri dönüş sırasında daha hızlı bir yanıt gözlendi, bu da balığın görevi öğrendiğini ve hatırladığını gösterdi. Değerler Ortalama ± SEM olarak raporlanır. Noktalı çizgi şansı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 3 oda seçimi davranışsal görevi kullanılarak hiperglemik zebra balıklarının edinimi ve tersine çevrilmesi. (A) Tedaviden önce, naif zebra balığı üç günlük davranış eğitimi boyunca 3 oda seçimi davranışsal görevi aldı (edinme, A1-A3). A1 ve A3'te öğrenmenin gerçekleştiğini gösteren ayrımcılık oranları arasında anlamlı bir fark vardı (p = 0.012). 4 haftalık tedavinin ardından (renkli semboller) tedavinin önemli bir etkisi oldu (p = 0.048), glikozla tedavi edilen hayvanlar su ile tedavi edilen hayvanlara kıyasla önemli ölçüde azaltılmış ayrımcılık oranları gösterdi (p = 0.037). (B) Ayrı bir deneyde, 8 haftalık hiperglisemi öncesi ve sonrası davranışlar değerlendirildi. Her satın alma gününde performanstaki istikrarlı artışa rağmen, A1-A3 genelinde önemli bir fark ayrımcılık oranı yoktu. Bununla birlikte, 8 haftalık tedaviden sonra (renkli semboller), tedavinin ana etkisi (p < 0.001) ve eğitim gününün bireysel bir ana etkisi (p = 0.010) vardı. Post-hoc analizler, su ile arıtılmış grup ile hem mannitol hem de glikozla tedavi edilen gruplar arasında önemli bir fark olduğunu ortaya koydu ve ozmotik bir etki olduğunu düşündürmektedir (su v. mannitol: p = 0.008; su v. glikoz: p < 0.001). * önemli bir ana etkiye sahiptir. Veri noktaları grup ortalama ± SEM'i temsil eder ve farklı harflere sahip veri noktaları bir bir birinden önemli ölçüde farklıdır. Noktalı çizgi şansı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son 15 yılda zebra balığı kullanılarak yapılan nörobilim araştırmalarının miktarında ve çeşitliliğinde muazzam bir büyüme olmasına rağmen24, davranışsal tahliller bu türlerde memeli model sistemlerine kıyasla eksik11,25,26. Burada, kemirgenlerle kullanılmak üzere geliştirilen üç odalı bir seçim görevinin zebra balıklarında görsel ayrımcılık öğreniminin edinilmesini ve tersine çevrilmesini değerlendirmek için uyarlanabildiğini gösteriyoruz. Ödül olarak canlı bir sürü kullanarak, bu görev diyabet, Alzheimer ve demansın hiperglipik komplikasyonları gibi davranışsal olarak bağlantılı hastalıkları inceleyen çeşitli çalışmalara uygulanabilecek sağlam bir test sağladı.
Zebra balıklarının ekolojik olarak ilgili kararlar almak ve vahşi doğada hayatta kalmak için gerekli olduğu için bilgi öğrenebileceği ve depolayabildiği daha önce tespitedilmiştir 3. 8 haftalık uzunlamasına bir çalışmada elde edilen ve tersine çevrilen verilerimiz, zebra balıklarının küçük olsa da basit bir ayrımcılık görevini öğrenebildiğine ve hatırlayabildiğine ve zebra balıklarının daha önce edinilen yanıtları da engelleyebileceğine dair önceki kanıtları desteklemektedir. Boyuna 8 haftalık çalışmada, zorla ödül sayısı azaldı ve ayrımcılık oranı arttı, bu da balıkların doğru, ödüllendirilen tarafı seçmede daha iyi olduğunu ve görevi öğrendiğini gösteriyor. Bu değişiklikler önemli olmasa da, satın alma sırasında güç ödüllü denemelerin sayısında genel bir düşüş eğilimi ve ayrımcılık oranında bir artış gördük. Ayrıca, hipergliplik balıklarla yapılan üç oda seçimi davranışsal görevin sonuçları, testin hipergliplik koşulları inceleyen çalışmalara uygulanabilirliğini ortaya koydu ve bu paradigmanın biliş üzerindeki potansiyel etkileri değerlendirmek için ilaç maruziyetleri veya mutant çizgileri gibi diğer deneysel manipülasyonlarla birlikte kullanılabileceğini göstermektedir.
Bu çalışmanın önemli bir sınırlaması, zaman içinde bireysel balıkları tanımlayamamamız ve bu nedenle verileri değerlendirmek için grup ortalamalarına güvenmemiz gerektiğidir. Kemirgenlerde olduğu gibi farklı tedavi gruplarındaki balıkları bireysel olarak izlemenin bir yolunu geliştirmek bu sorunları ele alabilir. Bu farklılıkları çözmek için, balıkları satın alma aşamasında performanslarına göre sıraladık, bu da metodolojimizin beklenmedik bir yararı olduğu ortaya çıktı. 'Yüksek performanslı balık', eğitimin her gününde 6/8'≥ puan toplarken, daha düşük puanlı balıklar 'düşük performanslı balık' oldu. Her gün sayıldığında, sürü ödüllü grupta 'yüksek performans gösterenlerin' sayısı arttı, böylece 3. Tüm balıklarda ('yüksek + düşük performans gösterenler') gözlenen seçim gecikme eğilimleri, yalnızca 'yüksek performanslı' grupta gözlemlenenlere benzer, bu da bu grubun güçlü tepkilerinin genel tepkileri yönlendirdiğini göstermektedir.
Özetle, bu bulgular zebra balıklarında sürü tabanlı ayrımcılık öğreniminin normal ve bozulmuş bilişsel işleyişin incelenmesi için uygun maliyetli bir model sağladığını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Sabrina Jones'a zebra balığı modeline kemirgen üç odalı bir paradigmayı uyarlamadaki yardımı için ve Jeremy Popowitz ve Allison Murk'a davranış toplama günlerindeki yardımları, koşu denemeleri, hayvan bakımı ve tank kurulumu konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca James M. Forbes'a (Makine Mühendisi) 3 oda seçimi tank tasarımı ve yapımındaki yardımı için özel teşekkürler.
Finansman: VPC ve TLD, Amerikan Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi'nden ortak bir Fakülte Araştırma Destek hibesi (FRSG) aldı. CJR, Amerikan Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Lisansüstü Öğrenci Desteği'nden destek aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Champion Sports Stopwatch Timer Set: Waterproof, Handheld Digital Clock Sport Stopwatches with Large Display for Kids or Coach - Bright Colored 6 Pack | Amazon | N/A | https://www.amazon.com/Champion-Sports-910SET-Stopwatch-Timer/dp/B001CD9LJK/ref=sr_1_17?dchild=1&keywords=stopwatch+for+sports&qid=1597081570&sr=8-17 Recommend two of different colors; one for choice latency and one for time to completion |
| Coofficer Extra Large Binder Clips 2-Inch (24 Pack), Big Paper Clamps for Office Supplies, Black | Amazon | N/A | https://www.amazon.com/Coofficer-Binder-2-Inch-Clamps-Supplies/dp/B07C94YCR5/ref=sr_1_3_sspa?dchild=1&keywords=large+binder+clips&qid=1597081521&sr=8-3-spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVyPUExUENWUTRZVjlIWEVPJmVuY3J5cHRlZElkPUEwNDQ5NDU0MlpSREkwTFlLSThVQiZlbmNyeXB0ZWRBZElkPUEwMTg5NDI3MllRV1EzOUdWTVpSOCZ3aWRnZXROYW1lPXNwX2F0ZiZhY3Rpb249Y2xpY2tSZWRpcmVjdCZkb05vdExvZ0NsaWNrPXRydWU= |
| Marineland® Silicone Aquarium Sealant | Petsmart | Item #2431002 | |
| PVC (Polyvinyl Chloride) Sheet, Opaque Gray, Standard Tolerance, UL 94/ASTM D1784, 0.125" Thickness, 12" Width, 24" Length | Amazon | N/A | https://www.amazon.com/Polyvinyl-Chloride-Standard-Tolerance-Thickness/dp/B000MAMGEQ/ref=sr_1_2?dchild=1&keywords=grey+PVC+sheet&qid=1597081440&sr=8-2 |
| Steelworks 1/4-in W x 8-ft L Mill Finished Aluminum Weldable Trim U-shaped Channel | Lowes | Item #55979Model #11377 | https://www.lowes.com/pd/Steelworks-1-4-in-W-x-8-ft-L-Mill-Finished-Aluminum-Weldable-Trim-Channel/3058181 |
| Tetra 10 Gallon Fish tank | Petsmart | Item #5271256 | |
| Top Fin Fine Mesh Fish Net (3 in) | Petsmart | Item #5175115 |
References
- Gitler, A. D., Dhillon, P., Shorter, J. Neurodegenerative disease: models, mechanisms, and a new hope. Disease Models & Mechanisms. 10, 499-502 (2017).
- Perry, R. J., Watson, P., Hodges, J. R. The nature and staging of attention dysfunction in early (minimal and mild) Alzheimer's disease: relationship to episodic and semantic memory impairment. Neuropsychologia. 38, 252-271 (2000).
- Gerlai, R. Learning and memory in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 134, Elsevier Ltd. (2016).
- Davidson, T. L., et al. The effects of a high-energy diet on hippocampal-dependent discrimination performance and blood-brain barrier integrity differ for diet-induced obese and diet-resistant rats. Physiology and Behavior. 107, 26-33 (2012).
- Yang, M., Silverman, J. L., Crawley, J. N. Automated three-chambered social approach task for mice. Current Protocols in Neuroscience. 56 (1), (2011).
- Remmelink, E., Smit, A. B., Verhage, M., Loos, M. Measuring discrimination- and reversal learning in mouse models within 4 days and without prior food deprivation. Learning and Memory. 23, 660-667 (2016).
- Salas, C., et al. Neuropsychology of learning and memory in teleost fish. Zebrafish. 3, 157-171 (2006).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10, 70-86 (2013).
- Luchiaria, A. C., Salajanb, D. C., Gerlai, R. Acute and chronic alcohol administration: Effects on performance of zebrafish in a latent learning task. Behavior Brain Research. 282, 76-83 (2015).
- Fadool, J., Dowling, J. Zebrafish: A model system for the study of eye genetics. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 89-110 (2008).
- Fernandes, Y. M., Rampersad, M., Luchiari, A. C., Gerlai, R. Associative learning in the multichamber tank: A new learning paradigm for zebrafish. Behavioural Brain Research. 312, 279-284 (2016).
- Reider, M., Connaughton, V. P. Developmental exposure to methimazole increases anxiety behavior in zebrafish. Behavioral Neuroscience. , (2015).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
- May, Z., et al.
- Mathur, P., Lau, B., Guo, S. Conditioned place preference behavior in zebrafish. Nature Protocols. 6, 338-345 (2011).
- Guo, S. Linking genes to brain, behavior and neurological diseases: What can we learn from zebrafish. Genes, Brain and Behavior. 3, 63-74 (2004).
- Kily, L. J. M., et al. Gene expression changes in a zebrafish model of drug dependency suggest conservation of neuro-adaptation pathways. Journal of Experimental Biology. 211, 1623-1634 (2008).
- Webb, K. J., et al. Zebrafish reward mutants reveal novel transcripts mediating the behavioral effects of amphetamine. Genome Biology. 10, (2009).
- Clayman, C. L., Malloy, E. J., Kearns, D. N., Connaughton, V. P. Differential behavioral effects of ethanol pre-exposure in male and female zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 335, 174-184 (2017).
- Ruhl, T., et al. Acute administration of THC impairs spatial but not associative memory function in zebrafish. Psychopharmacology. 231, 3829-3842 (2014).
- Gellermann, L. W. Chance orders of alternating stimuli in visual discrimination experiments. The Pedagogical Seminary and Journal of Genetic Psychology. 42, 206-208 (1933).
- Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44, 157-163 (2007).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13, 87-94 (2016).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: Zebrafish as a model system of human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 817341 (2012).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R., Court, P. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35, 63-75 (2014).
- Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in cell biology. 101, 249-270 (2011).
