Summary
Vi presenterer et atferdskammer designet for å vurdere kognitiv ytelse. Vi gir data som viser at når de er anskaffet, husker sebrafisk oppgaven 8 uker senere. Vi viser også at hyperglykemisk sebrafisk har endret kognitiv ytelse, noe som indikerer at dette paradigmet gjelder for studier som vurderer kognisjon og hukommelse.
Abstract
Nevrodegenerative sykdommer er aldersavhengige, svekkende og uhelbredelige. Nyere rapporter har også korrelert hyperglykemi med endringer i hukommelse og/eller kognitiv svikt. Vi har modifisert og utviklet en tre-kammer valg kognitiv oppgave som ligner den som brukes med gnagere for bruk med hyperglykemisk sebrafisk. Testkammeret består av et sentralt plassert startkammer og to valgrom på hver side, med en stimer av konsifikter som brukes som belønning. Vi gir data som viser at når de er anskaffet, husker sebrafisk oppgaven minst 8 uker senere. Våre data tyder på at sebrafisk reagerer robust på denne belønningen, og vi har identifisert kognitive underskudd i hyperglykemisk fisk etter 4 ukers behandling. Denne atferdsanalysen kan også gjelde for andre studier relatert til kognisjon og hukommelse.
Introduction
Nevrodegenerative sykdommer er aldersavhengige, svekkende og uhelbredelige. Disse sykdommene øker i utbredelse, noe som resulterer i et presserende behov for å forbedre og utvikle nye terapeutiske strategier. Utbruddet og presentasjonen av hver sykdom er unik, da noen påvirker språk, motoriske og autonome hjerneregioner, mens andre forårsaker læringsunderskudd og hukommelsestap1. Spesielt er kognitive underskudd og / eller svekkelse de mest utbredte komplikasjonene på tvers av alle nevrodegenerative sykdommer2. I håp om å kaste lys over de underliggende mekanismene som er involvert i disse nevrodegenerative sykdommene, har bruken av mange forskjellige modellsystemer (inkludert encellede organismer til Drosophila til høyere ordens vertebrater som gnagere og mennesker) blitt brukt; Imidlertid forblir flertallet av nevrodegenerative sykdommer uhelbredelige.
Læring og hukommelse er svært bevarte prosesser blant organismer, da konstante endringer i miljøet krever tilpasning3. Svekkelse i både kognisjon og synaptisk plastisitet er vist i flere gnagermodeller. Spesielt bruker veletablerte atferdsanalyser assosiativ læring for å vurdere kognitive endringer etter ulike svekkelsesinduserte sykdommer og lidelser4. I tillegg vurderer kontrastdiskriminerings reversering kognitive underskudd fordi det innebærer høyere ordens lærings- og minnefunksjoner, og reversering avhenger av hemming av en tidligere lært forening. Den mye brukte trekammervalgsoppgaven belyser mulige underskudd i læring og minneveier i sentralnervesystemet5,6. Nylig har dette feltet utvidet seg til å omfatte ikke-pattedyrmodeller, for eksempel sebrafisk (Danio rerio), da flere paradigmer er utviklet i en rekke aldre fra larver til voksne7,8.
Sebrafisk gir en balanse mellom kompleksitet og enkelhet som er fordelaktig for vurdering av kognitive svekkelser med atferdsteknikker. For det første er sebrafisk egnet til atferdsscreening med høy gjennomstrømning gitt deres lille størrelse og produktive reproduktive natur. For det andre har sebrafisk en struktur, lateral pallium, som er analog med pattedyret hippocampus som det har lignende nevronmarkører og celletyper7. Sebrafisk er også i stand til å skaffe og huske romlig informasjon9 og, som mennesker, er daglige10. Derfor er det ikke overraskende at sebrafisk brukes som modell for nevrodegenerative sykdommer med økende frekvens. Fraværet av passende atferdsanalyser har imidlertid gjort det vanskelig å bruke sebrafiskmodellen til kognitive vurderinger. Publisert arbeid ved hjelp av sebrafiskspesifikke atferdsanalyser inkluderer assosiative læringsoppgaver11, angstatferd12, minne13, objektgjenkjenning14og betinget stedspreferanse15,16,17,18,19. Selv om det har vært mange utviklinger med hensyn til sebrafisk atferdsanalyser, har kolleger for noen tester av kognitive funksjoner hos gnagere ennå ikke blitt utviklet for bruk med sebrafisk18.
Basert på tidligere studier fra laboratoriet vårt modellerte/utviklet vi en kognitiv oppgave i sebrafisk basert på trekammervalgsoppgaven som brukes med gnagere som bruker sosial interaksjon som belønning. I tillegg utvidet vi det assosiative læringsaspektet ved atferdsoppgaven og innlemmet kontrastdiskriminerings reversering i håp om å videreutvikle denne atferdsoppgaven for å vurdere kognitiv svikt. Dette gjorde det mulig for oss å undersøke både det første oppkjøpet av diskrimineringslæring og den påfølgende hemmingen av denne læringen i reverseringsfasen. I den nåværende studien viser vi at denne prosedyren ga en pålitelig metode for å vurdere kognitiv funksjon i sebrafisk etter glukose nedsenking i 4 eller 8 uker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved American University (protokoll # 1606, 19-02).
1. Dyr
- Oppdrett og vedlikehold av dyr
- Få voksen vill-type sebrafisk (Danio rerio) i alderen 4-11 måneder som embryoer og bak dem internt.
- Vedlikehold fisken i et vannstativsystem ved 28-29 °C på en 14-timers lys: 10-timers mørk fotoperiod.
- Fôr fisken to ganger per dag med kommersielle flak og supplement med levende Artemia.
- Velg fisk tilfeldig fra disse lagertankene for atferdseksperimenter.
- Ved eksperimentfullføring bedøver du dyrene ved nedsenking i 0,02% trikain i 2 min eller til det er mangel på motorisk koordinering og redusert åndedrettsfrekvens for senere molekylære og / eller nevrokjemiske analyser.
2. Testkammer med tre kammervalg
MERK: Denne atferdsteknikken ble endret fra Ruhl et al.20.
- Kammer konstruksjon
- Endre virkekammeret26–et akvarium på 40 l (50 x 30 x 30 cm3)— for å ha et sentralt eller startkammer (10 x 30 x 30 cm3), atskilt fra to sidevalgkamre (hver 20 x 30 x 30 cm3, bilde 1A).
- Konstruer de tre rommene ved hjelp av en aluminium "U-formet" kanal festet til de innvendige glassveggene med akvariumforseglingsmiddel, for å skille tanken i tre kamre.
- Konstruer ugjennomsiktige skillevegger, 10 cm høye, ut av grått PVC-ark som passer inn i aluminiumskanalene på hver side. Gjør hver skillelinje av 2 stykker, hver lik i størrelse: et stasjonært bunnstykke permanent montert i tanken og et bevegelig toppstykke som beveger seg opp og ned i aluminiumssporene.
- Lim ekstra store bindemiddelklemmer til toppen av de grå PVC-arkene for å fungere som håndtak.
- Bruk en permanent markør til å tegne små horisontale linjer 10 cm over det festede grå PVC-røret på utsiden av tanken.
MERK: Dette merket er punktet der det øverste grå PVC-arket åpnes for å gi tilgang til begge sider. - Legg kontroll (system) vann til tanken til et nivå på 25 cm fra bunnen til toppen av tanken, eller ~ 30 L. Plasser glass akvariumvarmere i hver del av kammeret i 24 timer før testing for å bringe temperaturen til 28,5 °C.
MERK: Fjern varmeapparatene ved starten av atferdsøkten og utfør en full vannutveksling etter to dagers bruk.
- Oppsett av diskriminering
- For hver diskrimineringsoppgave plasserer du filtstykker (beige, svart eller hvit) individuelt på yttersiden, siden og bunnen av valgkamrene ved hjelp av borrelås (figur 1B–D).
MERK: Det sentrale kammeret skal ikke ha noen bakgrunnsfarge knyttet til seg.
- For hver diskrimineringsoppgave plasserer du filtstykker (beige, svart eller hvit) individuelt på yttersiden, siden og bunnen av valgkamrene ved hjelp av borrelås (figur 1B–D).
- Som belønning, lag en gruppe konspektiver (shoal) ved å plassere 4 voksne sebrafisk, som ellers ikke vil bli brukt i studien, i en liten, klar tank i det fjerne bakhjørnet i hvert valgkammer (Figur 1B-D).
MERK: Velg shoal fisk tilfeldig fra lagertanker hver dag, med minst en mann og en kvinne i samme alder og størrelse som den eksperimentelle fisken i hver shoal tank.
3. Atferdsoppgaver
- Acclimation
MERK: Akklimatisering til atferdskammeret består av tre dager med trening; to dager med gruppeakklimatisering etterfulgt av en dag med individuell trening. - Akklimatisering av gruppe
- Fest beige (nøytral) filtbakgrunnen på utsiden av begge valgrommene, og senk en levende stimertank i hvert av de valgte rommene (Figur 1B).
- Tilsett fem-seks sebrafisk til sentrumsstartkammeret med begge skyvedørene åpne, og la fisken streife fritt i 30 minutter.
MERK: Den eksperimentelle sebrafisken skal kunne samhandle og sosialisere med disse shoal fiskene gjennom tanken som belønning etter å ha krysset inn i et av valgrommene under akklimatisering. En fisk anses å ha kommet inn i et av sidekamrene når hele kroppen kommer inn i kammeret. - Gjenta denne prosedyren med samme eksperimentelle fisk for en andre dag (2 dager med gruppeakklimatisering).
MERK: Ikke behold de samme gruppene med fisk.
- Individuell akklimatisering
- Kammeroppsett: Fest beige (nøytral) filtbakgrunnen på utsiden av begge valgrommene, og senk en levende shoaltank i begge valgrommene, som i gruppeakklimatisering (Figur 1B,E).
- Plasser en individuell sebrafisk i det sentrale startkammeret i 2 min med skyvedørene lukket, og etter 2-min-perioden åpner du begge dørene samtidig.
- Pass på at hver fisk svømmer fra sentralkammeret gjennom en dør i totalt 10 ganger, uavhengig av hvilken side. Belønn fisken hver gang den kommer inn i et av sidekamrene (1 dag med individuell akklimatisering).
MERK: Hvis en fisk ikke er i stand til å fullføre denne oppgaven 10 ganger i løpet av en 30-minutters periode eller nekter å forlate startkammeret i det hele tatt, må du utelukke det fra studien.
- Datainnsamling: Registrer antall ganger fisken svømmer inn på hver side og den totale tiden det tar å fullføre oppgaven.
- Kammeroppsett: Fest beige (nøytral) filtbakgrunnen på utsiden av begge valgrommene, og senk en levende shoaltank i begge valgrommene, som i gruppeakklimatisering (Figur 1B,E).
- Ervervelse
MERK: Etter akklimatisering begynte sebrafisk en 3-dagers oppkjøpsoppgave.- Kammeroppsett: Fest et hvitt filtstykke på utsiden av ett valgrom og et svart filtstykke på utsiden av det andre valgrommet (Figur 1C,F).
MERK: Vekselvis bakgrunnsfargen på hver side daglig ved hjelp av en pseudorandomplan37.- I løpet av denne fasen av treningen, plasser en shoal-belønning bare plassert i et av valgrommene; Dette blir den belønnede siden.
- For å begynne oppkjøpet, plasser en enkelt eksperimentell fisk i startkammeret i en 2-minutters periode med valgrommene stengt av.
- Etter 2-min akklimatisering, åpne begge dørene samtidig, gi tilgang til begge valgrommene, og start stoppeklokken for å vurdere valgventetiden.
- Ved hjelp av en partisk design tilordner du fisken tilfeldig enten en svart eller hvit preferanse (dvs. enten W +/ B- eller B + / W-), noe som betyr at shoal er plassert i enten det svarte (B +) eller hvite (W +) valgrommet.
- Betegner valgsvaret
- Når fisken gjør et valg ved å gå inn i et av siderommene, stopp timeren.
- Hvis fisken velger riktig side, lukk straks døren mellom sentralkammeret og den siden for å begrense fisken til ønsket side i 1 min, og la den bli belønnet ved å samhandle med stimertanken (Figur 1C, F). Score denne prøveperioden som "C" for "Riktig" (belønnet).
- Hvis fisken svømmer gjennom feil dør, overfør den tilbake til sentralkammeret, lukk begge dørene og score rettssaken som "I" for "feil" (ikke-belønnet).
- Hvis fisken ikke tar en beslutning innen 2 minutter etter at dørene er åpnet, flytt fisken til riktig side i 1 min, og score studien som "M" for "merket" (force-rewarded).
- Ved overføring/flytting av fisk tilbake til startkammeret, før fisken forsiktig inn i det sentrale kammeret ved hjelp av et fiskenett som gjeterverktøy.
MERK: Ikke øs fisken opp av vannet og sett den tilbake i startkammeret, da dette kan påvirke atferdsanalysen. - Når fisken kommer tilbake til sentralkammeret, vent i 1 min før du utfører oppgaven igjen. Forsikre deg om at hver fisk utfører oppgaven 8 ganger.
- Datainnsamling
- For hver eksperimentell fisk registrerer du tiden til første beslutning (eller valgventetid) og de enkelte poengsummene (C, I eller M) for hver av de 8 oppkjøpsforsøkene (avsnitt 3.4.2) i rekkefølge.
- Rapporter resultatene for disse eksperimentene ble rapportert som gruppegjennomsnitt for hver studie på hver anskaffelsesdag.
- Når en fisk har fullført en prøve, kategoriser den som enten en "høytytende" fisk eller en "lavpresterende" fisk.
MERK: En fisk ble ansett som "høy ytelse" hvis den lyktes valgte riktig side av tanken i minst 6 av de 8 totale forsøkene for dagen. Enhver fisk som ikke oppfyller dette kriteriet er en "lav utøver". - Når den er identifisert, huser du høy ytelse og lav ytelse fisk separat.
- Kategoriser fisken som "høye" eller "lave" utøvere på hver av de tre dagene med oppkjøp, etter at en fisk har fullført forsøkene.
MERK: På slutten av den tredje oppkjøpsdagen forblir fisk som enten "høye" eller "lave" utøvere i løpet av studien.
MERK: Noen fisk som i utgangspunktet var i gruppen med lav ytelse, lærer oppgaven på anskaffelsesdagen 2 eller 3. Når dette skjer, kan den første "lavpresterende" fisken flyttes inn i gruppen med høy ytelse. Ikke flytt fisken mellom grupper på denne måten etter dag 3 (slutten av oppkjøpet).
- Kammeroppsett: Fest et hvitt filtstykke på utsiden av ett valgrom og et svart filtstykke på utsiden av det andre valgrommet (Figur 1C,F).
4. Eksperimentell behandling
- Etter oppkjøpsperioden, når fisken demonstrerer evnen til å løse en enkel diskrimineringsoppgave mellom svart og hvit bakgrunn, start behandlingsregimet for eksperimentell sebrafisk.
MERK: For å vise anvendelsen av denne metoden, viser denne studien to eksperimentelle design:- Langsgående studie
- Returner den eksperimentelle fisken til sine lagertanker i 8 uker. Vedlikehold fisken i standardtanker med daglige vannforandringer, og mate dem to ganger daglig.
MERK: Ikke utfør atferdstrening i løpet av disse 8 ukene i lagertankene. - Utfør reverseringsvurdering etter denne perioden for å vurdere om sebrafisken kan løse reverseringsoppgaven etter 8 uker uten trening.
- Returner den eksperimentelle fisken til sine lagertanker i 8 uker. Vedlikehold fisken i standardtanker med daglige vannforandringer, og mate dem to ganger daglig.
- Hyperglykemi: Utsett eksperimentelle grupper for vann (håndtering av stresskontroll), mannitol (1%–3 %, osmotisk kontroll) eller glukose (1 %–3 %) i 4 eller 8 uker22,23.
MERK: Ikke utfør atferdstrening i løpet av disse 4 eller 8 ukene.
- Langsgående studie
5. Tilbakeføring
MERK: Etter eksperimentell manipulering (som i pkt. 4.2) testes fisken i siste del av 3-kammervalgparadigmet – reversering. For å gjøre dette reverseres den belønnede siden (sammenlignet med oppkjøp) slik at fisk som tidligere ble belønnet med en shoal på den hvite siden, nå belønnes med en shoal på den svarte siden og omvendt. På denne måten vurderer reversering om fisken har lært hvor belønningen (shoal) ligger, uavhengig av fargen på bakgrunnen.
- Oppsett av kammer
- Fest svart filt på utsiden av et av valgkamrene og det hvite føltes på utsiden av det andre, og sørg for at de svarte og hvite sidene er de samme sidene som i oppkjøpsforsøkene (avsnitt 3.4).
- Senk shoaltanken ned i det fjerne bakre hjørnet av siden som er det motsatte av det tidligere belønnede valgkammeret (Figur 1D,G).
MERK: Fisken som tidligere ble belønnet på den hvite siden, belønnes med andre ord nå på den svarte siden og omvendt. - Test fisken individuelt som i pkt. 3.5. Begynn med å plassere en enkelt eksperimentell fisk i startkammeret i en periode på 2 minutter, og lukk tilgangen til valgrommene.
- Åpne begge sider av kammeret samtidig.
MERK: Fullfør totalt 8 studier hver dag i tre påfølgende behandlingsdager.
- Betegner valgsvaret
- Hvis fisken riktig velger den foretrukne fargen, lukk straks døren til sentralkammeret i 1 min, slik at fisken kan samhandle med shoal-belønningen. Score denne prøveperioden som "C" for "Riktig" (belønnet).
- Hvis fisken svømmer gjennom feil dør, overfør den tilbake til sentralkammeret, lukk begge dørene, og score denne rettssaken som "I" for "feil" (ikke-belønnet).
- Hvis fisken ikke tar en beslutning innen 2 minutter etter at dørene er åpnet, flytt fisken til riktig side, og score studien som "M" for "merket" (force-rewarded).
- Datainnsamling
- For hver eksperimentell sebrafisk registrerer du valgventetiden og de enkelte poengsummene (C, I, M), i rekkefølge, for hver prøve.
- Rapporter resultatene for disse eksperimentene som gruppegjennomsnitt for hver to-prøveblokk på hver av de tre tilbakeføringsdagene.
- Hold dataene for fisk med høy og lav ytelse atskilt for å avgjøre om de viser samme ytelsesnivå under reversering som de gjorde under oppkjøpet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Akklimatisering til atferdskammeret innebærer tre dager med trening: 2 dager med gruppeakklimatisering etterfulgt av 1 dag med individuell akklimatisering. Men fordi vi ikke kunne skille individuelle sebrafisk fra hverandre, var vi bare i stand til å samle inn data under individuell akklimatisering. På dette tidspunktet tok eksperimentelle dyr (n = 30), betinget ved hjelp av en shoal-basert belønning, i gjennomsnitt 125,11 s for å nå sin første beslutning (figur 2A) og i gjennomsnitt 725,34 s (12 min) for å fullføre hele den individuelle akklimatiseringsoppgaven (figur 2B). Det var ingen signifikant sidepreferanse under akklimatisering (figur 2C). Antall ekskludert fisk var minimalt sammenlignet med andre belønningstyper (mat) vi tidligere hadde vurdert i vårt laboratorium (Figur 2C).
Etter akklimatisering begynte sebrafisk oppkjøpsfasen. Etter hvert som fisken ble testet individuelt, samlet vi inn data fra hver fisk på hver av de tre anskaffelsesdagene. Fisken ble klassifisert som enten "høye eller lave utøvere", med "høye utøvere" som reagerte raskere og mer nøyaktig, til tross for at alle fiskene hadde samme tidligere eksponering for testkammeret. Bare fisk som valgte det belønnede valgrommet i minst 6 av de 8 studiene ble klassifisert som "høye utøvere". Fisk som ikke oppfylte dette kriteriet var «lave utøvere». Høy og lav ytelse fisk ble plassert separat for å skille deres ytelse i alle etterfølgende forsøk. Interessant nok observerte vi at noen fisk endret kategori (dvs. var i utgangspunktet "lave utøvere", men ble "høye utøvere" i løpet av oppkjøpet. Faktisk økte antall høytytende dyr hver dag, med mer høy ytelse fisk på oppkjøpsdag 3 sammenlignet med dag 1 (Figur 3A). På dag 3 hadde >50% av fisken blitt "høye utøvere". Videre gikk startvalgsventetiden for all fisk over de tre oppkjøpsdagene (A1–A3) ned, noe som indikerer en forbedret ytelse for hver anskaffelsesdag (figur 3B). Den samme trenden ble også sett da bare den høytytende fiskegruppen ble vurdert: ved dag 3 ble tiden for første beslutning forbedret (ble raskere) (Figur 3C).
Et diskrimineringsforhold (belønnede forsøk/(belønning + ikke-videresendte forsøk) ble beregnet for hver anskaffelsesprøveblokk (gjennomsnitt på to forsøk/fisk) i løpet av de tre anskaffelsesdagene (A1–A3) for alle forsøksdyr (n = 30) for å avgjøre hvor nøyaktig fisken løste (anskaffet) diskrimineringsoppgaven (dvs. å gå til den belønnede siden av tanken). Dette forholdet viste at prosentandelen fisk som beveger seg til den belønnede siden i løpet av hver studie økte daglig (dvs. på tvers av prøveblokker på hver enkelt dag) og samlet (dvs. på tvers av de tre oppkjøpsdagene) noe som resulterte i at all fisk presterte over sjanse ved oppkjøpsslutt (prikket linje representert på grafen; (Figur 4A) og indikerer at fisken hadde lært diskrimineringsoppgaven.
Etter oppkjøpet av diskrimineringslæring testet vi hvor lenge sebrafisk ville huske oppgaven. For å gjøre det forble testet sebrafisk i lagertanker i 8 uker. Etter denne tiden ble fisk testet på en reverseringsoppgave som varte i 3 dager (R1–R3). Vi fant at fisken viste sterk reverseringsadferd og økt diskriminering i løpet av de tre dagene med reversering (figur 4B), noe som indikerer at de var i stand til å (1) huske forholdet mellom tankens farge og belønningen og (2) hemme det de tidligere hadde lært under oppkjøpet og lære reverseringen / motsatt paradigme. Som vist i figur 4B, gikk sebrafisk i utgangspunktet til den ikke-belønnede siden av tanken, som angitt av at diskrimineringsforholdet var under sjanse under innledende stier på reverseringsdag 1. Ved utgangen av R1 økte imidlertid ytelsen til større enn tilfeldigheter, et resultat som ble opprettholdt på R2 og R3, med de høyeste diskrimineringsgradspoengene observert på R3. Samlet sett viser disse dataene at naive eksperimentelle dyr er i stand til å løse diskrimineringsoppgaven, selv om den første oppførselen ble oppnådd 8 uker tidligere, uten ytterligere trening mellom atferdsøkter.
3-kammer valg paradigmet kan også brukes til undersøkelse av sykdomskomplikasjoner. I vår studie med hyperglykemisk sebrafisk ble akklimatisering og oppkjøp som beskrevet, og reversering ble testet etter enten 4 eller 8 uker hyperglykemi. Hyperglykemi ble indusert med en alternativ nedsenkningsprotokoll (McCarthy et al., 2020 - dette problemet), slik at trening skjedde annenhver dag, på dager etter at sebrafisk hadde vært i testløsninger i 24 timer. Under oppkjøpet var det en hovedeffekt av opplæringsdagen på diskrimineringsforholdet (F (2, 239) = 4,457, p = 0,012; Figur 5A), der forholdet mellom A1 er betydelig lavere enn på A3 (p = 0,010), noe som indikerer at fisken forbedret valgnøyaktigheten over tid. Under reversering var det en signifikant hovedeffekt av behandlingen (F (2, 326) = 3,057, p = 0,048), men ingen andre signifikante hovedeffekter eller interaksjoner (treningsdag: (F (2, 326) = 1,602, p = 0,203); treningsdag x behandling: (F (4, 326) = 0,661, p = 0,620); Figur 5A). Responsen til glukosebehandlede dyr ble betydelig redusert sammenlignet med de vannbehandlede dyrene (p = 0,037), men det var ingen andre signifikante forskjeller (kontroll v. mannitol: p = 0,387; mannitol v. glukose: p = 0,524), noe som tyder på en glukosespesifikk effekt. Etter 8 uker med hyperglykemi ble det ikke registrert statistiske forskjeller i diskrimineringsforhold på tvers av oppkjøpstrening (F (2 263) = 2,909, p = 0,056; Figur 5B). Det var imidlertid signifikante hovedeffekter av begge treningsdagene (F (2, 189) = 4,721, p = 0,010) og behandling (F (2, 189) = 7,940, p = 0,000) ved reversering, men ingen signifikant interaksjon (treningsdag * behandling = F (4, 189) = 0,869, p = 0,484). Etterfølgende minst signifikante forskjellssammenligninger (LSD) identifiserte signifikante forskjeller mellom R1 og R3 (p = 0,022) og mellom R2 og R3 (p = 0,003). LSD parvis sammenligninger avslørte også betydelige forskjeller mellom vannbehandlingsgruppen og både glukose- og mannitolbehandlingsgrupper (vann v. mannitol: p = 0,008; vann v. glukose: 0,000); Imidlertid var glukose- og mannitolgruppene ikke signifikant forskjellig fra hverandre (p = 0,265), noe som tyder på at disse forskjellene i diskrimineringsforhold kan skyldes osmotiske effekter.
Figur 1: Testkammer for trekammervalg og oppsett av atferd. (A) Skjema med tre kammer. Eksperimentelle dyr ble begrenset til det sentrale startkammeret i 2 min og tillot deretter tilgang til hver side av tanken ved starten av en prøve. For å gjøre det ble den øverste halvdelen av hver av de to partisjonene hevet for å skape en 10 cm plass for fisk å krysse inn i et av valgrommene. (B,E) Akklimatisering ble utført ved hjelp av en beige bakgrunn og stimer av konspektiver som belønningen. (C,F) Oppkjøpet ble utført med svart-hvitt bakgrunn på valgkamrene; belønningen var bare plassert på den ene siden av kammeret. (G) Reversering ble utført med svart-hvitt bakgrunn på valgrommene; belønning var bare tilgjengelig på motsatt side av kammeret (vs. oppkjøp). (H) Nærbilde av shoal tank nedsenket i et av valgrommene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ventetid og antall merkede forsøk under individuell akklimatisering. (A) Valgventetid for første beslutning. (B) Den totale tiden for å fullføre individuell akklimatisering. (C) Antall oppføringer til venstre og høyre side er ikke forskjellig, noe som indikerer ingen iboende sidepreferanse før oppkjøpsstart. Vi rapporterer også totalt antall mark-studier under individuell akklimatisering. Verdier rapporteres som Mean ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Andelen fisk med høy ytelse og det første valget mellom all fisk og fisk med høy ytelse i løpet av de tre oppkjøpsdagene. (A) Høypresterende fisk flyttet fra sentralkammeret til den belønnede siden av kammeret i minst 6 av 8 forsøk hver oppkjøpsdag (A1–A3). (B) I løpet av tre dager med oppkjøpstrening (A1–A3) ble den totale startventetiden redusert; en trend også tydelig i høypresterende fisk (C). Verdier rapporteres som Mean ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Diskrimineringsresultater under oppkjøps- og reverseringsforsøk. (A) Diskrimineringsforhold (belønnede forsøk/(belønning + ikke-videresendte forsøk) av fisk på tvers av anskaffelsesdager (A1–A3) og (B) under reverseringslæring 8 uker senere. Reversering ble også vurdert i 3 dager (R1–R3). For begge oppgavene måtte hver fisk fullføre 8 forsøk, og resultatene presenteres i to prøveblokker (2, 4, 6, 8). Korrekte svar under både oppkjøp og reversering økte med tiden, med en raskere respons observert under reversering, noe som indikerer at fisken lærte og husket oppgaven. Verdier rapporteres som Gjennomsnittlig ± SEM. Den prikkete linjen representerer tilfeldigheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Anskaffelse og reversering av hyperglykemisk sebrafisk ved hjelp av 3-kammervalgets atferdsoppgave. (A) Før behandling fikk naiv sebrafisk 3-kammervalget atferdsoppgave over tre dager med atferdstrening (oppkjøp, A1–A3). Det var en signifikant forskjell mellom diskrimineringsforhold på A1 og A3 som indikerer at læring fant sted (p = 0,012). Etter 4 ukers behandling (fargede symboler) var det en betydelig effekt av behandling (p = 0,048), med glukosebehandlede dyr som viste betydelig reduserte diskrimineringsforhold sammenlignet med vannbehandlede dyr (p = 0,037). (B) I et eget eksperiment ble atferd før og etter 8 uker med hyperglykemi vurdert. Til tross for den stadige økningen i resultatene på tvers av hver oppkjøpsdag, var det ingen signifikante forskjeller i diskrimineringsforholdet på tvers av A1–A3. Men etter 8 ukers behandling (fargede symboler) var det en hovedeffekt av behandling (p < 0,001) og en individuell hovedeffekt av treningsdagen (p = 0,010). Post-hoc-analyser avdekket en signifikant forskjell mellom den vannbehandlede gruppen og både mannitol- og glukosebehandlede grupper, noe som tyder på en osmotisk effekt (vann v. mannitol: p = 0,008; vann v. glukose: p < 0,001). * betegner en betydelig hovedeffekt. Datapunkter representerer gruppegjennomsnitt ± SEM, og datapunkter med forskjellige bokstaver er vesentlig forskjellige fra hverandre. Den prikkete linjen representerer tilfeldigheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om det har vært enorm vekst i mengden og mangfoldet av nevrovitenskapsforskning utført ved hjelp av sebrafisk de siste 15 årene24, mangler atferdsanalyser i denne arten sammenlignet med pattedyrmodellsystemer11,25,26. Her viser vi at en trekammers valgoppgave utviklet for bruk med gnagere kan tilpasses for å vurdere oppkjøp og reversering av en visuell diskrimineringslæring i sebrafisk. Ved å bruke en levende shoal som belønning, ga denne oppgaven en robust analyse som kan brukes på en rekke studier som undersøker atferdsmessige koblede sykdommer som hyperglykemiske komplikasjoner av diabetes, Alzheimers og demens.
Det har tidligere blitt fastslått at sebrafisk er i stand til å lære og lagre informasjon, da det er nødvendig å ta økologisk relevante beslutninger og nødvendig for overlevelse i naturen3. Våre innsamlings- og reverseringsdata på tvers av en 8-ukers langsgående studie støtter tidligere bevis på at sebrafisk, mens den er liten, er i stand til å lære og huske en enkel diskrimineringsoppgave, og at sebrafisk også kan hemme tidligere ervervede svar. I den langsgående 8-ukers studien gikk antall tvangsbelønninger ned, og diskrimineringsgraden økte, noe som indikerer at fisken blir bedre til å velge riktig, belønnet side og har lært oppgaven. Selv om disse endringene ikke var signifikante, så vi en samlet nedadgående trend i antall tvangsbelønnede forsøk under oppkjøpet og en økning i diskrimineringsgraden. Videre avslørte resultatene av trekammervalgets atferdsoppgave med hyperglykemisk fisk testens anvendbarhet til studier som undersøkte hyperglykemiske forhold og indikerer at dette paradigmet kan brukes i kombinasjon med andre eksperimentelle manipulasjoner, for eksempel legemiddeleksponeringer eller mutantlinjer, for å vurdere potensielle effekter på kognisjon.
En viktig begrensning i denne studien er at vi ikke kan identifisere enkeltfisk over tid og derfor må stole på gruppegjennomsnitt for å vurdere dataene. Å utvikle en måte å individuelt spore fisk i de ulike behandlingsgruppene, som hos gnagere, kan løse disse problemene. I et forsøk på å løse disse forskjellene sorterte vi fisken i oppkjøpsfasen basert på deres ytelse, noe som viste seg å være en uventet fordel med vår metodikk. "Høypresterende fisk" scoret ≥ 6/8 på hver treningsdag, mens fisk med lavere score var "lavpresterende fisk". Når det telles hver dag, økte antallet "høye utøvere" i den shoal belønnede gruppen, slik at det etter dag 3 var betydelig mer fisk i denne kategorien sammenlignet med den fiskebelønnede behandlingen. Valgforsinkelsestrender observert på tvers av alle ('høye + lave utøvere') fisk ligner de som bare observeres i gruppen med høy ytelse, noe som tyder på at de sterke svarene fra denne gruppen førte til generelle svar.
Oppsummert indikerer disse funnene at shoalbasert diskrimineringslæring i sebrafisk gir en gjennomførbar kostnadseffektiv modell for studiet av normal og nedsatt kognitiv funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Sabrina Jones for hennes hjelp til å tilpasse en gnager tre-kammer valg paradigme til sebrafisk modellen og Jeremy Popowitz og Allison Murk for deres hjelp på atferd samling dager, hjelp med å kjøre forsøk, dyrepleie, og tank oppsett. Spesiell takk også til James M. Forbes (Maskiningeniør) for hans hjelp med 3-kammer valg tank design og konstruksjon.
Finansiering: VPC og TLD mottok et felles fakultetsstipend (FRSG) fra American University College of Arts and Sciences. CJR fikk støtte fra American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Champion Sports Stopwatch Timer Set: Waterproof, Handheld Digital Clock Sport Stopwatches with Large Display for Kids or Coach - Bright Colored 6 Pack | Amazon | N/A | https://www.amazon.com/Champion-Sports-910SET-Stopwatch-Timer/dp/B001CD9LJK/ref=sr_1_17?dchild=1&keywords=stopwatch+for+sports&qid=1597081570&sr=8-17 Recommend two of different colors; one for choice latency and one for time to completion |
| Coofficer Extra Large Binder Clips 2-Inch (24 Pack), Big Paper Clamps for Office Supplies, Black | Amazon | N/A | https://www.amazon.com/Coofficer-Binder-2-Inch-Clamps-Supplies/dp/B07C94YCR5/ref=sr_1_3_sspa?dchild=1&keywords=large+binder+clips&qid=1597081521&sr=8-3-spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVyPUExUENWUTRZVjlIWEVPJmVuY3J5cHRlZElkPUEwNDQ5NDU0MlpSREkwTFlLSThVQiZlbmNyeXB0ZWRBZElkPUEwMTg5NDI3MllRV1EzOUdWTVpSOCZ3aWRnZXROYW1lPXNwX2F0ZiZhY3Rpb249Y2xpY2tSZWRpcmVjdCZkb05vdExvZ0NsaWNrPXRydWU= |
| Marineland® Silicone Aquarium Sealant | Petsmart | Item #2431002 | |
| PVC (Polyvinyl Chloride) Sheet, Opaque Gray, Standard Tolerance, UL 94/ASTM D1784, 0.125" Thickness, 12" Width, 24" Length | Amazon | N/A | https://www.amazon.com/Polyvinyl-Chloride-Standard-Tolerance-Thickness/dp/B000MAMGEQ/ref=sr_1_2?dchild=1&keywords=grey+PVC+sheet&qid=1597081440&sr=8-2 |
| Steelworks 1/4-in W x 8-ft L Mill Finished Aluminum Weldable Trim U-shaped Channel | Lowes | Item #55979Model #11377 | https://www.lowes.com/pd/Steelworks-1-4-in-W-x-8-ft-L-Mill-Finished-Aluminum-Weldable-Trim-Channel/3058181 |
| Tetra 10 Gallon Fish tank | Petsmart | Item #5271256 | |
| Top Fin Fine Mesh Fish Net (3 in) | Petsmart | Item #5175115 |
References
- Gitler, A. D., Dhillon, P., Shorter, J. Neurodegenerative disease: models, mechanisms, and a new hope. Disease Models & Mechanisms. 10, 499-502 (2017).
- Perry, R. J., Watson, P., Hodges, J. R. The nature and staging of attention dysfunction in early (minimal and mild) Alzheimer's disease: relationship to episodic and semantic memory impairment. Neuropsychologia. 38, 252-271 (2000).
- Gerlai, R. Learning and memory in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 134, Elsevier Ltd. (2016).
- Davidson, T. L., et al. The effects of a high-energy diet on hippocampal-dependent discrimination performance and blood-brain barrier integrity differ for diet-induced obese and diet-resistant rats. Physiology and Behavior. 107, 26-33 (2012).
- Yang, M., Silverman, J. L., Crawley, J. N. Automated three-chambered social approach task for mice. Current Protocols in Neuroscience. 56 (1), (2011).
- Remmelink, E., Smit, A. B., Verhage, M., Loos, M. Measuring discrimination- and reversal learning in mouse models within 4 days and without prior food deprivation. Learning and Memory. 23, 660-667 (2016).
- Salas, C., et al. Neuropsychology of learning and memory in teleost fish. Zebrafish. 3, 157-171 (2006).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10, 70-86 (2013).
- Luchiaria, A. C., Salajanb, D. C., Gerlai, R. Acute and chronic alcohol administration: Effects on performance of zebrafish in a latent learning task. Behavior Brain Research. 282, 76-83 (2015).
- Fadool, J., Dowling, J. Zebrafish: A model system for the study of eye genetics. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 89-110 (2008).
- Fernandes, Y. M., Rampersad, M., Luchiari, A. C., Gerlai, R. Associative learning in the multichamber tank: A new learning paradigm for zebrafish. Behavioural Brain Research. 312, 279-284 (2016).
- Reider, M., Connaughton, V. P. Developmental exposure to methimazole increases anxiety behavior in zebrafish. Behavioral Neuroscience. , (2015).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
- May, Z., et al. Object recognition memory in zebrafish. Behavioural Brain Research. 296, 199-210 (2016).
- Mathur, P., Lau, B., Guo, S. Conditioned place preference behavior in zebrafish. Nature Protocols. 6, 338-345 (2011).
- Guo, S. Linking genes to brain, behavior and neurological diseases: What can we learn from zebrafish. Genes, Brain and Behavior. 3, 63-74 (2004).
- Kily, L. J. M., et al. Gene expression changes in a zebrafish model of drug dependency suggest conservation of neuro-adaptation pathways. Journal of Experimental Biology. 211, 1623-1634 (2008).
- Webb, K. J., et al. Zebrafish reward mutants reveal novel transcripts mediating the behavioral effects of amphetamine. Genome Biology. 10, (2009).
- Clayman, C. L., Malloy, E. J., Kearns, D. N., Connaughton, V. P. Differential behavioral effects of ethanol pre-exposure in male and female zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 335, 174-184 (2017).
- Ruhl, T., et al. Acute administration of THC impairs spatial but not associative memory function in zebrafish. Psychopharmacology. 231, 3829-3842 (2014).
- Gellermann, L. W. Chance orders of alternating stimuli in visual discrimination experiments. The Pedagogical Seminary and Journal of Genetic Psychology. 42, 206-208 (1933).
- Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44, 157-163 (2007).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13, 87-94 (2016).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: Zebrafish as a model system of human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 817341 (2012).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R., Court, P. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35, 63-75 (2014).
- Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in cell biology. 101, 249-270 (2011).
