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Neuroscience

सेरेब्रल कॉर्टेक्स क्षेत्रों की इलेक्ट्रोकॉर्टिकोग्राफिक रिकॉर्डिंग चूहों में कोफिलिन को लक्षित करने वाले एडेनो-एसोसिएटेड वायरस का उपयोग करके हेरफेर किया गया

Published: February 21, 2021 doi: 10.3791/61976
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Center for Advanced Research in Sleep Medicine, Recherche CIUSSS-NIM, 2GELIFES, University of Groningen, 3Department of Neuroscience, Université de Montréal

Summary

यह लेख एडेनो-संबद्ध वायरस का उपयोग करके सेरेब्रल कॉर्टेक्स में आणविक लक्ष्यों में हेरफेर के लिए और इलेक्ट्रोकॉर्टिकोग्राफिक रिकॉर्डिंग का उपयोग करके जागने और नींद के दौरान इस हेरफेर के प्रभावों की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Abstract

कृंतक में इलेक्ट्रोकॉर्टिकोग्राफिक (ईकोग) रिकॉर्डिंग का उपयोग नींद अनुसंधान और न्यूरोलॉजिकल स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के अध्ययन के लिए प्रासंगिक है। Adeno से जुड़े वायरस (AAVs) तेजी से मस्तिष्क सर्किट और उनके कार्यों की समझ में सुधार करने के लिए उपयोग किया जाता है । विशिष्ट कोशिका आबादी और/या सटीक आणविक घटकों के एएवी-मध्यस्थता हेरफेर नींद की हानि के प्रतिकूल प्रभावों में योगदान करने वाले नए स्लीप रेगुलेटरी सर्किट/अणुओं और प्रमुख प्रोटीन की पहचान करने के लिए काफी उपयोगी रहा है । उदाहरण के लिए, एएवी का उपयोग करके फिलामेंटस ऐक्टिन-ब्रेकिंग प्रोटीन कोफिलिन की गतिविधि को बाधित करना नींद के अभाव-प्रेरित स्मृति हानि को रोकता है। यहां, एक प्रोटोकॉल वर्णित है जो ईकोग गतिविधि की रिकॉर्डिंग के साथ सेरेब्रल कॉर्टेक्स क्षेत्र में कोफिलिन फ़ंक्शन के हेरफेर को जोड़ती है ताकि यह जांच की जा सके कि कॉर्टिकल कोफिलिन जागना और नींद ईकॉग संकेतों को संशोधित करता है या नहीं। एएवी इंजेक्शन वयस्क पुरुष और मादा चूहों में ईकॉग और इलेक्ट्रोमायोग्राफिक (ईएमजी) इलेक्ट्रोड के प्रत्यारोपण के रूप में एक ही शल्य प्रक्रिया के दौरान किया जाता है। चूहों को एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है, और उनके सिर मुंडा दिए जाते हैं। त्वचा की सफाई और चीरा के बाद, मोटर कॉर्टेक्स के स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक निर्धारित किए जाते हैं, और खोपड़ी को इस स्थान पर छेदा जाता है। कोफिलिन का एक निष्क्रिय रूप, कोफिलिनकाएक निष्क्रिय रूप, एएवी व्यक्त करने वाले एएवी के साथ एक कैनुला धीरे-धीरे कॉर्टिकल ऊतक में तैनात होता है। AAV जलसेक के बाद, सोने से ढके शिकंजा (ECoG इलेक्ट्रोड) खोपड़ी के माध्यम से खराब कर रहे है और सोने की गर्दन की मांसपेशियों (EMG इलेक्ट्रोड) में डाला तारों के साथ खोपड़ी को मजबूत । जानवरों को ठीक होने और कोफिलिनS3Dकी पर्याप्त अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए तीन सप्ताह की अनुमति है । संक्रमित क्षेत्र और सेल प्रकार इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके सत्यापित किए जाते हैं, और ईपीओजी का विश्लेषण सतर्कता राज्यों और स्पेक्ट्रल विश्लेषण की दृश्य पहचान का उपयोग करके किया जाता है। संक्षेप में, यह संयुक्त पद्धतिगत दृष्टिकोण अणुकार्य आकृति विज्ञान और जागना और नींद के दौरान सिंक्रोनाइज्ड सेरेब्रल कॉर्टेक्स गतिविधि के नियमन के लिए कनेक्टिविटी को विनियमित करने वाले आणविक घटकों के सटीक योगदान की जांच की अनुमति देता है।

Introduction

इलेक्ट्रोएन्सेफेलोग्राफिक (या आम तौर पर इलेक्ट्रोकॉर्टिकोग्राफिक [ईकोग] कृंतक में) और इलेक्ट्रोमायोग्राफिक (ईएमजी) रिकॉर्डिंग का बड़े पैमाने पर नींद अनुसंधान के साथ-साथ तंत्रिका विज्ञान, न्यूरोलॉजी और मनोरोग में अधिक व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। संयोजन में, ये इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सिग्नल सतर्कता राज्यों की पहचान और मनुष्यों और कृंतक दोनों1,2,3,4 दोनों में राज्य अवधि और स्पेक्ट्रल संरचना के बाद के मात्राकरण के लिए अनुमतिदेतेहैं। इस तरह की मात्रा यह समझने के लिए उपयोगी रही है कि न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों और मॉडल 5 , 6,7या आनुवंशिक संशोधन 8,9जैसी रोग स्थितियों में नींद को कैसे संशोधित कियाजाताहै । उदाहरण के लिए, न्यूरोनल संचार से जुड़े विभिन्न जीनों के नॉकआउट (KO) को माउस और फल फ्लाई10, 11, 12, 13दोनों में जागने और नींद की अवधि को बदलने के लिए दिखाया गया था। कृंतक में पूर्ण शरीर KO के अध्ययन से उत्पन्न होने वाले संभावित विकासात्मक मुआवजे से निपटने के लिए और आनुवंशिक हेरफेर के महीन नियंत्रण के लिए अनुमति देने के लिए, जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने का एक कुशल तरीका एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) का उपयोग करना है। एक एएवी-मध्यस्थता आनुवंशिक हेरफेर का उपयोग किसी दिए गए आणविक लक्ष्य को कम करने या अपरेगुलेट करने और विभिन्न प्रकार के प्रवर्तकों का उपयोग करके एक विशिष्ट कोशिकाआबादीतक हेरफेर को सीमित करने के लिए किया जा सकता है। एएवी का उपयोग क्लस्टर में डिलीवरी विधि के रूप में भी बड़े पैमाने पर किया जाता है, नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR)/Cas9 प्रौद्योगिकी15,16। ये पद्धतियां आनुवंशिक हेरफेर के बेहतर लौकिक और स्थानिक नियंत्रण के लिए अनुमति देती हैं, जो आम तौर पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके संक्रमित क्षेत्र के परिमाणीकरण की अनुमति देने वाले रिपोर्टर की अभिव्यक्ति से जुड़ी होती है।

एएवी ऑप्टोजेनेटिक्स और केमोजेनेटिक्स17, 18, 19के माध्यम से न्यूरोनल गतिविधि के सेल प्रकार-विशिष्ट जोड़तोड़ के लिए मुख्य वेक्टर का भी प्रतिनिधित्व करते हैं, जिनका हाल के शोध में न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों, व्यवहार, अनुभूति और नींद20,21,22पर व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। नींद अनुसंधान में, कुछ मस्तिष्क क्षेत्रों की सक्रियता या अवरोध के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स का अनुप्रयोग, जैसे बेसल फोरेब्रेशन, हाइपोथैलेमस, और सबलेट्रोडोर्सल टेगमेंटम, उत्तेजना, धीमी लहर की नींद (जिसे गैर-रैपिड आई मूवमेंट स्लीप के रूप में भी जाना जाता है), विरोधाभासी नींद (या रैपिड आई मूवमेंट स्लीप), और कैटप्लेक्सी23,और कैटप्लेक्सी 23, और कैटप्लेक्सी 23, और कैटप्लेक्सी 23, कैटेप्लेक्सी के नियंत्रण में उनकी भूमिकाओं को निर्धारित करने के लिए उपयोगी रहाहै। 24,25. इसके अलावा , एएवी-मध्यस्थता जोड़तोड़ ने महत्वपूर्ण नींद नियामक सर्किट और अणुओं को स्पष्ट करने में मदद की है जो नींद की हानि26,27, 28के प्रतिकूल प्रभावों में योगदानदेतेहैं। उदाहरण के लिए, नींद के अभाव-प्रेरित स्मृति हानि में फंसाया जाने वाला एक प्रोटीन कोफिलिन29,30है। यह प्रोटीन एक तंतुपात्मक ऐक्टिविन-ब्रेकिंग प्रोटीन है जो ऐक्टिन फिलामेंट्स के पुनर्गठन में शारीरिक रूप से बाध्यकारी होकर और तंतुओं के विघटन को गतिशीलतरीकेसे बढ़ावा देता है । एएवी-मध्यस्थता दृष्टिकोण का उपयोग करके कोफिलिन गतिविधि को बाधित करने के लिए रीढ़ की हड्डी की हानि के साथ-साथ चूहों29में नींद के अभाव से प्रेरित सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी और स्मृति घाटे को रोकने के लिए दिखाया गया था। सामूहिक रूप से, ये अध्ययन नींद विनियमन और कृंतक में नींद के अभाव के परिणामों को समझने के लिए एएवी-मध्यस्थता जोड़तोड़ की उपयोगिता और प्रासंगिकता पर जोर देते हैं।

यहां, एक प्रोटोकॉल वर्णित है कि एएवी का उपयोग करके जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों के सेरेब्रल कॉर्टेक्स क्षेत्र में कोफिलिन फ़ंक्शन के हेरफेर के साथ ईकॉग और ईएमजी इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण और रिकॉर्डिंग को जोड़ती है। अधिक सटीक रूप से, माउस कोफिलिन (कोफिलिनएस3 डी)के फॉस्फोरमेटिक रूप के कोडिंग अनुक्रम को व्यक्त करने वाला एएवी (सीरोटाइप 9), इसे निष्क्रिय32, 33प्रदान करता है, मोटर कॉर्टेक्स (एम 1 और एम 2) में इंजेक्ट कियाजाताहै। संक्रमित कोशिकाओं की समकालिक कॉर्टिकल गतिविधि की रिकॉर्डिंग सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन साइट पर सीधे एक ईकोग इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपित किया जाता है। ECoG/EMG रिकॉर्डिंग सर्जरी, अनुकूलन, और उच्च cofilinS3D अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देने के लिए सर्जरी के तीन सप्ताह बाद अबाधित परिस्थितियों में 24 घंटे के लिए आयोजित किया जाता है । इसके बाद रिकॉर्डिंग का उपयोग सतर्कता राज्यों और ईकोग स्पेक्ट्रल विश्लेषण की पहचान के लिए किया जाता है, जैसा कि पिछले अध्ययनों में वर्णितहै 11,34। यह पद्धति विशेष रूप से प्रकट कर सकती है कि चूहों में कॉर्टिकल कोफिलिन जागने और स्लीप ईकॉग संकेतों को कैसे संशोधित करता है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग और एएवी-मध्यस्थता आनुवंशिक हेरफेर का यह संयोजन विशेष रूप से विशिष्ट मस्तिष्क कार्यों में विभिन्न आणविक तत्वों की भूमिकाओं की जांच करने के लिए प्रासंगिक है और इसे डब्ल्यूटीई में रुचि के कॉर्टिकल (और उपकॉर्टिकल) मस्तिष्क क्षेत्र (एस) पर लागू किया जा सकता है और दोनों लिंगों और यहां तक कि अन्य प्रजातियों के आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों।

Protocol

सभी तरीकों को कॉमिटे डी एथिक डी एल एक्सपेरिमेंटेशन एनिमल ऑफ रेचेचे सीआईयूएसएस-एनआईएम द्वारा अनुमोदित किया गया था और यह एनिमल केयर पर कनाडाई परिषद के दिशानिर्देशों के अनुसार है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अभिकर् स, उपकरण और सामग्रियों के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. सर्जरी की तैयारी

  1. ईकॉग और ईएमजी इलेक्ट्रोड की तैयारी
    1. प्रत्येक जानवर के लिए, तीन ईकोग इलेक्ट्रोड तैयार करें: सोल्डरिंग लोहे का उपयोग करके, सोने से ढके स्क्रू की स्क्रू कैप पर सीसा मुक्त मिलाप की एक छोटी बूंद रखें, और मिलाप को लीड-फ्री सोल्डर(चित्रा 1A)का उपयोग करके स्क्रू कैप के शीर्ष पर 4 मिमी लंबा, 0.2 मिमी व्यास का सोने का तार (गैर-अछूता) रखें। सीधे सोने के तार के साथ 2 इलेक्ट्रोड तैयार करें, और ऊर्ध्वाधर से 45 डिग्री कोण के साथ एक।
    2. प्रत्येक जानवर के लिए, दो ईएमजी इलेक्ट्रोड तैयार करें: एक 0.2 मिमी व्यास के सोने के तार को 1.5 सेमी की लंबाई और दूसरे से 2 सेमी तक काटें। इन के लिए दोनों तारों वक्र गर्दन की मांसपेशियों तक खोपड़ी के वक्र गले लगाने के लिए, एक सीधा अंत है कि कनेक्टर(चित्रा 1B)को मिलाप किया जाएगा रखते हुए ।
    3. प्रत्येक जानवर के लिए, एक कनेक्टर तैयार करें: 6-चैनल कनेक्टर (5 मिमी x 8 मिमी x 8 मिमी + 3 मिमी धातु पिन) का उपयोग करें, और 6 धातु पिनों में से 5 में लीड-फ्री मिलाप जोड़ें (एक मध्य पिन को छोड़ दें; चित्रा 1C)। कूड़े या पानी की घुसपैठ से बचने के लिए टेप के साथ कनेक्टर के शीर्ष को कवर करें।
  2. एएवी और सिरिंज पंप की तैयारी
    1. स्टॉक AAV मिक्स(es)(यहां, AAV 9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA)और/या नियंत्रण AAV (यहां, AAV 9-CaMKIIα0.4-eGFP) तैयार करें । एएवी फॉस्फेट-बफर खारा के समाधान में गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट [0.001%]) के साथ वांछित वायरल टाइटर (आम तौर पर 1012-13 जीनोम प्रतियां [जीसी]/एमएल) प्राप्त करने के लिए बाँझ खारा और चूहों की संख्या के इलाज के लिए आवश्यक मात्रा प्राप्त करने के लिए।
      नोट: प्रति माउस कॉर्टिकल क्षेत्र में 1 माइक्रोन की इंजेक्ट की गई मात्रा के लिए 2 माइक्रोन की तैयारी की आवश्यकता होती है।
    2. एक सिरिंज पंप के लिए एक 10 माइक्रोन सिरिंज फिक्स और आसुत पानी के साथ इसे भरने ।
    3. 1 एमएल सिरिंज और 21 जी सुई का उपयोग करके आसुत पानी के साथ लगभग 60-सेमी लंबाई की एक PE50 ट्यूब भरें। महत्वपूर्ण बात, भरने के बाद जगह में 21G सुई और सिरिंज छोड़ दें । सिरिंज पंप के साथ PE50 ट्यूब कनेक्ट; PE50 ट्यूब के एक छोर पर 21 जी सुई/सिरिंज छोड़ दो, और 10 μL सिरिंज के लिए दूसरे छोर कनेक्ट ।
    4. एक बार ट्यूब 10 माइक्रोन सिरिंज के लिए तय हो गया है, दूसरे छोर पर सुई को हटा दें, और पानी के साथ सुई से छोड़ दिया अंतर को भरने के लिए 10 μL सिरिंज के पिस्टन धक्का ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि कोई हवा बुलबुला नहीं है, और ट्यूब पूरी तरह से पानी से भर गया है।
    5. ट्यूब के अंत में 28 जी कैनुला स्थापित करें जहां सुई हटा दी गई थी। इसे पूरी तरह से भरने के लिए 10 माइक्रोन सिरिंज के साथ कैनुला में पानी पुश करें। कैनुला को स्टीरियोटैक्सिक आर्म में कसकर ठीक करें।
  3. जानवरों की तैयारी
    नोट: C57BL6/J पुरुष और महिला चूहों ~ 12 सप्ताह की उम्र के पहले व्यक्तिगत पिंजरों में आवास के लिए और एक 12-h प्रकाश के लिए कम से 2 सप्ताह के लिए अनुकूलित किया गया: 12-विज्ञापन libitum भोजन और पानी और एक लकड़ी के घन के लिए उपयोग के साथ एच अंधेरे चक्र ।
    1. ध्यान से चूहों का वजन, और इंट्रापेरिटोनली संज्ञाहरण के लिए केटामाइन/जाइलाज़ीन (120/10 मिलीग्राम/किलो) का मिश्रण इंजेक्ट करें । गहरी संज्ञाहरण के लिए लगभग 10 मिनट रुको।
    2. बाल ट्रिमर का उपयोग करके आंखों के बीच कान के पीछे से सिर के सामने तक बालों को शेव करें।
      नोट: मूंछ (शेविंग के दौरान एक उंगली के साथ मूंछ की रक्षा) के रूप में मूंछ ट्रिमिंग संवेदी आदानों और ECoG गतिविधि३५,३६को संशोधित करेगा नहीं करने के लिए बहुत सावधान रहें ।
    3. निर्जलीकरण को रोकने के लिए प्रत्येक आंख पर नेत्र मरहम की एक उदार बूंद जोड़ें। हिंद पंजा से पैर की अंगुली को चुटकी बजाकर प्रक्रिया के दौरान नियमित रूप से संज्ञाहरण की गहराई को सत्यापित करें। यदि एक पंजा चुटकी पलटा दिखाई देता है तो गहरी संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए माउस को 0.5-1.5% आइसोफ्लारेन के साथ प्रदान करें।

2. एक सिरिंज पंप के साथ इंट्रासोर्टिकल एएवी इंजेक्शन

नोट: निष्फल उपकरणों के साथ और एक स्वच्छ वातावरण में सभी निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें। सर्जरी शुरू करने से पहले निष्फल उपकरणों को आगे धोने और धारा 1.1 में तैयार इलेक्ट्रोड को धोने के साथ-साथ एंकर शिकंजा (गैर-सोने से ढके शिकंजा) को धोने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें।

  1. कान की सलाखों के साथ स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर माउस के सिर को सावधानी से ठीक करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सिर पार्श्व रूप से नहीं चल रहा है।
  2. घुटन से बचने के लिए जानवर की जीभ को धीरे-धीरे मुंह से बाहर खींचें, और स्टीरियोटैक्सिक एडाप्टर के साथ माउस की नाक को ठीक करें।
    नोट: प्रक्रिया के दौरान अक्सर सांस लेने की निगरानी करें।
  3. 70% इथेनॉल के साथ सिर के मुंडा क्षेत्र को स्टरलाइज करें और त्वचा को अतिरिक्त ठीक ग्रीफे संदंश के साथ पकड़कर, त्वचा को कान के आधार से ऊतक कैंची के साथ आंखों के स्तर तक काटें। त्वचा को फैलाने और खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए चार सर्जिकल क्लैंप का उपयोग करें (चीरा के प्रत्येक पक्ष पर दो; चित्रा 1Dदेखें)।
  4. एक तेज कैंची टिप के साथ खोपड़ी की सतह खरोंच: हड्डी टांके से बचने के दौरान, पेरिओस्टियम को हटा दें और दो या अधिक दिशाओं में ओवरलैपिंग धारियां बनाएं। हड्डी के टुकड़ों को हटा दें, और खोपड़ी को 70% इथेनॉल के साथ सुखाएं।
    नोट: खरोंच और लकीर खोपड़ी के लिए सीमेंट के पालन में सुधार के द्वारा रिकॉर्डिंग असेंबल और अधिक मजबूत बनाने में मदद मिलेगी (नीचे देखें) ।
  5. स्टीरियोटैक्सिक आर्म में तय कैनुला के साथ, ब्रेग्मा के स्थान की पहचान करें (यानी, खोपड़ी कोरोनल और सगिटल टांके के बीच का चौराहा; चित्रा 1D) और लैम्ब्डा (यानी, खोपड़ी के बीच का चौराहा सागिटल सीवन और बाईं और दाईं ओर लैम्ब्डॉयड सीवन को जोड़ने वाली एक सीधी रेखा; चित्रा 1D),और प्रत्येक के स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक ध्यान दें। यदि ब्रेग्मा और लैम्ब्डा के जेड निर्देशांक (ऊर्ध्वाधर धुरी) के बीच का अंतर 0.3 मिमी से अधिक है, तो स्टीरियोटैक्सिक एडाप्टर का उपयोग करके नाक की ऊंचाई को समायोजित करें जब तक कि ब्रेग्मा और लैम्ब्डा की जेड स्थिति गठबंधन न हो जाए।
  6. इन निर्देशांक (मोटर कॉर्टेक्स) पर एक कलम के साथ खोपड़ी पर कैनुला की स्थिति को चिह्नित करें: मिडलाइन के लिए 1.5 मिमी पार्श्व अधिकार और ब्रेग्मा के लिए 1.5 मिमी पूर्वकाल। ध्यान से खोपड़ी की सतह (ऊर्ध्वाधर धुरी के साथ गठबंधन) के लिए एक दिशा लंबवत में 0.7 मिमी ड्रिल बिट के साथ कैनुला की स्थिति में खोपड़ी छेदना। छेदित खोपड़ी को 10% प्रोविडोन-आयोडीन समाधान के साथ गर्भवती बाँझ कपास टिप के साथ धोएं।
  7. 10 माइक्रोन सिरिंज पिस्टन को 1 माइक्रोन द्वारा वापस खींचकर 1 माइक्रोन एयर बबल के साथ कैनुला लोड करें। टेस्ट AAV लोड (यहां AAV 9-CaMKIIα0.4-CofilinS3D-HA)या नियंत्रण AAV (यहां AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP)पहले हवा बुलबुले के साथ भरी हुई कैनुला में: धीरे से ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा AAV मिश्रण, एक बाँझ पेट्री डिश पर पिपेट 1.7 माइक्रोन, और धीरे-धीरे 10 माइक्रोन सिरिंज के पिस्टन खींचकर कैनुला में समाधान के 1.5 माइक्रोन को एस्पिरेट करें। इंजेक्शन की ट्रैकिंग की अनुमति देने के लिए PE50 ट्यूब पर हवा के बुलबुले की स्थिति को चिह्नित करें।
  8. खोपड़ी (यानी खोपड़ी की सतह) के ऊपरी किनारे तक पहुंचने के लिए कैनुला की ऊर्ध्वाधर स्थिति के लिए खोपड़ी पर छेद के साथ कैनुला को संरेखित करें। खोपड़ी की सतह से, धीरे-धीरे कैनुला को 1.5 मिमी से कम करें (खोपड़ी की सतह और मोटर कॉर्टेक्स की परत वी के नीचे 1.5 मिमी तक पहुंचने के लिए)।
    नोट: मस्तिष्क के ऊतकों के अनावश्यक घाव से बचने के लिए कैनुला को बहुत कम न करें।
  9. 40 मिनट के दौरान एएवी के 1 माइक्रोन इंजेक्ट करने के लिए सिरिंज पंप शुरू करें (ऊतक क्षति को कम करने के लिए गति: 0.025 μL/ हवा बुलबुले के आंदोलन के साथ PE50 ट्यूब पर इंजेक्शन का ट्रैक रखें, और यदि आवश्यक हो तो समायोजन करें।
  10. इंजेक्शन पूरा होने के बाद, पर्याप्त प्रसार सुनिश्चित करने और बैकफ्लो से बचने के लिए कैनुला को 5 मिनट के लिए छोड़ दें। फिर, धीरे-धीरे और ध्यान से कॉर्टेक्स से कैनुला को हटाने के लिए स्टीरियोटैक्सिक आर्म उठाएं।

3. ईकॉग/ईएमजी इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण

  1. सीधे केली संदंश का उपयोग करना, धीरे-धीरे ऊर्ध्वाधर धुरी में एक ईकोग इलेक्ट्रोड (सीधे सोने के तार के साथ) पेंच (एक ही कोण है कि छेद छेद छेद था) छेद में जहां AAV इंजेक्शन था। डुरा और सेरेब्रल कॉर्टेक्स (यानी, खोपड़ी की सतह से 1.1 मिमी की अनुमानित गहराई के लिए) को नुकसान को कम करने के लिए खोपड़ी से कम से कम 2.5 मिमी स्क्रू छोड़ दें; चित्रा 1D)।
  2. इन निर्देशांकों पर एक कलम के साथ खोपड़ी पर पीछे ईकोग इलेक्ट्रोड और संदर्भ इलेक्ट्रोड की स्थिति को चिह्नित करें: पीछे इलेक्ट्रोड (दृश्य प्रांतस्था) मिडलाइन के लिए 1.5 मिमी पार्श्व अधिकार और लैम्ब्डा, संदर्भ इलेक्ट्रोड (सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स) 2.6 मिमी पार्श्व दाईं ओर मिडलाइन और 0.7 मिमी पीछे के पूर्व में ब्रेग्मा। इसके अलावा, कोई विशिष्ट निर्देशांक के साथ बाएं गोलार्द्ध पर तीन रखरखाव शिकंजा (सिर असेंबल जमना करने के लिए खोपड़ी और दंत सीमेंट के बीच लंगर के रूप में अभिनय) की स्थिति को चिह्नित करें, लेकिन एक दूसरे से और ईकॉग इलेक्ट्रोड से जितना संभव हो सके उतना दूर।
  3. ध्यान से 0.7 मिमी ड्रिल बिट के साथ अन्य इलेक्ट्रोड और एंकर शिकंजा की चिह्नित स्थिति में खोपड़ी छेदा। प्रत्येक पेंच के लिए खोपड़ी की सतह के लंबवत दिशा में पियर्स (यानी, पीछे के इलेक्ट्रोड के लिए ऊर्ध्वाधर धुरी लेकिन अन्य साइटों के लिए ऊर्ध्वाधर धुरी से एक कोण के साथ)। छेदित खोपड़ी को 10% प्रोविडोन-आयोडीन समाधान के साथ धोएं, और रक्तस्राव और संदूषण को रोकने के लिए शिकंजा स्थापित करने से पहले नाजुक कार्य वाइपर के छोटे, लुढ़का टुकड़ों के साथ छेद को अवरुद्ध करें।
  4. सीधे केली संदंश का उपयोग करना, बाएं गोलार्द्ध में रखरखाव शिकंजा पेंच और फिर सही गोलार्द्ध में पिछले दो इलेक्ट्रोड पेंच । एक ही कोण है कि छेद छेद थे और खोपड़ी(चित्रा 1D)से बाहर प्रत्येक पेंच के कम से कम 2.5 मिमी छोड़ने के लिए पेंच के साथ पेंच करने के लिए सुनिश्चित करें।
    नोट: अंतिम असेंबल की दृढ़ता और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल संकेतों की गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए, सावधान रहें कि अगले एक को स्थापित करते समय किसी भी पेंच को न छुएं।
  5. शिकंजा के अंदर अंगूठी की तरह अंतरिक्ष के केंद्र में दंत सीमेंट की कुछ छोटी बूंदें रखें। डुमोंट #5 संदंश का उपयोग करके घुमावदार छोर को पकड़कर और अतिरिक्त-ठीक ग्रीफे संदंश के साथ मांसपेशियों के ऊपर त्वचा को उठाने के द्वारा गर्दन की मांसपेशियों में लगभग 1-2 मिमी ईएमजी इलेक्ट्रोड (चरण 1.1.2 पर तैयार) के घुमावदार अंत डालें। फिर, इलेक्ट्रोड की घुमावदार ओर और कोहनी को दंत सीमेंट में रखें; दूसरे ईएमजी इलेक्ट्रोड के लिए दोहराएं।
    नोट: लंबे ईएमजी इलेक्ट्रोड के सीधे अंत को पूर्वकाल ईकोग इलेक्ट्रोड और पीछे के ईकोग इलेक्ट्रोड के साथ छोटे ईएमजी इलेक्ट्रोड के साथ गठबंधन किया जाना चाहिए। सुनिश्चित करें कि दो ईएमजी इलेक्ट्रोड एक दूसरे या शिकंजा के किसी भी छू नहीं रहे हैं।
  6. चूहों की आंखों को कवर करें, और सीमेंट जमना में मदद करने के लिए 3-5 मिनट के लिए प्रकाश लागू करें। एक बार ईएमजी इलेक्ट्रोड मजबूती से पकड़ रहे हैं, ECoG इलेक्ट्रोड के आधार और दंत सीमेंट के साथ लंगर शिकंजा के आधार को कवर करने के लिए एक मुकुट के आकार का समोच्च फार्म । चूहों की आंखों को कवर करें, और सीमेंट जमना में मदद करने के लिए 3-5 मिनट के लिए प्रकाश लागू करें।
    नोट: ईकॉग और ईएमजी इलेक्ट्रोड चरम पर सीमेंट न लगाएं (सोने के तार जो कनेक्टर को मिलाप किया जाएगा) या त्वचा पर।
  7. पहले मिश्रित ऐक्रेलिक सीमेंट के साथ असेंबल के केंद्र को भरें। सीमेंट ठोसकरण के दौरान, त्वचा को पकड़े हुए चार सर्जिकल क्लैंप को हटा दें (और इन्हें तुरंत नाजुक कार्य वाइपर के साथ धोएं)।
    नोट: ईकॉग और ईएमजी इलेक्ट्रोड चरम पर सीमेंट न लगाएं (सोने के तार जो कनेक्टर को मिलाप किया जाएगा) या त्वचा पर।
  8. एक सीवन सुई (13 मिमी 3/8 सी) और सिंथेटिक अवशोषित मोनोफिलमेंट का उपयोग करके खोपड़ी को उजागर नहीं किया जाता है (लेकिन त्वचा को बहुत अधिक खींचने से बचें) पीठ पर त्वचा को सीवन करें।
  9. घुमावदार संदंश के साथ असेंबल के ऊपर कनेक्टर पकड़ो, और ध्यान से कनेक्टर पिन के साथ इलेक्ट्रोड के सोने के तार संरेखित करें। सोल्डर इलेक्ट्रोड टांका लोहे के साथ कनेक्टर पिन करने के लिए हाथ।
    नोट: कॉर्टिकल ऊतक को ओवरहीटिंग और नुकसान से बचने के लिए जल्दी से आगे बढ़ें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक इलेक्ट्रोड संबंधित कनेक्टर पिन के साथ अच्छा संपर्क करता है, और इलेक्ट्रोड एक दूसरे से जुड़े नहीं हैं।
  10. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से माउस निकालें। इलेक्ट्रोड और कनेक्टर पिन के बीच सभी कनेक्शन को कवर करके पहले मिश्रित ऐक्रेलिक सीमेंट के साथ कनेक्टर और सिर के बीच खाली जगह को कवर करें।
    नोट: सिर के ऊपर कनेक्टर के साथ माउस पकड़ कर कनेक्टर के अंदर सीमेंट घुसपैठ से बचें (सिर सीधे झुकाव नहीं) ।
  11. माउस का वजन करें और इसे एक साफ पिंजरे में रखें (अधिमानतः एक गैर-मेशेड ढक्कन से लैस) एक हीट पैड पर (सिर असेंबल को नुकसान से बचने के लिए व्यक्तिगत आवास)। नियमित रूप से जानवर की निगरानी करें, और जागृति पर 0.1 मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन का संचालन करें, और 12 घंटे बाद में यदि जानवर दर्द के लक्षण दिखाता है (उदाहरण के लिए, असामान्य मुद्रा, भेंगा हुआ आंखें)।
    नोट: पूर्व सर्जरी वजन के सापेक्ष वजन 1.5 ग्राम से अधिक नहीं होना चाहिए।

4. रिकॉर्डिंग

  1. घर चूहों व्यक्तिगत रूप से आपसी संवारने के साथ ही नुकसान और रिकॉर्डिंग केबल की उलझन का एक परिणाम के रूप में सिर असेंबल को नुकसान से बचने के लिए ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, चूहों को भोजन, पानी और लकड़ी के घन तक विज्ञापन लिबिटम पहुंच के साथ रखे गए थे, और दैनिक निगरानी आयोजित की गई थी।
  2. केबलिंग की स्थिति के अनुकूलन के लिए सर्जरी के 2 सप्ताह बाद केबल रिकॉर्डिंग केबल के लिए चूहों को कनेक्ट करें।
  3. रिकॉर्ड ECoG/EMG 24 घंटे के लिए संकेत (या अधिक/अनुसंधान प्रश्नों के आधार पर कम) ।
    नोट: ECoG/EMG सिग्नल रिकॉर्डिंग एक केबल, एक कुंडा कनेक्टर (केबल के रोटेशन की अनुमति के लिए), एक ३६ चैनल पहनने योग्य बॉक्स, और एक एम्पलीफायर, जो एक कंप्यूटर से जुड़ा हुआ था का उपयोग कर पूरा किया गया था । सिग्नल 256 हर्ट्ज (या अधिक अनुसंधान प्रश्नों के आधार पर) पर नमूना और वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर के साथ दर्ज की जाती है (सामग्री की तालिकादेखें)। पर्याप्त वायरल अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए, एएवी इंजेक्शन के कम से कम 3 सप्ताह बाद प्रयोग किए जाने चाहिए, जैसा कि पहले29,37वर्णित है।
  4. रिकॉर्डिंग के बाद, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था (या इम्यूनोदाता प्रोटोकॉल के आधार पर अन्य तरीकों) द्वारा चूहों का बलिदान करें, और इम्यूनोदाते हुए मस्तिष्क को फसल दें।

Representative Results

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के बाद, इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग एएवी इंजेक्शन से संक्रमित क्षेत्र को परिभाषित करने और कोफिलिनS3D (चित्रा 2)की अभिव्यक्ति को मान्य करने के लिए किया जाता है। इम्यूनोदाता को पहले 29 , 37,38,39वर्णित पद्धति के समान कार्यप्रणाली का उपयोग करके किया जासकताहै । एएवी एक हेमेग्लूटिनिन (एचए) -टैग (कोफिलिनS3D-HA)के साथ जुड़े कोफिलिन के एक निष्क्रिय रूप को व्यक्त करता है, जिसका पता एंटी-एचए एंटीबॉडी और एक माध्यमिक एंटीबॉडी (एलेक्सा फ्लोर 488) का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा लगाया जाता है। संक्रमित उत्तेजक न्यूरॉन्स (यहां, कैल्शियम/calmodulin-निर्भर प्रोटीन kinase द्वितीय अल्फा[CamKIIα]प्रमोटर AAV में निहित ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के साथ लक्षित) विरोधी हा एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं । एक सफल संक्रमण इंजेक्शन साइट(चित्रा 2A,बी)के आसपास के मोटर कॉर्टेक्स में न्यूरॉन्स के धुंधला द्वारा इंगित किया जाता है। इस प्रतिनिधि उदाहरण में, दूसरे गोलार्द्ध के सेरेब्रल कॉर्टेक्स में कोई ध्यान देने योग्य धुंधला नहीं दिखा। बहरहाल, यह देखते हुए कि उत्तेजक न्यूरॉन्स दूर मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए परियोजना कर सकते हैं, contralateral गोलार्द्ध में धुंधला जरूरी असफल इंजेक्शन का एक संकेत नहीं है । संक्रमित क्षेत्र के उच्च आवर्धन ने कोशिका निकायों और अनुमानों को धुंधला दिखाया, इस बात की पुष्टि करते हुए कि लक्षित कॉर्टिकल क्षेत्र की केवल विशिष्ट कोशिकाएं संक्रमित थीं(चित्रा 2 सी)।

उत्तेजक न्यूरॉन्स के मार्कर के साथ सह-धुंधला (उदाहरण के लिए, वेसिकुलर ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 1, CaMKIIα) भी सेल प्रकार-विशिष्टता को मान्य करने के लिए किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इन कोशिकाओं को विभिन्न प्रमोटरों का उपयोग करके लक्षित किए जाने की स्थिति में निरोधात्मक न्यूरॉन्स या एस्ट्रोसाइट्स के मार्कर के साथ सह-धुंधला किया जा सकता है। कोफिलिनS3D-HAऔर CaMKIIα के सह-धुंधला भी इंजेक्शन साइट है कि अभी भी मोटरप्रांतस्था (चित्रा 2 डी)में विरोधी हा धुंधला दिखाया करने के लिए एक क्षेत्र के लिए एक ही जानवर में प्रदर्शन किया गया था । क्षेत्र की उच्च आवर्धन छवि कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से कोफिलिनS3D-HA(एलेक्सा फ्लोर 488, चित्रा 2E)और CaMKIIα (एलेक्सा फ्लोर 568, चित्रा 2F)व्यक्त करती है। कोफिलिनS3D-HAऔर CaMKIIα धुंधला के अधिस्थिति से पता चलता है कि सबसे (नहीं तो सभी) cofilinS3D-HAके लिए दाग कोशिकाओं CaMKIIα(चित्रा 2G)के लिए भी सकारात्मक हैं । यह अवलोकन उत्तेजक न्यूरॉन्स के लिए संक्रमण की विशिष्टता का समर्थन करता है।

ECoG गतिविधि पर कोफिलिन हेरफेर के प्रभाव का आकलन करने के लिए, ECoG और ईएमजी संकेतों का उपयोग सतर्कता राज्यों (जागना, धीमी लहर नींद, विरोधाभासी नींद) की एक दृश्य पहचान करने के लिए किया जाता है। माउस 2 में सतर्कता स्थिति में तेजी से परिवर्तन के कारण यह 4-एस युगों पर कियाजाताहै, और यहां, पूर्ण 24-एच रिकॉर्डिंग के लिए। मानक विश्लेषणों में नींद वास्तुकला और स्पेक्ट्रल विश्लेषण चर की गणना शामिल है, जैसा कि पहले विभिन्न डेटासेट11, 12,13,28,34केलिए किया गया था। विशेष रूप से, विभिन्न राज्यों के ईकोग सिग्नल का स्पेक्ट्रल विश्लेषण राज्य संरचना और गुणवत्ता को सूचकांक करेगा। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोड की विभिन्न गहराई से उत्पन्न होने वाले मतभेदों को दूर करने के लिए, स्पेक्ट्रल विश्लेषण डेटा किसी दिए गए जानवर(चित्रा 3 ए)के सभी राज्यों की कुल शक्ति के सापेक्ष व्यक्त किया जा सकता है। उच्च आवृत्तियों में ईकॉग गतिविधि के बहुत कम सापेक्ष आयाम को देखते हुए, जागना, धीमी लहर नींद के लिए सापेक्ष शक्ति स्पेक्ट्रा, और विरोधाभासी नींद को लॉग-ट्रांसफॉर्म किया गया है और साथ ही कम और उच्च आवृत्तियों में गतिविधि की तुलना करें। यह विश्लेषण कॉफिलिन निष्क्रियता(चित्रा 3B)की शर्तों के तहत स्पेक्ट्रल गतिविधि में राज्य-विशिष्ट अंतर को इंगित करता है। अधिक सटीक रूप से, पुरुष और महिला चूहों के संयोजन वाले ये प्रारंभिक निष्कर्ष बताते हैं कि कोफिलिन निष्क्रियता जागने के दौरान और विरोधाभासी नींद के दौरान धीमी आवृत्तियों (1-4 हर्ट्ज) में तेजी से आवृत्तियों (14-30 हर्ट्ज) में स्पेक्ट्रल पावर को काफी बढ़ाती है, जबकि धीमी गति से तरंग नींद के दौरान ईकोग गतिविधि को मुख्य रूप से अप्रभावित छोड़ देता है। इसके अलावा, कोफिलिन निष्क्रियता ईकोग गतिविधि में अंतर-माउस परिवर्तनशीलता को बढ़ाने के लिए प्रतीत होती है (विशेष रूप से चित्र 3बीमें जागने के लिए त्रुटि सलाखों से ध्यान देने योग्य)।

Figure 1
चित्रा 1:ईकोग/ईएमजी असेंबल घटकों की तैयारी और ईकोग इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट का प्रतिनिधि उदाहरण। (क)एक ईकोग इलेक्ट्रोड: लीड-फ्री सोल्डर का उपयोग करके सोने से ढके पेंच (1.9 मिमी सिर व्यास, 1.14 मिमी धागा प्रमुख व्यास, 3.6 मिमी कुल लंबाई) के सिर पर 4 मिमी लंबा, 0.2 मिमी व्यास का सोने का तार (गैर-अछूता) जुड़ा हुआ है। (ख)ईएमजी इलेक्ट्रोड: दो सोने के तारों (1.5 और 2 सेमी) गर्दन की मांसपेशी तक खोपड़ी के वक्र को गले लगाने के लिए घुमावदार हैं, और दूसरे छोर को सीधे कनेक्टर में मिलाप रखा जाता है। (ग)एक 6-चैनल कनेक्टर: कनेक्टर (5 मिमी x 8 मिमी x 8 मिमी + 3 मिमी धातु पिन) के 6 धातु पिन (बीच में एक लोप) के 5 में लीड-मुक्त मिलाप जोड़ा जाता है। कनेक्टर के शीर्ष को कूड़े/पानी की घुसपैठ से बचने के लिए टेप से ढका जाता है । (घ)बाएं गोलार्द्ध की खोपड़ी पर तीन रखरखाव शिकंजा की स्थिति का उदाहरण और दाएं गोलार्द्ध पर तीन ईकोग इलेक्ट्रोड (एक संदर्भ इलेक्ट्रोड सहित) । ईकोग इलेक्ट्रोड के सटीक स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक चरण 2.6 और 3.2 में इंगित किए जाते हैं और ब्रेग्मा और लैम्ब्डा (जो पीले बिंदुओं द्वारा इंगित किए जाते हैं) के स्थान के अनुसार गणना की गई है। संक्षिप्त रूप: ईकोग = इलेक्ट्रोकॉर्टिकोग्राफिक; ईएमजी = इलेक्ट्रोमायोग्राफिक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:एएवी-संक्रमित क्षेत्र और सेल प्रकार को परिभाषित करने के लिए प्रतिनिधि इम्यूनोस्टेपिंग। (A)योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व पैनल बी में प्रस्तुत कोरोनल स्लाइस की इंजेक्शन साइट दिखा रहा है । स्थिति ब्रेग्मा के लिए 1.1 मिमी पूर्वकाल है, और कैनुला (लाल रंग में दिखाया गया है) को सही प्राथमिक मोटर कॉर्टेक्स (एम 1) की परतों वी के लिए लक्षित किया गया था। फ्रैंकलिन और पैक्सिनोस40से संशोधित प्रतिनिधित्व। (ख)पूरे मस्तिष्क के कोरोनल स्लाइस के लिए दिखाए गए न्यूरॉन्स में कोफिलिनS3D-HAअभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एचए की इम्यूनोदाता लगभग 1.1 मिमी पूर्वकाल में स्थित ब्रेग्मा के लिए दिखाया गया है। संक्रमित क्षेत्र मुख्य रूप से सही प्राथमिक और माध्यमिक मोटर कॉर्टिस (एम 1 और एम 2) की परतों वी और छठी (इनफ्रैग्रैन्युलर लेयर्स) के लिए स्थानीयकरण करता है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। वर्ग संक्रमित कोशिकाओं के धुंधला दिखा क्षेत्र के सी(सी)उच्च आवर्धन में दिखाया क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है और मोटर प्रांतस्था की गहरी परतों में cofilinS3D-HAकी अभिव्यक्ति की पुष्टि । स्केल बार = 100 माइक्रोन.(डी)एचए और CaMKIIα के सह-इम्यूनोसटेनिंग को सही गोलार्द्ध के कोरोनल स्लाइस के लिए दिखाए गए सेल प्रकार-विशिष्टता का आकलन करने के लिए लगभग 0.5 मिमी पूर्वकाल में स्थित ब्रेग्मा के लिए और इसलिए, इंजेक्शन साइट के पीछे (पैनल बी और सी में समान माउस)। संक्रमित क्षेत्र मोटर कॉर्टिस (एम 1 और मुख्य रूप से एम 2) के लिए स्थानीयकरण करता है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। वर्ग ई, एफ, और जी(ई)संक्रमित कोशिकाओं के धुंधला दिखा क्षेत्र के उच्च आवर्धन और कोफिलिनS3D-HAकी अभिव्यक्ति की पुष्टि में दिखाया क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है । स्केल बार = 100 माइक्रोन(एफ)संक्रमित क्षेत्र का उच्च आवर्धन CaMKIIα-सकारात्मक कोशिकाओं के धुंधला दिखा। स्केल बार = 100 माइक्रोन।(जी)संक्रमित क्षेत्र के उच्च आवर्धन सह-लेबलिंग कोलिफिनS3D-HAऔर CaMKIIα दिखा रहा है, इस बात की पुष्टि करता है कि संक्रमित कोशिकाएं CaMKIIα-सकारात्मक हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: एएवी = एडेनो से जुड़े वायरस; M1 = प्राथमिक मोटर कॉर्टेक्स; M2 = माध्यमिक मोटर कॉर्टेक्स; सीपीयू = कॉडेट पुटामेन (स्ट्रेटम); एलवी = पार्श्व वेंट्रिकल; हा = हेमाग्लुटिनिन; CamKIIα = कैल्शियम/calmodulin-निर्भर प्रोटीन kinase द्वितीय अल्फा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:कोफिलिन फ़ंक्शन के वायरल हेरफेर के बाद प्राप्त जागना, धीमी लहर की नींद और विरोधाभासी नींद के लिए प्रतिनिधि शक्ति स्पेक्ट्रा। पुरुष (n = 5 प्रति समूह) और महिला (एन = 2 प्रति समूह) चूहों AAV9के साथ इंजेक्शन -CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA(वायरल टाइटर 2.58 × 1013 जीसी/एमएल) या एक नियंत्रण के साथ एक AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP 1.25 ×10 13 जीसी/एमएल; इस नियंत्रण एएवी के बढ़े हुए संकेत के लिए नियंत्रण करने के लिए परीक्षण टाइटर का आधा) मोटर कॉर्टेक्स की परत वी में 24 घंटे के लिए दर्ज किया गया था, और इलेक्ट्रोकॉर्टिकोग्राफिक सिग्नल को स्पेक्ट्रल विश्लेषण के अधीन किया गया था (0.5 और 30 हर्ट्ज के बीच स्पेक्ट्रल पावर की गणना करने के लिए फास्ट फोरियर ट्रांसफॉर्म 0.25-हर्ट्ज रिज़ॉल्यूशन के साथ)। (A)तीन सतर्कता राज्यों के दौरान बिजली स्पेक्ट्रा सभी राज्यों की कुल शक्ति के सापेक्ष व्यक्त किया गया । (ख)सापेक्ष शक्ति स्पेक्ट्रा लॉग-रूप-अधिक पर्याप्त रूप से उच्च आवृत्तियों में समूह मतभेदों का प्रतिनिधित्व करने के लिए बदल दिया । एएवी9-CaMKIIα0.4-कोफिलिनS3D-HAका उपयोग करके मोटर कॉर्टेक्स में कोफिलिन गतिविधि का दमन जागने के दौरान बीटा रेंज (14-30 हर्ट्ज) में इलेक्ट्रोकॉर्टोग्राफिक गतिविधि को काफी बढ़ाता है, और नियंत्रण इंजेक्शन की तुलना में विरोधाभासी नींद के दौरान डेल्टा रेंज (1-4 हर्ट्ज) में (एक्स अक्षों के ऊपर लाल रेखाएं फ्रीक्वेंसी बैंड पावर पी < 0.05 पर मान-व्हिटनी यू-टेस्टका संकेत देती हैं)। संक्षिप्त: एएवी = एडेनो से जुड़े वायरस जीसी = जीनोम प्रतियां; हा = हेमाग्लुटिनिन; CamKIIα = कैल्शियम/calmodulin-निर्भर प्रोटीन kinase द्वितीय अल्फा; eGFP = बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह प्रोटोकॉल एएवी का उपयोग करके आणविक लक्ष्यों में हेरफेर के दौरान ईकॉग और ईएमजी गतिविधि की निगरानी करने के लिए एक सटीक और सरल विधि का वर्णन करता है। पर्याप्त बीच समूह तुलना के लिए, परीक्षण और नियंत्रण जानवरों के लिए एक ही दिन में हमेशा सर्जिकल प्रक्रियाओं (एएवी इंजेक्शन और इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण) की योजना बनाने और एक साथ उनके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। परीक्षण और नियंत्रण जानवरों के बीच इसी तरह की वायरल अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए, एक ही वायरल टाइटर इंजेक्शन वांछनीय है। वर्तमान मामले में, नियंत्रण एएवी के वायरल टाइटर को इसी तरह के वायरल अभिव्यक्ति को सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण एएवी के आधे से कम कर दिया गया था । प्रयोगकर्ताओं को मस्तिष्क क्षेत्र/कॉर्टिकल लेयर टार्गेटिंग में कम-पशु परिवर्तनशीलता सुनिश्चित करने के लिए टकसाली निर्देशांक के माप के साथ बहुत सावधान रहना चाहिए । इसके अतिरिक्त, यह देखते हुए कि इंजेक्शन की गहराई खोपड़ी की सतह से गणना की जाती है, और खोपड़ी की मोटाई उम्र और लिंग के साथ भिन्न होती है, कैनुला की नियुक्ति को हमेशा पोस्ट-प्रोटोकॉल हिस्टोलॉजी या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (जैसे, चित्रा 2)का उपयोग करके सत्यापित किया जाना चाहिए ताकि इंजेक्शन की पर्याप्त स्थिति/गहराई सुनिश्चित की जा सके, और यदि आवश्यक हो तो स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक को समायोजित किया जाना चाहिए। 40-मिनट एएवी इंजेक्शन के दौरान, पंप रुकावट जैसे संभावित मुद्दों का तेजी से पता लगाने और सही करने के लिए इंजेक्शन की गति की निगरानी करना बहुत महत्वपूर्ण है। इष्टतम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सिग्नल प्राप्त करने के लिए कुछ प्रयोगात्मक कदम भी महत्वपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण के दौरान ओवरक्रू न करें; सेरेब्रल कॉर्टेक्स को नुकसान को कम करने और ग्लियल निशान के गठन के लिए शिकंजा को खोपड़ी से कम से कम 2.5 मिमी तक रहना चाहिए। बाद में, यह भी काफी महत्वपूर्ण है i) इलेक्ट्रोड के चरम पर सीमेंट लगाने से बचें, ii) कनेक्टर के लिए इलेक्ट्रोड की तेजी से टांका सुनिश्चित करें, और iii) सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड के बीच कोई संपर्क नहीं है।

ईकॉग और ईएमजी रिकॉर्डिंग के लिए यहां प्रस्तुत प्रक्रिया बहुत अच्छी तरह से स्थापित, सरल है, और व्यापक रूप से चूहों2,11, 13,34में जागना और नींद की निगरानी करने के लिए उपयोग की जाती है। सतत ईकॉग और ईएमजी रिकॉर्डिंग लगातार कई दिनों (और यहां तक कि हफ्तों) के लिए किया जा सकता है और एक बहुत ही समृद्ध डेटासेट उत्पन्न करता है जिसका उपयोग विश्लेषण की कई पंक्तियों को करने के लिए किया जा सकता है जिसमें जागना और नींद की मात्रा और वास्तुकला2,11,12 (उदाहरण के लिए, प्रकाश और अंधेरे अवधि के प्रति विभिन्न राज्यों में बिताया गया समय, प्रत्येक राज्य के एपिसोड की संख्या, 24-h नींद का वितरण), जागना और नींद स्पेक्ट्रल सामग्री34,41 (उदाहरण के लिए, विभिन्न आवृत्ति बैंड में शक्ति [चित्र 3], स्केल-मुक्त गतिविधि के समान), और व्यक्तिगत तरंगों की विशेषताएं42,43,44 (उदाहरण के लिए, धीमी-तरंग आयाम और ढलान)। जब एएवी-मध्यस्थता आणविक जोड़तोड़ के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो एक अतिरिक्त लाभ संभावित विकासात्मक मुआवजे से बचा जाता है जो ट्रांसजेनिक जानवरों में हो सकता है। अभ्यास के साथ, 40-मिनट एएवी इंजेक्शन सहित पूरी प्रक्रिया, लगभग 90 मिनट में की जा सकती है। मृत्यु दर (बहुत) कम होनी चाहिए क्योंकि सर्जरी न्यूनतम आक्रामक है।

ईकॉग/ईएमजी रिकॉर्डिंग और एएवी के साथ लक्षित हेरफेर का एक साथ उपयोग कई प्रकार के अन्य लाभ और अनुप्रयोग प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, स्टीरियोटैक्सिक लक्ष्यीकरण की सटीकता, जब पर्याप्त रूप से किया जाता है, बहुत अधिक और प्रतिकृति होती है और नींद या अन्य शारीरिक प्रक्रियाओं के नियमन में किसी दिए गए मस्तिष्क क्षेत्र (और/या कोशिका प्रकार या क्षेत्र के भीतर एक आणविक तत्व) की विशिष्ट भूमिका निर्धारित करने के लिए उपयोगी होती है । इस प्रकार वर्तमान प्रोटोकॉल के रूपांतरों का उपयोग करके कई अलग-अलग कॉर्टिकल क्षेत्रों को आसानी से लक्षित किया जा सकता है। इसके अलावा, AAVs का उपयोग कर लक्ष्य जोड़तोड़ एक कॉर्टिकल/उपकॉर्टिकल ईकॉग रिकॉर्डिंग साइटों से अलग क्षेत्र के लिए निर्देशित किया जा सकता है । ऐसे मामलों में, एएवी इंजेक्शन के लिए बर्र छेद दंत सीमेंट (या हड्डी मोम) का उपयोग करके तय एक छोटे ग्लास कवरलिप द्वारा कवर किया जा सकता है। बढ़ी हुई विशिष्टता के लिए, एएवी निर्माण में अक्सर एक प्रमोटर शामिल होता है जो सटीक सेल प्रकार14के लक्षित संक्रमण की अनुमति देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में मोटर कॉर्टेक्स के14,29,45उत्तेजक पिरामिड कोशिकाओं को विशेष रूप से लक्षित करने के लिए एक CamKIIα प्रमोटर का उपयोग किया गया था। इस रणनीति ने मोटर कॉर्टेक्स के उत्तेजक न्यूरॉन्स में कोफिलिन (कोफिलिनS3D)32, 33का उपयोग करके और ईकॉग गतिविधि (चित्र3) में राज्य-विशिष्ट परिवर्तनों के अवलोकन को सक्षमबनाया है। संक्रमण/ट्रांसडक्शन प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए, भविष्य के प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता प्रस्तुत एएवी-ईकोग प्रोटोकॉल को इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा सह-धुंधला में से एक के साथ जोड़ सकते हैं, और उच्च आवर्धन छवियों का उपयोग करने के लिए क्षमताओं की कुल संख्या से बाहर डबल लेबलिंग दिखाने के लिए लक्ष्य की एकल लेबलिंग (यहां, CaMKIIα-व्यक्त न्यूरॉन्स) । हाल ही में एक अध्ययन में, यहां वर्णित एक के समान एएवी-ईकोग विधि का उपयोग एक सिनेप्सिन प्रमोटर युक्त एएवी का उपयोग करके मोटर कॉर्टेक्स के सभी न्यूरॉन्स में नाजुक एक्स मानसिक मंदता सिंड्रोम से संबंधित प्रोटीन 1 (FXR1) को अधिक व्यक्त करने के लिए किया गया था और सतर्कता राज्य वितरण और स्पेक्ट्रल सामग्री28पर इस हेरफेर के प्रभाव का पता चला। इन निष्कर्षों से स्पष्ट होता है कि AAVs का उपयोग करके लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र में दिए गए अणु में हेरफेर करने से विशिष्ट जागना/नींद मापदंडों के नियमन में भूमिकाओं का पता चल सकता है ।

वर्णित प्रोटोकॉल की एक सीमा एएवी इंजेक्शन करने से पहले कैनुला प्लेसमेंट के साथ होने वाले मस्तिष्क के ऊतकों का छोटा घाव है, जो एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के साथ भी हो सकता है। यह विशेष चिंता का विषय हो सकता है जब उपकॉर्टिकल क्षेत्रों में एएवी इंजेक्शन प्रदर्शन और हमेशा पर्याप्त नियंत्रण का उपयोग करके निपटा जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, वर्तमान प्रोटोकॉल का पालन नियंत्रण और परीक्षण समूहों में इसी तरह के स्तर को सुनिश्चित करने के लिए प्रतिक्रियाशील ग्लियोसिस और/या माइक्रोग्लियाल एक्टिवेशन (उदाहरण के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके) की मात्रा के बाद किया जा सकता है और इसलिए, ईकोग रीडआउट पर । एक दूसरी सीमा इलेक्ट्रोड और कनेक्टर के बीच खराब संबंध के जोखिम से संबंधित है, जिसके परिणामस्वरूप लगातार या कभी-कभी खराब इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सिग्नल हो सकता है। मजबूत रूप से खराब, टांका, और सीमेंटेड इलेक्ट्रोड इस मुद्दे की घटनाओं को कम करेंगे। एक तीसरी सीमा रिकॉर्डिंग के दौरान सिर असेंबल के माध्यम से सीमित जानवरों से संबंधित है, जो कम से कम कुछ हद तक लोकोमोशन और अन्य व्यवहार को सीमित कर सकता है, और कभी-कभी केबलिंग क्षति और सिग्नल हानि में परिणाम देता है। अंत में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल वयस्क चूहों के लिए अधिक उपयुक्त है, यह देखते हुए कि छोटे जानवरों की खोपड़ी का आकार चित्रित सिर असेंबल स्थापित करने में कठिनाइयों का कारण बन सकता है, जैसा कि पहले2वर्णित है।

संयुक्त ECoG/EMG रिकॉर्डिंग और एक सटीक लक्ष्य के AAV मध्यस्थता हेरफेर भी नींद के तंत्रिका विज्ञान के अलावा अंय अनुसंधान क्षेत्रों के लिए लागू होता है । अन्य लोगों के अलावा, इसका उपयोग जब्ती के पशु मॉडलों में मिर्गी की घटनाओं का अध्ययन और हेरफेर करने के लिए किया जा सकता है और स्मृति एन्कोडिंग और समेकन46, 47में शामिल मस्तिष्क दोलनों को मिलाना एक शक्तिशाली उपकरण है। तदनुसार, संभावित अनुप्रयोगों में निश्चित रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों सहित मनोरोग और न्यूरोलॉजी में मौलिक अनुसंधान के क्षेत्र शामिल हैं। एक अणु के एक निष्क्रिय रूप को व्यक्त करने की क्षमता के अलावा, AAVs कर सकते है और अधिक प्रयोग या डाउनरेगुलेट (जैसे, छोटे हस्तक्षेप आरएनए, CRISPR/Cas9) या एक पूर्ण शरीर KO में एक अणु की अभिव्यक्ति को बचाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । महत्वपूर्ण बात यह है कि वर्तमान प्रोटोकॉल की दोहरी पद्धति अन्य स्तनधारी प्रजातियों जैसे चूहों और दैनिक कृंतकों पर भी लागू होती है जो नींद और न्यूरोडिजेनरेशन48, 49दोनों को समझने के लिए दिलचस्प मॉडल का प्रतिनिधित्व करती हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को स्लीप मॉलिक्यूलर फिजियोलॉजी में कनाडा रिसर्च चेयर द्वारा वित्त पोषित किया गया था । लेखक तकनीकी मदद के लिए क्लो प्रोवोस्ट और कैरोलीन बोचार्ड के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery peparation
21 G needle Terumo NN-2125R
6-channel connector ENA AG BPHF2-O6S-E-3.2 Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below
Distrelec 300-93-672 Potential replacement for discontinued connector above
C57BL6/J mice Jackson Laboratory 000664 | B6 Animals bred on site
Pluronic F-68 Non-ionic surfactant
Gold wire 0.2 mm diameter Delta scientific 920-862-41 Non-insulated
Hamilton syringe (10 μL) Fisher Scientific 14815279
Infusion syringe Pump CMA 402 Harvard Apparatus CMA8003110
Injection cannula 28 G Plastics one C313l-SPCL
Isoflurane Baxter CA2L9100
Ketamine (10 mg/mL) SANDOZ 4550
Lead-free solder AIM SN100C
Lubricating ophthalmic ointment ALLERGAN 210889
PE 50 Catheter thin wall Plastics one C232CT
Flat fillister head self tapping screws MORRIS FF00CE125 ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length
Soldering iron Weller WES51
Syringe 1 mL BD 309659
Trimmer Harvard Apparatus 72-9063
Xylazine (20 mg/mL) Bayer 2169592
Intracortical AAV injection with syringe pump
0.7 mm drill bit Dremel 628
AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA UPenn Viral Core
AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP UPenn Viral Core
Cotton tippped applicators Medicom 806
Drill Dremel 8050-N/18
Extra-fine Graefe forceps Fine science tools 11150-10
Stereotaxic arm Stoelting 51604U
Stereotaxic frame Stoelting 51600
Surgical clamps Fine science tools 18050-28
Tissue scissor Magna Stainless M4-124
ECoG/EMG electrode implantation
Buprenorphine (0.3 mg/mL) CEVA 57133-02
Curved forceps Fine science tools 11001-12
Delicate task wipers Kimtech 34120
Dental acrylic cement Yates Motloid 44115
Dumont #5 forceps Fine science tools 91150-20
Extra fine Graefe forceps Fine science tools 11150-10
Kelly forceps Fine science tools 13002-10
Liquid acrylic Yates Motloid 44119
Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting Ethicon MCP494
Providone-iodine 10% Triad disposables 10-8208
RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2 3M 56849
Immunofluorescence and ECoG recording
36-Channel EEG Wearable Headbox LaMONT Medical 832-000350
CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2) Invitrogen 13-7300 Dilution 1:500
Conductors Awg PVC Insulation Cable Calmont Wire & Cables HC-0819075R0
Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568 Invitrogen A10037 Dilution 1:1000
Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11008 Dilution 1:500
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb Cell signaling 3724 Dilution 1:800
Programmable Amplifier LaMONT Medical 815-000002-S2
Stellate Harmonie Natus HSYS-REC-LT2
Swivel connector Crist Instrument Company Inc. 4-TBC-9-S

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 168 स्लीप रेगुलेशन मोटर कॉर्टेक्स ऐक्टिन तोड़ने प्रोटीन सर्जरी इलेक्ट्रोड कैनुला खोपड़ी गर्दन की मांसपेशी माउस
सेरेब्रल कॉर्टेक्स क्षेत्रों की इलेक्ट्रोकॉर्टिकोग्राफिक रिकॉर्डिंग चूहों में कोफिलिन को लक्षित करने वाले एडेनो-एसोसिएटेड वायरस का उपयोग करके हेरफेर किया गया
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Dufort-Gervais, J., Havekes, R., Mongrain, V. Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice. J. Vis. Exp. (168), e61976, doi:10.3791/61976 (2021).

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