Summary
Denne artikel beskriver en protokol for manipulation af molekylære mål i hjernebarken ved hjælp af adeno-associerede vira og til overvågning af virkningerne af denne manipulation under vågenhed og søvn ved hjælp af elektrokorttiske optagelser.
Abstract
Brugen af elektrokortografiske (ECoG) optagelser i gnavere er relevant for søvnforskning og for studiet af en lang række neurologiske tilstande. Adeno-associerede vira (AAV'er) bruges i stigende grad til at forbedre forståelsen af hjernekredsløb og deres funktioner. Den AAV-medierede manipulation af specifikke cellepopulationer og/eller af præcise molekylære komponenter har været uhyre nyttig til at identificere nye søvnregulerende kredsløb/molekyler og nøgleproteiner, der bidrager til de negative virkninger af søvntab. For eksempel forhindrer hæmmende aktivitet af den filamentøse actin-afskærende protein cofilin ved hjælp af AAV søvnmangel-induceret hukommelsesnedsættelse. Her beskrives en protokol, der kombinerer manipulation af cofilin-funktion i et hjernebarkområde med registrering af ECoG-aktivitet for at undersøge, om kortikal cofilin modulerer vågenhed og søvn ECoG-signaler. AAV-injektion udføres under samme kirurgiske procedure som implantationen af ECoG og elektromyografiske (EMG) elektroder hos voksne han- og hunmus. Mus bedøves, og deres hoveder barberes. Efter hudrensning og indsnit bestemmes stereotaxiske koordinater for den motoriske cortex, og kraniet gennembores på dette sted. En kanyle fyldt med en AAV, der udtrykker cofilinS3D, en inaktiv form for cofilin, er langsomt placeret i det kortikale væv. Efter AAV-infusion skrues gulddækkede skruer (ECoG-elektroder) gennem kraniet og cementeres til kraniet med guldtråde indsat i nakkemusklerne (EMG-elektroder). Dyrene får tre uger til at komme sig og sikre tilstrækkeligt udtryk for cofilinS3D. Det inficerede område og celletype verificeres ved hjælp af immunhistokemi, og ECoG analyseres ved hjælp af visuel identifikation af årvågenhedstilstande og spektralanalyse. Sammenfattende gør denne kombinerede metodologiske tilgang det muligt at undersøge det præcise bidrag fra molekylære komponenter, der regulerer neuronal morfologi og forbindelse til reguleringen af synkroniseret hjernebarkaktivitet under vågenhed og søvn.
Introduction
Elektroencefalografiske (eller generelt elektrokortografiske [ECoG] i gnavere) og elektromyografiske (EMG) optagelser anvendes i vid udstrækning i søvnforskning såvel som mere bredt inden for neurovidenskab, neurologi og psykiatri. Tilsammen giver disse elektrofysiologiske signaler mulighed for identifikation af årvågenhedstilstande og den efterfølgende kvantificering af statens varighed og spektralsammensætning, både hos mennesker og gnavere1,2,3,4. En sådan kvantificering har været nyttig til at forstå, hvordan søvn ændres under patologiske tilstande som neurodegenerative sygdomme og model5,6,7 eller ved genetisk modifikation8,9. For eksempel blev knockout (KO) af forskellige gener forbundet med neuronal kommunikation vist sig at ændre varigheden af vågenhed og søvn i både musen og frugt flyve10,11,12,13. For at tackle den potentielle udviklingskompensation, der følger af undersøgelsen af fuldkrops-KO hos gnavere, og for at muliggøre en finere kontrol med genmanipulation er en effektiv måde at manipulere genekspression på at anvende adeno-associerede vira (AAV'er). En AAV-medieret genmanipulation kan bruges til at nedregulere et givet molekylært mål og til at begrænse manipulationen til en bestemt cellepopulation ved hjælp af forskellige typer initiativtagere14. AAV'er anvendes også i vid udstrækning som leveringsmetode i de grupperede, der regelmæssigt interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9-teknologi15,16. Disse metoder giver mulighed for bedre tidsmæssig og rumlig kontrol af genmanipulation, som generelt er forbundet med udtrykket af en reporter, der tillader kvantificering af det inficerede område ved hjælp af immunfluorescens.
AAV'er repræsenterer også hovedvektoren for celletypespecifikke manipulationer af neuronal aktivitet via optogenetics og kemogetik17,18,19, som er blevet udbredt i nyere forskning i neurodegenerative sygdomme, adfærd, kognition og søvn20,21,22. I søvnforskning har anvendelsen af optogenetics til aktivering eller hæmning af visse hjerneregioner, såsom basal forhjernen, hypothalamus og sublaterodorsal tegmentum, været nyttig til at bestemme deres roller i kontrollen af ophidselse, langsom bølge søvn (også kendt som ikke-hurtig øjenbevægelsessøvn), paradoksal søvn (eller hurtig øjenbevægelsessøvn) og katapleksi23, 24,25. Desuden har AAV-medierede manipulationer hjulpet med at belyse vigtige søvnregulerende kredsløb og molekyler , der bidrager til de negative virkninger af søvntab26,27,28. For eksempel, et protein vist sig at være impliceret i søvnmangel-induceret hukommelsesnedsættelse er cofilin29,30. Dette protein er et filamentøst actin-severing protein, der deltager i reorganiseringen af actin filamenter ved fysisk bindende for actin og fremme demontering af filamenter på en dynamisk måde31. Hæmmende cofilinaktivitet ved hjælp af en AAV-medieret tilgang viste sig at forhindre tab af rygsøjlen samt synaptisk plasticitet og hukommelsesunderskud forårsaget af søvnmangel hos mus29. Samlet understreger disse undersøgelser nytten og relevansen af AAV-medierede manipulationer for at forstå søvnregulering og konsekvenserne af søvnmangel hos gnavere.
Her beskrives en protokol, der kombinerer ECoG og EMG elektrodeimplantation og optagelse med manipulation af cofilin-funktion i et hjernebarkområde af vilde mus (WT) ved hjælp af en AAV. Mere præcist injiceres en AAV (serotype 9), der udtrykker kodningssekvensen af en fosformisk form af musens cofilin (cofilinS3D), hvilket gør den inaktiv32,33, injiceret i den motoriske cortex (M1 og M2). En ECoG-elektrode implanteres direkte på injektionsstedet for at sikre registrering af de inficerede cellers synkroniserede kortikale aktivitet. ECoG/EMG-optagelsen udføres i 24 timer under uforstyrrede forhold tre uger efter operationen for at give mulighed for genopretning, tilpasning og høj cofilinS3D-udtryk. Optagelsen bruges derefter til identifikation af årvågenhedstilstande og ECoG-spektralanalyse som beskrevet i tidligere undersøgelser11,34. Denne metode kan specifikt afsløre, hvordan kortikal cofilin modulerer vågenhed og søvn ECoG signaler i mus. Denne kombination af elektrofysiologiske optagelser og AAV-medieret genmanipulation er særlig relevant for at undersøge forskellige molekylære elementers roller i specifikke hjernefunktioner og kan anvendes på kortikale (og subkortikale) hjerneområder af interesse for WT og genetisk modificerede mus af begge køn og endda andre arter.
Protocol
Alle metoder er godkendt af Comité d'éthique de l'expérimentation animale of the Recherche CIUSSS-NIM og er i overensstemmelse med retningslinjerne fra Canadian Council on Animal Care. Se tabellen over materialer for reagenser, udstyr og materialer, der anvendes i denne protokol.
1. Forberedelse af kirurgi
- Fremstilling af ECoG- og EMG-elektroder
- For hvert dyr skal du fremstille tre ECoG-elektroder: Ved hjælp af et loddejern skal der anbringes en lille dråbe blyfri lodde på skruehætten på en guldbeklædt skrue og lodde en guldtråd med en diameter på 4 mm og en guldtråd med en diameter på 4 mm (ikke-isoleret) på toppen af skruehætten ved hjælp af den blyfri lodde (Figur 1A). Forbered 2 elektroder med guldtråden lige op, og en med en 45 ° vinkel fra lodret.
- For hvert dyr skal du forberede to EMG-elektroder: Skær en 0,2 mm diameter guldtråd til en længde på 1,5 cm og en anden til 2 cm. Kurve begge ledninger for disse til at omfavne kurven af kraniet op til nakkemusklerne, holde en lige ende, der vil blive loddet til stikket (Figur 1B).
- For hvert dyr skal du forberede et stik: Brug et 6-kanals stik (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm metalstifter), og tilsæt blyfri lodde til 5 af de 6 metalstifter (udelade en mellemstift; Figur 1C). Dæk toppen af stikket med tape for at undgå kuld eller vandinfiltration.
- Forberedelse af AAV'er og sprøjtepumpe
- Forbered testen AAV (her AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA) og/eller kontrol AAV (her AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) ved at fortynde bestanden AAV mix (es) (her, AAV'er i en opløsning af fosfat-bufferet saltvand indeholdende nonionisk overfladeaktivt middel [0,001%]) med steril saltvand for at opnå den ønskede virale titer (generelt 1012-13 genomkopier [GC]/mL) og det krævede volumen for antallet af mus, der skal behandles.
BEMÆRK: Et injiceret volumen på 1 μL pr. kortikalt område pr. mus kræver, at der forekom 2 μL. - Fastgør en 10 μL sprøjte til en sprøjtepumpe og fyld den med destilleret vand.
- Fyld et PE50-rør med en længde på ca. 60 cm med destilleret vand med en 1 mL sprøjte og en 21 G nål. Det er vigtigt, at 21G-nålen og sprøjten er på plads efter påfyldning. Tilslut PE50-røret til sprøjtepumpen. Lad 21 G-kanylen/sprøjten stå i den ene ende af PE50-røret, og tilslut den anden ende til 10 μL-sprøjten.
- Når røret er fastgjort til 10 μL sprøjten, skal du fjerne nålen i den anden ende og skubbe stemplet på 10 μL sprøjten for at fylde hullet efterladt af nålen med vand.
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er nogen luftboble, og at røret er helt fyldt med vand. - Installer en 28 G kanyle for enden af røret, hvor nålen blev fjernet. Skub vand ind i kanylen med 10 μL sprøjten for at fylde den helt. Fastgør kanylen tæt på den stereotaxiske arm.
- Forbered testen AAV (her AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA) og/eller kontrol AAV (her AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) ved at fortynde bestanden AAV mix (es) (her, AAV'er i en opløsning af fosfat-bufferet saltvand indeholdende nonionisk overfladeaktivt middel [0,001%]) med steril saltvand for at opnå den ønskede virale titer (generelt 1012-13 genomkopier [GC]/mL) og det krævede volumen for antallet af mus, der skal behandles.
- Tilberedning af dyr
BEMÆRK: C57BL6/J han- og hunmus på ~12 uger er tidligere blevet tilpasset i mindst 2 uger til at huse i individuelle bure og til en 12-timers lys:12-timers mørk cyklus med ad libitum mad og vand og adgang til en træterning.- Afveje musene forsigtigt og intraperitoneally en blanding af ketamin/xylazin (120/10 mg/kg) for anæstesi. Vent ca. 10 minutter på dybbedøvelse.
- Barber håret fra bagsiden af ørerne til forsiden af hovedet mellem øjnene ved hjælp af en hårtrimmer.
BEMÆRK: Pas på ikke at skære whiskers (beskyt whiskers med en finger under barbering) som whisker trimning vil ændre sensoriske indgange og ECoG aktivitet35,36. - Tilsæt en generøs dråbe oftalmisk salve på hvert øje for at forhindre dehydrering. Kontroller dybden af anæstesi regelmæssigt under proceduren ved at klemme en tå fra bagpoten. Giv musen 0,5-1,5% isoflurane for at sikre dyb anæstesi, hvis der opstår en tåklemrefleks.
2. Intracortical AAV injektion med en sprøjte pumpe
BEMÆRK: Udfør alle følgende trin med steriliserede instrumenter og i et rent miljø. Brug 70% ethanol til yderligere vask af steriliserede instrumenter og til vask af elektroder tilberedt i punkt 1.1 samt ankerskruer (ikke-gulddækkede skruer), før operationen påbegyndes.
- Fastgør forsigtigt musens hoved på det stereotaxiske apparat med ørestænger.
BEMÆRK: Sørg for, at hovedet ikke bevæger sig sideværts. - Træk forsigtigt dyrets tunge ud af munden for at undgå kvælning, og fastgør musens næse med den stereotaxiske adapter.
BEMÆRK: Overvåg vejrtrækningen ofte under proceduren. - Steriliser det barberede område af hovedet med 70% ethanol og ved at holde huden med en ekstra fin Graefe pincet, skære huden fra bunden af ørerne til niveauet af øjnene med væv saks. Brug fire kirurgiske klemmer til at strække huden og eksponere kraniet (to på hver side af snittet; se figur 1D).
- Skrab kraniets overflade med en skarp saksespids: Undgå samtidig knogle suturer, fjern periosteum og opret overlappende striber i to eller flere retninger. Fjern knoglefragmenterne, og tør kraniet med 70% ethanol.
BEMÆRK: Ridserne og striberne vil hjælpe med at gøre optagelsesmontagen mere robust ved at forbedre cementens tilslutning til kraniet (se nedenfor). - Med kanylen fastgjort til den stereotaxiske arm, identificere placeringen af bregma (dvs. skæringspunktet mellem kraniet koronar og sagittal suturer; Figur 1D) og lambda (dvs. skæringspunktet mellem kraniet sagittal sutur og en lige linje, der forbinder venstre og højre lambdoid sutur; Figur 1D), og bemærk de stereotaxiske koordinater for hver. Hvis forskellen mellem z-koordinaterne (lodret akse) for bregma og lambda er større end 0,3 mm, justeres næsens højde ved hjælp af den stereotaxiske adapter, indtil z-positionen for bregma og lambda er justeret.
- Marker kanylens position på kraniet med en pen ved disse koordinater (motorisk cortex): 1,5 mm lateral ret til midterlinje og 1,5 mm forreste til bregma. Gennembor forsigtigt kraniet på kanylens position med en 0,7 mm borebit i en retning vinkelret på kraniets overflade (justeret med den lodrette akse). Vask det gennemborede kranium med en steril bomuldsspids imprægneret med en 10% providone-jodopløsning.
- Kanylen fyldes med en 1 μL luftboble ved at trække 10 μL sprøjtestemplet tilbage med 1 μL. Indlæs testen AAV (her AAV9-CaMKIIα0.4-CofilinS3D-HA) eller styringen AAV (her AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) i kanylen, der tidligere var fyldt med luftboblen: Bland AAV'en ved langsomt at pipette op og ned 1,7 μL på en steril petriskål og aspirat 1,5 μL af opløsningen i kanylen ved langsomt at trække i stemplet på 10 μL sprøjten. Marker luftboblens position på PE50-røret, så injektionen kan spores.
- Juster kanylen med hullet på kraniet for den lodrette position af kanylen for at nå den øverste kant af kraniet (dvs. kraniets overflade). Fra kraniets overflade sænkes langsomt kanylen med 1,5 mm (for at nå 1,5 mm under kraniets overflade og lag V af den motoriske cortex).
BEMÆRK: Pas meget på ikke at sænke kanylen for meget for at undgå unødvendig læsion af hjernevævet. - Start sprøjtepumpen for at injicere 1 μL AAV i løbet af 40 minutter (hastighed: 0,025 μL/min for at minimere vævsskader). Hold styr på injektionen på PE50-røret med luftboblens bevægelse, og foretag justeringer, hvis det er nødvendigt.
- Når injektionen er afsluttet, skal du lade kanylen være på plads i 5 minutter for at sikre tilstrækkelig diffusion og undgå tilbageløb. Løft derefter langsomt og forsigtigt den stereotaxiske arm for at fjerne kanylen fra cortex.
3. ECoG/EMG elektrodeimplantation
- Brug lige Kelly pincet, langsomt skrue en ECoG elektrode (med lige guld-wire) i den lodrette akse (samme vinkel, at hullet blev gennemboret) i hullet, hvor AAV blev injiceret. Lad mindst 2,5 mm af skruen ud af kraniet for at minimere skader på dura og hjernebark (dvs. for en omtrentlig dybde på 1,1 mm fra kraniets overflade; Figur 1D).
- Marker placeringen af den bageste ECoG elektrode og referenceelektroden på kraniet med en pen ved disse koordinater: bageste elektrode (visuel cortex) 1,5 mm lateral ret til midterlinje og 1,5 mm forreste til lambda, referenceelektrode (somatosensorisk cortex) 2,6 mm lateral ret til midterlinje og 0,7 mm posterior til bregma. Marker også placeringen af tre vedligeholdelsesskruer (der fungerer som ankre mellem kraniet og tandcementen for at størkne hovedmontage) på venstre halvkugle uden specifikke koordinater, men så fjernt som muligt fra hinanden og fra ECoG-elektroderne.
- Gennembor forsigtigt kraniet på den markerede position af de andre elektroder og ankerskruer med 0,7 mm boret. Pierce i en retning vinkelret på kraniets overflade for hver skrue (dvs. lodret akse til den bageste elektrode, men med en vinkel fra den lodrette akse til andre steder). Vask det gennemborede kranium med en 10% providone-jodopløsning, og bloker hullerne med små, rullede stykker delikate opgaveviskere, før du installerer skruerne for at forhindre blødning og forurening.
- Brug den lige Kelly pincet, skrue vedligeholdelse skruer i venstre halvkugle og derefter skrue de sidste to elektroder i højre halvkugle. Sørg for at skrue med samme vinkel, som hullerne blev gennemboret, og at efterlade mindst 2,5 mm af hver skrue ud af kraniet (Figur 1D).
BEMÆRK: For at maksimere soliditeten af den endelige montage og kvaliteten af de elektrofysiologiske signaler skal du passe på ikke at røre ved nogen skrue, når du installerer den næste. - Placer et par små dråber dental cement i midten af ringen-lignende rum inde i skruerne. Den buede ende af en EMG-elektrode (fremstillet ved trin 1.1.2) indsættes ca. 1-2 mm i nakkemusklerne ved at holde den buede ekstremitet ved hjælp af Dumont #5 pincet og løfte huden over musklerne med ekstra fine Graefe-pincet. Placer derefter elektrodens buede side og albue i tandcementen; gentages for den anden EMG-elektrode.
BEMÆRK: Den lige ende af den længere EMG-elektrode skal være justeret med den forreste ECoG-elektrode og den kortere EMG-elektrode med den bageste ECoG-elektrode. Sørg for, at de to EMG-elektroder ikke rører hinanden eller nogen af skruerne. - Dæk musenes øjne, og påfør lys i 3-5 minutter for at hjælpe med cementstørkning. Når EMG-elektroderne holder fast, skal du dække bunden af ECoG-elektroderne og bunden af ankerskruerne med dentalcement for at danne en kroneformet kontur. Dæk musenes øjne, og påfør lys i 3-5 minutter for at hjælpe med cementstørkning.
BEMÆRK: Påfør ikke cement på ECoG- og EMG-elektrode ekstremiteterne (guldtråd, der vil blive loddet på stikket) eller på huden. - Fyld midten af montagen med tidligere blandet akrylcement. Under cement størkning, fjerne de fire kirurgiske klemmer holde huden (og vask disse straks med sarte opgave vinduesviskere).
BEMÆRK: Påfør ikke cement på ECoG- og EMG-elektrode ekstremiteterne (guldtråd, der vil blive loddet på stikket) eller på huden. - Sutur huden på bagsiden og forsiden af montagen, så kraniet ikke er udsat (men undgå at strække huden for meget) ved hjælp af en sutur nål (13 mm 3 /8 c) og syntetisk absorberelig monofilamenter.
- Hold stikket over montagen med buede pincet, og juster forsigtigt elektrodernes guldtråd med stikstifterne. Loddeelektrode ekstremiteter til stikstifter med loddejernet.
BEMÆRK: Fortsæt hurtigt for at undgå overophedning og beskadigelse af det kortikale væv. Sørg for, at hver elektrode kommer godt i kontakt med den tilsvarende stikstift, og at elektroderne ikke er forbundet med hinanden. - Fjern musen fra den stereotaxiske ramme. Dæk det tomme rum mellem stikket og hovedet med tidligere blandet akrylcement ved at dække alle forbindelser mellem elektroder og stikstifter.
BEMÆRK: Undgå cementinfiltration inde i stikket ved at holde musen med stikket over hovedet (hovedet lige hælder ikke). - Vej musen og læg den i et rent bur (helst udstyret med et ikke-masket låg) på en varmepude (individuelt hus for at undgå skader på hovedmontagen). Monitor dyret regelmæssigt, og administrere 0,1 mg/kg buprenorphin subkutanly ved opvågnen, og 12 timer senere, hvis dyret viser tegn på smerte (f.eks unormal kropsholdning, skelede øjne).
BEMÆRK: Vægtforøgelsen i forhold til vægt før operationen bør ikke overstige 1,5 g.
4. Optagelser
- Husmus individuelt for at undgå skader på hovedmontagen som følge af gensidig pleje samt skade og sammenfiltring af optagekablerne.
BEMÆRK: Til denne protokol blev mus anbragt med ad libitum adgang til mad, vand og en trækube, og daglig overvågning blev udført. - Tilslut musene til optagelseskabler 2 uger efter operationen for tilpasning til kabler betingelser.
- Optag ECoG/EMG-signaler i 24 timer (eller længere/kortere afhængigt af forskningsspørgsmål).
BEMÆRK: ECoG/EMG-signaloptagelse blev udført ved hjælp af et kabel, et drejestik (for at tillade rotation af kablet), en 36-kanals bærbar boks og en forstærker, der var tilsluttet en computer. Der udtages prøver af signaler ved 256 Hz (eller mere afhængigt af forskningsspørgsmål) og registreres med kommerciel software (se materialeoversigten). For at sikre tilstrækkeligt viralt udtryk skal forsøgene udføres mindst 3 uger efter AAV-injektionen som beskrevet tidligere29,37. - Efter optagelse ofre musene ved livmoderhalskræft dislokation (eller andre metoder afhængigt af immunostaining protokollen), og høste hjernen til immunostaining.
Representative Results
Efter elektrofysiologiske optagelser anvendes immunfluorescens til at definere det område, der er inficeret med AAV-injektionen, og til at validere udtrykket af cofilinS3D (figur 2). Immunostaining kan udføres ved hjælp af en metode svarende til det , der tidligere er beskrevet29,37,38,39. AAV udtrykker en inaktiv form for cofilin smeltet sammen med en hemagglutinin (HA)-Tag (cofilinS3D-HA),som påvises ved immunfluorescens ved hjælp af et anti-HA antistof og et sekundært antistof (Alexa Fluor 488). De inficerede excitatoriske neuroner (her, målrettet med en calcium/calmodulin-afhængig protein kinase II alpha [CamKIIα] promotor, der styrer ekspressionen af transgenet indeholdt i AAV) er plettet med anti-HA antistof. En vellykket infektion er indikeret ved farvning af neuronerne i den motoriske cortex omkring injektionsstedet(Figur 2A,B). I dette repræsentative eksempel viste hjernebarken på den anden halvkugle ikke nogen mærkbar farvning. Ikke desto mindre, da excitatoriske neuroner kan projicere til fjerne hjerneområder, er farvning i den kontralaterale halvkugle ikke nødvendigvis en indikation af mislykket injektion. Højere forstørrelse af det inficerede område viste farvning af cellelegemer og fremskrivninger, hvilket bekræftede, at kun specifikke celler i det målrettede kortikale område var inficeret (Figur 2C).
Co-farvning med markører af excitatoriske neuroner (f.eks vesikulær glutamat transportør 1, CaMKIIα) kan også udføres for at validere celle type-specificitet. Alternativt kan co-farvning med markører af hæmmende neuroner eller astrocytter udføres, hvis disse celler er målrettet ved hjælp af forskellige initiativtagere. Co-farvning af cofilinS3D-HAog CaMKIIα blev også udført i samme dyr for et område mere bageste til injektionsstedet, der stadig viste anti-HA farvning i den motoriske cortex (Figur 2D). Det højere forstørrelsesbillede af området viser celler, der tydeligt udtrykker cofilinS3D-HA (Alexa Fluor 488, Figur 2E) og CaMKIIα (Alexa Fluor 568, Figur 2F). Sammenstillingen af cofilinS3D-HAog CaMKIIα farvning afslører, at de fleste (hvis ikke alle) celler farves til cofilinS3D-HAer også positive for CaMKIIα (Figur 2G). Denne observation understøtter infektionens specificitet for excitatoriske neuroner.
For at vurdere cofilinmanipulationens indvirkning på ECoG-aktiviteten bruges ECoG- og EMG-signaler til at udføre en visuel identifikation af årvågenhedstilstande (vågenhed, langsom bølgesøvn, paradoksal søvn). Dette gøres på 4-s epoker på grund af den hurtige ændring i årvågenhed tilstand i musen2, og her, for en fuld 24-timers optagelse. Standardanalyser omfatter beregning af søvnarkitektur og spektralanalysevariabler , som tidligere udført for forskellige datasæt11,12,13,28,34. Navnlig vil spektralanalysen af ECoG-signalet fra de forskellige stater indeksere statens sammensætning og kvalitet. For at fjerne forskelle, der kan opstå, f.eks. fra forskellige dybder af elektroderne, kan spektralanalysedata udtrykkes i forhold til den samlede effekt af alle tilstande af et givet dyr (Figur 3A). I betragtning af den meget lave relative amplitude af ECoG aktivitet i højere frekvenser, relative effektspektre for vågenhed, langsom bølge søvn, og paradoksal søvn er blevet log-forvandlet til mere passende visualisere og samtidig sammenligne aktiviteten i lave og høje frekvenser. Denne analyse viser de statsspecifikke forskelle i spektralaktiviteten under betingelser for cofilinininaktivering (figur 3B). Mere præcist påpeger disse foreløbige fund, der kombinerer mandlige og kvindelige mus, at cofilinininaktivering øger spektraleffekten betydeligt i hurtige frekvenser (14-30 Hz) under vågenhed og i langsomme frekvenser (1-4 Hz) under paradoksal søvn, mens ECoG-aktiviteten under langsom bølgesøvn hovedsageligt er upåvirket. Desuden synes cofilinininaktivering at øge variabiliteten mellem musene i ECoG-aktiviteten (især mærkbar fra fejllinjer for vågenhed i figur 3B).
Figur 1: Forberedelse af ECoG/EMG montagekomponenter og repræsentativt eksempel på ECoG elektrodeplacering. (A) En ECoG-elektrode: En guldtråd med en diameter på 4 mm og en guldtråd med en diameter på 4 mm (ikke-isoleret) smeltes på hovedet af en guldbeklædt skrue (1,9 mm hoveddiameter, 1,14 mm gevindmajometer, 3,6 mm totallængde) ved hjælp af blyfri lodde. (B) EMG-elektroder: To guldtråde (1,5 og 2 cm) er buede til at omfavne kraniets kurve op til nakkemusklen, og den anden ende holdes lige til loddet til stikket. (C) Et 6-kanals stik: Blyfri lodde tilsættes til 5 af de 6 metalstifter (uden en i midten) på stikket (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm metalstifter). Toppen af stikket er dækket af tape for at undgå kuld / vand infiltration. (D) Eksempel på placeringen af de tre vedligeholdelsesskruer på kraniet på venstre halvkugle og af de tre ECoG-elektroder (herunder en referenceelektrode) på højre halvkugle. De nøjagtige stereotaxiske koordinater for ECoG-elektroderne er angivet i trin 2.6 og 3.2 og er beregnet i henhold til bregma- og lambdaens placering (som er angivet med de gule prikker). Forkortelser: ECoG = elektrokortografisk; EMG = elektromyografisk. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentativ immunosang til definition af AAV-inficeret område og celletype. (A) Skematisk gengivelse, der viser injektionsstedet for koronaskiven, der præsenteres i panel B. Positionen er 1,1 mm foran bregmaen, og kanylen (vist med rødt) var målrettet mod lag V af den rigtige primære motoriske cortex (M1). Repræsentation ændret fra Franklin og Paxinos40. (B) Immunostaining af HA til påvisning af cofilin S3D-HA-ekspression i neuroner vist for en koronar skive af den fulde hjerne placeret ca. 1,1 mm forreste til bregma. Det inficerede område lokaliserer hovedsageligt til lag V og VI (infragranular lag) af højre primære og sekundære motor cortices (M1 og M2). Skalastang = 500 μm. Pladsen repræsenterer det område, der er vist i C. (C) Højere forstørrelse af det inficerede område, der viser farvning af inficerede celler og bekræfter udtryk for cofilinS3D-HA i dybere lag af den motoriske cortex. Skalastang = 100 μm. (D) Co-immunostaining af HA og CaMKIIα for at vurdere celletypespecifikitet vist for en koronarskive på højre halvkugle placeret ca. 0,5 mm forreste til bregma og derfor bagest til injektionsstedet (samme mus som i panelerne B og C). Det inficerede område lokaliseres til motor cortices (M1 og hovedsagelig M2). Skalastang = 500 μm. Kvadratet repræsenterer det område, der er vist i E, F og G. (E) Højere forstørrelse af det inficerede område, der viser farvning af inficerede celler og bekræfter udtryk for cofilinS3D-HA. Skalastang = 100 μm. (F) Højere forstørrelse af det inficerede område, der viser farvning af CaMKIIα-positive celler. Skalastang = 100 μm. (G) Højere forstørrelse af det inficerede område, der viser cofilincofilin S3D-HA og CaMKIIα, hvilket bekræfter, at inficerede celler er CaMKIIα-positive. Skalastang = 100 μm. Forkortelser: AAV = adeno-associeret virus; M1 = primær motorisk cortex; M2 = sekundær motorisk cortex; CPu = caudate putamen (striatum); LV = lateral ventrikel; HA= hemagglutinin; CamKIIα = calcium/calmodulinafhængig protein kinase II alpha. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative effektspektre for vågenhed, langsom bølgesøvn og paradoksal søvn opnået efter viral manipulation af cofilin-funktionen. Hanmus (n = 5 pr. gruppe) og hunmus (n = 2 pr. gruppe) injiceret med AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA(viral titer 2,58 × 1013 GC/mL) eller med kontrol AAV (AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP 1,25 ×10 13 GC/mL; halvdelen af testtitlen til kontrol for det forstærkede signal fra denne kontrol AAV) i lag V af den motoriske cortex blev registreret i 24 timer, og det elektrokortografiske signal blev underkastet spektralanalyse (hurtig Fourier Transform til beregning af spektraleffekt mellem 0,5 og 30 Hz med en opløsning på 0,25 Hz). (A)Effektspektre i de tre årvågenhedstilstande udtrykt i forhold til alle staters samlede magt. (B) Relativ effektspektrestamme, der omdannes til mere passende at repræsentere gruppeforskelle i højere frekvenser. Undertrykkelsen af cofilinaktiviteten i den motoriske cortex ved hjælp af AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HAøger elektrokorttisk aktivitet betydeligt i betaområdet (14-30 Hz) under vågenhed, og i deltaområdet (1-4 Hz) under paradoksal søvn i forhold til kontrolinjektioner (røde linjer over x akser indikerer Mann-Whitney U-test på frekvensbåndseffekt p < 0,05). Forkortelser: AAV = adeno-associeret virus GC = genomkopier; HA= hemagglutinin; CamKIIα = calcium/calmodulinafhængig proteinkinase II alpha; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol beskriver en præcis og ligetil metode til at overvåge ECoG- og EMG-aktivitet under manipulation af molekylære mål ved hjælp af AAV'er. For at sikre en passende sammenligning mellem grupperne anbefales det på det kraftigste altid at planlægge kirurgiske procedurer (AAV-injektion og elektrodeimplantation) samme dag for forsøgs- og kontroldyr og at registrere deres elektrofysiologiske signaler samtidigt. For at opnå et lignende viralt udtryk mellem forsøgs- og kontroldyrene er det ønskeligt at injicere den samme virale titer. I det foreliggende tilfælde var den virale kontroltitre AAV blevet reduceret til halvdelen af testenS AAV for at sikre et lignende viralt udtryk. Forsøgsfolk bør være meget forsigtige med målinger af stereotaxiske koordinater for at sikre lav variation mellem dyr i hjernens område/ kortikale lagmålretning. Da injektionsdybden beregnes ud fra kraniets overflade, og kraniets tykkelse varierer efter alder og køn, bør kanylens placering altid kontrolleres ved hjælp af histologi efter protokollen eller immunohistochemisteri (f.eks. figur 2) for at sikre tilstrækkelig positionering/dybde af injektionen, og de stereotaxiske koordinater bør om nødvendigt justeres. I løbet af 40-minutters AAV-injektionen er det meget vigtigt at overvåge injektionshastigheden for hurtigt at opdage og rette potentielle problemer såsom pumpeblokering. Nogle eksperimentelle trin er også afgørende for at opnå optimale elektrofysiologiske signaler. For eksempel må du ikke overscrew under elektrodeimplantation; skruer skal stikke ud af kraniet med mindst 2,5 mm for at minimere skader på hjernebarken og dannelsen af et glial ar. Bagefter er det også uhyre vigtigt at i) undgå at påføre cement til elektrodernes ekstremiteter, ii) sikre en hurtig lodning af elektroderne til stikket, og iii) sørg for, at der ikke er nogen kontakt mellem elektroderne.
Den procedure, der præsenteres her for ECoG- og EMG-optagelse, er ekstremt veletableret, enkel og meget udbredt til at overvåge vågenhed og søvn hos mus2,11,13,34. Kontinuerlige ECoG- og EMG-optagelser kan udføres i flere på hinanden følgende dage (og endda uger) og generere et meget rigt datasæt, der kan bruges til at udføre flere analyselinjer, der omfatter variabler relateret til vågenhed og søvnmængde og arkitektur2,11,12 (f.eks. tid brugt i forskellige tilstande pr. lys og mørke perioder, antal episoder i hver stat, 24-timers fordeling af søvn), vågenhed og søvnspektralindhold34,41 (f.eks. effekt i forskellige frekvensbånd [svarendetil figur 3 ], skalafri aktivitet) og karakteristika for individuelle bølger42,43,44 (f.eks. langsom bølge amplitude og hældning). Når det anvendes i kombination med AAV-medierede molekylære manipulationer, er en yderligere fordel at undgå potentiel udviklingskompensation, der kan forekomme hos transgene dyr. Med øvelse kan hele proceduren, herunder 40-minutters AAV-injektionen, udføres på ca. 90 minutter. Dødeligheden bør være (meget) lav, da operationen er minimalt invasiv.
Samtidig brug af ECoG/ EMG-optagelse og målrettet manipulation med AAV tilbyder en række andre fordele og applikationer. For eksempel er præcisionen af stereotaxisk målretning, når den udføres tilstrækkeligt, meget høj og replikerbar og er nyttig til at bestemme den specifikke rolle, som en given hjerneregion (og / eller en celletype eller et molekylært element i regionen) spiller i reguleringen af søvn eller andre fysiologiske processer. Flere forskellige kortikale områder kan således let målrettes ved hjælp af tilpasninger af den nuværende protokol. Desuden kan målmanipulationer ved hjælp af AAV'er rettes mod et kortikalt/subkortikalt område, der er forskelligt fra ECoG-registreringsstederne. I sådanne tilfælde kan burrhullet til AAV-injektion dækkes af en lille glasovertræksdækning, der er fastgjort ved hjælp af dentalcement (eller knoglevoks). For øget specificitet indeholder AAV-konstruktionen ofte en promotor, der tillader målrettet infektion af en præcis celletype14. En CamKIIα promotor blev brugt i denne protokol til specifikt at målrette excitatoriske pyramideceller14,29,45af den motoriske cortex. Denne strategi har gjort det muligt at inaktivere cofilin (ved hjælp af cofilinS3D)32,33 i excitatoriske neuroner af den motoriske cortex og observation af statsspecifikke ændringer i ECoG-aktivitet ( Figur3). For at vurdere infektions-/transduktionseffektiviteten kunne fremtidige protokolbrugere kombinere den præsenterede AAV-ECoG-protokol med en co-farvning ved immunfluorescens og bruge billeder med høj forstørrelse til at beregne antallet af celler, der viser dobbeltmærkning ud af det samlede antal celler, der viser enkeltmærkning af målet (her CaMKIIα-udtrykkende neuroner). I en nylig undersøgelse blev en AAV-ECoG-metode svarende til den, der er beskrevet her, brugt til at overekspressere skrøbelig X mental retardering syndrom-relateret protein 1 (FXR1) i alle neuroner af den motoriske cortex ved hjælp af en AAV, der indeholder en synapsinpromotor og afslørede en effekt af denne manipulation på årvågenhedstilstandsfordeling og spektralindhold28. Disse fund illustrerer, hvordan manipulering af et givet molekyle i en målhjerneregion ved hjælp af AAV'er kan afsløre roller i reguleringen af specifikke vågenheds- / søvnparametre.
En begrænsning af den beskrevne protokol er den lille læsion af hjernevæv, der forekommer med kanyleplacering, før AAV-injektionen udføres, hvilket også kan ledsages af en inflammatorisk reaktion. Dette kan give anledning til særlig bekymring, når der foretages AAV-injektion i subkortikale områder, og bør altid tackles ved hjælp af passende kontroller. Alternativt kan den nuværende protokol efterfølges af kvantificering af reaktiv gliose og/eller mikroglial aktivering (f.eks. ved hjælp af immunfluorescens) for at sikre lignende niveauer i kontrol- og testgrupper og dermed på ECoG-udlæsningen. En anden begrænsning vedrører risikoen for dårlig forbindelse mellem en elektrode og stikket, hvilket kan resultere i et kontinuerligt eller lejlighedsvis dårligt elektrofysiologisk signal. Solidt skruet, loddet og cementeret elektroder vil minimere forekomsten af dette problem. En tredje begrænsning er relateret til dyr, der bindes via hovedmontage under optagelsen, hvilket kan begrænse bevægelse og anden adfærd, i det mindste til en vis grad, og lejlighedsvis resultere i kablerskader og signaltab. Endelig er den præsenterede protokol mere egnet til voksne mus, da kraniestørrelsen af yngre dyr kan forårsage vanskeligheder med at installere den afbildede hovedmontage, som beskrevet tidligere2.
Kombineret ECoG/ EMG-optagelse og AAV-medieret manipulation af et præcist mål gælder også for andre forskningsområder end neurovidenskab af søvn. Blandt andet kan det bruges til at studere og manipulere epileptiske begivenheder i dyremodeller af beslaglæggelse og er et kraftfuldt værktøj til at modulere hjernesvingninger, der er involveret i hukommelseskodning og konsolidering46,47. Derfor omfatter potentielle anvendelser helt sikkert områderne grundforskning inden for psykiatri og neurologi, herunder neurodegenerative sygdomme. Ud over evnen til at udtrykke en inaktiv form af et molekyle kan og er AAV'er blevet brugt til at overekspressere eller nedregulere (f.eks. små forstyrrende RNA, CRISPR/Cas9) eller til at redde ekspressionen af et molekyle i en helkrops KO. Det er vigtigt, at den dobbelte metode i den nuværende protokol også gælder for andre pattedyrarter som rotter og døgn gnavere, der repræsenterer interessante modeller til at forstå både søvn og neurodegeneration48,49.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet blev finansieret af Canada Research Chair i Sleep Molecular Fysiologi. Forfatterne er taknemmelige for Chloé Provost og Caroline Bouchard for teknisk hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgery peparation | |||
| 21 G needle | Terumo | NN-2125R | |
| 6-channel connector | ENA AG | BPHF2-O6S-E-3.2 | Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below |
| Distrelec | 300-93-672 | Potential replacement for discontinued connector above | |
| C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | 000664 | B6 | Animals bred on site |
| Pluronic F-68 | Non-ionic surfactant | ||
| Gold wire 0.2 mm diameter | Delta scientific | 920-862-41 | Non-insulated |
| Hamilton syringe (10 μL) | Fisher Scientific | 14815279 | |
| Infusion syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
| Injection cannula 28 G | Plastics one | C313l-SPCL | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Ketamine (10 mg/mL) | SANDOZ | 4550 | |
| Lead-free solder | AIM | SN100C | |
| Lubricating ophthalmic ointment | ALLERGAN | 210889 | |
| PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
| Flat fillister head self tapping screws | MORRIS | FF00CE125 | ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length |
| Soldering iron | Weller | WES51 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
| Trimmer | Harvard Apparatus | 72-9063 | |
| Xylazine (20 mg/mL) | Bayer | 2169592 | |
| Intracortical AAV injection with syringe pump | |||
| 0.7 mm drill bit | Dremel | 628 | |
| AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA | UPenn Viral Core | ||
| AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP | UPenn Viral Core | ||
| Cotton tippped applicators | Medicom | 806 | |
| Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
| Extra-fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
| Stereotaxic arm | Stoelting | 51604U | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
| Surgical clamps | Fine science tools | 18050-28 | |
| Tissue scissor | Magna Stainless | M4-124 | |
| ECoG/EMG electrode implantation | |||
| Buprenorphine (0.3 mg/mL) | CEVA | 57133-02 | |
| Curved forceps | Fine science tools | 11001-12 | |
| Delicate task wipers | Kimtech | 34120 | |
| Dental acrylic cement | Yates Motloid | 44115 | |
| Dumont #5 forceps | Fine science tools | 91150-20 | |
| Extra fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
| Kelly forceps | Fine science tools | 13002-10 | |
| Liquid acrylic | Yates Motloid | 44119 | |
| Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting | Ethicon | MCP494 | |
| Providone-iodine 10% | Triad disposables | 10-8208 | |
| RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2 | 3M | 56849 | |
| Immunofluorescence and ECoG recording | |||
| 36-Channel EEG Wearable Headbox | LaMONT Medical | 832-000350 | |
| CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2) | Invitrogen | 13-7300 | Dilution 1:500 |
| Conductors Awg PVC Insulation Cable | Calmont Wire & Cables | HC-0819075R0 | |
| Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilution 1:1000 |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Dilution 1:500 |
| HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb | Cell signaling | 3724 | Dilution 1:800 |
| Programmable Amplifier | LaMONT Medical | 815-000002-S2 | |
| Stellate Harmonie | Natus | HSYS-REC-LT2 | |
| Swivel connector | Crist Instrument Company Inc. | 4-TBC-9-S |
References
- Campbell, I. G. EEG recording and analysis for sleep research. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 10 (unit 10.2) (2009).
- Mang, G. M., Franken, P. Sleep and EEG phenotyping in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 2 (1), 55-74 (2012).
- Bastien, C. H., et al. Insomnia and sleep misperception. Pathologie Biologie. 62 (5), 241-251 (2014).
- Malafeev, A., et al. Automatic artefact detection in single-channel sleep EEG recordings. Journal of Sleep Research. 28 (2), 12679 (2019).
- Latreille, V., et al. Electroencephalographic prodromal markers of dementia across conscious states in Parkinson's disease. Brain. 139, Pt 4 1189-1199 (2016).
- Rodrigues Brazete, J., et al. Electroencephalogram slowing predicts neurodegeneration in rapid eye movement sleep behavior disorder. Neurobiology of Aging. 37, 74-81 (2016).
- Kent, B. A., Strittmatter, S. M., Nygaard, H. B. Sleep and EEG power spectral analysis in three transgenic mouse models of Alzheimer's disease: APP/PS1, 3xTgAD, and Tg2576. Journal of Alzheimers Disease. 64 (4), 1325-1336 (2018).
- Chang, A. M., et al. Circadian gene variants influence sleep and the sleep electroencephalogram in humans. Chronobiology International. 33 (5), 561-573 (2016).
- Shi, G., Wu, D., Ptacek, L. J., Fu, Y. H. Human genetics and sleep behavior. Current Opinion in Neurobiology. 44, 43-49 (2017).
- Nakai, Y., et al. Calcineurin and its regulator sra/DSCR1 are essential for sleep in Drosophila. Journal of Neuroscience. 31 (36), 12759-12766 (2011).
- El Helou, J., et al. Neuroligin-1 links neuronal activity to sleep-wake regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9974-9979 (2013).
- Freyburger, M., et al. EphA4 is involved in sleep regulation but not in the electrophysiological response to sleep deprivation. Sleep. 39 (3), 613-624 (2016).
- Seok, B. S., et al. The effect of Neuroligin-2 absence on sleep architecture and electroencephalographic activity in mice. Molecular Brain. 11 (1), 52 (2018).
- Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
- Schmidt, F., Grimm, D. CRISPR genome engineering and viral gene delivery: a case of mutual attraction. Biotechnology Journal. 10 (2), 258-272 (2015).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Havekes, R., et al. Transiently increasing cAMP levels selectively in hippocampal excitatory neurons during sleep deprivation prevents memory deficits caused by sleep loss. Journal of Neuroscience. 34 (47), 15715-15721 (2014).
- Fuller, P. M., Yamanaka, A., Lazarus, M. How genetically engineered systems are helping to define, and in some cases redefine, the neurobiological basis of sleep and wake. Temperature. 2 (3), Austin. 406-417 (2015).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
- Ono, D., Yamanaka, A. Hypothalamic regulation of the sleep/wake cycle. Neuroscience Research. 118, 74-81 (2017).
- Shiromani, P. J., Peever, J. H. New neuroscience tools that are identifying the sleep-wake circuit. Sleep. 40 (4), 032 (2017).
- Oishi, N., et al. Artificial association of memory events by optogenetic stimulation of hippocampal CA3 cell ensembles. Molecular Brain. 12 (1), 2 (2019).
- Anaclet, C., et al. Genetic activation, inactivation, and deletion reveal a limited and nuanced role for somatostatin-containing basal forebrain neurons in behavioral state control. Journal of Neuroscience. 38 (22), 5168-5181 (2018).
- Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
- Torontali, Z. A., Fraigne, J. J., Sanghera, P., Horner, R., Peever, J. The sublaterodorsal tegmental nucleus functions to couple brain state and motor activity during REM sleep and wakefulness. Current Biology. 29 (22), 3803-3813 (2019).
- Rolls, A., et al. Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 13305-13310 (2011).
- Ognjanovski, N., Broussard, C., Zochowski, M., Aton, S. J. Hippocampal network oscillations rescue memory consolidation deficits caused by sleep loss. Cerebral Cortex. 28 (10), 3711-3723 (2018).
- Khlghatyan, J., et al. Fxr1 regulates sleep and synaptic homeostasis. EMBO Journal. 39 (21), 103864 (2020).
- Havekes, R., et al. Sleep deprivation causes memory deficits by negatively impacting neuronal connectivity in hippocampal area CA1. Elife. 5, 13424 (2016).
- Wong, L. W., Tann, J. Y., Ibanez, C. F., Sajikumar, S. The p75 neurotrophin receptor is an essential mediator of impairments in hippocampal-dependent associative plasticity and memory induced by sleep deprivation. Journal of Neuroscience. 39 (28), 5452-5465 (2019).
- Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
- Nagaoka, R., Abe, H., Obinata, T. Site-directed mutagenesis of the phosphorylation site of cofilin: its role in cofilin-actin interaction and cytoplasmic localization. Cell Motility and the Cytoskeleton. 35 (3), 200-209 (1996).
- Elam, W. A., et al. Phosphomimetic S3D cofilin binds but only weakly severs actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 292 (48), 19565-19579 (2017).
- Areal, C. C., Cao, R., Sonenberg, N., Mongrain, V. Wakefulness/sleep architecture and electroencephalographic activity in mice lacking the translational repressor 4E-BP1 or 4E-BP2. Sleep. 43 (2), (2020).
- Vyazovskiy, V., Borbely, A. A., Tobler, I. Unilateral vibrissae stimulation during waking induces interhemispheric EEG asymmetry during subsequent sleep in the rat. Journal of Sleep Research. 9 (4), 367-371 (2000).
- Sitnikova, E. Neonatal sensory deprivation promotes development of absence seizures in adult rats with genetic predisposition to epilepsy. Brain Research. 1377, 109-118 (2011).
- Tudor, J. C., et al. Sleep deprivation impairs memory by attenuating mTORC1-dependent protein synthesis. Science Signaling. 9 (425), 41 (2016).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), e52293 (2015).
- Dufort-Gervais, J., et al. Neuroligin-1 is altered in the hippocampus of Alzheimer's disease patients and mouse models, and modulates the toxicity of amyloid-beta oligomers. Scientific Reports. 10 (1), 6956 (2020).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates, Third edition. , Academic Press. New York. (2007).
- Lina, J. M., O'Callaghan, E. K., Mongrain, V. Scale-free dynamics of the mouse wakefulness and sleep electroencephalogram quantified using Wavelet-Leaders. Clocks & Sleep. 1 (1), 50-64 (2019).
- Massart, R., et al. The genome-wide landscape of DNA methylation and hydroxymethylation in response to sleep deprivation impacts on synaptic plasticity genes. Translational Psychiatry. 4, 347 (2014).
- Freyburger, M., Poirier, G., Carrier, J., Mongrain, V. Shorter duration of non-rapid eye movement sleep slow waves in EphA4 knockout mice. Journal of Sleep Research. 26 (5), 539-546 (2017).
- Hubbard, J., et al. Rapid fast-delta decay following prolonged wakefulness marks a phase of wake-inertia in NREM sleep. Nature Communications. 11 (1), 3130 (2020).
- Johansen, J. P., et al. Optical activation of lateral amygdala pyramidal cells instructs associative fear learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (28), 12692-12697 (2010).
- Boyce, R., Glasgow, S. D., Williams, S., Adamantidis, A. Causal evidence for the role of REM sleep theta rhythm in contextual memory consolidation. Science. 352 (6287), 812-816 (2016).
- Bandarabadi, M., et al. Dynamic modulation of theta-gamma coupling during rapid eye movement sleep. Sleep. 42 (12), 182 (2019).
- Estrada, C., et al. Transcranial magnetic stimulation and aging: Effects on spatial learning and memory after sleep deprivation in Octodon degus. Neurobiology of Learning and Memory. 125, 274-281 (2015).
- Hurley, M. J., et al. The long-lived Octodon degus as a rodent drug discovery model for Alzheimer's and other age-related diseases. Pharmacology & Therapeutics. 188, 36-44 (2018).
