Login processing...

JoVE Journal
Chemistry
Author Produced

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Chemistry

Kovalent merking med Diethylpyrokarbonat for å studere protein høyere orden struktur ved massespektrometri

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

Journal (Chemistry)

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

Amide Coupling Reaction for the Synthesis of Bispyridine-based Ligands and Their Complexation to Platinum as Dinuclear Anticancer Agents

Journal (Chemistry)

Amide Coupling Reaction for the Synthesis of Bispyridine-based Ligands and Their Complexation to Platinum as Dinuclear Anticancer Agents

Click here for the English version

Kovalent merking med Diethylpyrokarbonat for å studere protein høyere orden struktur ved massespektrometri

Article DOI: 10.3791/61983-v

June 15th, 2021 •

Zachary J. Kirsch¹, Blaise G. Arden¹, Richard W. Vachet*^1,2, Patanachai Limpikirati*³

¹Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, ²Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, ³Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University

* These authors contributed equally

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

June 15th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

De eksperimentelle prosedyrene for å utføre dietylpyrokarbonatbasert kovalentmerking med massespektrometrisk deteksjon er beskrevet. Diethylpyrokarbonat blandes ganske enkelt med protein- eller proteinkomplekset av interesse, noe som fører til modifikasjon av løsningsmiddel tilgjengelige aminosyrerester. De modifiserte rester kan identifiseres etter proteolytisk fordøyelse og flytende kromatografi / massespektrometrianalyse.

Transcript

Karakterisering av en proteinstruktur er avgjørende for å forstå funksjonen. Massespektrometri har dukket opp som et kraftig verktøy for dette formålet, spesielt for proteinsystemer som er vanskelige å studere ved tradisjonelle metoder. For å studere en proteinstruktur etter massespesifikasjon, utføres spesifikke kjemiske reaksjoner i løsning som koder en proteinstrukturinformasjon i massen.

En spesielt effektiv tilnærming er å bruke reagenser som kovalent endrer løsning av tilgjengelige aminosyrer sidekjeder. Disse reaksjonene fører til masseøkninger som kan lokaliseres med restnivåoppløsning når de kombineres med proteolytisk fordøyelse og tandemmassespektrometri. Her beskrev vi protokollene knyttet til bruk av dietylpyrokarbonat eller DEPC som et kovalente merkingsreagens sammen med massespesifikasjonsdeteksjon.

DEPC er et svært elektrofilt molekyl som er i stand til å merke opptil 30% av rester i det gjennomsnittlige proteinet, og gir dermed utmerket strukturell oppløsning. DEPC har blitt brukt sammen med massespesifikasjoner for å få strukturell informasjon for mange forskjellige proteiner. Begynn med å forberede en bufret løsning av ditt protein av interesse ved en konsentrasjon i området titalls mikromolar.

Vi bruker vanligvis en 10 millimolar pH 7.4 MOPS buffer. Alternativt kan en eksisterende proteinløsning være bufferutveksling til MOPS eller en annen buffer hvis den opprinnelige prøven inneholder en buffer som har nukleofile funksjonelle grupper. Det er nødvendig at bufferen ikke har nukleofile funksjonelle grupper fordi de vil forstyrre DEPC-proteinreaksjonen.

I et annet mikrorør, lag en lagerløsning på 100 millimolar DEPC i tørr acetonitril. Forberedelse av lagerløsningen i tørr acetonitril er nødvendig for å forhindre hydrolyse av DEPC. I et nytt mikrorør, lag løsning av en molar imidazol i HPLC-klasse vann.

Bland MOPS-bufferen og proteinløsningen i et nytt mikrorør. Til proteinet og bufferen legger du til en aliquot av DEPC-lagerløsningen og sørger for at den blandes riktig før du plasserer reaksjonsblandingen i et 37 grader Celsius vannbad i ett minutt. Volumet av DEPC-lagerløsningen som brukes, bør velges basert på det endelige DEPC-proteinkonsentrasjonsforholdet som er ønsket.

Det er ingen sett med DEPC og proteinkonsentrasjoner som vil fungere med hvert protein, selv om den optimale DEPC-konsentrasjonen kan estimeres basert på antall løsningsmiddel tilgjengelige histidin- og lysinrester som er tilstede i proteinet. Det skal bemerkes at volumet av acetonitril tilsatt, som effektivt er volumet av DEPC-løsningen som tilsettes, ikke bør overstige 1% av det totale reaksjonsvolumet for å unngå perturbasjon av proteinstrukturen under reaksjonen. Reaksjonstiden er til slutt opp til brukeren, selv om en ett minutts reaksjon under eksempelbetingelsen minimerer over merking av protein og hydrolyse av DEPC.

Etter at ett minutt har gått, slukker du reaksjonen ved å legge til imidazolet for å samle de resterende på reagert DEPC. Sørg for at den endelige konsentrasjonen av imidazol er 50 ganger DEPC-konsentrasjonen. For å identifisere rester som er modifisert av DEPC, må proteinet proteolytisk fordøyes i peptidfragmenter.

For fordøyelsen, velg forhold som er mottagelige for protein av interesse. Vanlige trinn som er beskrevet her innebærer å utfolde protein og deretter redusere og alkylere disulfidbindinger slik at fordøyelseseffektiviteten kan forbedres. Etter vår erfaring forbedrer utfoldelse av proteinet med en denaturant og varme før fordøyelsen effektiviteten av fordøyelsen.

Mens protein utfoldes, sammenlign løsninger av TCEP og iodoacetamid i en passende fordøyelsesbuffer. TCEP bør brukes som reduksjonsmiddel i stedet for dithiothreitol eller DTT fordi DTT kan reagere med DEPC-modifiserte rester. Alkylering av de resulterende filene etter reduksjon er viktig for å unngå etikett scrambling der gratis filer og proteinet reagerer med modifiserte aminosyrer.

Når det utfoldende trinnet er ferdig, reduser disulfidbindingene ved å legge TCEP til reaksjonsblandingen og la den reagere i tre minutter ved romtemperatur. Etter reduksjon, tilsett iodoacetamid til reaksjonsblandingen, la den reagere i 30 minutter ved romtemperatur i mørket. Oppnås her ved å plassere reaksjonsblandingen i en boks.

Den endelige konsentrasjonen av iodoacetamid bør være dobbelt så stor konsentrasjon som brukes til TCEP eller 80 ganger proteinkonsentrasjonen eller disulfidbindingen. Forbered enzymet av interesse, vanligvis trypsin eller chymotrypsin i henhold til produsentens spesifikasjoner. Etter å ha forberedt det valgte enzymet, start fordøyelsen og inkuber reaksjonsblandingen ved 37 grader Celsius.

Et 10:1 protein til enzymforhold med en tre timers fordøyelse ved hjelp av immobiliserte enzymer er vanligvis et godt valg for DEPC-merkede proteiner. Etter fordøyelsen bør prøven enten umiddelbart analyseres av LC-MS/MS eller blinke frosset med flytende nitrogen for å minimere nedbrytning av prøven og etiketttapet. Standard LC-MS/MS-parametere for proteomikk nederst opp kan brukes til å identifisere merkede steder på proteolytiske peptidfragmenter.

Den omvendte fasen C18 stasjonær fase bør brukes til å oppnå best mulig separasjon av peptider. Vår erfaring er at kapillær LC gir mer pålitelig kvantitativ informasjon om modifikasjonsnivåer enn nano LC på grunn av de høyere utvalgsmengdene som brukes. En typisk LC-mobilfase som brukes til å skille DEPC-merkede peptider, består av to løsningsmidler.

Løsningsmiddel A er vann med 0,1% maursyre og løsningsmiddel B er et acetonitril med 0,1% maursyre. En gradient elution brukes, og separasjonstiden kan optimaliseres basert på prøvekompleksitet. Et massespektrometer som er i stand til å gjøre online LC-MS og MS / MS er nødvendig for å identifisere DEPC-modifikasjonssteder på peptidene.

I våre eksperimenter har vi med hell brukt flere typer massespektrometre. Vi har funnet ut at en Thermo Orbitrap Fusion gir gode resultater, selv om ethvert massespektrometer som er i stand til automatisk å utføre MS / MS av mange peptider i løpet av en LC-MS-analyse, bør være egnet. HPLC-forhold og massespektrometriske parametere bør stilles inn riktig før målingen.

Hvis prøven har blitt blinket frosset, bør den tines rett før analyse. Prøv ditt beste for å minimere tiden mellom prøvepreparering og HPLC-injeksjon. Last inn og injiser den fordøyde merkede proteinprøven i LC-systemet og start LC-MS/MS-oppkjøpet eller DEPC-merkingsstedsidentifikasjonen og toppområde kvantifisering, det finnes flere metoder.

På Thermo Fisher instrumenter, excalibur eller proteome oppdager kanskje brukt. Angi passende parametere for peptididentifikasjon i et program. DEPC-tillegg og karbamidometylering er inkludert som variable modifikasjoner som hjelper rester eller tildelt.

Kromatografiske toppområder i modifiserte og umodifiserte versjoner av peptidene brukes til å bestemme restnivåmodifikasjonsprosenter. DEPC-merking med MS-deteksjon er også et verdifullt verktøy for å karakterisere strukturelle endringer i proteiner med høyere rekkefølge. Fra vår studie kan DEPC kovalente merking identifisere spesifikke proteinregioner som gjennomgår strukturelle endringer på termisk og oksidativt stress.

I figuren vises betydelige endringer i modifikasjonsprosenter i blått for nedgangen i merking og rødt for økningen i merking, mens rester uten vesentlige merkingsendringer vises i lysegrønn. For eksempel, etter at beta-2 mikroglobulin er utsatt for varmestress, er mange rester som gjennomgår betydelige reduksjoner i merkeutstrekninger, N-terminus, serin 28, histidin 31, serin 33, serin 55, serin 57 og lysin 58 nærmere enn den ene siden av proteinet som tyder på at denne regionen av proteinet gjennomgår en bekreftelsesendring eller muligens medieaggregering. Etter at proteinet er utsatt for oksidativt stress, oppstår forskjellige rester med en reduksjon i merking, serin 11, histidin 13, lysin 19, lysin 41 og lysin 94 fra en klynge på en annen fase av proteinet som indikerer at oksidasjonen induserte konfirmasjonsendring forekommer andre steder.

Denne studien har viktige implikasjoner for proteinterapeutikk, som for tiden er det raskest voksende segmentet av det farmasøytiske markedet. Annet arbeid fra vår gruppe har også vist at DEPC kovalente merking massespesifikasjoner kan oppdage og identifisere steder for konfirmasjonelle endringer i stressede monoklonale antistoffterapeutiske behandlinger. Som du kan se, er kovalent merking med DEPC enkel å implementere eksperimentelt, men kan likevel gi verdifull strukturell informasjon for proteiner.

Den strukturelle oppløsningen fra DEPC-merkingsmassespesifikasjonen er beskjeden sammenlignet med teknikkene som røntgenkrystallografi og NMR, men den er mottagelig for nesten alle proteiner uavhengig av størrelse eller evne til å bli krystallisert. DEPC kovalente merking massespesifikasjoner fungerer også med proteinblandinger og kan fungere med svært kompliserte prøvetyper, for eksempel cellelys og det haCat-celler. Etter å ha sett denne videoen, er vi sikre på at du vil finne DEPC-merking et nyttig verktøy for å karakterisere proteinstruktur.

X

Simple Hit Counter