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Bioengineering

मॉड्यूलर गोल्डन गेट क्लोनिंग का उपयोग करके मल्टी-जीन निर्माण की रैपिड असेंबली

Published: February 5, 2021 doi: 10.3791/61993
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biological Sciences, University at Buffalo, State University of New York
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य गोल्डन गेट क्लोनिंग के आधार पर मॉड्यूलर क्लोनिंग प्रणाली का उपयोग करके बहु-जीन निर्माण कोडांतरण के लिए एक विस्तृत, कदम-दर-कदम गाइड प्रदान करना है। यह हमारे अनुभवों के आधार पर इष्टतम असेंबली सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदमों पर सिफारिशें भी देता है।

Abstract

गोल्डन गेट क्लोनिंग विधि किसी भी उपयोगकर्ता परिभाषित व्यवस्था में कई जीन की तेजी से विधानसभा सक्षम बनाता है । यह प्रकार IIS प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करता है जो उनकी मान्यता साइटों के बाहर काटते हैं और एक छोटी अधिकता बनाते हैं। यह मॉड्यूलर क्लोनिंग (MoClo) प्रणाली एक पदानुक्रमित कार्यप्रवाह का उपयोग करती है जिसमें विभिन्न डीएनए भागों, जैसे प्रमोटर, कोडिंग दृश्य (सीडीएस), और टर्मिनेटर, पहले एक प्रवेश वेक्टर में क्लोन किए जाते हैं। कई प्रवेश वैक्टर तो प्रतिलेखन इकाइयों में इकट्ठा। कई ट्रांसक्रिप्शन इकाइयां फिर एक बहु-जीन प्लाज्मिड में कनेक्ट होती हैं। गोल्डन गेट क्लोनिंग रणनीति जबरदस्त लाभ की है क्योंकि यह एक बर्तन प्रतिक्रिया में निशान कम, दिशात्मक, और मॉड्यूलर विधानसभा की अनुमति देता है । पदानुक्रमित कार्यप्रवाह आम तौर पर प्रवेश वैक्टर से परे अनुक्रमण की कोई आवश्यकता नहीं के साथ बहु-जीन निर्माण की एक बड़ी विविधता की फेसियल क्लोनिंग को सक्षम बनाता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन ड्रॉपआउट का उपयोग आसान दृश्य स्क्रीनिंग को सक्षम बनाता है। यह काम खमीर मॉड्यूलर क्लोनिंग (MoClo) किट का उपयोग कर बहु जीन प्लाज्मिड कोडांतरण के लिए एक विस्तृत, कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है । हम बहु-जीन प्लाज्मिड असेंबली के इष्टतम और उप-इष्टतम परिणाम दिखाते हैं और कॉलोनियों के लिए स्क्रीनिंग के लिए एक गाइड प्रदान करते हैं। यह क्लोनिंग रणनीति खमीर मेटाबोलिक इंजीनियरिंग और अन्य स्थितियों के लिए अत्यधिक लागू होती है जिसमें बहु-जीन प्लाज्मिड क्लोनिंग की आवश्यकता होती है।

Introduction

सिंथेटिक जीव विज्ञान का उद्देश्य दवा, कृषि और रासायनिक उद्योगों के लिए उपयोगी नई कार्यक्षमताओं के साथ जैविक प्रणालियों को इंजीनियर करना है। एक उच्च थ्रूपुट तरीके से डीएनए के टुकड़ों की बड़ी संख्या कोडांतरण सिंथेटिक जीव विज्ञान में एक मूलभूत प्रौद्योगिकी है । इस तरह की जटिल प्रक्रिया जटिलता को कम करने के साथ कई स्तरों में टूट सकती है, बुनियादी इंजीनियरिंग विज्ञान1,2से उधार ली गई अवधारणा। सिंथेटिक जीव विज्ञान में, डीएनए टुकड़े आमतौर पर कार्यक्षमता के आधार पर पदानुक्रम से इकट्ठा होते हैं: (i) भाग स्तर: "भाग" एक विशिष्ट कार्य के साथ डीएनए टुकड़ों को संदर्भित करता है, जैसे कि प्रमोटर, एक कोडिंग अनुक्रम, एक टर्मिनेटर, प्रतिकृति की उत्पत्ति; (ii) ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों (टीयू) स्तर: एक टीयू में एक प्रमोटर, एक कोडिंग अनुक्रम और एक एकल जीन को पार करने में सक्षम टर्मिनेटर होता है; (iii) बहु-जीन स्तर एक बहु-जीन प्लाज्मिड में कई टीयू होते हैं जिनमें अक्सर एक संपूर्ण मेटाबोलिक मार्ग शामिल होता है । बायोब्रिक समुदाय द्वारा बीड़ा उठाया गया यह पदानुक्रमित असेंबली सिंथेटिक जीव विज्ञान3में डीएनए के बड़े सेटों की असेंबली के लिए मूलभूत अवधारणा है।

पिछले4, 5,6,7दशक में गोल्डन गेट क्लोनिंग तकनीक ने पदानुक्रमित डीएनए असेंबली2को काफी सुविधा प्रदान की है . गिब्सन क्लोनिंग8,लिगेशन-इंडिपेंडेंट क्लोनिंग (एससीआईएल)9,यूरासिल एक्सिशन-बेस्ड क्लोनिंग (यूजर)10,लिगास साइक्लिंग रिएक्शन (एलसीआर) 11 और वीवो रिकॉम्बिनेशन (डीएनए असेंबलर)12,13जैसे कई अन्य मल्टी-पार्ट क्लोनिंग तरीके भी अब तक विकसित किए गए हैं । लेकिन गोल्डन गेट क्लोनिंग एक आदर्श डीएनए विधानसभा विधि है क्योंकि यह जीन विशिष्ट दृश्यों से स्वतंत्र है, एक बर्तन प्रतिक्रिया में निशान कम, दिशात्मक, और मॉड्यूलर विधानसभा की अनुमति । गोल्डन गेट क्लोनिंग प्रकार IIS प्रतिबंध एंजाइमों का लाभ लेता है जो मान्यता साइट2के बाहर कंपित ओवरहैंग बनाने के लिए एक गैर-पैलिंड्रोमिक अनुक्रम को पहचानते हैं। एक ligase तो एक बहु भाग विधानसभा प्राप्त करने के लिए annealed डीएनए टुकड़े में मिलती है । मॉड्यूलर क्लोनिंग (MoClo) प्रणाली के लिए इस क्लोनिंग रणनीति लागू करने के लिए 90% से अधिक परिवर्तनकर्ताओं सही ढंग से इकट्ठे निर्माण4युक्त जांच के साथ 10 डीएनए टुकड़े करने के लिए इकट्ठा सक्षम है।

MoClo प्रणाली जबरदस्त लाभ है कि सिंथेटिक जीव विज्ञान के डिजाइन निर्माण परीक्षण चक्र में तेजी आई है प्रदान करता है । सबसे पहले, इंटरचेंजेबल हिस्से तेजी से मापदंडों की एक बड़ी जगह का परीक्षण करने के लिए संयोजन क्लोनिंग को सक्षम करते हैं। उदाहरण के लिए, मेटाबोलिक मार्ग का अनुकूलन आमतौर पर मार्ग प्रवाह को संतुलित करने के लिए प्रत्येक जीन के लिए कई प्रमोटरों के माध्यम से साइकिल चालन की आवश्यकता होती है। MoClo प्रणाली आसानी से इस तरह की मांग क्लोनिंग कार्यों को संभाल कर सकते हैं । दूसरे, एक भाग प्लाज्मिड अनुक्रम की जरूरत है, लेकिन आम तौर पर नहीं टीयू या बहु जीन प्लाज्मिड । ज्यादातर मामलों में, कॉलोनी पीसीआर द्वारा स्क्रीनिंग या प्रतिबंध पाचन टीयू और बहु-जीन प्लाज्मिड स्तर पर सत्यापन के लिए पर्याप्त है। इसका कारण यह है कि भाग प्लाज्मिड क्लोनिंग पीसीआर की आवश्यकता होती है, जो अक्सर म्यूटेशन का परिचय देता है। तीसरा, MoClo प्रणाली बहु जीन जटिल मेटाबोलिक रास्ते के निर्माण के लिए आदर्श है । अंत में, सार्वभौमिक ओवरहैंग के कारण, भाग प्लाज्मिड को पूरे बायोइंजीनियरिंग समुदाय के साथ पुन: इस् तेमित और साझा किया जा सकता है। वर्तमान में, 14 ,15, 5,16,17,कवक 6,18, 19,20,21,22,बैक्टीरिया 7 ,23,24, 25,26,27,और जानवरों केलिए 28,29पौधों के लिए MoClo किट उपलब्ध हैं। हाल ही में30को एक मल्टी-किंगडम मोक्लो प्लेटफॉर्म भी पेश किया गया है ।

सैकरोमाइसेस सेरेविसिया केलिए, ली एट अल6 ने एक बहुमुखी मोक्लो टूलकिट विकसित किया है, जो खमीर सिंथेटिक जीव विज्ञान समुदाय के लिए एक उत्कृष्ट संसाधन है। यह किट एक सुविधाजनक 96-अच्छी तरह से प्रारूप में आती है और अच्छी तरह से विशेषता वाले प्रमोटरों, फ्लोरोसेंट प्रोटीन, टर्मिनेटर, पेप्टाइड टैग, चयन मार्कर, प्रतिकृति की उत्पत्ति और जीनोम संपादन उपकरणों के विविध संग्रह के साथ आठ प्रकार के विनिमेय डीएनए भागों को परिभाषित करती है। यह टूलकिट एक बहु-जीन प्लाज्मिड में पांच ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों की असेंबली की अनुमति देता है। ये विशेषताएं खमीर मेटाबोलिक इंजीनियरिंग के लिए मूल्यवान हैं, जिसमें लक्षित रसायनों का उत्पादन करने के लिए आंशिक या पूरे रास्ते अधिक व्यक्त किए जाते हैं। इस किट का उपयोग करते हुए, शोधकर्ताओं ने खमीर में जेरनियाल, लिनालूल31,पेनिसिलिन32,म्यूकोनिक एसिड33,इंडिगो34और बेतालिन35 के उत्पादन को अनुकूलित किया है।

यहां हम या तो एपिसोमल या जीनोमिक अभिव्यक्ति के लिए बहु-जीन रास्ते उत्पन्न करने के लिए MoClo टूलकिट के उपयोग का मार्गदर्शन करने के लिए एक विस्तृत, कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस किट के व्यापक उपयोग के माध्यम से, हमने पाया है कि डीएनए सांद्रता का सटीक माप गोल्डन गेट प्रतिक्रिया में प्रत्येक भाग के सममोलीय वितरण सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम टी 7 डीएनए लिगाज़ पर टी 4 डीएनए लिगाज़ की भी सलाह देते हैं क्योंकि पूर्व में अधिक संख्या में ओवरहैंग्स36के साथ बेहतर काम करता है। अंत में, बीएसएमबीआई और बीएसएआई के किसी भी आंतरिक मान्यता स्थलों को विधानसभा से पहले हटाया जाना चाहिए या पालतू होना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, कोई भी कई आंतरिक साइटों को हटाने और एक साथ कोडन अनुकूलन प्राप्त करने के लिए भागों को संश्लेषित करने पर विचार कर सकता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि एस सेरेविसिया में β-कैरोटीन और लाइकोपीन उत्पादन के लिए पांच जीन मार्ग व्यक्त करके इस टूलकिट का उपयोग कैसे करें। हम आगे दिखाते हैं कि इस किट से जीनोम-संपादन उपकरणों का उपयोग करके ADE2 लोकस को कैसे खटखटाया जाए। इन रंग आधारित प्रयोगों को आसान दृश्य के लिए चुना गया था। हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि फ्यूजन प्रोटीन कैसे उत्पन्न करें और गोल्डन गेट क्लोनिंग का उपयोग करके अमीनो एसिड म्यूटेशन बनाएं।

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Protocol

नोट: इस टूलकिट में पेश किए गए पदानुक्रमित क्लोनिंग प्रोटोकॉल को तीन प्रमुख चरणों में विभाजित किया जा सकता है: 1. क्लोनिंग भाग प्लाज्मिड; 2. क्लोनिंग ट्रांसक्रिप्शन इकाइयां (TUs); 3. मल्टी-जीन प्लाज्मिड्स की क्लोनिंग(चित्रा 1)। यह प्रोटोकॉल प्राइमर डिजाइन से शुरू होता है और क्लोन किए गए मल्टी-जीन प्लाज्मिड के अनुप्रयोगों के साथ समाप्त होता है।

1. भाग प्लाज्मिड (pYTK001) क्लोनिंग के लिए प्राइमर डिजाइन:

  1. 5 ' अंत में फ्लैंकिंग न्यूक्लियोटाइड टीटीटी युक्त फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर डिजाइन करें, एक अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइड (सीजीटीसीटीसीएन), एक 4-न्यूक्लियोटाइड (एनटी) ओवरहांग (टीसीजी) के पूरक के साथ एक बीएसएमबीआई मान्यता साइट, प्रवेश वेक्टर के पूरक, टेम्पलेट-विशिष्ट अनुक्रम(चित्रा 2 ए)के अलावा एक अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइड (जीजीटीसीएन) और 4-एनटी पार्ट-स्पेसिफिक ओवरहांग के साथ एक बीएसएआई मान्यता स्थल। गोल्डनब्रैड 4.037 और गोल्डनमुटेनेसिस38 कुछ ऑनलाइन सॉफ्टवेयर हैं जिनका उपयोग गोल्डन गेट विशिष्ट प्राइमर डिजाइन के लिए किया जा सकता है।
  2. यदि बीएसएआईआई या बीएसएमबीआई मान्यता स्थल किसी भी भाग में मौजूद हैं, तो गोल्डन गेट असेंबली39से पहले इन साइटों को म्यूट करने के लिए एक पालतू चरण का उपयोग करें। एकीकृत प्लाज्मिड्स (चरण 4 देखें) के लिए, किसी भी नोटी मान्यता साइट को पालतू करें। एक अवांछनीय मान्यता स्थल के साथ एक भाग को पालतू बनाने के लिए, भाग को अवांछनीय साइट(चित्रा 2 ए)के पास दो उपभागों में विभाजित करें:
    1. पहले सबपार्ट के फॉरवर्ड प्राइमर को उसी तरीके से डिजाइन करें जैसे स्टेप 1.1 में। लेकिन बीएसएमबीआई साइट और केवल 4-एनटी जीन-विशिष्ट ओवरहांग के साथ रिवर्स प्राइमर डिजाइन करें।
    2. बीएसएमबीआई साइट और 4-एनटी जीन-विशिष्ट ओवरहांग के साथ दूसरा उप-भाग फॉरवर्ड प्राइमर डिजाइन करें जो पहले उप-भाग के रिवर्स प्राइमर के साथ ओवरलैप होता है। दूसरे उप-भाग के रिवर्स प्राइमर को उसी तरीके से डिजाइन करें जैसे चरण 1.1 में।
    3. प्राइमर के जीन-विशिष्ट क्षेत्र में रिवर्स (चरण 1.2.1 के लिए) या फॉरवर्ड प्राइमर (चरण 1.2.2) में वांछित उत्परिवर्तन (एस) पेश करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक BSmBI-और BsaI मुक्त और codon-अनुकूलित हिस्सा व्यावसायिक रूप से संश्लेषित किया जा सकता है । कोडिंग दृश्यों (सीडीएस) के लिए, एक पर्यायवाची उत्परिवर्तन को अमीनो एसिड कोडन के तीसरे न्यूक्लियोटाइड पर आसानी से शामिल किया जा सकता है। प्रमोटरों और टर्मिनेटर के लिए, हालांकि, रिपोर्टर परख का उपयोग करके उत्परिवर्तित प्रमोटर या टर्मिनेटर गतिविधि की जांच करने की सिफारिश39है। यदि अनुक्रम के अंत की ओर एक अवांछनीय प्रतिबंध स्थल है, तो इसे लंबे रिवर्स प्राइमर का उपयोग करके म्यूट किया जा सकता है। यदि कई अवांछनीय साइटें मौजूद हैं, तो साइट निर्देशित म्यूटेनेसिस कई साइटों को म्यूट करने की अनुमति देता है40प्रदर्शन किया जा सकता है।
  3. कभी-कभी, बीच में एक लिंकर के साथ एक भाग के रूप में दो प्रोटीन को फ्यूज करना वांछनीय है(चित्रा 2A)। लिंकर दो अलग - अलग प्रोटीनकीसंरचनात्मक अखंडता सुनिश्चित करने में मदद करता है ।
    1. पहले जीन के लिए फॉरवर्ड प्राइमर चरण 1.1 में समान है। रिवर्स प्राइमर में, एक BSmBI साइट, एक 4-nt जीन विशिष्ट ओवरहांग, और एक लिंकर अनुक्रम शामिल हैं । 4-nt ओवरहांग या तो लिंकर या दूसरे जीन के पहले कुछ न्यूक्लियोटाइड हो सकते हैं ।
    2. दूसरे जीन के लिए, फॉरवर्ड प्राइमर को इस तरह डिजाइन करें कि इसमें एक BSmBI मान्यता साइट है और पहले जीन के रिवर्स प्राइमर के पूरक 4-एनटी ओवरहांग पूरक है। दूसरे जीन के रिवर्स प्राइमर को चरण 1.1 में डिजाइन करें।
  4. पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर)42द्वारा भागों को बढ़ाने के लिए, जीनोमिक डीएनए, सीडीएनए या प्लाज्मिड से भागों को बढ़ाने के लिए उच्च निष्ठा डीएनए पॉलीमरेज का उपयोग करें। 1% एगर उठे जेल पर पीसीआर उत्पाद की जांच करें और उसके बाद जेल-शुद्धि। शुद्ध डीएनए का उपयोग दृढ़ता से सिफारिश की जाती है, यदि जेल शुद्धि श्रमसाध्य है, तो पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करने के लिए कम से कम एक स्पिन कॉलम का उपयोग करें।

2. पार्ट प्लाज्मिड्स(चित्रा 2B)बनाने के लिए प्रवेश वेक्टर (pYTK001) में क्लोनिंग भागों

  1. गोल्डन गेट रिएक्शन मिक्स स्थापित करने के लिए, प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के 20 एफएमोल और प्रवेश वेक्टर (pYTK001), 10X T4 ligase बफर के 1μL, Esp3I के 0.5 माइक्रोन (बीएसएमबीआई का एक अत्यधिक कुशल आइसोस्चिजोमर), और T4se के 0.5 माइक्रोनल जोड़ें। कुल वॉल्यूम को 10 माइक्रोल में लाने के लिए डीडीएच2ओ जोड़ें।
  2. क्लोनिंग प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए, थर्मोसाइकिलर में निम्नलिखित कार्यक्रम चलाएं: 5 मिनट (पाचन) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के 25-35 चक्र और 5 मिनट (लिगेशन) के लिए 16 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम पाचन और 10 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम निष्क्रियता।
    नोट: पाचन/लिगेशन के ३५ चक्रों की सिफारिश की जाती है जब एक साथ प्रवेश वेक्टर में कई डीएनए टुकड़ों क्लोनिंग, उदाहरण के लिए, संलयन जीन की क्लोनिंग के दौरान या एक जीन पालतू ।
  3. हीट शॉक द्वारा डीएच5α तनाव या समकक्ष एस्चेरिचिया कोलाई रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं में पूरी प्रतिक्रिया मिश्रण को बदल दें। पूरे 10 μL क्लोन उत्पाद को 35 माइक्रोन रासायनिक रूप से सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं (2 X 105 4fu/mL) में बदलने, सीआईएफयू की गणना सक्षम कोशिकाओं के 100 माइक्रोन में 5 एनजी pYTK001 को बदलने से की जाती है) की सिफारिश की जाती है। 35 माइक्रोनजी/एमएल क्लोरम्फेनिकोल (मुख्यमंत्री) के साथ एक लिसोजनी शोरबा (एलबी) प्लेट पर फैलाएं। रात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  4. 16-18 घंटे के बाद, प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और प्लेट को लगभग 5 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ताकि सुपर फोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एसएफजीएफपी) अधिक तीव्र हरे रंग के लिए विकसित हो सके।
  5. आसान स्क्रीनिंग के लिए प्लेट को पराबैंगनी (यूवी) या नीली बत्ती वाले ट्रांसिल्यूमिनेटर पर रखें। कॉलोनियों से युक्त एसएफजीएफपी यूवी लाइट के नीचे फ्लोरोरेस होगा।
  6. हरी उपनिवेश नकारात्मक हैं क्योंकि उनमें अनकट pYTK001 होते हैं। सफेद कॉलोनियों की संभावना सकारात्मक है । क्लोनिंग आमतौर पर सफल होती है यदि ~ 30-100% सफेद उपनिवेश हैं। कॉलोनी पीसीआर या प्रतिबंध पाचन (सुझाए गए एंजाइम: बीएसएआई-एचएफवी 2) द्वारा कुछ सफेद कॉलोनियों की आगे की स्क्रीनिंग करें।
  7. कुछ संभावित सही उपनिवेशों से प्लाज्मिड को शुद्ध करें और सेंगर अनुक्रमण द्वारा दृश्यों की पुष्टि करें।

3. "कैसेट" प्लाज्मिड्स में भाग प्लाज्मिड कोडांतरण

नोट: एक कैसेट प्लाज्मिड में एक उपयोगकर्ता-परिभाषित ट्रांसक्रिप्शन यूनिट (टीयू) होता है जिसमें एक प्रमोटर, एक सीडीएस और टर्मिनेटर होता है। एक कैसेट प्लाज्मिड एक जीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। यदि कैसेट प्लाज्मिड को एक बहु-जीन प्लाज्मिड में इकट्ठा किया जाएगा, तो पहला कदम बहु-जीन प्लाज्मिड में टीयू की संख्या और आदेश निर्धारित करना है। ये यह निर्धारित करेंगे कि कैसेट प्लाज्मिड में कौन से कनेक्टर उपयोग करने के लिए कनेक्टर मल्टी-जीन प्लाज्मिड में टीयू को लिंक करते हैं। पहले टीयू का लेफ्ट कनेक्टर कॉनल्स होना चाहिए, और आखिरी टीयू का राइट कनेक्टर कॉनर होना चाहिए । वे मल्टी-जीन प्लाज्मिड के ConLS और ConRE ' के साथ ओवरलैप करेंगे । बाकी कनेक्टर बढ़ते संख्यात्मक क्रम में होने चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि बहु-जीन प्लाज्मिड में चार टीयू होते हैं, तो कनेक्टर संयोजन ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3, और ConL3-TU4-ConR(चित्रा 1)होगा ।

  1. ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों को कोडांतरण करने से पहले, निम्नलिखित छह भागों के साथ एक मध्यवर्ती वेक्टर कोडांतरण की सिफारिश की जाती है: बाएं कनेक्टर, एसएफजीएफपी ड्रॉपआउट (pYTK047), सही कनेक्टर, एक खमीर चयन मार्कर, प्रतिकृति का खमीर मूल और एक mRFP1 के साथ भाग प्लाज्मिड, एक ई कोलाई मूल और ampicillin प्रतिरोधी जीन (pYTK083)(चित्रा 3)।
    1. उपरोक्त छह प्लाज्मिड को शुद्ध करें। यूवी-व स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या फ्लोरेसेंस-आधारित परख का उपयोग करके उनकी सांद्रता रिकॉर्ड करें और प्रत्येक प्लाज्मिड को डीडीएच2ओ के साथ पतला करें ताकि 1 माइक्रोन में डीएनए के 20 फ्लेमोल हों। ऑनलाइन कैलकुलेटर का उपयोग करके डीएनए मोलर एकाग्रता की गणना करें।
      नोट: डीएनए सांद्रता को सही ढंग से मापना और विधानसभा के लिए काम करने के लिए, विशेष रूप से पांच से सात भाग प्लाज्मिड के साथ विधानसभाओं के लिए, ठीक से पिपट करना बहुत महत्वपूर्ण है। प्रत्येक प्लाज्मिड की डीएनए एकाग्रता में छोटी त्रुटियों क्लोनिंग दक्षता में एक महत्वपूर्ण कमी पैदा कर सकता है।
    2. प्रत्येक प्लाज्मिड का 1 माइक्रोन, 10X T4 लीगासे बफर का 1 माइक्रोन, बीएसएआई-एचएफवी2 का 0.5 माइक्रोन (बीएसएआई का एक अत्यधिक कुशल संस्करण), और T4 ligase का 0.5 माइक्रोन जोड़ें। डीएच 2 ओ जोड़कर वॉल्यूम को 10माइक्रोनतक बनाएं।
    3. क्लोनिंग प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए, थर्मोसाइकिलर में निम्नलिखित कार्यक्रम चलाएं: 5 मिनट (पाचन) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के 25-35 चक्र और 5 मिनट (लिगेशन) के लिए 16 डिग्री सेल्सियस। अंतिम पाचन और गर्मी निष्क्रियता कदम ों को छोड़ दें क्योंकि बीएसएआई साइटों को इंटरमीडिएट वेक्टर(चित्रा 3)में बनाए रखने की आवश्यकता है।
    4. DH5α तनाव या अन्य ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं में पूरी प्रतिक्रिया मिश्रण बदलना। 50 μg/एमएल कार्बेनेसिलिन (सीबी) या एम्पिसिलिन के साथ एक एलबी प्लेट पर फैलाएं। रात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      नोट: कार्बेनेसिलिन एम्पीसिलिन का एक स्थिर एनालॉग है।
    5. 16-18 घंटे के बाद, थाली को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें। प्लेट में पीला लाल और पीला हरा उपनिवेश(आंकड़े 6C और 6D)दोनों शामिल होंगे। mRFP1 और एसएफजीएफपी को परिपक्व होने देने के लिए प्लेट को लगभग 5 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। हरी कालोनियों की पहचान करने के लिए यूवी या ब्लू लाइट ट्रांसल्यूमिनेटर का उपयोग करें, जिसमें संभावित रूप से सही मध्यवर्ती वेक्टर होता है।
    6. एक पौंड + सीबी प्लेट पर हरी कालोनियों बाहर लकीर और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट । अगले दिन, एक एलबी + सेमी प्लेट पर फिर से लकीर और रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । एलबी + सेमी प्लेटों पर उगने वाली कॉलोनियों में गलत असेंबल किए गए प्लासमिड होते हैं क्योंकि मुख्यमंत्री प्रतिरोधी पार्ट वैक्टर बनाए रखे जाते हैं ।
    7. उन कॉलोनियों को चुनें जो एलबी + सेमी प्लेट पर नहीं बढ़ती हैं और प्रतिबंध पाचन करती हैं (सुझाए गए एंजाइम: बीएसएआई-एचएफवी2, ईएसपी 3आई) सही ढंग से इकट्ठे प्लास्मिड की पुष्टि करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, जांच के लिए कॉलोनी पीसीआर का उपयोग करें।
  2. एक बार मध्यवर्ती वेक्टर सफलतापूर्वक इकट्ठा किया गया है, अगले कदम के लिए प्रतिलेखन इकाइयों को इकट्ठा है । यह निम्नलिखित भागों के साथ एक 4-टुकड़ा विधानसभा: मध्यवर्ती वेक्टर, एक प्रमोटर, एक सीडीएस, और एक टर्मिनेटर।
    1. चार भाग प्लाज्मिड को शुद्ध करें। उनकी सांद्रता रिकॉर्ड करें और प्रत्येक प्लाज्मिड को पतला करें ताकि 1 माइक्रोन में डीएनए के 20 फ्लेमोल हों।
    2. प्रतिक्रिया मिश्रण स्थापित करने के लिए, चरण 3.1.2 का पालन करें।
    3. क्लोनिंग प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए, चरण 2.2 का पालन करें।
    4. डीएच5α या समकक्ष ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं और एलबी + सीबी पर प्लेट में पूरे क्लोनिंग प्रतिक्रिया मिश्रण को बदलना। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर।
    5. 16-18 घंटे के बाद, थाली को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें। सफेद और पीली हरी कालोनियों दिखाई देगा(आंकड़े 6E और 6F)। एसएफजीएफपी को परिपक्व होने देने के लिए प्लेट को लगभग 5 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। गैर-फ्लोरोसेंट सफेद उपनिवेशों की पहचान करने के लिए यूवी या नीली रोशनी वाले ट्रांसिल्यूमिनेटर का उपयोग करें। इनमें संभावित रूप से सही प्रतिलेखन इकाइयां होती हैं।
    6. लकीर बाहर और 8-10 सफेद कालोनियों हो जाना और एक कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन करते हैं। कॉलोनी पीसीआर से पॉजिटिव टेस्ट करने वाली कॉलोनियों से प्लाज्मिड को शुद्ध करें। विधानसभा की पुष्टि करने के लिए प्रतिबंध पाचन (सुझाए गए एंजाइम: Esp3I) को पूरा करें।
      नोट: अनुक्रमण प्रतिलेखन इकाइयां आमतौर पर आवश्यक नहीं होती हैं क्योंकि क्लोनिंग में केवल प्रतिबंध पाचन और बंधन शामिल होता है। ब्याज के सभी दृश्यों भाग प्लाज्मिड स्तर पर पुष्टि की गई है ।

4. कोडांतरण कैसेट प्लाज्मिड "बहु जीन" प्लाज्मिड में:

नोट: बहु-जीन प्लाज्मिड एक से अधिक जीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देते हैं। डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के आधार पर, बहु-जीन प्लाज्मिड प्रतिकृति या एकीकृत हो सकते हैं। प्रतिकृति प्लाज्मिड में प्रतिकृति की खमीर उत्पत्ति होती है; इसलिए, खमीर सेल विभाजित होने पर इसे स्थिर रूप से बनाए रखा जा सकता है। एकीकृत प्लाज्मिड में प्रतिकृति की खमीर उत्पत्ति नहीं होती है। इसके बजाय, उनके पास 5 ' और 3 ' होमोलॉजी हथियार हैं जो समरूप पुनर्संयोजन के माध्यम से जीनोम के विशिष्ट लोकी में कई जीन के एकीकरण की अनुमति देते हैं।

  1. बहु-जीन प्लाज्मिड्स के लिए, पहले एक मध्यवर्ती वेक्टर को इकट्ठा करें।
    1. प्रतिकृति मध्यवर्ती वैक्टर(चित्रा 4A)को इकट्ठा करने के लिए, निम्नलिखित छह भागों को इकट्ठा करें: बाएं कनेक्टर (ConLS'-pYTK008), एसएफजीएफपी ड्रॉपआउट (pYTK047), सही कनेक्टर (ConRE'-pYTK072), एक खमीर चयन मार्कर, प्रतिकृति का खमीर मूल, और mRFP1 के साथ भाग प्लाज्मिड, प्रतिकृति की ई कोलाई उत्पत्ति, और कानमाइसिन प्रतिरोधी जीन (pYTK084)।
      1. विधानसभा के लिए, 3.1.1 से 3.1.3 तक के चरणों का पालन करें।
      2. पूरे क्लोनिंग प्रतिक्रिया मिश्रण को DH5α या समकक्ष ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं में बदलना, और एलबी प्लस 50 μg/mL kanamycin (किमी) पर प्लेट। रात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      3. लाल/हरे रंग आधारित स्क्रीनिंग के लिए, चरण 3.1.5 का पालन करें।
      4. गलत संयोजनों की स्क्रीनिंग के लिए, लकीर और एक पौंड + किमी प्लेट पर हरी कालोनियों को विकसित करें। फिर चरण 3.1.6 का पालन करें।
    2. एकीकृत बहु-जीन वैक्टर(चित्रा 4B)के लिए, पहले ब्याज के जीनोमिक लोकस का निर्धारण करते हैं, फिर उस लोकस को एकीकृत करने के लिए लगभग 500 आधार जोड़े 5 ' और 3 ' होमोलॉजी हथियार डिजाइन करते हैं।
      1. प्रवेश वेक्टर-pYTK001 में खमीर जीनोमिक डीएनए से 5 ' और 3 ' homology हथियार क्लोन । चरण 1 और 2 का पालन करें।
      2. निम्नलिखित सात प्लाज्मिड्स को इकट्ठा करें: लेफ्ट कनेक्टर (ConLS'-pYTK008), एसएफजीएफपी ड्रॉपआउट (pYTK047), सही कनेक्टर (ConRE'-pYTK072), एक खमीर चयन मार्कर, 3 'होमोलॉजी आर्म, एमआरएफपी1 के साथ भाग प्लाज्मिड, प्रतिकृति के ई कोलाई मूल, और कानमाइसिन प्रतिरोधी जीन (pYTK090), और 5 'होमोलॉजी आर्म) ।
      3. विधानसभा और स्क्रीनिंग के लिए, चरण 4.1.1 का पालन करें।
  2. बहु-जीन प्लाज्मिड की असेंबली
    1. मध्यवर्ती वेक्टर के प्लाज्मिड को चरण 4.1 में प्राप्त किया गया और चरण 3 से कैसेट प्लाज्मिड। यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या फ्लोरेसेंस-आधारित परख का उपयोग करके उनकी सांद्रता रिकॉर्ड करें। डीएच2ओ में प्रत्येक को पतला करें ताकि 1 माइक्रोल में 20 एफएमोल डीएनए हो।
    2. मध्यवर्ती वेक्टर के 1 माइक्रोन, प्रत्येक ट्रांसक्रिप्शन यूनिट के 1 माइक्रोन, 10x T4 ligase बफर के 1 माइक्रोन, Esp3I के 0.5 माइक्रोन, और T4 ligase के 0.5 माइक्रोन जोड़ें। डीएच2ओ का उपयोग करने के 10 μL करने के लिए मात्रा लाओ।
    3. क्लोनिंग प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए, चरण 2.2 का पालन करें।
    4. पूरे क्लोनिंग प्रतिक्रिया मिश्रण को DH5α या समकक्ष ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं में बदलना, और एलबी + किमी पर प्लेट करें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. चरण 3.2.5 के रूप में हरे/सफेद स्क्रीनिंग प्रदर्शन करते हैं।
    6. कुछ सफेद उपनिवेशों से प्लाज्मिड को शुद्ध करें और प्रतिबंध पाचन करते हैं। नोटी-एचएफ एंजाइम का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि ई कोलाई मूल और किमी चयन मार्कर भाग में क्रमशः दो नोटी साइटें हैं(चित्रा 4B)। यदि इकट्ठा प्लाज्मिड बहुत बड़ा है, तो आगे की पुष्टि के लिए एक और प्रतिबंध साइट चुनी जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, पाचन को प्रतिबंधित करने के लिए आगे बढ़ने से पहले कॉलोनी पीसीआर के साथ स्क्रीन करें।

5. क्रोमोसोमल या प्लाज्मिड आधारित जीन अभिव्यक्ति के लिए बहु-जीन प्लाज्मिड लगाना

  1. क्रोमोसोमल जीन अभिव्यक्ति के लिए खमीर जीनोम में बहु-जीन प्लाज्मिड को एकीकृतकरना (चित्र 5)
    1. वांछित लोकस के लिए एक गाइड आरएनए (जीआरएनए) डिजाइन करें। बेंचलिंग, CRISPRdirect43और CHOPCHOP 44जैसे कई ऑनलाइन संसाधनों का उपयोग करके अधिकतम ऑन-टारगेट विशिष्टता निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है।
    2. गिब्सन क्लोनिंग द्वारा pCAS प्लाज्मिड 45 में संश्लेषित20-एनटी gRNA क्लोन। एचडीवी रिबोजाइम के 3 ' और ट्रेकरएनए के 5 'क्रमशः(चित्रा5) के लिए बाध्यकारी एक उलट प्राइमर जोड़ी का उपयोग करके पीसीआर द्वारा पीसीएएस प्लाज्मिड को लाइनराइज करें। वैकल्पिक रूप से, जीआरएनए को एसजीआरएनए ड्रॉपआउट प्लाज्मिड (pYTK050) में क्लोन करें और ड्रॉपआउट प्लाज्मिड को लिंकर्स के साथ कैसेट प्लाज्मिड में इकट्ठा करें। फिर Cas9 भाग प्लाज्मिड (pYTK036) के साथ Cas9 टीयू को इकट्ठा करें। अंत में, Cas9 टीयू और SgRNA टीयू को एक प्रतिकृति बहु-जीन प्लाज्मिड में इकट्ठा करें।
    3. रात भर नोटी-एचएफ एंजाइम के 1 माइक्रोन के साथ एकीकृत बहु-जीन प्लाज्मिड के 5-15 माइक्रोन को लाइनराइज करें। पीसीएएस-जीआरएनए के 1 माइक्रोन को बदलें और लाइनराइज्ड इंटीग्रेटिव मल्टी-जीन प्लाज्मिड को एस सेरेविसियामें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध खमीर परिवर्तन किट का उपयोग करके या गीट्ज और गीस्टल, 200746द्वारा प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए सक्षम कोशिकाओं को तैयार करें।
      नोट: नोटी पाचन के बाद रैखिक बहु-जीन प्लाज्मिड को शुद्ध करना अनावश्यक है।
    4. वसूली के बाद कोशिकाओं को गोली दें, सुपरनेट को त्यागें, पानी की बराबर मात्रा से धोएं। पूर्ण सिंथेटिक माध्यम (सीएसएम) ड्रॉपआउट प्लेट या खमीर निकालने पेप्टोन डेक्सट्रोस माध्यम (वाईपीडी) प्लेट पर प्लेट खमीर चयनात्मक मार्कर के आधार पर एंटीबायोटिक दवाओं के साथ। कॉलोनियों को बनाने के लिए दो दिन तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। यदि कोई कॉलोनी नहीं देखी जाती है, तो 30 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त एक से दो दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. कॉलोनी पीसीआर47द्वारा एकीकरण के लिए स्क्रीन खमीर कालोनियों ।
    6. पीसीएएस का इलाज करने के लिए, एक गैर-चयनात्मक वाईपीडी प्लेट पर सही एकीकरण के साथ कॉलोनी को बाहर निकालें। रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ें। एक ताजा YPD प्लेट पर YPD प्लेट से लकीर एक कॉलोनी। फिर, रात भर 30 डिग्री सेल्सियस से आगे बढ़ें। दूसरी वाईपीडी प्लेट से एक कॉलोनी को वाईपीडी प्लस 100 μg/mL nourseothricin, pCAS के चयन मार्कर के लिए लकीर । सफल इलाज तब होता है जब खमीर कोशिकाओं को चयनात्मक थाली पर बढ़ने में विफल ।
      नोट: यदि pCAS प्लाज्मिड गैर चयनात्मक YPD के दो दौर में ठीक नहीं है, एक और 1-2 दौर के लिए एक ताजा YPD पर फिर से लकीर ।
  2. प्लाज्मिड आधारित जीन अभिव्यक्ति के लिए प्रतिकृति बहु-जीन प्लाज्मिड को बदलना
    1. 100 एनजी-1 माइक्रोन शुद्ध बहु-जीन प्लाज्मिड को एस सेरेविसिया सक्षम कोशिकाओं में बदलें।
    2. प्लेट खमीर कोशिकाओं तुरंत सीएसएम ड्रॉपआउट प्लेट या YPD प्लस एंटीबायोटिक प्लेट पर परिवर्तन के बाद, खमीर चयन मार्कर के आधार पर इस्तेमाल किया । कॉलोनियों को बनाने के लिए 2-3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

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Representative Results

यहां β कैरोटीन (पीला) और लाइकोपीन (लाल) उत्पादन के लिए चार प्रतिकृति बहु-जीन प्लाज्मिड के परिणाम । ADE2 लोकस को बाधित करने के लिए एक एकीकृत बहु-जीन प्लाज्मिड का निर्माण किया गया था, जिनमें से उपनिवेश लाल हैं।

प्रवेश वेक्टर में सीडीएसएस क्लोनिंग (pYTK001)
ERG20 खमीर जीनोम और तीन कैरोटेनॉयड जीन crtE, crtYB, प्लाज्मिड pLM49448 से आवेदन वेक्टर pYTK001 में के रूप में वर्णित से परिलक्षित किया गया था। खमीर प्रमोटरों pENO2, pTIP1, pPYK1 और pPDC1 और टर्मिनेटर tTDH2, tHSP26, tADH2, tACS2 भाग प्लाज्मिड के रूप में क्लोन किया गया । लाइकोपीन के उत्पादन के लिए एक बिंदु उत्परिवर्तन को क्रिटीबी (G247A) में पेश किया गया था और कैरोटेनॉइड के लिए प्रीनिल इंटरमीडिएट को बेहतर चैनल करने के लिए एक बीटीएस1-ईआरजी20 फ्यूजन निर्माण बनाया गया था। आंकड़े 6A और 6B एक भाग प्लाज्मिड के सफल क्लोनिंग की एक प्रतिनिधि थाली दिखाने के लिए और ९०.३५ ± ४.२२% कुल कालोनियों संभावित सही (सफेद) जा रहा है के साथ हरे रंग का एक उदाहरण प्रदान करते हैं ।

प्रतिलेखन इकाइयों की विधानसभा (कैसेट प्लाज्मिड्स)
कैसेट प्लाज्मिड को कोडांतरण करने से पहले मल्टी-जीन प्लाज्मिड के डिजाइन को अंतिम रूप दिया गया था । चार कैरोटेनॉयड टीयू के लिए, विभिन्न कनेक्टर्स के साथ चार मध्यवर्ती वैक्टर पहले चरण 3.1 के बाद क्लोन किए गए थे। आंकड़े 6C और 6D मध्यवर्ती वेक्टर की एक सफल विधानसभा से एक प्रतिनिधि थाली दिखाने के लिए और लाल/हरे रंग की स्क्रीनिंग का एक उदाहरण प्रदान करते हैं, १७.५६ ± ३.३२% कुल कालोनियों सकारात्मक (ग्रीन) जा रहा है । हालांकि यह अनुपात अपेक्षाकृत कम है, स्क्रीनिंग को ग्रीन फ्लोरेसेंस द्वारा बहुत सुविधाजनक है।

इसके बाद, बीटीएस1-ईआरजी20, ईआरजी 20, क्रेट, क्रिटीबी, सीआरटीवाईबी (जी247ए)और सीआरटीआई के लिए टीयू को चरण 3.2(तालिका 1)के बाद इकट्ठा किया गया। आंकड़े 6E और 6F TUs की एक सफल विधानसभा के एक प्रतिनिधि थाली दिखाने के लिए और एक हरे रंग का एक उदाहरण प्रदान ±/

बहु-जीन प्लाज्मिड की असेंबली
चार प्रतिकृति और एक एकीकृत बहु-जीन प्लाज्मिड इकट्ठे किए गए थे। प्रतिकृति बहु-जीन प्लाज्मिड्स के लिए, ईआरजी20, बीटीएस1-ईआरजी20, क्रिटीईबी, क्रिटीबी (जी247ए) और क्रिटीआई को चार अलग-अलग संयोजनों में इकट्ठा किया गया, चार प्लाज्मिड्स बनाए गए: β-कैरोटीन के लिए दो और लाइकोपीन उत्पादन(तालिका 2)के लिए दो)। मध्यवर्ती वेक्टर क्लोनिंग के लिए संभावित सही कालोनियों (ग्रीन) का अनुपात 1.83 ± 0.15%(आंकड़े 7 ए और 7B)था। हालांकि यह संख्या कम लगती है, लेकिन ग्रीन फ्लोरेसेंस(चित्रा 7B)का पता लगाकर स्क्रीनिंग को आसान बना दिया गया था । एक बार मध्यवर्ती प्लाज्मिड क्लोन किया गया था, मध्यवर्ती से बहु जीन प्लाज्मिड (सफेद) कोडांतरण की सफलता दर ९३.७७± १.६५%(आंकड़े 7C और 7D)था । आंकड़े 7E और 7F बहु जीन प्लाज्मिड की एक उप-ोप्टिमल असेंबली दिखाते हैं, क्योंकि सकारात्मक उपनिवेशों (सफेद) की संख्या नगण्य थी। खमीर में बदलने के बाद, β कैरोटीन (पीला) और लाइकोपीन (लाल) का उत्पादन करने वाली कॉलोनियां तीन दिन बढ़ी । प्रत्येक प्लेट से चार कालोनियों ताजा प्लेटों पर बाहर लकीर और दो दिनों के लिए हो गए थे । आंकड़े 8A और 8B बताते है कि fusing BTS1-ERG20 अधिक geranylgeranyl-पायरोफोस्फेट कैरोटीनॉइड उत्पादन की ओर निर्देश, के रूप में अकेले ERG20 का उपयोग कर गहरे रंग से देखा । प्रमाणिक मानकों के साथ यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा कैरोटेनॉइड की निकासी49 और मात्राकरण पर, यह देखा गया है कि BTS1-ERG20 के संलयन ०.७२९ μg/mg β-कैरोटीन के उत्पादन की ओर जाता है, जो ~ ३५ गुना अधिक है ०.०२१ μg/mg β-कैरोटीन अकेले ERG20 के साथ तनाव द्वारा उत्पादित । इसी तरह, लाइकोपीन का उत्पादन बीटीएस 1-ईआरजी20 (1.126 माइक्रोग्राम/मिलीग्राम) के साथ तनाव में ~ 16.5 गुना अधिक है, जो ERG20 (0.068 μg/mg) की तुलना में अकेले(चित्रा 8C) है।

प्रतिकृति बहु जीन प्लाज्मिड(ए) BTS1-ERG20 संलयन टीयू और(बी) ERG20 टीयू के साथ खमीर में तब्दील हो गया । प्रत्येक प्लेट पर, बाईं ओर खमीर में β के उत्पादन के लिए क्रेटई टू, क्रिटीबी टू और क्रिटी टीयू युक्त प्लाज्मिड्स होते हैं-दाईं ओर कैरोटीन और खमीर में प्लेटे टू, क्रिटीबी (जी247ए) टीयू और लाइकोपीन के उत्पादन के लिए क्रिटी टू होते हैं।

एकीकृत प्लाज्मिड के लिए, ConLS', sfGFP ड्रॉपआउट, ConRE', अपने3 (खमीर चयन मार्कर), ADE2 5 ' और 3 ' homology हथियार कदम ४.१.२ के बाद इकट्ठे हुए थे । 5 ' और 3 ' होमोलॉजी हथियार ५०० बीपी के अलावा थे, एकीकरण के बाद ~१८० अमीनो एसिड को हटा । इसके अतिरिक्त, 5 ' होमोलॉजी आर्म में इसके 3 ' अंत की ओर छह स्टॉप कोडन थे । उत्परिवर्तित ADE2 के परिणामस्वरूप लाल उपनिवेश50हो गए । ADE2 gRNA 5'-ATTGGGAC GTATGATTGGAGG-3'51 का इस्तेमाल किया गया और जीनोमिक एकीकरण के लिए कदम 5.1 का पालन किया गया। 3-4 दिनों के बाद, लाल उपनिवेशों को वाईपीडी प्लेट + 100 μg/mL nourseothricin पर देखा गया, यह दर्शाता है कि ADE2 को सफलतापूर्वक बाधित किया गया था(आंकड़े 8D और 8E)।

Figure 1
चित्रा 1:बहु-जीन असेंबली का अवलोकन। विधानसभा तीन स्तरों में होती है। In0 स्तर 1, सीडीएस, या किसी अन्य भाग, जीनोम या संश्लेषित से परिलक्षित होता है, और फिर बीएसएमबीआई (या Esp3I) एंजाइम का उपयोग करके pYTK001 प्रवेश वेक्टर में क्लोन किया जाता है। ColE1: प्रतिकृति केई. कोलाई मूल; मुख्यमंत्रीआर:क्लोरम्फेनिकोल प्रतिरोधी जीन। स्तर 2 में, एक प्रमोटर, एक सीडीएस और टर्मिनेटर युक्त ट्रांसक्रिप्शन यूनिट (टीयू) को बीएसएआई एंजाइम का उपयोग करके इकट्ठा किया जाता है। स्तर 3 में, पांच ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों को बीएसएमबीआई (या Esp3I) एंजाइम का उपयोग करके एक बहु-जीन प्लाज्मिड में इकट्ठा किया जाता है। बहु-जीन प्लाज्मिड या तो प्रतिकृति या एकीकृत हो सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:प्राइमर डिजाइन और भाग प्लाज्मिड की क्लोनिंग। (ए)प्राइमर डिजाइन अलग-अलग हिस्सों को बढ़ाना, जीन को पालतू बनाने या पॉइंट म्यूटेशन बनाने और फ्यूजन प्रोटीन को असेंबल करने के लिए। प्राइमर में बीएसएमबीआई और बीएसएआई मान्यता और कट साइटें और उचित असेंबली के लिए MoClo ओवरहांग शामिल हैं । MoClo ओवरहैंग 1, 2, 3, 4, और 5, 6, 7, 8 के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। डोमेस्टिक या फ्यूजन प्रोटीन बनाने के लिए इंटरनल प्राइमर में बीएसएमबीआई होता है लेकिन बीएसएआई साइट्स नहीं । इनके लिए ओवरहैंग अनुकूलित आंतरिक दृश्य हैं (एनएनएन और बैंगनी रंग में N'N'N') । टर्मिनल "टीटीटी" इष्टतम एंजाइम पाचन के लिए शामिल हैं। भारत सरकार: ब्याज का जीन। (ख)बीएसएमबीआई (या Esp3I) का उपयोग करके pYTK001 प्रवेश वेक्टर में प्रवर्धित भागों की क्लोनिंग। पूरक ओवरहैंग भाग के एकीकरण और बीएसएमबीआई मान्यता स्थल को हटाने के लिए नेतृत्व करते हैं। ColE1: प्रतिकृति केई. कोलाई मूल; मुख्यमंत्रीआर:क्लोरम्फेनिकोल प्रतिरोधी जीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:प्रतिलेखन इकाई विधानसभा। टीयू प्लाज्मिड को इकट्ठा करने के लिए, एक मध्यवर्ती वेक्टर की असेंबली को संयोजन टीयू असेंबली की सुविधा प्रदान करने की सिफारिश की जाती है। मध्यवर्ती वेक्टर को इकट्ठा करने के लिए, कॉन एलएक्स (एक्स: पांच बाएं कनेक्टर में से एक), एसएफजीएफपी ड्रॉपआउट, कॉन आरआई (वाई: पांच सही कनेक्टर्स में से एक), एक खमीर ओरी (प्रतिकृति की उत्पत्ति), और बीएसए एंजाइम का उपयोग करके mRFP1 ड्रॉपआउट वेक्टर में एक खमीर मार्कर हिस्सा क्लोन करें। मध्यवर्ती प्लाज्मिड एम्पीसिलिन के लिए प्रतिरोधी है। टीयू प्लाज्मिड क्लोनिंग के लिए बीएसएआई मान्यता स्थलों को बरकरार रखा गया है। टीयू प्लाज्मिड का क्लोन बनाने के लिए, एक प्रमोटर, एक सीडीएस और टर्मिनेटर को BsaI का उपयोग करके मध्यवर्ती वेक्टर में इकट्ठा किया जाता है। क्लोन टीयू में अगले कदम बहु-जीन असेंबली के लिए ConLX और ConRY क्षेत्रों में BSmBI साइटें होंगी । क्लोन टीयू एम्पीसिलिन के लिए भी प्रतिरोधी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नाम ConLX (बाएं कनेक्टर) प्रमोटर सीडी टर्मिनेटर ConRY (सही कनेक्टर)
बीटीएस/ERG20 टू एलएस पीआईनो2 बीटीएस1/ईआरजी20 टीटीडीएच2 R1
ईआरजी20 टू एलएस पीआईनो2 ईआरजी20 टीटीडीएच2 R1
क्रेट टू L1 पीटीआईपी1 क्रेट tHSP26 R2
क्रिटीबी टू L2 पीपीडीसी1 क्रिटीबी tADH2 R3
crtYBG247A टू L2 पीपीडीसी1 crtYBG247A tADH2 R3
क्रिटी टू L3 pPYK1 क्रिटी tACS2 पुनः

तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली ट्रांसक्रिप्शन इकाइयां। प्रमोटरों और टर्मिनेटर को एस सेरेविसियासे परिलक्षित किया गया था। बीटीएस1 (जेरानिल डिफोफेट सिंथेस) और ईआरजी 20 (फारनेसिल पाइरोफोस्फेट सिंथेटास) को एस सेरेविसियासे परिलक्षित किया गया था। जीन क्रेट (जेरानिलेरिल डिफोस्फेट सिंथास), सीआरटीवाईबी (बिफंक्शनल लाइकोपीन साइक्लेज़/फाइटोईन सिंथेस), और क्रेटी (फाइटोईन डेसातुरस) Xanthophyllomyces dendrorhousसे थे ।

Figure 4
चित्रा 4:बहु-जीन प्लाज्मिड असेंबली। (A)प्रतिकृति प्लाज्मिड असेंबली। प्रतिकृति मध्यवर्ती वेक्टर की विधानसभा में कांग्रेस एलएस', एसएफजीएफपी ड्रॉपआउट, कॉन आरई,एक खमीर ओरी, एक खमीर मार्कर, और बीएसएआई एंजाइम का उपयोग करके mRFP1 ड्रॉपआउट वेक्टर पर ई. कोलाई मूल और मार्कर की क्लोनिंग शामिल है। कॉनल्स और कॉनआरे की साइटें बीएसएमबीआई मान्यता साइटों को वेक्टर में पेश करते हैं। संभावित रूप से सही विधानसभाओं को कानमाइसिन के साथ एक चयनात्मक प्लेट पर हरे रंग की कॉलोनियों की तलाश करके जांच की जा सकती है। पहले इकट्ठे हुए टीयू को बीएसएएमबीआई एंजाइम का उपयोग करके मध्यवर्ती वेक्टर में क्लोन किया जा सकता है। इस प्लाज्मिड में एक खमीर ओरी शामिल है जो इसे खमीर मेजबान में दोहराने की अनुमति देता है। (ख)इंटीग्रेटिव प्लाज्मिड असेंबली । एकीकृत मध्यवर्ती वेक्टर की असेंबली में कांग्रेस एलएस की क्लोनिंग, एसएफजीएफपी ड्रॉपआउट, कॉन आरई', एक 5 ' होमोलॉजी आर्म, एक 3 ' होमोलॉजी आर्म, एक खमीर मार्कर, और ई कोलाई मूल और मार्कर को बीएसएआई एंजाइम का उपयोग करके आरएफपी ड्रॉपआउट वेक्टर में शामिल है। सही असेंबली को कानमाइसिन के साथ एक चयनात्मक प्लेट पर हरे रंग की दिखाई नी चाहिए। पहले की गई ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों को बीएसएमबीआई एंजाइम का उपयोग करके प्रतिकृति मध्यवर्ती वेक्टर में क्लोन किया जा सकता है। इस वेक्टर में खमीर ओरी नहीं है और इसे CRISPR और मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से लक्ष्य लोकस में एकीकृत किया जाएगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नाम TU1 TU2 TU3 TU4 गुणनफल
B/e-β-कैरोटीन बीटीएस1/ईआरजी20 क्रेट क्रिटीबी क्रिटी β कैरोटीन
B/E-Lycopene बीटीएस1/ईआरजी20 क्रेट crtYBG247A क्रिटी लाइकोपीन
ई-β कैरोटीन ईआरजी20 क्रेट क्रिटीबी क्रिटी β कैरोटीन
ई-लाइकोपीन ईआरजी20 क्रेट crtYBG247A क्रिटी लाइकोपीन

तालिका 2: इस अध्ययन में बहु-जीन प्लाज्मिड का उपयोग किया जाता है।

Figure 5
चित्रा 5:CRISPR एकीकरण। (A)CRISPR और हेल्पर प्लाज्मिड क्लोनिंग । पीसीएएस प्लाज्मिड में एक जीआरएनए की इष्टतम अभिव्यक्ति के लिए Cas9 एंडोक्यूलेज और घटक (tRNA प्रमोटर, SNR52 टर्मिनेटर, एचडीवी रिबोजाइम, और ट्रेकर आरएनए) शामिल हैं। गिब्सन क्लोनिंग का उपयोग कर रैखिक पीसीएएस के साथ सिंथेटिक जीएनए कोडांतरण द्वारा पीसीएएस + जीआरएनए प्लाजा प्लाजा को क्लोन करें। (ख)CRISPR सहायता प्राप्त आनुवंशिक एकीकरण । चरण 1: सहसंस्थान: पीसीएएस +जीएनए को एकीकृत प्लाज्मिड के साथ खमीर में सह-रूपांतरित किया गया था जिसमें जीन (एस) ब्याज (भारत सरकार), एक खमीर चयनात्मक मार्कर, और 5 ' और 3 ' होमोलॉजी क्षेत्र जीनोमिक लोकस को लक्षित करता है। इष्टतम एकीकरण के लिए, नोटी के साथ एकीकृत प्लाज्मिड को रैखिक करें। चरण 2: लक्ष्य लोकस पर एकीकरण: खमीर मार्कर के लिए चयनात्मक प्लेट पर परिवर्तित खमीर बढ़ रहा है, या तो एंटीबायोटिक या ऑक्सोट्रोफिक। एकीकरण की पुष्टि करने के लिए जेनोटाइपिंग करें। चरण 3: एक गैर-चयनात्मक प्लेट पर खमीर को लकीर करके पीसीएएस + जीएनए प्लाज्मिड का इलाज करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: ई. कोलाई में प्रवेश वेक्टर और ट्रांसक्रिप्शन यूनिट स्तर क्लोनिंग की प्रतिनिधि प्लेटें। प्रवेश वेक्टर pYTK001 के तहत(ए)दृश्य प्रकाश और(बी)यूवी प्रकाश में एक जीन की सफल क्लोनिंग की प्रतिनिधि प्लेटें । सकारात्मक कॉलोनियां सफेद हैं और नकारात्मक कॉलोनियां हरी हैं। कुल कॉलोनियों में सकारात्मक कॉलोनियों का अनुपात 90.35 ± 4.22% है। ट्रांसक्रिप्शन यूनिट लेवल असेंबली के लिए इंटरमीडिएट वेक्टर की सफल असेंबली और(सी)दृश्यमान प्रकाश और(डी)यूवी लाइट के तहत हरे/लाल चयन। पॉजिटिव कॉलोनियां हरी-भरी हैं। कुल कॉलोनियों में सकारात्मक कॉलोनियों का अनुपात 17.56 ± 3.32% है। मध्यवर्ती वेक्टर और हरे/सफेद स्क्रीनिंग के तहत(ई)दृश्यमान प्रकाश और(एफ)यूवी लाइट से ट्रांसक्रिप्शन यूनिट की सफल असेंबली । सकारात्मक कॉलोनियां सफेद हैं और नकारात्मक कॉलोनियां हरी हैं। कुल कॉलोनियों में सकारात्मक कॉलोनियों का अनुपात है: 65.02 ± 3.32% है। डेटा तीन जैविक प्रतिकृति से कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: ई. कोलाईमें बहु-जीन प्लाज्मिड क्लोनिंग की प्रतिनिधि प्लेटें । बहु-जीन स्तर की असेंबली के लिए मध्यवर्ती वेक्टर की असेंबली और(ए)दृश्यमान प्रकाश और(बी)यूवी लाइट के तहत लाल/हरे रंग का चयन। सकारात्मक कॉलोनियां हरी हैं और नकारात्मक कॉलोनियां लाल हैं। कुल कॉलोनियों में सकारात्मक कॉलोनियों का अनुपात 1.83 ± 0.15% है। इंटरमीडिएट वेक्टर और ग्रीन/व्हाइट सेलेक्शन(सी)से दृश्यमान प्रकाश और(डी)यूवी लाइट से मल्टीपल टीयू की सफल असेंबली । सकारात्मक कॉलोनियां सफेद हैं। कुल कॉलोनियों में सकारात्मक कॉलोनियों का अनुपात 93.77 ± 1.65% है। बहु-जीन प्लाज्मिड अंडर(ई)दृश्यमान प्रकाश और(एफ)यूवी लाइट की उप-ोप्टिमल असेंबली। सकारात्मक कॉलोनियों की संख्या नगण्य है। डेटा तीन जैविक प्रतिकृति से कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8:खमीर में एकीकृत और प्रतिकृति प्लाज्मिड की प्रतिनिधि प्लेटें। प्रतिकृति बहु जीन प्लाज्मिड(ए) BTS1-ERG20 संलयन टीयू और(बी) ERG20 टीयू के साथ खमीर में तब्दील हो गया । प्रत्येक प्लेट पर, बाईं ओर खमीर में β के उत्पादन के लिए क्रेटई टू, क्रिटीबी टू और क्रिटी टीयू युक्त प्लाज्मिड्स होते हैं-दाईं ओर कैरोटीन और खमीर में प्लेटे टू, क्रिटीबी (जी247ए) टीयू और लाइकोपीन के उत्पादन के लिए क्रिटी टू होते हैं। (ग)यूवी-विस स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके चार बहु-जीन प्लाज्मिड्स के साथ खमीर निकालने से β-कैरोटीन और लाइकोपीन की मात्रा । अधिकतम अवशोषण क्रमशः 450 एनएम और β-कैरोटीन और लाइकोपीन के लिए 470 एनएम दर्ज किया गया था। पूर्ण मात्रा प्रामाणिक मानकों(अनुपूरक चित्रा S3)का उपयोग करके किया गया था। बीटीएस1-ईआरजी20 का संलयन अकेले ईआरजी 20 की तुलना में ~ 35 गुना अधिक β-कैरोटीन और ~ 16.5 गुना अधिक लाइकोपीन का उत्पादन करता है। एक जीएनए और कोई सहायक डीएनए(डी)के साथ एक बहु जीन एकीकृत प्लाज्मिड के एकीकरण और GRNA और सहायक डीएनए(ई)के रूप में एक बहु जीन एकीकृत प्लाज्मिड के एकीकरण से ADE2 लोकस के व्यवधान के लिए प्रतिनिधि प्लेटें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ली एट अल द्वारा विकसित MoClo आधारित क्लोनिंग किट एक से पांच प्रतिलेखन इकाइयों की त्वरित असेंबली के लिए एक बहु-जीन प्लाज्मिड में या तो खमीर जीनोम में प्रतिकृति या एकीकरण के लिए एक उत्कृष्ट संसाधन प्रदान करता है। इस किट का उपयोग समय लेने वाली क्लोनिंग अड़चन को समाप्त करता है जो अक्सर खमीर में कई जीन व्यक्त करने के लिए मौजूद होता है।

हमने टी 4 डीएनए लिगाज़ के साथ गोल्डन गेट क्लोनिंग के पाचन/लिगेशन चक्रों के लिए पांच अलग-अलग स्थितियों का परीक्षण किया। हमने पाया कि 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पाचन के 30 चक्र और 5 मिनट के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर लिगेशन और उसके बाद 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम पाचन कदम और 10 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन निष्क्रियता कदम के परिणामस्वरूप 99.5% कॉलोनियां हुईं जो संभावित रूप से 4-पीस असेंबली(सप्लीमेंट्री फिगर एस1 और S3)में सही थीं। 16 डिग्री सेल्सियस पर लिगेशन इष्टतम लिगाज़ गतिविधि और ओवरहैंग एनीलिंग सुनिश्चित करता है। 50 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम पाचन पचाने वाले उत्पादों को फिर से लिगेशन से रोकता है। इस चक्र विधानसभा प्रतिक्रियाओं के सभी के लिए पीछा किया गया था जब तक कि अंयथा निर्दिष्ट ।

हमें कुछ महत्वपूर्ण कदम भी मिले हैं जिन पर इष्टतम परिणामों के लिए विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। हम दृढ़ता से ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों को कोडांतरण करने से पहले एसएफजीएफपी ड्रॉपआउट के साथ मध्यवर्ती वैक्टर को कोडांतरण करने की सलाह देते हैं। सिद्धांत रूप में, सभी सात भागों mRFP1 के साथ ई. कोलाई वेक्टर में क्लोन किया जा सकता है, लाल/सफेद स्क्रीनिंग के बाद । हालांकि, व्यवहार में, mRFP1 रंग बहुत धीरे-धीरे विकसित करता है और दृश्य प्रकाश के तहत हल्के लाल और हल्के-पीले ई. कोलाई उपनिवेशों के बीच अंतर करना चुनौतीपूर्ण है। चूंकि एसएफजीएफपी यूवी रेंज52पर अवशोषित होता है, यूवी या नीली रोशनी के ट्रांसिल्यूमिनेटर का उपयोग करके उज्ज्वल हरे रंग की कॉलोनियों के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करता है। इसके अलावा, एक मध्यवर्ती वेक्टर क्लोनिंग विभिन्न प्रमोटर, सीडीएस और टर्मिनेटर संयोजनों के अधिक फेसियल को इकट्ठा करने की अनुमति देती है, जिससे एक आसान संयोजन पुस्तकालय निर्माण सक्षम होता है, क्योंकि चार भागों के साथ एक असेंबली आमतौर पर अधिक भागों के साथ असेंबली की तुलना में अधिक सकारात्मक उपनिवेशों में परिणाम देती है। अनुपूरक चित्रा S2 एक 6-टुकड़ा से एक 8 टुकड़ा विधानसभा के लिए संभावित सही कालोनियों के अनुपात में एक प्रगतिशील कमी से पता चलता है ।

प्रत्येक भाग की समतुल्य एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए सभी भागों की सांद्रता को सावधानीपूर्वक मापा जाना चाहिए। यूवी-विस स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके भागों की मात्रा निर्धारित करना आमतौर पर पर्याप्त होता है लेकिन फ्लोरेसेंस-आधारित परख जैसे अधिक संवेदनशील तरीके बेहतर परिणाम दे सकते हैं। सभी भागों को सही ढंग से निर्धारित करने में विफलता के परिणामस्वरूप अक्सर कम असेंबली दक्षता होती है। किसी को क्रमशः अत्यधिक कुशल Esp3I और BsaI-HFv2 का चयन करना चाहिए । हमने देखा है कि टी 4 किट में दोनों ओवरहैंग के लिए अच्छी तरह से काम करता है और अनुकूलित ओवरहैंग दो भागों को फ्यूज करने के लिए आवश्यक हैं, जो साहित्य36के अनुरूप है, हालांकि मूल पेपर ने T7 लिगाज़6की सिफारिश की। चक्रों की संख्या बढ़ाने से संभावित सही कॉलोनियों की संख्या कुछ हद तक बढ़ सकती है। उदाहरण के लिए, पाचन और लिगेशन के 25 चक्र तीन से चार भागों को इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त हैं लेकिन 30-35 चक्र अधिक भागों के लिए बेहतर परिणाम देते हैं।

मोलक्लो रणनीति वैकल्पिक बहु-भाग विधानसभा विधियों8, 9,10, 11,12 पर लाभप्रद है क्योंकि यह मॉड्यूलर और अत्यधिक बहुमुखी क्लोनिंग की अनुमति देता है। हालांकि, प्राथमिक सीमा पालतू कदम है क्योंकि कभी-कभी कई हिस्सों में कई बीएसएएमबीआई, बीएसएआईआई या नोटी साइटें होती हैं। सभी भागों को म्यूट करने में समय लेने वाला हो सकता है। इस मामले में, कोई भी इन प्रतिबंध साइटों के बिना सीडीएस को संश्लेषित करने पर विचार कर सकता है। हालांकि, प्रमोटरों और टर्मिनेटर के लिए, एक भी न्यूक्लियोटाइड को म्यूट करने से उनकी कार्यक्षमता बदल सकती है। इसलिए, रिपोर्टर परख का उपयोग करके इन भागों की गतिविधि को मान्य करने की सिफारिश की जाती है39. एक और सीमा यह है कि यह किट केवल एक बहु-जीन प्लाज्मिड में पांच ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों की अनुमति देता है। यदि अधिक प्रतिलेखन इकाइयां वांछित हैं, तो अत्यधिक संगत ओवरहैंग36के एक सेट का चयन करके अतिरिक्त कनेक्टर का निर्माण किया जा सकता है।

किट 27 प्रमोटरों, छह टर्मिनेटर, सात खमीर चयन मार्कर, और प्रतिकृतियों के दो खमीर मूल प्रदान करता है । इस तरह के प्रमोटरों और टर्मिनेटर के रूप में अनुकूलित भागों, या तो देशी या सिंथेटिक, इस प्रोटोकॉल के बाद प्रवेश वेक्टर में क्लोन किया जा सकता है । खमीर MoClo किट मुख्य रूप से बहु जीन चयापचय रास्ते अतिएक्सप्रेसिंग के लिए खमीर में उच्च मूल्य रसायनों का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग तब भी किया जा सकता है जब खमीर में जैविक सर्किट के लिए विभिन्न स्विच वांछित होते हैं। प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, प्रोटीन स्थानीयकरण और एंजाइम गतिविधियों के बारे में बुनियादी जैविक सवालों की जांच के लिए इस किट को लागू करने की भी जबरदस्त क्षमता है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल बेहद लचीला और विश्वसनीय है और खमीर जीव विज्ञान में किसी भी मांग क्लोनिंग का समर्थन कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को रिसर्च फाउंडेशन फॉर स्टेट यूनिवर्सिटी ऑफ न्यूयॉर्क (अवार्ड #: 71272) और यूनिवर्सिटी एट बफेलो (अवार्ड #: 000077) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Glass beads RPI research products 9831 For lysing yeast cells
Bacto Agar BD & Company 214010 Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto Peptone BD& Company 211677 Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2 New England Biolabs R3733S a highly efficient version of BsaI restriction enzyme
Carbenicillin Fisher Bioreagents 4800-94-6 Antibiotic for screening at the transcription unit level
Chloramphenicol Fisher Bioreagents 56-75-7 Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-His Sunrise Sciences 1006-010 Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Dextrose Fisher Chemical D16-500 Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids BD & Company 291940 Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mix Promega U1515 dNTPs for PCR
Esp3I New England Biolabs R0734S a highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit Zymo Research T2001 For yeast transformation
Hexanes Fisher Chemical H302-1 For carotenoid extraction from yeast cells
Kanamycin Fisher Bioreagents 25389-94-0 Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, Miller Fisher Bioreagents BP1425-2 Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, Miller Fisher Bioreagents BP1426-2 Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Lycopene Cayman chemicals NC1142173 For lycopene quantification
MoClo YTK Addgene 1000000061 Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England Biolabs T1010L For plasmid purification from E.coli
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND2000c For measuring accurate DNA concentrations
NotI-HF New England Biolabs R3189S Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin Sulphate Goldbio N-500-100 Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X) New England Biolabs B0518S Buffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530S High fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494 Addgene 100539 Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz Cuvette Thermo Electron 10050801 For quantifing carotenoids
T4 ligase New England Biolabs M0202S Ligase for Golden Gate cloning
Thermocycler BIO-RAD 1851148 For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue Homogenizer Bullet Blender Model: BBX24 For homogenization of yeast cells
UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific Genesys 150 For quantifing carotenoids
Yeast Extract Fisher Bioreagents BP1422-500 Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-carotene Alfa Aesar AAH6010603 For β-carotene quantification

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Mukherjee, M., Caroll, E., Wang, Z. Q. Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning. J. Vis. Exp. (168), e61993, doi:10.3791/61993 (2021).

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