Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Rask montering av multigenkonstruksjoner ved hjelp av modulær golden gate-kloning

Published: February 5, 2021 doi: 10.3791/61993
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biological Sciences, University at Buffalo, State University of New York
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne protokollen er å gi en detaljert, trinnvis guide for montering av multigenkonstruksjoner ved hjelp av det modulære kloningssystemet basert på Golden Gate-kloning. Det gir også anbefalinger om kritiske skritt for å sikre optimal montering basert på våre erfaringer.

Abstract

Golden Gate-kloningsmetoden muliggjør rask montering av flere gener i ethvert brukerdefinert arrangement. Den bruker type IIS-begrensningsenzymer som kutter utenfor deres anerkjennelsessteder og skaper et kort overheng. Dette modulære kloningssystemet (MoClo) bruker en hierarkisk arbeidsflyt der forskjellige DNA-deler, for eksempel promotorer, kodesekvenser (CDS) og terminatorer, først klones inn i en inngangsvektor. Flere inngangsvektorer samles deretter i transkripsjonsenheter. Flere transkripsjonsenheter kobles deretter til en multigenplasmid. Golden Gate-kloningsstrategien er av enorm fordel fordi den tillater arrfri, retningsmessig og modulær montering i en en-pott-reaksjon. Den hierarkiske arbeidsflyten muliggjør vanligvis facile-kloning av et stort utvalg av flergenkonstruksjoner uten behov for sekvensering utover inngangsvektorer. Bruken av fluorescerende proteinfrafall muliggjør enkel visuell screening. Dette arbeidet gir en detaljert, trinnvis protokoll for montering av multigenplasmider ved hjelp av gjær modulær kloning (MoClo) kit. Vi viser optimale og suboptimale resultater av multi-gen plasmid montering og gir en guide for screening for kolonier. Denne kloning strategien er svært anvendelig for gjær metabolsk engineering og andre situasjoner der multi-gen plasmid kloning er nødvendig.

Introduction

Syntetisk biologi har som mål å konstruere biologiske systemer med nye funksjoner som er nyttige for farmasøytisk, landbruks- og kjemisk industri. Montering av et stort antall DNA-fragmenter på en høy gjennomstrømningsmåte er en grunnleggende teknologi i syntetisk biologi. En slik komplisert prosess kan brytes ned i flere nivåer med synkende kompleksitet, et konsept lånt fra grunnleggende ingeniørvitenskap1,2. I syntetisk biologi samler DNA-fragmenter vanligvis hierarkisk basert på funksjonalitet: (i) Delnivå: "deler" refererer til DNA-fragmenter med en bestemt funksjon, for eksempel en promotor, en kodingssekvens, en terminator, en opprinnelse av replikering; (ii) Transkripsjonsenheter (TU) nivå: en TU består av en promotor, en kodingssekvens og en terminator som er i stand til å transkribere et enkelt gen; (iii) Multigennivå: en multigenplasmid inneholder flere TUer som ofte består av en hel metabolsk vei. Denne hierarkiske samlingen som er banebrytende av BioBrick-samfunnet er det grunnleggende konseptet for montering av store sett med DNAer i syntetisk biologi3.

I løpet av det siste tiåret4,5,6,7, golden gate kloning teknikken har betydelig tilrettelagt hierarkisk DNA-montering2. Mange andre flerdelte kloningsmetoder, for eksempel Gibson kloning8, ligation-uavhengig kloning (SLIC)9, uracil excision-basert kloning (USER)10, ligase sykkelreaksjonen (LCR)11, og in vivo rekombinasjon (DNA Assembler)12,13, er også utviklet så langt. Men Golden Gate kloning er en ideell DNA-monteringsmetode fordi den er uavhengig av genspesifikke sekvenser, noe som tillater arrfri, retningsbestemt og modulær montering i en en-pot reaksjon. Golden Gate-kloning drar nytte av type IIS-begrensningsenzymer som gjenkjenner en ikke-palindrom sekvens for å skape forskjøvede overheng utenfor anerkjennelsesstedet2. En ligase blir deretter med de glødede DNA-fragmentene for å få en flerdelt montering. Ved å bruke denne kloningsstrategien på det modulære kloningssystemet (MoClo) har det mulig å montere opptil 10 DNA-fragmenter med over 90% transformanter screenet som inneholder den riktig monterte konstruksjonen4.

MoClo-systemet tilbyr enorme fordeler som har akselerert design-build-test-syklusen til syntetisk biologi. For det første muliggjør de utskiftbare delene kombinatorisk kloning for å teste et stort rom med parametere raskt. For eksempel krever optimalisering av en metabolsk vei vanligvis å sykle gjennom mange promotører for hvert gen for å balansere banestrømmen. MoClo-systemet kan enkelt håndtere slike krevende kloningsoppgaver. For det andre må man sekvensere delen plasmid, men vanligvis ikke TU eller multi-genplasmider. I de fleste tilfeller er screening av koloni PCR eller begrensning fordøyelse tilstrekkelig for verifisering på TU og multi-gen plasmid nivå. Dette er fordi kloning av delen plasmid er det eneste trinnet som krever PCR, som ofte introduserer mutasjoner. For det tredje er MoClo-systemet ideelt for å bygge multigenkomplekse metabolske veier. Til slutt, på grunn av de universelle overhengene, kan delen plasmider gjenbrukes og deles med hele bioingeniørsamfunnet. For tiden er MoClo-sett tilgjengelige for planter14,15,5,16,17, sopp6,18,19,20,21,22, bakterier7,23,24,25,26,27og dyr28,29. En Multi-Kingdom MoClo-plattform har også blitt introdusert nylig30.

For Saccharomyces cerevisiaehar Lee et al.6 utviklet et allsidig MoClo-verktøysett, en utmerket ressurs for gjærsyntetisk biologisamfunn. Dette settet kommer i et praktisk 96-brønns format og definerer åtte typer utskiftbare DNA-deler med en mangfoldig samling av godt karakteriserte promotorer, fluorescerende proteiner, terminatorer, peptidkoder, utvalgsmarkører, opprinnelsen til replikasjon og genomredigeringsverktøy. Dette verktøysettet gjør det mulig å montere opptil fem transkripsjonsenheter i en multigenplasmid. Disse funksjonene er verdifulle for gjær metabolsk engineering, der delvise eller hele veier er over-uttrykt for å produsere målrettede kjemikalier. Ved hjelp av dette settet har forskere optimalisert produksjonen av geraniol, linalool31, penicillin32, mukonsyre33, indigo34og betalain35 i gjær.

Her tilbyr vi en detaljert, trinnvis protokoll for å veilede bruken av MoClo-verktøysettet for å generere flergenbaner for enten episomalt eller genomisk uttrykk. Gjennom utstrakt bruk av dette settet har vi funnet ut at nøyaktig måling av DNA-konsentrasjoner er nøkkelen til å sikre likeverdig fordeling av hver del i Golden Gate-reaksjonen. Vi anbefaler også T4 DNA-ligaer over T7 DNA-ligaene fordi førstnevnte fungerer bedre med større antall overheng36. Til slutt må eventuelle interne anerkjennelsessteder for BsmBI og BsaI fjernes eller tammes før montering. Alternativt kan man vurdere å syntetisere deler for å fjerne flere interne nettsteder og for å oppnå samtidig kodonoptimalisering. Vi demonstrerer hvordan du bruker dette verktøysettet ved å uttrykke en fem-gens vei for β-karoten- og lykopenproduksjon i S. cerevisiae. Vi viser videre hvordan du slår ut ADE2-locus ved hjelp av genomredigeringsverktøyene fra dette settet. Disse fargebaserte eksperimentene ble valgt for enkel visualisering. Vi demonstrerer også hvordan man genererer fusjonsproteiner og skaper aminosyremutasjoner ved hjelp av Golden Gate-kloning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Den hierarkiske kloningsprotokollen som tilbys i dette verktøysettet, kan deles inn i tre hovedtrinn: 1. Kloning av delplasmider; 2. Kloning transkripsjon enheter (TUer); 3. Kloning av multigenplasmider (Figur 1). Denne protokollen starter fra primer design og slutter med anvendelser av klonet multi-gen plasmid.

1. Primer design for kloning av delen plasmid (pYTK001):

  1. Design fremre og omvendte primere som inneholder flanke nukleotider TTT på 5 ' enden, en BsmBI anerkjennelse nettstedet med en ekstra nukleotid (CGTCTCN), en 4-nukleotider (nt) overheng (TCGG) komplementær til inngangsvektoren, et BsaI-anerkjennelsesområde med et ekstra nukleotid (GGTCTCN) og et 4-nt delspesifikt overheng, i tillegg til den malspesifikke sekvensen (figur 2A). GoldenBraid 4.037 og GoldenMutagenesis38 er noe av den elektroniske programvaren som kan brukes til Golden Gate-spesifikk primerdesign.
  2. Hvis BsaI- eller BsmBI-anerkjennelsessteder er til stede i noen del, bruker du et domesticeringstrinn for å mutere disse nettstedene før Golden Gate-montering39. For integrative plasmider (se trinn 4), tamme ethvert NotI-anerkjennelsessted. Hvis du vil tamme en del med ett uønsket anerkjennelsesområde, deler du delen i to underdeler i nærheten av det uønskede området (Figur 2A):
    1. Design den fremre primeren for den første underdelen på samme måte som i trinn 1.1. men design den omvendte primeren med BsmBI-nettstedet og bare et 4-nt genspesifikk overheng.
    2. Design den andre sub-delen fremover primer med BsmBI nettstedet og 4-nt gen-spesifikk overheng bare som overlapper med omvendt primer av den første sub-delen. Design den omvendte primeren til den andre underdelen på samme måte som i trinn 1.1.
    3. Introduser ønsket mutasjon(er) enten omvendt (for trinn 1.2.1) eller fremoverprimer (trinn 1.2.2) i den genspesifikke regionen til primeren.
      MERK: Alternativt kan en BsmBI- og BsaI-fri og codonoptimalisert del syntetiseres kommersielt. For kodingssekvenser (CDS) kan en synonym mutasjon lett innlemmes ved den tredje nukleotid av en aminosyrekodon. For arrangører og terminatorer anbefales det imidlertid å sjekke den muterte promotør- eller terminatoraktiviteten ved hjelp av en reporteranalyse39. Hvis det er et uønsket begrensningssted mot slutten av sekvensen, kan det muteres ved hjelp av en lengre omvendt primer. Hvis det finnes flere uønskede områder, kan områdestyrt mutagenese som tillater mutering av flere områder, utføres40.
  3. Av og til er det ønskelig å fusjonere to proteiner som en enkelt del med en kobling i mellom (Figur 2A). Linker bidrar til å sikre strukturell integritet av de to individuelle proteinene41.
    1. Den fremre primeren for det første genet er den samme som i trinn 1.1. I den omvendte primeren inkluderer du et BsmBI-nettsted, et 4-nt genspesifikk overheng og en linkersekvens. 4-nt-overhenget kan enten være linker eller andre genets første nukleotider.
    2. For det andre genet, design den fremadrettet primeren slik at den har et BsmBI-anerkjennelsessted og en 4-nt overheng komplementær til den omvendte primeren til det første genet. Design den omvendte primeren av det andre genet som i trinn 1.1.
  4. For å forsterke delene ved polymerasekjedereaksjon (PCR)42, bruk en high-fidelity DNA-polymerase for å forsterke delene fra enten et genomisk DNA, en cDNA eller en plasmid. Kontroller PCR-produktet på en 1% agarose gel etterfulgt av gelrensing. Bruk av renset DNA anbefales sterkt, hvis gelrensing er arbeidskrevende, bruk minst en spinnkolonne for å rense PCR-produktet.

2. Kloning av deler i inngangsvektoren (pYTK001) for å lage delplasmider (Figur 2B)

  1. For å sette opp Golden Gate-reaksjonsblandingen, legg til 20 fmol av hvert PCR-produkt og inngangsvektoren (pYTK001), 1 μL 10X T4 ligasebuffer, 0,5 μL Esp3I (en svært effektiv isoschizomer av BsmBI) og 0,5 μL T4-ligaer. Tilsett ddH2O for å bringe det totale volumet til 10 μL.
  2. For å sette opp kloningsreaksjonen, kjør følgende program i en termosykler: 25-35 sykluser på 37 °C i 5 minutter (fordøyelse) og 16 °C i 5 minutter (ligasjon), etterfulgt av en endelig fordøyelse ved 50 °C i 10 minutter og enzymaktivering ved 80 °C i 10 minutter.
    MERK: 35 sykluser med fordøyelse/ligasjon anbefales ved kloning av flere DNA-stykker i inngangsvektoren samtidig, for eksempel under kloning av fusjonsgener eller tamme et gen.
  3. Forvandle hele reaksjonsblandingen til DH5α-stammen eller tilsvarende Escherichia coli kjemisk kompetente celler ved varmesjokk. Det anbefales å transformere hele det 10 μL klonede produktet til 35 μL kjemisk kompetente E. coli-celler (2 X 105 cfu/ml, cfu beregnes fra å transformere 5 ng pYTK001 til 100 μL av de kompetente cellene). Spred på en lysogeny buljongplate (LB) med 35 μg/ml kloramfenikol (cm). Inkuber ved 37 °C over natten.
  4. Etter 16-18 timer, ta platen ut av inkubatoren og hold platen ved 4 °C i ca. 5 timer for å la supermappen grønt fluorescerende protein (sfGFP) utvikle seg for en mer intens grønn farge.
  5. For enklere screening, plasser platen på en ultrafiolett (UV) eller en blå lystransilluminator. SfGFP som inneholder kolonier vil fluoresce under UV-lyset.
  6. De grønne koloniene er negative fordi de inneholder den uklippede pYTK001. De hvite koloniene er sannsynligvis positive. Kloningen er vanligvis vellykket hvis det er ~ 30-100% hvite kolonier. Utfør videre screening av noen få hvite kolonier av enten koloni PCR eller begrensning fordøyelser (foreslått enzym: BsaI-HFv2).
  7. Rens plasmider fra noen få av de potensielt korrekte koloniene og bekreft sekvensene ved Sanger-sekvensering.

3. Montering av delplasmider i "kassett" plasmider

MERK: En kassettplasmid inneholder en brukerdefinert transkripsjonsenhet (TU) som består av en promotor, en CDS og en terminator. En kassettplasmid tillater uttrykk for et enkelt gen. Hvis kassettplasmidene skal settes sammen til en multigenplasmid, er det første trinnet å bestemme antall og rekkefølgen på TUer i multigenplasmid. Disse vil avgjøre hvilke kontakter som skal brukes i kassettplasmider siden kontakter kobler TUer i multi-gen plasmid. Den første TUs venstre kontakt skal være ConLS, og høyre kontakt på siste TU skal være ConRE. De vil overlappe med ConLS' og ConRE' av multigenplasmider. Resten av koblingene bør være i den økende numeriske rekkefølgen. Hvis for eksempel multigenplasmid inneholder fire TUer, vil koblingskombinasjonene være ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 og ConL3-TU4-ConRE (figur 1).

  1. Før du monterer transkripsjonsenheter, anbefales det å montere en mellomliggende vektor med følgende seks deler: venstre kontakt, sfGFP-frafallet (pYTK047), høyre kontakt, en gjærvalgmarkør, en gjæropprinnelse av replikasjon og delen plasmid med mRFP1, en E. coli-opprinnelse og det ampicillinresistente genet (pYTK083) (Figur 3).
    1. Rens de ovennevnte seks plasmidene. Registrer konsentrasjonene deres ved hjelp av et UV-Vis spektrofotometer eller en fluorescensbasert analyse og fortynn hver plasmid med ddH2O slik at 1 μL har 20 fmol DNA. Beregn DNA-molarkonsentrasjonen ved å bruke en online kalkulator.
      MERK: Det er svært viktig å måle DNA-konsentrasjonene nøyaktig og å pipet nøyaktig for at monteringen skal fungere, spesielt for sammenstillinger med fem til syv delplasmider. Små feil i DNA-konsentrasjonen av hver plasmid kan forårsake en betydelig reduksjon i kloning effektivitet.
    2. Tilsett 1 μL av hver plasmid, 1 μL 10X T4 ligasebuffer, 0,5 μL BsaI-HFv2 (en svært effektiv versjon av BsaI) og 0,5 μL T4-ligase. Utgjør volumet til 10 μL ved å legge til ddH2O.
    3. For å sette opp kloningsreaksjonen, kjør følgende program i termosykleren: 25-35 sykluser på 37 °C i 5 minutter (fordøyelse) og 16 °C i 5 minutter (ligasjon). Utelat den endelige fordøyelsen og varmeaktiveringstrinnene, da BsaI-anleggene må beholdes i mellomvektoren (figur 3).
    4. Forvandle hele reaksjonsblandingen til DH5α-stammen eller andre E. coli-kompetente celler. Spred på en LB-plate med 50 μg/ml carbenicillin (Cb) eller ampicillin. Inkuber ved 37 °C over natten.
      MERK: Carbenicillin er en stabil analog av ampicillin.
    5. Etter 16-18 timer, ta platen ut av inkubatoren. Platen vil inneholde både blekrøde og blekgrønne kolonier (figur 6C og 6D). Hold platen ved 4 °C i ca. 5 timer for å la mRFP1 og sfGFP modnes. Bruk en UV eller en blålystransilluminator for å identifisere de grønne koloniene, som inneholder den potensielt korrekte mellomvektoren.
    6. Strekk ut de grønne koloniene på en LB + Cb-plate og inkuber ved 37 °C over natten. Neste dag, strekk ut igjen på en LB + Cm plate og inkuber ved 37 °C over natten. Koloniene som vokser på LB + Cm-plater inneholder feilmonterte plasmider fordi Cm-resistente delvektorer beholdes.
    7. Velg koloniene som ikke vokser på LB + Cm-platen og utfør begrensningsfordøyelser (foreslåtte enzymer: BsaI-HFv2, Esp3I) for å bekrefte riktig montert plasmid. Alternativt kan du bruke koloni PCR for screening.
  2. Når mellomvektoren er montert, er neste trinn å montere transkripsjonsenheter. Dette er en 4-delt montering med følgende deler: mellomvektoren, en promotor, en CDS og en terminator.
    1. Rens de fire delplasmidene. Registrer konsentrasjonene og fortynn hver av plasmid slik at 1 μL har 20 fmol DNA.
    2. Følg trinn 3.1.2 for å sette opp reaksjonsblandingen.
    3. Følg trinn 2.2 for å konfigurere kloningsreaksjonen.
    4. Forvandle hele kloningsreaksjonsblandingen til DH5α eller tilsvarende E. coli kompetente celler og plate på LB + Cb. Inkuber ved 37 °C over natten.
    5. Etter 16-18 timer, ta platen ut av inkubatoren. Hvite og lysegrønne kolonier vises (Figur 6E og 6F). Oppbevar platen ved 4 °C i ca. 5 timer for å la sfGFP modnes. Bruk en UV eller en blålystransilluminator for å identifisere de ikke-fluorescerende hvite koloniene. Disse inneholder potensielt korrekte transkripsjonsenheter.
    6. Strek ut og vokse 8-10 hvite kolonier og utfør en koloni PCR. Rens plasmider fra koloniene som tester positivt fra kolonien PCR. Utfør begrensningsfordøyetid (foreslått enzym: Esp3I) for å bekrefte forsamlingen ytterligere.
      MERK: Sekvensering av transkripsjonsenheter er vanligvis ikke nødvendig fordi kloningen bare innebærer begrensning av fordøyelse og ligasjon. Alle sekvenser av interesse er bekreftet på del plasmidnivå.

4. Montering av kassettplasmider i "multi-gene" plasmider:

MERK: Multigenplasmider tillater uttrykk for mer enn ett gen. Avhengig av nedstrømsapplikasjonen kan multigenplasmider være replikerende eller integrative. Replikerende plasmider har gjæropprinnelsen av replikering; Derfor kan den opprettholdes stabilt når gjærcellen deler seg. Integrative plasmider har ikke gjæropprinnelsen av replikasjon. I stedet har de 5' og 3' homologiarmer som tillater integrering av flere gener i spesifikk loci av genomet gjennom homolog rekombinasjon.

  1. For multi-gen plasmider, montere en mellomliggende vektor først.
    1. Hvis du vil sette sammen replikerende mellomvektorer (figur 4A), setter du sammen følgende seks deler: venstre kontakt (ConLS'-pYTK008), sfGFP-frafallet (pYTK047), høyre kontakt (ConRE'-pYTK072), en gjærvalgmarkør, en gjæropprinnelse av replikasjon, og delen plasmid med mRFP1, en E. coli-opprinnelse av replikasjon, og det kanamycinresistente genet (pYTK084).
      1. Følg trinnene fra 3.1.1 til 3.1.3 for montering.
      2. Forvandle hele kloningsreaksjonsblandingen til DH5α eller tilsvarende E. coli kompetente celler, og plate på LB pluss 50 μg / ml kanamycin (Km). Inkuber ved 37 °C over natten.
      3. For rød/grønn fargebasert screening, følg trinn 3.1.5.
      4. For screening av misassemblies, strek og vokse de grønne koloniene på en LB + Km plate. Følg deretter trinn 3.1.6.
    2. For integrative multigenvektorer (figur 4B) må du først bestemme det genomiske locus av interesse, og deretter designe omtrent 500 basispar med 5' og 3 ' homologi armer for integrering til det locus.
      1. Klone 5' og 3 ' homologi armer fra gjær genomisk DNA inn i oppføring vektor-pYTK001. Følg trinn 1 og 2.
      2. Sett sammen følgende syv plasmider: venstre kontakt (ConLS'-pYTK008), sfGFP-frafallet (pYTK047), høyre kontakt (ConRE'-pYTK072), en gjærmarkeringsmarkør, den 3' homologiarmen, den delen plasmid med mRFP1, E. coli opprinnelse av replikasjon, og kanamycinresistent gen (pYTK090), og 5 'homologi arm.
      3. Følg trinn 4.1.1 for montering og screening.
  2. Montering av multigenplasmid
    1. Rens plasmider av mellomvektoren oppnådd i trinn 4.1 og kassettplasmidene fra trinn 3. Registrer konsentrasjonene deres ved hjelp av et UV-Vis spektrofotometer eller en fluorescensbasert analyse. Fortynn hver i ddH2O slik at 1 μL har 20 fmol DNA.
    2. Tilsett 1 μL mellomvektor, 1 μL av hver transkripsjonsenhet, 1 μL 10x T4 ligasebuffer, 0,5 μL Esp3I og 0,5 μL T4-ligaer. Ta volumet til 10 μL ved bruk av ddH2O.
    3. Følg trinn 2.2 for å konfigurere kloningsreaksjonen.
    4. Forvandle hele kloningsreaksjonsblandingen til DH5α eller tilsvarende E. coli kompetente celler, og plate på LB + Km. Inkuber ved 37 °C over natten.
    5. Utfør grønn/hvit screening som i trinn 3.2.5.
    6. Rens plasmider fra noen få hvite kolonier og utfør begrensningsfordøyelser. Bruk av NotI-HF-enzymet anbefales fordi det er to NotI-steder på henholdsvis E. coli-opprinnelses- og km-merketrdelen (figur 4B). Hvis den monterte plasmiden er veldig stor, kan et annet begrensningssted velges for ytterligere bekreftelse. Alternativt kan du skjerme med koloni-PCR før du fortsetter å begrense fordøyelsen.

5. Påføring av multigenplasmider for kromosomal eller plasmidbasert genuttrykk

  1. Integrering av multigenplasmid i gjærgenomet for kromosomalt genuttrykk (figur 5)
    1. Design en guide RNA (gRNA) for ønsket locus. Bruk av flere elektroniske ressurser, for eksempel Benchling, CRISPRdirect43og CHOPCHOP44, anbefales for å fastslå maksimal målspesifikk.
    2. Klone syntetisert 20-nt gRNA inn i pCAS plasmid45 ved Gibson kloning. Lineariser pCAS-plasmidet av PCR ved hjelp av en omvendt primerparbinding til 3' av HDV-ribozymet og 5' av henholdsvis tracrRNA (Figur 5). Alternativt kan du klone gRNA i sgRNA-frafallet plasmid (pYTK050) og montere frafallsplasmid i en kassettplasmid med linkers. Monter deretter Cas9 TU med Cas9 delplasmid (pYTK036). Til slutt, samle Cas9 TU og sgRNA TU i en replikerende multi-gen plasmid.
    3. Lineariser 5-15 μg integrativ multigenplasmid med 1 μL NotI-HF-enzym over natten. Transformer 1 μg pCAS-gRNA og den lineariserte integrative multigenplasmiden til S. cerevisiae. Forbered kompetente celler ved hjelp av enten et kommersielt tilgjengelig gjærtransformasjonssett eller etter protokollen av Geitz og Schiestl, 200746.
      MERK: Det er unødvendig å rense den lineariserte multigenplasmiden etter NotI-fordøyelsen.
    4. Pellet cellene etter utvinning, kast supernatanten, vask med like mye vann. Plate gjærceller på den komplette syntetiske medium (CSM) dropout plate eller gjær ekstrakt peptone dextrose medium (YPD) plate med antibiotika, avhengig av gjær selektiv markør. Inkuber ved 37 °C i to dager for at koloniene skal danne seg. I tilfelle ingen koloni observeres, inkuber i ytterligere en til to dager ved 30 °C.
    5. Skjerm gjær kolonier for integrasjon av koloni PCR47.
    6. For å kurere pCAS, strekke ut kolonien med riktig integrasjon på en ikke-selektiv YPD-plate. Vokse ved 30 °C over natten. Strekk en koloni fra YPD-platen til en frisk YPD-plate. Igjen, vokse ved 30 °C over natten. Strekk en koloni fra den andre YPD-platen til en YPD pluss 100 μg/ml nourseothricin, utvalgsmarkøren for pCAS. Vellykket herding oppstår når gjærceller ikke vokser på selektivplaten.
      MERK: Hvis pCAS-plasmidet ikke er herdet i to runder med ikke-selektiv YPD, kan du strekke igjen på en frisk YPD i ytterligere 1-2 runder.
  2. Transformere replikerende multigenplasmid for plasmidbasert genuttrykk
    1. Forvandle 100 ng-1 μg ren multigenplasmid til S. cerevisiae kompetente celler.
    2. Plate gjærceller umiddelbart etter transformasjon på CSM-frafallsplaten eller YPD pluss antibiotikaplate, avhengig av gjærvalgmarkøren som brukes. Inkuber ved 30 °C i 2-3 dager før koloniene dannes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her resultatene av fire replikerende multi-gen plasmider for β-karoten (gul) og lykopen (rød) produksjon. En integrativ multi-gen plasmid for å forstyrre ADE2 locus ble konstruert, hvis kolonier er røde.

Kloning av CDS-er i inngangsvektoren (pYTK001)
ERG20 ble forsterket fra gjærgenomet og de tre karotenoidgenene crtE, crtYB, crtI fra plasmid pLM49448 inn i inngangsvektoren pYTK001 som beskrevet. Gjærpromotorer pENO2, pTIP1, pPYK1 og pPDC1 og terminatorer tTDH2, tHSP26, tADH2, tACS2 ble klonet som delplasmider. En punktmutasjon ble introdusert i CrtYB (G247A) for å produsere lykopen og en BTS1-ERG20 fusjonskonstruksjon ble opprettet for bedre å kanalisere prenylen mellomliggende til karotenoider. Figur 6A og 6B viser en representativ plate for vellykket kloning av en delplasmid og gir et eksempel på at grønn/hvit screening med 90,35 ± 4,22 % totale kolonier er potensielt korrekte (hvite).

Montering av transkripsjonsenheter (kassettplasmider)
Før du monterer kassettplasmidet, ble utformingen av multigenplasmid ferdigstilt. For de fire karotenoid-TV-ene ble fire mellomliggende vektorer med forskjellige kontakter klonet først etter trinn 3.1. Figur 6C og 6D viser en representativ plate fra en vellykket montering av mellomvektoren og gir et eksempel på at rød/grønn screening, med 17,56 ± 3,32 % totale kolonier er positive (grønne). Selv om dette forholdet er relativt lavt, er screeningen sterkt tilrettelagt av den grønne fluorescensen.

Deretter ble TUene for BTS1-ERG20, ERG20, crtE, crtYB, crtYB(G247A)og crtI montert etter trinn 3.2 (Tabell 1). Figur 6E og 6F viser en representativ plate for en vellykket montering av TUene og gir et eksempel på en grønn/hvit screeningmetode, der 65,02 ± 4,99 % totale koloniene er positive (hvite).

Montering av multi-gen plasmider
Fire replikerende og en integrativ multi-gen plasmider ble samlet. For replikerende multigenplasmider ble ERG20, BTS1-ERG20, crtE, crtYB, crtYB (G247A) og crtI samlet i fire forskjellige kombinasjoner, og skapte fire plasmider: to for β-karoten og to for lykopenproduksjon (Tabell 2). Forholdet mellom potensielt korrekte kolonier (grønn) for mellomliggende vektorkloning var 1,83 ± 0,15 % (figur 7A og 7B). Selv om dette tallet virker lavt, ble screeningen gjort enkelt ved å oppdage den grønne fluorescensen (Figur 7B). Når mellomliggende plasmid ble klonet, var suksessraten for montering av multigenplasmider (hvit) fra mellomliggende 93,77± 1,65% (Figur 7C og 7D). Figur 7E og 7F viser en suboptimal montering av multigenplasmider, da antallet positive kolonier (hvite) var ubetydelige. Etter å ha forvandlet seg til gjær, vokste kolonier som produserer β-karoten (gul) og lykopen (rød) på dag tre. Fire kolonier fra hver tallerken ble strødd ut på ferske tallerkener og vokst i to dager til. Figur 8A og 8B viser at fusing av BTS1-ERG20 styrer mer geranylgeranyl-pyrofosfat mot karotenoidproduksjonen, sett av mørkere farger enn å bruke ERG20 alene. Ved ekstraksjon49 og kvantifisering av karotenoider ved UV-Vis spektrofotometri med autentiske standarder, det ses at fusjon av BTS1-ERG20 fører til produksjon av 0,729 μg/mg β-karoten, som er ~ 35 ganger høyere enn 0,021 μg /mg β-karoten produsert av stammen med ERG20 alene. På samme måte er produksjonen av lykopen ~16,5 ganger høyere i belastningen med BTS1-ERG20 (1,126 μg/mg) sammenlignet med ERG20 (0,068 μg/mg) alene (figur 8C).

Replikerende multigenplasmider forvandlet til gjær med (A) BTS1-ERG20 fusjon TU og (B) ERG20 TU. På hver tallerken har gjær på venstre side plasmider som inneholder crtE TU, crtYB TU og crtI TU for produksjon av β-karoten og gjær på høyre side har plasmider som inneholder crtE TU, crtYB (G247A)TU og crtI TU for produksjon av lykopen.

For den integrative plasmiden ble ConLS', sfGFP-frafallet, ConRE', HIS3 (gjærvalgsmarkør), ADE2 5' og 3' homologiarmer samlet etter trinn 4.1.2. 5' og 3 ' homologi armer var 500 bp fra hverandre, slette ~ 180 aminosyrer etter integrasjon. I tillegg hadde 5's homologiarm seks stopp codons mot sin 3' slutt. Den muterte ADE2 resulterte i røde kolonier50. ADE2 gRNA 5'-ATTGGGAC GTATGATTGTTGAGG-3'51 ble brukt og fulgte trinn 5.1 for genomisk integrasjon. Etter 3-4 dager ble det observert røde kolonier på YPD-platen + 100 μg/ml nourseothricin, noe som indikerer at ADE2 hadde blitt vellykket forstyrret (Figur 8D og 8E).

Figure 1
Figur 1: Oversikt over flergenmontering. Montering foregår på tre nivåer. In0 nivå 1, CDS, eller en annen del, forsterkes fra genomet eller syntetiseres, og klones deretter inn i pYTK001 oppføringsvektoren ved hjelp av BsmBI (eller Esp3I) enzymet. ColE1: E. coli opprinnelse av replikering; CmR: Kloramfenikolresistent gen. I nivå 2 er transkripsjonsenheten (TU) som inneholder en promotor, en CDS og en terminator montert ved hjelp av BsaI-enzymet. I nivå 3 settes opptil fem transkripsjonsenheter sammen til en multigenplasmid ved hjelp av BsmBI (eller Esp3I) enzymet. Multigenplasmid kan enten være replikerende eller integrativ. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Primer design og kloning av delplasmider. (A) Primer design for å forsterke individuelle deler, tamme gener eller skape punktmutasjoner, og montering av fusjonsproteiner. Primere inkluderer BsmBI- og BsaI-anerkjennelse og kuttede steder og MoClo-overhenget for riktig montering. MoClo-overheng er representert som 1, 2, 3, 4 og 5, 6, 7, 8. Interne primere for domesticering eller opprettelse av fusjonsprotein inneholder BsmBI, men ikke BsaI-stedene. Overhengene for disse er tilpassede interne sekvenser (NNNN og N'N'N'N' i lilla). Terminal "ttt" er inkludert for optimal enzym fordøyelse. GOI: gen av interesse. (B) Kloning forsterkede deler i pYTK001 inngangsvektoren ved hjelp av BsmBI (eller Esp3I). Komplementære overheng fører til integrasjon av delen og fjerning av BsmBI anerkjennelsesstedet. ColE1: E. coli opprinnelse av replikering; CmR: Kloramfenikolresistent gen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Montering av transkripsjonsenhet. For å montere TU-plasmidene anbefales montering av en mellomvektor for å lette kombinatorisk TU-montering. Hvis du vil montere mellomvektoren, kloner du Con LX (X: en av de fem venstre kontaktene), sfGFP-frafallet, Con RY (Y: en av de fem høyre kontaktene), en gjær-ORI (opprinnelsen til replikasjon) og en gjærmarkørdel i mRFP1-frafallsvektoren ved hjelp av BsaI-enzymet. Mellomliggende plasmid er motstandsdyktig mot ampicillin. BsaI-anerkjennelsesstedene beholdes for TU-plasmid kloning. For å klone TU-plasmiden, samles en promotor, en CDS og en terminator i mellomvektoren ved hjelp av BsaI. Den klonede TU vil ha BsmBI-anlegg i ConLX- og ConRY-regionene for neste trinns flergenmontering. Den klonede TU er også motstandsdyktig mot ampicillin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

navn ConLX (venstre kontakt) Promoter Cder Terminator ConRY (høyre kontakt)
BTS/ERG20 Tu Ls pENO2 BTS1/ERG20 tTDH2 R1
ERG20 Tu Ls pENO2 ERG20 tTDH2 R1
crtE Tu L1 pTIP1 crtE tHSP26 R2
crtYB Tu L2 pPDC1 crtYB tADH2 R3
crtYBG247A Tu L2 pPDC1 crtYBG247A tADH2 R3
crtI Tu L3 pPYK1 crtI tACS2 Re

Tabell 1: Transkripsjonsenheter som brukes i denne studien. Arrangører og terminatorer ble forsterket fra S. cerevisiae. BTS1 (geranylgeranyl difosfatsyntase) og ERG20 (farnesylpyrofosfatsyntetase) ble forsterket fra S. cerevisiae. Genene crtE (geranylgeranyl difosfatsyntase), crtYB (bifunksjonell lykopencyklase/fytoensyntase) og crtI (fytoendesaturase) var fra Xanthophyllomyces dendrorhous.

Figure 4
Figur 4: Multigen plasmid montering. (A) Replikert plasmid samling. Montering av den replikerende mellomvektoren inkluderer kloning av Con LS', sfGFP-frafallet, Con RE', en gjær ORI, en gjærmarkør og en E. coli-opprinnelse og markør på mRFP1-frafallsvektoren ved hjelp av BsaI-enzymet. ConLS- og ConRE-nettstedene introduserer BsmBI-anerkjennelsessteder for vektoren. Potensielt korrekte forsamlinger kan screenes ved å lete etter grønne kolonier på en selektiv plate med kanamycin. De tidligere monterte TV-ene kan deretter klones inn i mellomvektoren ved hjelp av BsmBI-enzymet. Denne plasmiden inneholder en gjær ORI slik at den kan replikere i en gjærvert. (B) Integrativ plasmid montering. Montering av den integrerende mellomvektoren inkluderer kloning av Con LS', sfGFP-frafallet, Con RE', en 5' homologiarm, en 3' homologiarm, en gjærmarkør og E. coli-opprinnelsen og markøren i RFP-frafallsvektoren ved hjelp av BsaI-enzymet. Korrekte monteringer skal vises grønne på en selektiv plate med kanamycin. Transkripsjonsenheter som tidligere er laget, kan klones inn i den replikerbare mellomvektoren ved hjelp av BsmBI-enzymet. Denne vektoren har ikke en gjær ORI og vil bli integrert i målet locus gjennom CRISPR og homolog rekombinasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

navn TIRs TU2 TU3 TU4 Produktet
B/E-β-karoten BTS1/ERG20 crtE crtYB crtI β-karoten
B/E-Lycopen BTS1/ERG20 crtE crtYBG247A crtI Lycopene
E-β-karoten ERG20 crtE crtYB crtI β-karoten
E-Lycopene ERG20 crtE crtYBG247A crtI Lycopene

Tabell 2: Multigen Plasmider brukt i denne studien.

Figure 5
Figur 5: CRISPR-integrasjon. (A) CRISPR og hjelper plasmid kloning. pCAS-plasmidet inneholder Cas9-endonuklease og komponenter (tRNA-promotor, SNR52-terminator, HDV ribozyme og tracrRNA) for optimalt uttrykk for en gRNA. Klone pCAS+gRNA-plasmidet ved å montere syntetisk gRNA med den lineariserte pCAS ved hjelp av Gibson-kloning. (B) CRISPR hjalp genetisk integrasjon. Trinn 1: Cotransformasjon: pCAS +gRNA ble co-forvandlet til gjær med den integrative plasmiden som inneholder genet (GOI), en gjærselektiv markør og 5' og 3' homologiregion rettet mot det genomiske locus. For optimal integrasjon, lineariser den integrative plasmiden med NotI. Trinn 2: Integrasjon ved mållocus: Dyrking av den transformerte gjæren på en tallerken selektiv for gjærmarkøren, enten antibiotika eller auxotrofisk. Utfør genotyping for å bekrefte integreringen. Trinn 3: Herd pCAS + gRNA-plasmidet ved å strekke gjær på en ikke-selektiv plate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Representative plater av inngangsvektor og transkripsjonsenhetsnivå kloning i E. coli. Representative plater av vellykket kloning av et gen i inngangsvektoren pYTK001 under (A) synlig lys og (B) UV-lys. Positive kolonier er hvite og negative kolonier er grønne. Forholdet mellom positive kolonier samlet kolonier er 90,35 ± 4,22%. Vellykket montering av mellomvektoren for transkripsjon enhet nivå montering og grønn / rød valg under (C) synlig lys og (D) UV-lys. Positive kolonier er grønne. Forholdet mellom positive kolonier samlet kolonier er 17,56 ± 3,32%. Vellykket montering av transkripsjonsenhet fra mellomvektoren og grønn/hvit screening under (E) synlig lys og (F) UV-lys. Positive kolonier er hvite og negative kolonier er grønne. Forholdet mellom positive kolonier generelle kolonier er: 65,02 ± 3,32%. Data er fra tre biologiske replikeringer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Representative plater av multigenplasmid kloning i E. coli. Montering av mellomvektoren for montering på flergennivå og rød/grønn seleksjon under (A) synlig lys og (B) UV-lys. Positive kolonier er grønne og negative kolonier er røde. Forholdet mellom positive kolonier generelle kolonier er 1,83 ± 0,15%. Vellykket montering av flere TUer fra mellomvektsvektoren og grønn/hvit-markeringen (C) under synlig lys og (D) UV-lys. Positive kolonier er hvite. Forholdet mellom positive kolonier samlet kolonier er 93,77 ± 1,65%. Suboptimal montering av multigenplasmid under (E) synlig lys og (F) UV-lys. Antall positive kolonier er ubetydelig. Data er fra tre biologiske replikeringer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Representative plater av integrative og replikerende plasmider i gjær. Replikerende multigenplasmider forvandlet til gjær med (A) BTS1-ERG20 fusjon TU og (B) ERG20 TU. På hver tallerken har gjær på venstre side plasmider som inneholder crtE TU, crtYB TU og crtI TU for produksjon av β-karoten og gjær på høyre side har plasmider som inneholder crtE TU, crtYB (G247A)TU og crtI TU for produksjon av lykopen. (C) kvantifiserer β-karoten og lykopen fra gjærekstrakt med fire multigenplasmider ved hjelp av et UV-vis spektrometer. Maksimal absorbans ble registrert ved henholdsvis 450 nm og 470 nm for henholdsvis β-karoten og lykopen. Den absolutte kvantifiseringen ble utført ved hjelp av autentiske standarder (Supplementary Figure S3). Fusjon av BTS1-ERG20 fører til produksjon av ~ 35 ganger høyere β-karoten og ~ 16,5 ganger høyere lykopen sammenlignet med ERG20 alene. Representative plater for forstyrrelse av ADE2-gresset ved integrering av en multigenintegrativ plasmid med gRNA og ingen hjelper-DNA (D) og med gRNA og en multigenintegrativ plasmid som hjelper-DNA (E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsmaterialer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det MoClo-baserte kloningssettet utviklet av Lee et al. gir en utmerket ressurs for rask montering av en til fem transkripsjonsenheter i en multigenplasmid enten for replikering eller integrasjon i gjærgenomet. Bruken av dette settet eliminerer den tidkrevende kloning flaskehalsen som ofte eksisterer for å uttrykke flere gener i gjær.

Vi testet fem forskjellige forhold for fordøyelses-/ligasjonssyklusene til Golden Gate-kloning med T4 DNA-ligaer. Vi fant at 30 sykluser av fordøyelsen ved 37 °C i 5 minutter og ligasjon ved 16 °C i 5 minutter etterfulgt av et siste fordøyelsestrinn ved 50 °C i 10 minutter og et proteininaktiveringstrinn ved 80 °C i 10 minutter resulterte i 99,5 % kolonier som potensielt var korrekte i en 4-delt montering (Supplementary Figure S1 og Table S3). Ligasjon ved 16 °C sikrer optimal ligaseaktivitet og overheng. Endelig fordøyelse ved 50 °C forhindrer at fordøyde produkter blir re-ligation. Denne syklusen ble fulgt for alle monteringsreaksjonene med mindre annet er spesifisert.

Vi har også funnet noen kritiske trinn som trenger spesiell oppmerksomhet for optimale resultater. Vi anbefaler på det sterkeste å montere mellomvektorer med sfGFP-frafallet før du monterer transkripsjonsenheter. I teorien kan alle syv delene klones inn i E. coli-vektoren med mRFP1, etterfulgt av rød / hvit screening. Men i praksis utvikler mRFP1 farge veldig sakte, og det er utfordrende å skille mellom blekrøde og blekgule E. coli-kolonier under synlig lys. Som sfGFP absorberer i UV-området52, ved hjelp av en UV eller en blå lystransilluminator letter screeningen for lyse grønne kolonier. Kloning av en mellomliggende vektor tillater også mer facile-montering av de forskjellige promotor-, CDS- og terminatorkombinasjonene, noe som muliggjør en enklere kombinatorisk bibliotekoppretting, siden en montering med fire deler vanligvis resulterer i mer positive kolonier enn en montering med flere deler. Supplerende figur S2 viser en progressiv reduksjon i forholdet mellom potensielt korrekte kolonier fra en 6-delt til en 8-delt montering.

Konsentrasjonene av alle delene må måles omhyggelig for å sikre likevektskonsentrasjonen av hver del. Kvantifisering av deler ved hjelp av uv-vis spektrometer er vanligvis tilstrekkelig, men mer følsomme metoder, for eksempel fluorescensbaserte analyser, kan gi bedre resultater. Unnlatelse av å kvantifisere alle delene nøyaktig resulterer ofte i lav monteringseffektivitet. Man bør velge henholdsvis den svært effektive Esp3I og BsaI-HFv2. Vi har observert at T4 fungerer bra for både overheng i settet og tilpassede overheng er nødvendige for å smelte sammen to deler, som er i samsvar med litteratur36, selv om det opprinnelige papiret anbefalte T7 ligase6. Økning av antall sykluser kan øke antall potensielt korrekte kolonier til en viss grad. For eksempel er 25 sykluser av fordøyelse og ligasjon nok til å montere tre til fire deler, men 30-35 sykluser gir bedre resultater for flere deler.

MolClo-strategien er fordelaktig i forhold til alternative flerdelte monteringsmetoder8,9,10,11,12 fordi den tillater modulær og svært allsidig kloning. Den primære begrensningen er imidlertid domesticeringstrinnet siden deler noen ganger har flere BsmBI-, BsaI- eller NotI-nettsteder. Det kan være tidkrevende å mutere alle delene. I dette tilfellet kan man vurdere å syntetisere CDS uten disse begrensningsområdene. Men for promotører og terminatorer kan mutering av selv et enkelt nukleotid endre funksjonaliteten. Derfor anbefales det å validere aktiviteten til disse delene ved hjelp av en reporteranalyse39. En annen begrensning er at dette settet bare tillater opptil fem transkripsjonsenheter i en multigenplasmid. Hvis flere transkripsjonsenheter ønskes, kan flere koblinger konstrueres ved å velge et sett med svært kompatible overheng36.

Settet gir 27 promotører, seks terminatorer, syv gjærvalgmarkører og to gjæropprinnelse av replikasjoner. Tilpassede deler, for eksempel promotorer og terminatorer, enten innfødte eller syntetiske, kan klones inn i inngangsvektoren etter denne protokollen. Gjær moclo kit har blitt brukt primært for overekspresserende multi-gen metabolske veier for å produsere høyverdige kjemikalier i gjær. Denne protokollen kan også brukes når forskjellige brytere for biologiske kretser er ønsket i gjær. Det er også et enormt potensial for å bruke dette settet til undersøkelse av grunnleggende biologiske spørsmål om proteinproteininteraksjoner, proteinlokalisering og enzymaktiviteter. Totalt sett er denne protokollen ekstremt fleksibel og pålitelig og kan støtte enhver krevende kloning i gjærbiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Research Foundation for State University of New York (Pris #: 71272) og IMPACT Award of University at Buffalo (Pris #: 000077).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Glass beads RPI research products 9831 For lysing yeast cells
Bacto Agar BD & Company 214010 Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto Peptone BD& Company 211677 Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2 New England Biolabs R3733S a highly efficient version of BsaI restriction enzyme
Carbenicillin Fisher Bioreagents 4800-94-6 Antibiotic for screening at the transcription unit level
Chloramphenicol Fisher Bioreagents 56-75-7 Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-His Sunrise Sciences 1006-010 Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Dextrose Fisher Chemical D16-500 Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids BD & Company 291940 Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mix Promega U1515 dNTPs for PCR
Esp3I New England Biolabs R0734S a highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit Zymo Research T2001 For yeast transformation
Hexanes Fisher Chemical H302-1 For carotenoid extraction from yeast cells
Kanamycin Fisher Bioreagents 25389-94-0 Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, Miller Fisher Bioreagents BP1425-2 Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, Miller Fisher Bioreagents BP1426-2 Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Lycopene Cayman chemicals NC1142173 For lycopene quantification
MoClo YTK Addgene 1000000061 Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England Biolabs T1010L For plasmid purification from E.coli
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND2000c For measuring accurate DNA concentrations
NotI-HF New England Biolabs R3189S Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin Sulphate Goldbio N-500-100 Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X) New England Biolabs B0518S Buffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530S High fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494 Addgene 100539 Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz Cuvette Thermo Electron 10050801 For quantifing carotenoids
T4 ligase New England Biolabs M0202S Ligase for Golden Gate cloning
Thermocycler BIO-RAD 1851148 For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue Homogenizer Bullet Blender Model: BBX24 For homogenization of yeast cells
UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific Genesys 150 For quantifing carotenoids
Yeast Extract Fisher Bioreagents BP1422-500 Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-carotene Alfa Aesar AAH6010603 For β-carotene quantification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
  2. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553 (2009).
  3. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5 (2008).
  4. Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
  5. Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622 (2011).
  6. Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
  7. Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892 (2018).
  8. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  9. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  10. Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55 (2007).
  11. de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16 (2009).
  13. Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
  14. Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
  15. Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185 (2018).
  16. Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
  17. Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
  18. Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
  19. Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
  20. Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123 (2017).
  21. Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
  22. Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
  23. Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
  24. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  25. Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
  26. Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
  27. Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
  28. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  29. Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
  30. Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131 (2019).
  31. Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965 (2018).
  32. Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker's yeast. Nature Communications. 8, 15202 (2017).
  33. Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
  34. Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
  35. Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
  36. Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
  37. Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
  38. Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932 (2019).
  39. Engler, C., Sylvestre, M. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. 1116, Humana Press. Ch. 9 119-131 (2014).
  40. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
  41. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  42. Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, Pt 1 263-273 (1986).
  43. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  44. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
  45. Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
  46. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  47. Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
  48. Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931 (2018).
  49. Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
  50. Jones, E., et al. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast 181 (1982).
  51. Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
  52. Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750 (2014).

Tags

Bioengineering Utgave 168 MoClo Saccharomyces cerevisiae metabolsk ingeniørkunst heterologt uttrykk CRISPR genomredigering
Rask montering av multigenkonstruksjoner ved hjelp av modulær golden gate-kloning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, M., Caroll, E., Wang, Z.… More

Mukherjee, M., Caroll, E., Wang, Z. Q. Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning. J. Vis. Exp. (168), e61993, doi:10.3791/61993 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter