Summary
이 프로토콜의 목표는 골든 게이트 복제를 기반으로 모듈형 복제 시스템을 사용하여 다중 유전자 구조를 조립하기위한 상세한 단계별 가이드를 제공하는 것입니다. 또한 우리의 경험을 바탕으로 최적의 어셈블리를 보장하기 위한 중요한 단계에 대한 권장 사항을 제공합니다.
Abstract
골든 게이트 복제 방법은 사용자 정의 배열에서 여러 유전자의 신속한 조립을 가능하게합니다. 그것은 그들의 인식 사이트 외부 잘라 하 고 짧은 오버행을 만드는 유형 IIS 제한 효소를 활용. 이 모듈식 복제(MoClo) 시스템은 프로모터, 코딩 서열(CDS) 및 종착기와 같은 다른 DNA 부품이 먼저 엔트리 벡터로 복제되는 계층적 워크플로우를 사용합니다. 그런 다음 여러 항목 벡터가 전사 단위로 어셈블합니다. 몇몇 전사 단위는 그 때 다중 유전자 플라스미드로 연결합니다. 골든 게이트 복제 전략은 한 냄비 반응에서 흉터가없고 방향성 및 모듈식 조립을 허용하기 때문에 엄청난 이점입니다. 계층적 워크플로우를 통해 전형적으로 엔트리 벡터를 넘어 시퀀싱할 필요 없이 다양한 다중 유전자 구조의 촉진 복제를 가능하게 합니다. 형광 단백질 중퇴를 사용하면 쉽게 시각적 으로 선별 할 수 있습니다. 이 작업은 효모 모듈식 복제(MoClo) 키트를 사용하여 다중 유전자 플라스미드를 조립하기 위한 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 우리는 다중 유전자 플라스미드 조립의 최적 및 최적 결과를 보여주고 식민지에 대한 검열을위한 가이드를 제공합니다. 이 복제 전략은 효모 대사 공학 및 다중 유전자 플라스미드 복제가 필요한 다른 상황에 매우 적용 가능합니다.
Introduction
합성 생물학은 제약, 농업 및 화학 산업에 유용한 새로운 기능으로 생물학적 시스템을 설계하는 것을 목표로합니다. 높은 처리량 방식으로 많은 수의 DNA 단편을 조립하는 것은 합성 생물학의 기초 기술입니다. 이러한 복잡한 과정은 복잡성이 감소하여 여러 단계로 분해 될 수 있으며, 기본 공학과학1,2에서빌린 개념. 합성 생물학에서 DNA 단편은 일반적으로 기능에 기초하여 계층적으로 조립됩니다: (i) 부품 수준: "부품"은 프로모터, 코딩 서열, 터미네이터, 복제의 기원과 같은 특정 기능을 가진 DNA 단편을 지칭한다. (ii) 전사 단위 (TU) 수준: TU는 프로모터, 코딩 서열 및 단일 유전자를 전사할 수 있는 종점으로 구성된다. (iii) 다중 유전자 수준: 다중 유전자 플라스미드는 전체 대사 경로로 자주 구성된 다중 투구를 함유하고 있습니다. BioBrick 커뮤니티가 개척한 이 계층적 조립은 합성 생물학3에서대형 DN 세트의 조립을 위한 기본 개념입니다.
지난 10년 동안4,5,6,7,골든 게이트 복제 기술은 계층적 DNA 어셈블리2를현저히 촉진했다. 깁슨 복제8,결찰-독립 복제(SLIC)9,우라실 절제 기반 복제(USER)10,리구아 사이클링 반응(LCR)11,생체 내 재조합(DNA 어셈블러)12,13등 다른 다중 부품 복제 방법도 지금까지 개발되었다. 그러나 골든 게이트 복제는 유전자 특정 서열과 독립적이기 때문에 이상적인 DNA 조립 방법이므로 흉터가 없고 방향성 및 모듈식 조립을 한 냄비 반응에서 허용합니다. 골든 게이트 복제는 비 palindromic 서열을 인식하는 유형 IIS 제한 효소를 활용하여 인식 부위2외부에서 비틀거리는 오버행을 만듭니다. 그런 다음 리거제는 어닐링된 DNA 단편에 합류하여 다중 부분 조립을 얻습니다. 모듈형 복제(MoClo) 시스템에 이 복제 전략을 적용하면 올바르게 조립된 구조4를포함하는 90% 이상의 변압제를 통해 최대 10개의 DNA 단편을 조립할 수 있게 되었다.
MoClo 시스템은 합성 생물학의 설계 구축 테스트 주기를 가속화한 엄청난 이점을 제공합니다. 첫째, 교환 가능한 부품은 결합 복제를 가능하게 하여 큰 파라미터 공간을 빠르게 테스트할 수 있습니다. 예를 들면, 신진 대사 통로를 최적화하는 것은 일반적으로 통로 플럭스의 균형을 맞추기 위하여 각 유전자를 위한 많은 프로모터를 통해 순환을 요구합니다. MoClo 시스템은 이러한 까다로운 복제 작업을 쉽게 처리할 수 있습니다. 둘째, 하나는 부품 플라스미드를 서열화할 필요가 있지만 전형적으로TU 또는 다중 유전자 플라스미드가 아닙니다. 대부분의 경우, 콜로니 PCR 또는 제한 소화에 의한 스크리닝은 TU 및 다중 유전자 플라스미드 수준에서 검증하기에 충분하다. 이는 플라스미드 부분을 복제하는 것이 돌연변이를 자주 도입하는 PCR을 필요로 하는 유일한 단계이기 때문입니다. 셋째, MoClo 시스템은 다중 유전자 복합 대사 경로를 구축하는 데 이상적입니다. 마지막으로, 보편적 인 오버행으로 인해 부품 플라스미드를 재사용하고 전체 생물 공학 커뮤니티와 공유 할 수 있습니다. 현재, MoClo 키트는 식물14,15,5,16,17,곰팡이6,18,19,20,21,22,박테리아7,23,24,25,26,27및 동물28,29에사용할 수 있습니다. 멀티 킹덤 MoClo 플랫폼도 최근에 도입되었습니다30.
Saccharomyces cerevisiae를위해, Lee외. 6효모 합성 생물학 커뮤니티를 위한 우수한 자원인 다재다능한 MoClo 툴킷을 개발했습니다. 이 키트는 편리한 96웰 형식으로 제공되며 다양한 유형의 상호 교환 가능한 DNA 부품을 잘 특징적인 프로모터, 형광 단백질, 터미네이터, 펩타이드 태그, 선택 마커, 복제 원산지 및 게놈 편집 도구를 정의합니다. 이 툴킷은 최대 5개의 전사 단위를 다중 유전자 플라스미드로 조립할 수 있게 한다. 이러한 특징은 부분 또는 전체 경로가 표적 화학 물질을 생산하기 위해 과도하게 표현되는 효모 신진 대사 공학에 유용합니다. 이 키트를 사용하여 연구자들은 제라니올, 리날로올31,페니실린32,무코닉산33,인디고34,베타레인35 의 효모 의 생산을 최적화했다.
여기서 우리는 상피 또는 게놈 발현을 위한 다중 유전자 통로를 생성하기 위하여 MoClo 툴킷의 사용을 안내하는 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 키트의 광범위한 사용을 통해, 우리는 DNA 농도의 정확한 측정이 골든 게이트 반응에서 각 부분의 동등성 분포를 보장하는 열쇠임을 발견했다. 우리는 또한 T7 DNA 리개세 위에 T4 DNA 리구아제추천36의 더큰 숫자와 더 잘 작동하기 때문에. 마지막으로, BsmBI 및 BsaI의 내부 인식 사이트는 조립 전에 제거하거나 길들여야 합니다. 또는 여러 내부 사이트를 제거하고 동시 코돈 최적화를 달성하기 위해 부품을 합성하는 것을 고려할 수 있습니다. 우리는 S. cerevisiae에 있는 β 카로틴 및 리코펜 생산을 위한 5 유전자 통로를 표현하여 이 공구키트를 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한이 키트에서 게놈 편집 도구를 사용하여 ADE2 궤적을 노크하는 방법을 보여줍니다. 이러한 색상 기반 실험은 쉽게 시각화할 수 있는 선택되었습니다. 우리는 또한 융합 단백질을 생성하고 골든 게이트 복제를 사용하여 아미노산 돌연변이를 만드는 방법을 보여줍니다.
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Protocol
참고: 이 도구 키트에서 제공되는 계층 복제 프로토콜은 세 가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다: 1. 부품 플라스미드 복제; 2. 복제 전사 단위 (투스); 3. 복제 다중 유전자 플라스미드(그림 1). 이 프로토콜은 프라이머 설계에서 시작하여 복제된 다중 유전자 플라스미드의 응용으로 끝납니다.
1. 부품 플라스미드 (pYTK001)를 복제하기위한 프라이머 디자인 :
- 5'엔드에서 측면 뉴클레오티드 TTT를 포함하는 전방 및 역입 입문서를 설계하고, BsmBI 인식 부위를 추가 뉴클레오티드(CGTCTCN),4-뉴클레오티드(nt) 오버행(TCGG)을 입력 벡터의 상보적, 추가 뉴클레오티드(GGTCTCN)를 가진 BsaI 인식 부위및 4nt 부분별 오버행, 템플릿 특이적 서열(도2A)에추가된다. GoldenBraid 4.037 및 GoldenMutagenesis38 골든 게이트 특정 프라이머 디자인에 사용할 수 있는 온라인 소프트웨어 의 일부입니다.
- BsaI 또는 BsmBI 인식 사이트가 어느 부분에든 존재하는 경우, 골든 게이트어셈블리(39)이전에 이러한 사이트를 돌연변이하기 위해 길들이기 단계를 사용합니다. 통합 플라스미드(4단계 참조)의 경우 모든 NotI 인식 사이트를 길들이세요. 하나의 바람직하지 않은 인식 사이트로 부품을 길들이려면, 바람직하지 않은 사이트 근처의 두 개의 하위 부분으로 부품을 분할(그림 2A):
- 첫 번째 서브파트의 전방 프라이머를 1.1단계와 동일한 방식으로 설계합니다. 그러나 BsmBI 사이트와 4nt 유전자 특이오버행만으로 역프라이머를 설계한다.
- BsmBI 사이트와 4nt 유전자 특이 오버행을 제1 서브 파트의 역프라이머와 겹치는 것만으로 제2 서브 파트 포워드 프라이머를 설계한다. 제1.1단계와 동일한 방식으로 두 번째 서브 파트의 역프라이머를 설계한다.
- 프라이머의 유전자 특이적 영역에서 역(단계 1.2.1) 또는 전방 프라이머(step 1.2.2)에서 원하는 돌연변이를 소개한다.
참고: BsmBI 및 BsaI가 없고 코돈에 최적화된 부품을 상업적으로 합성할 수 있습니다. 코딩 서열(CDS)의 경우, 대명사 돌연변이는 아미노산 코돈의 제3 뉴클레오티드에 쉽게 통합될 수 있다. 그러나 프로모터 및 종기의 경우 리포터 분석기를 사용하여 돌연변이된 프로모터 또는 종료기 활성을 확인하는 것이좋습니다(39). 시퀀스의 끝을 향해 바람직하지 않은 제한 사이트가 있는 경우 더 긴 역프라이머를 사용하여 변질될 수 있다. 여러 바람직하지 않은 사이트가 있는 경우 여러 사이트를 돌연변이할 수 있는 사이트 지향 돌연변이 발생은40을수행할 수 있다.
- 때때로, 두 단백질을 단일 부분으로 결합하는 것이 바람직하다(도2A). 링커는 두 개의 개별단백질(41)의구조적 무결성을 보장하는 데 도움이 된다.
- 첫 번째 유전자에 대한 전방 프라이머는 1.1 단계와 동일합니다. 역계 프라이머에서, BsmBI 부위, 4nt 유전자 특이오버행 및 링커 서열을 포함한다. 4nt 오버행은 링커 또는 두 번째 유전자의 처음 몇 가지 뉴클레오티드일 수 있다.
- 제2 유전자의 경우, BsmBI 인식 부위와 제1 유전자의 역프라이머에 대한 보완적 4nt 오버행을 갖는다는 것을 같은 전방 프라이머를 설계한다. 제1.1단계에서와 같이 제2 유전자의 역프라이머를 설계한다.
- 중합효소 연쇄 반응(PCR)(42)에의해 부품을 증폭시키기 위해, 게놈 DNA, cDNA 또는 플라스미드로부터 부품을 증폭시키기 위해 고충실도 DNA 폴리머라아제를 사용한다. PCR 제품을 1% 아가로즈 젤로 체크하고 젤 정화를 확인하십시오. 정제 된 DNA를 사용하는 것이 강력하고, 젤 정제가 힘들면 PCR 제품을 정화하기 위해 적어도 스핀 컬럼을 사용하는 것이 좋습니다.
2. 부품 플라스미드를 만들기 위해 부품 플라스미드(그림2B)를생성하기 위해 부품을 엔트리 벡터(pYTK001)로 복제합니다.
- 골든 게이트 반응 믹스를 설정하려면 각 PCR 제품 및 엔트리 벡터(pYTK001), 1μL 1μL 10X T4 리구아제 버퍼, Esp3I의 0.5 μL(BsmBI의 고효율 이조머), T4 ligase의 0.5 μL을 추가합니다. ddH2O를 추가하여 총 부피를 10 μL로 가져옵니다.
- 복제 반응을 설정하려면, 열순환기에서 다음 프로그램을 실행: 25-35 사이클 37°C5 분 (소화) 및 16 °C 5 분 (리그화), 10 분 동안 50 °C에서 최종 소화 및 효소 비활성화 에 대한 10 분 10 분.
참고: 소화/결찰의 35주기는 여러 DNA 조각을 동시에 엔트리 벡터로 복제할 때 권장되며, 예를 들어 융합 유전자의 복제 중이거나 유전자를 길들이는 것이 좋습니다. - 전체 반응 믹스를 열 충격에 의해 DH5α 균주 또는 상응하는 대장균화학적으로 유능한 세포로 변환합니다. 전체 10 μL 복제 제품을 35 μL 화학적으로 유능한 대장균 세포(2 X 105 cfu/mL로 변환하면, cfu는 5 ng pYTK001을 유능한 세포의 100 μL로 변환하는 것으로 계산됩니다)를 권장합니다. 리소게니 브로스 (LB) 플레이트에 35 μg /mL 클로람페니콜 (Cm)을 퍼놓습니다. 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오.
- 16-18h 후, 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내서 약 5시간 동안 4°C에서 플레이트를 유지하여 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP)이 보다 강렬한 녹색 색을 개발하도록 한다.
- 쉽게 스크리닝을 위해 플레이트를 자외선(UV) 또는 청색 광 트랜일루미노이터에 놓습니다. 식민지를 포함하는 sfGFP는 UV 빛 의 밑에 형광할 것입니다.
- 녹색 식민지는 절단되지 않은 pYTK001을 포함하기 때문에 부정적입니다. 흰색 식민지는 긍정적 일 가능성이 높습니다. 복제는 일반적으로 ~ 30-100 % 흰색 식민지가있는 경우 성공합니다. 식민지 PCR 또는 제한 소화에 의해 몇 가지 흰색 식민지의 추가 검사를 수행 (제안 된 효소: BsaI-HFv2).
- 잠재적으로 올바른 식민지 중 몇 가지에서 플라스미드를 정화하고 Sanger 시퀀싱에 의해 시퀀스를 확인합니다.
3. 부품 플라스미드를 "카세트" 플라스미드로 조립
참고: 카세트 플라스미드에는 프로모터, CDS 및 종단자로 구성된 사용자 정의 전사 단위(TU)가 포함되어 있습니다. 카세트 플라스미드는 단일 유전자의 발현을 허용한다. 카세트 플라스미드가 다중 유전자 플라스미드로 조립될 경우, 첫 번째 단계는 다중 유전자 플라스미드에서 TUS의 수와 순서를 결정하는 것이다. 이들은 커넥터가 다중 유전자 플라스미드에서 TUs를 연결하기 때문에 카세트 플라스미드에서 사용할 커넥터를 결정합니다. 첫 번째 TU의 왼쪽 커넥터는 ConLS여야 하며 마지막 TU의 오른쪽 커넥터는 ConRE여야 합니다. 그들은 ConLS와 ConRE의 다중 유전자 플라스미드와 겹칩니다. 나머지 커넥터는 숫자 순서가 증가해야 합니다. 예를 들어, 다중 유전자 플라스미드에 4개의 투우가 포함되어 있는 경우, 커넥터 조합은 ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3및 ConL3-TU4-ConRE(그림 1)이다.
- 전사 단위를 조립하기 전에, 다음 여섯 부분으로 중간 벡터를 조립하는 것이 좋습니다: 왼쪽 커넥터, sfGFP 드롭아웃 (pYTK047), 오른쪽 커넥터, 효모 선택 마커, 복제의 효모 기원 및 mRFP1, 대장균 원점 및 앰프실린 내성 유전자 (pY3)를 가진 부분 플라스미드(pY3).
- 위의 여섯 플라스미드를 정화합니다. UV-Vis 분광광계 또는 형광계 분석기를 사용하여 농도를 기록하고 1 μL이 DNA 20 fmol을 가지고 있도록 ddH2O로 각 플라스미드를 희석시합니다. 온라인 계산기를 사용하여 DNA 어금니 농도를 계산합니다.
참고: DNA 농도를 정확하게 측정하고 어셈블리가 작동하도록 정확하게 파이프하는 것이 매우 중요하며, 특히 5~7개의 부품 플라스미드가 있는 어셈블리의 경우 매우 중요합니다. 각 플라스미드의 DNA 농도에 작은 오류는 복제 효율의 상당한 감소를 일으킬 수 있습니다. - 각 플라스미드 1μL, 10X T4 리구아제 버퍼 1μL, BsaI-HFv2의 0.5 μL(BsaI의 매우 효율적인 버전), T4 리구아제0.5 μL을 추가합니다. ddH2O를 추가하여 부피를 10 μL로 구성합니다.
- 복제 반응을 설정하려면, 열순환기에서 다음 프로그램을 실행: 25-35 사이클 37°C의 5분 (소화) 및 16°C 5 분 (결찰). BsaI 부위가 중간벡터(도 3)에유지되어야 하므로 최종 소화 및 열 불활성화 단계를 생략한다.
- 전체 반응 믹스를 DH5α 균주 또는 다른 대장균 유능한 세포로 변환합니다. 50 μg/mL 카베니실린(Cb) 또는 암피실린으로 LB 플레이트에 퍼짐. 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오.
참고 : 카베니실린은 암피실린의 안정적인 아날로그입니다. - 16-18 h 후, 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내. 플레이트에는 옅은 빨간색과 옅은 녹색식민지(그림 6C 및 6D)가모두 포함됩니다. mRFP1 및 sfGFP가 성숙하게 하기 위해 약 5 시간 동안 4 °C에서 플레이트를 유지하십시오. UV 또는 청색광 트랜실루미네이터를 사용하여 잠재적으로 올바른 중간 벡터를 포함하는 녹색 식민지를 식별합니다.
- LB + Cb 플레이트에 녹색 식민지를 줄이며 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오. 다음 날, LB + Cm 플레이트에 다시 밖으로 행진하고 하룻밤 37 ° C에서 배양. LB + Cm 플레이트에서 자라는 콜로니는 Cm 내성 부품 벡터가 유지되기 때문에 잘못 조립된 플라스미드를 함유하고 있습니다.
- LB + Cm 플레이트에서 자라지 않는 콜로니를 선택하고 제한 소화 (제안 된 효소 : BsaI-HFv2, Esp3I)를 수행하여 올바르게 조립 된 플라스미드를 확인하십시오. 또는, 스크리닝을 위해 콜로니 PCR을 사용하십시오.
- 위의 여섯 플라스미드를 정화합니다. UV-Vis 분광광계 또는 형광계 분석기를 사용하여 농도를 기록하고 1 μL이 DNA 20 fmol을 가지고 있도록 ddH2O로 각 플라스미드를 희석시합니다. 온라인 계산기를 사용하여 DNA 어금니 농도를 계산합니다.
- 중간 벡터가 성공적으로 조립되면 다음 단계는 전사 단위를 조립하는 것입니다. 중간 벡터, 프로모터, CDS 및 종단기와 같은 4피스 어셈블리입니다.
- 네 부분 플라스미드를 정화합니다. 그들의 농도를 기록하고 1 μLDNA의 20 fmol이 있도록 플라스미드의 각을 희석.
- 반응 믹스를 설정하려면 3.1.2 단계를 따르십시오.
- 복제 반응을 설정하려면 2.2 단계를 따르십시오.
- 전체 복제 반응 믹스를 DH5α 또는 동등한 대장균 유능한 세포및 LB + Cb. 인큐베이터에서 하룻밤 사이에 37°C로 변환한다.
- 16-18 h 후, 인큐베이터에서 접시를 꺼내. 흰색과 옅은 녹색 식민지가 나타납니다(그림 6E 및 6F). sfGFP가 성숙하게 하기 위해 약 5 시간 동안 4 °C에서 플레이트를 유지하십시오. UV 또는 청색광 트랜실루미네이터를 사용하여 비형광 백색 식민지를 식별합니다. 이들은 잠재적으로 정확한 전사 단위를 포함합니다.
- 밖으로 줄무늬와 8-10 흰색 식민지를 성장하고 식민지 PCR을 수행합니다. 식민지 PCR에서 양성 반응을 시험하는 식민지에서 플라스미드를 정화합니다. 조립을 더 확인하기 위해 제한 소화(제안된 효소: Esp3I)를 수행한다.
참고: 복제에는 소화 및 결찰제한만 수반되므로 시퀀싱 전사 단위는 일반적으로 필요하지 않습니다. 관심의 모든 순서는 부품 플라스미드 수준에서 확인되었습니다.
4. 카세트 플라스미드를 "다중 유전자" 플라스미드로 조립:
참고: 다중 유전자 플라스미드는 하나 이상의 유전자의 발현을 허용합니다. 다운스트림 응용 프로그램에 따라 다중 유전자 플라스미드는 복제 또는 통합될 수 있습니다. 복제 플라스미드는 복제의 효모 기원을 가지고; 따라서 효모 세포가 분할될 때 안정적으로 유지할 수 있습니다. 통합 플라스미드는 복제의 효모 기원이 없습니다. 대신, 그(것)들은 동종 재조합을 통해 게놈의 특정 loci로 다중 유전자의 통합을 허용하는 5' 및 3' homology 무기가 있습니다.
- 다중 유전자 플라스미드의 경우 중간 벡터를 먼저 조립합니다.
- 복제 중간벡터(그림 4A)를조립하기 위해 왼쪽 커넥터(ConLS-pYTK008), sfGFP 드롭아웃(pYTK047), 오른쪽 커넥터(ConRE'-pYTK072), 효모 선택 마커, 복제의 효모 기원, 및 mRFP1을 가진 부품 플라스미드, 복제의 대장균 기원, 및 가나마이신 내성 유전자(pYTK084).
- 어셈블리의 경우 3.1.1에서 3.1.3으로 단계를 따르십시오.
- 전체 복제 반응 믹스를 DH5α 또는 동등한 대장균 유능한 세포로 변환하고, LB 플러스 50 μg/mL 카나마이신(Km)에 플레이트를 변환합니다. 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오.
- 빨간색/녹색 색상 기반 스크리닝의 경우 3.1.5 단계를 따르십시오.
- 잘못된 조립을 선별하기 위해, 연승과 LB + Km 플레이트에 녹색 식민지를 성장. 그런 다음 3.1.6 단계를 따릅니다.
- 통합다중 다유전자 벡터(도4B)의경우 먼저 관심있는 게놈 궤적을 결정한 다음, 해당 궤적에 통합하기 위해 약 5개의 5' 및 3'상동성 팔을 설계합니다.
- 효모 게놈 DNA로부터 5' 및 3' 상동성 팔을 항목 벡터-pYTK001로 복제한다. 1단계와 2단계를 따릅니다.
- 왼쪽 커넥터(ConLS'-pYTK008), sfGFP 드롭아웃(pYTK047), 오른쪽 커넥터(ConRE'-pYTK072), 효모 선택 마커, 3' homology 팔, mRFP1, 복제의 대장균 기원, 및 가나마이신 내성 유전자(pYTK090) 및 5'homology arm을 가진 부품 플라스미드.
- 조립 및 스크리닝의 경우 4.1.1 단계를 따르십시오.
- 복제 중간벡터(그림 4A)를조립하기 위해 왼쪽 커넥터(ConLS-pYTK008), sfGFP 드롭아웃(pYTK047), 오른쪽 커넥터(ConRE'-pYTK072), 효모 선택 마커, 복제의 효모 기원, 및 mRFP1을 가진 부품 플라스미드, 복제의 대장균 기원, 및 가나마이신 내성 유전자(pYTK084).
- 다중 유전자 플라스미드의 조립
- 단계 4.1 및 3단계에서 카세트 플라스미드에서 얻은 중간 벡터의 플라스미드를 정화한다. UV-Vis 분광광계 또는 형광 기반 분석기로 농도를 기록합니다. 1 μL에 20 fmol DNA가 있도록 ddH2O로 각각 희석하십시오.
- 중간 벡터 1μL, 각 전사 단위의 1 μL, 1μL 1μL 10x T4 리구효소 버퍼, Esp3I의 0.5 μL, T4 리가제 0.5 μL을 추가합니다. ddH2O를 사용하여 10 μL로 볼륨을 가져옵니다.
- 복제 반응을 설정하려면 2.2 단계를 따르십시오.
- 전체 복제 반응 믹스를 DH5α 또는 동등한 대장균 유능한 세포로 변환하고, LB + Km. 플레이트에서 하룻밤 사이에 37°C에서 배양한다.
- 단계 3.2.5에서와 같이 녹색 /흰색 스크리닝을 수행하십시오.
- 몇 개의 흰색 식민지에서 플라스미드를 정화하고 제한 소화를 수행합니다. 노티-HF 효소를 사용하는 것은 대장균 원점 과 Km 선택 마커 부분에 각각 2개의 NotI 부위가 있기 때문에 권장된다(도4B). 조립된 플라스미드가 매우 큰 경우 추가 확인을 위해 다른 제한 사이트를 선택할 수 있습니다. 또는, 소화를 제한하기 전에 식민지 PCR로 화면.
5. 염색체 또는 플라스미드 계 유전자 발현을 위한 다중 유전자 플라스미드를 적용
- 염색체 유전자 발현을 위한 효모 게놈에 다유전자 플라스미드를 통합(도 5)
- 원하는 궤적에 대한 가이드 RNA(gRNA)를 설계한다. 벤치링, CRISPRdirect43및 CHOPCHOP44와같은 여러 온라인 리소스를 사용하여 대상의 최대 특이성을 결정하는 것이 좋습니다.
- 합성된 20nt gRNA를 깁슨 복제에 의한 pCAS 플라스미드45로 클론한다. HDV 리보지메의 3'와 tracrRNA의 5'에 결합하는 반전 된 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의한 pCAS 플라스미드를 선형화(도 5). 대안적으로, gRNA 드롭아웃 플라스미드(pYTK050)로 gRNA를 복제하고, 드롭아웃 플라스미드를 링커가 있는 카세트 플라스미드로 조립한다. 그런 다음 Cas9 부품 플라스미드(pYTK036)로 Cas9 TU를 조립합니다. 마지막으로, Cas9 TU와 sgRNA TU를 복제 다중 유전자 플라스미드로 조립한다.
- 하룻밤 동안 NotI-HF 효소의 1 μL로 통합다중 다유전자 플라스미드의 5-15 μg를 선형화한다. pCAS-gRNA의 1 μg및 선형화된 통합 된 다중 유전자 플라스미드를 S. cerevisiae로변환합니다. 2007년46일게이츠와 쉬텔의 프로토콜을 따르거나 시판되는 효모 변환 키트를 사용하여 유능한 세포를 준비한다.
참고: NotI 소화 후 선형화된 다중 유전자 플라스미드를 정화할 필요가 없습니다. - 회복 후 세포를 펠렛, 상류제를 버리고, 동일한 양의 물로 씻어 내십시오. 전체 합성 배지(CSM) 드롭아웃 플레이트 또는 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 배지(YPD) 플레이트에 플레이트 효모 세포는 효모 선택적 마커에 따라 항생제를 투여한다. 식민지가 형성될 수 있도록 2일 동안 37°C에서 배양합니다. 식민지가 관찰되지 않는 경우, 30 °C에서 1 ~ 2 일 동안 추가로 배양하십시오.
- 콜로니 PCR47에의한 통합을 위한 스크린 효모 콜로니.
- pCAS를 치료하기 위해, 비 선택적 YPD 플레이트에 올바른 통합으로 식민지를 줄입니다. 하룻밤 사이에 30 °C에서 성장하십시오. YPD 플레이트에서 신선한 YPD 접시에 하나의 식민지를 줄입니다. 다시, 하룻밤 30 °C에서 성장. 제2 YPD 플레이트에서 YPD플러스 100 μg/mL nourseothricin, pCAS의 선택 마커로 식민지를 행진합니다. 성공적인 경화는 효모 세포가 선택적 플레이트에서 성장하지 못할 때 발생합니다.
참고: pCAS 플라스미드가 비선택적 YPD의 두 라운드에서 경화되지 않으면, 또 다른 1-2 라운드에 대한 신선한 YPD에 다시 행진.
- 플라스미드 계 유전자 발현을 위한 복제 다중 유전자 플라스미드 변형
- 100 ng-1 μg 순수 다중 유전자 플라스미드를 S. 세레비시아에 유능한 세포로 변환합니다.
- 플레이트 효모 세포는 CSM 중퇴 플레이트 또는 YPD 플러스 항생제 판으로 전환한 직후, 사용되는 효모 선택 마커에 따라 한다. 식민지가 형성될 수 있도록 2-3일 동안 30°C에서 배양합니다.
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Representative Results
여기서 β 카로틴(yellow) 및 리코펜(red) 생산을 위한 4개의 복제다유전자 플라스미드의 결과. ADE2 궤적을 방해하기위한 하나의 통합 다중 유전자 플라스미드가 건설되었으며, 그 중 식민지는 빨간색입니다.
CDS를 엔트리 벡터로 복제(pYTK001)
ERG20은 설명된 바와 같이 효모 게놈 및 3개의 카로티노이드 유전자 crtE, crtYB, crtIB로부터증폭되었다. 효모 프로모터 pENO2, pTIP1, pPYK1 및 pPDC1 및 종기 tTDH2, tHSP26, tADH2, tACS2는 부품 플라스미드로 복제되었다. 포인트 돌연변이는 리코펜을 생산하기 위한 CrtYB(G247A)로 도입되었고 BTS1-ERG20 융합 구조는 프리닐 중급을 카로티노이드로 더 잘 채널화하기 위해 만들어졌습니다. 도 6A 및 6B는 부품 플라스미드의 성공적인 복제의 대표적인 플레이트를 나타내며, 90.35± 4.22%의 총 식민지가 잠재적으로 정확하다(흰색)를 가진 녹색/흰색 스크리닝의 예를 제공한다.
전사 단위의 조립 (카세트 플라스미드)
카세트 플라스미드를 조립하기 전에 다중 유전자 플라스미드의 설계가 최종 확정되었다. 4개의 카로티노이드 TUs의 경우, 서로 다른 커넥터를 가진 4개의 중간 벡터가 먼저 3.1단계 다음 에서 복제되었다. 도 6C 및 6D는 중간 벡터의 성공적인 어셈블리로부터 대표판을 나타내고 17.56± 3.32%의 총 콜로니가 양성(녹색)으로 적색/녹색 스크리닝의 예를 제공한다. 이 비율은 상대적으로 낮더라도, 검열은 녹색 형광에 의해 크게 촉진됩니다.
다음으로, BTS1-ERG20, ERG20, crtE, crtYB, crtYB(G247A)및 crtI를 위한 투우가 3.2단계(표1)에따라 조립되었다. 도 6E 및 6F는 TUs의 성공적인 조립의 대표적인 플레이트를 나타내고 녹색/흰색 스크리닝 방법의 예를 제공하며, 총 식민지는 65.02± 4.99%가 양성(흰색)이다.
다중 유전자 플라스미드의 조립
4개의 복제 및 1개의 통합다중 유전자 플라스미드가 조립되었다. 복제 다중 유전자 플라스미드, ERG20, BTS1-ERG20, crtE, crtYB, crtYB(G247A) 및 crtI는 4개의 다른 조합으로 조립되어 4개의 플라스미드를 생성했습니다: β-카로틴용 2개, 리코펜 생산용 2개(표2). 중간 벡터 복제에 대한 잠재적으로 정확한 콜로니(green)의 비율은 1.83± 0.15%(그림7A 및 7B)였다. 이 숫자는 낮아 보이지만 녹색 형광(도7B)을검출하여 쉽게 검사를 받았다. 중간 플라스미드가 복제되면 중간체에서 다유전자 플라스미드(흰색)를 조립하는 성공률은 93.77± 1.65%(수치7C 및 7D)였다. 그림 7E 및 7F는 양성 식민지 (흰색)의 수가 무시할 수 있었기 때문에 다중 유전자 플라스미드의 최적이 아닌 조립을 보여줍니다. 효모로 변신한 후, β 카로틴(노란색)과 리코펜(레드)을 생산하는 식민지는 셋째 날에 성장했습니다. 각 접시에서 네 개의 식민지는 신선한 접시에 줄지어 이틀 더 성장했다. 그림 8A 및 8B는 BTS1-ERG20을 융합하면 ERG20만 사용하는 것보다 어두운 색상으로 볼 수 있듯이 카로티노이드 생산쪽으로 더 많은 게르노게라인-파이로포스페이트가 연출되는 것을 보여줍니다. 본격적인 기준을 가진 UV-Vis 분광광법에 의해 카로티노이드를추출하고 정량화하면 BTS1-ERG20의 융합이 0.729 μg/mg β 카로틴의 생산으로 이어지는 것으로 보이며, 이는 0.021 μg/mg β 카로틴으로 단독으로 생산됩니다. 마찬가지로, 리코펜의 생산은 ERG20(0.068 μg/mg)에 비해 BTS1-ERG20(1.126 μg/mg)을 가진 균주에서 ~16.5배 더 높다(도8C).
복제 다중 유전자 플라스미드는(A) BTS1-ERG20 융합 TU 및(B) ERG20 TU와 함께 효모로 변형되었다. 각 플레이트에, 왼쪽의 효모에는 β 생산을 위한 crtE TU, crtYB TU 및 crtI TU를 포함하는 플라스미드가 있습니다-오른쪽의 카로틴과 효모에는 crtE TU, crtYB (G247A)TU 및 crtI TU가 함유되어 있습니다.
통합 플라스미드의 경우 ConLS', sfGFP 중퇴, ConRE', HIS3 (효모 선택 마커), ADE2 5' 및 3'homology 팔은 4.1.2 단계에 따라 조립되었다. 5' 및 3' 상동성 팔은 500 bp 떨어져 있었고 통합 후 ~ 180 개의 아미노산을 삭제했습니다. 또한, 5'homology 팔은 3'끝으로 여섯 정지 코돈이 있었다. 돌연변이 된 ADE2는 붉은 식민지50결과. ADE2 gRNA 5'-ATTGGGAC GTATGATTGTTGAGG-51이 사용되었고 게놈 통합을 위한 5.1단계를 따랐다. 3-4일 후, YPD 플레이트 + 100 μg/mL nourseothricin에서 붉은 식민지가 관찰되어 ADE2가 성공적으로 중단되었음을나타냅니다(그림 8D 및 8E).
그림 1: 다중 유전자 조립개요. 어셈블리는 세 가지 수준에서 이루어집니다. 0 레벨 1에서, CDS 또는 임의의 다른 부분은, 게놈으로부터 증폭되거나 합성된 다음, BsmBI(또는 Esp3I) 효소를 사용하여 pYTK001 진입 벡터로 복제된다. ColE1: 복제의 대장균 기원; CmR: 클로람페니콜 내성 유전자. 레벨 2에서, 프로모터, CDS 및 종기효소를 포함하는 전사 단위(TU)는 BsaI 효소를 사용하여 조립된다. 레벨 3에서, 최대 5개의 전사 단위는 BsmBI (또는 Esp3I) 효소를 사용하여 다중 유전자 플라스미드로 조립된다. 다중 유전자 플라스미드는 복제 또는 통합될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 프라이머 설계 및 부품 플라스미드의 복제. (A)개별 부품을 증폭, 유전자 를 길들이거나 포인트 돌연변이를 생성하고 융합 단백질을 조립하기위한 프라이머 디자인. 프라이머에는 BsmBI 및 BsaI 인식 및 절단 사이트및 적절한 조립을 위한 MoClo 오버행이 포함됩니다. MoClo 오버행은 1, 2, 3, 4 및 5, 6, 7, 8로 표시됩니다. 국산 또는 융합 단백질을 만들기위한 내부 프라이머는 BsmBI를 포함하지만 BsaI 사이트는 포함하지 않습니다. 이들에 대한 오버행은 사용자 정의 내부 시퀀스 (NNNNN 및 N'N'N'n's 보라색)입니다. 최적의 효소 소화를 위해 터미널 "ttt"가 포함되어 있습니다. GOI: 관심 유전자. (B)BsmBI(또는 Esp3I)를 이용하여 pYTK001 진입 벡터로 복제된 부품을 복제한다. 보완적인 오버행은 부품의 통합과 BsmBI 인식 사이트의 제거로 이어집니다. ColE1: 복제의 대장균 기원; CmR: 클로람페니콜 내성 유전자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 전사 단위 어셈블리. TU 플라스미드를 조립하려면 중간 벡터의 조립을 통해 조합 TU 어셈블리를 용이하게 하는 것이 좋습니다. 중간 벡터를 조립하려면 Con LX(왼쪽 5개 커넥터 중 하나), sfGFP 드롭아웃, Con RY(Y: 5개의 오른쪽 커넥터 중 하나), 효모 ORI(복제의 기원), BsaI 효소를 이용한 mRFP1 드롭아웃 벡터로 효모 마커 부분을 복제한다. 중간 플라스미드는 암피실린에 내성이 있습니다. BsaI 인식 사이트는 TU 플라스미드 복제를 위해 보관됩니다. TU 플라스미드를 복제하기 위해, 프로모터, CDS 및 종종기는 BsaI를 사용하여 중간 벡터로 조립된다. 복제된 TU는 다음 단계 다중 유전자 조립을 위해 ConLX 및 ConRY 지역에 BsmBI 사이트를 갖게 됩니다. 복제 된 TU는 또한 암피실린에 내성이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이름 | ConLX(왼쪽 커넥터) | 발기인 | CDS | 터미네이터 | ConRY(오른쪽 커넥터) |
| BTS/ERG20 TU (TU) | LS | pENO2 | BTS1/ERG20 | tTDH2 | R1 |
| ERG20 TU (TU) | LS | pENO2 | ERG20 | tTDH2 | R1 |
| crtE TU (TU) | L1 | pTIP1 | crtE | tHSP26 | R2 |
| crtYB TU (TU) | L2 | pPDC1 | crtYB | tADH2 | R3 |
| crtYBG247A TU (TU) | L2 | pPDC1 | crtYBG247A | tADH2 | R3 |
| crtI TU (TU) | L3 | pPYK1 | crtI | tACS2 | 재 |
표 1: 이 연구에서 사용되는 전사 단위. 프로모터 및 종점은 S. 세레비시아에서증폭되었다. BTS1(게라닐 디포스페이트 신타제)과 ERG20(파네실 파이로포스페이트 synthetase)은 S. 세레비시아에서증폭되었다. 유전자 crtE (geranylgeranyl diphosphate synthase), crtYB (양기능 리코펜 사이클라제 / 식물성 신타제), 및 crtI (식물성 desaturase) Xanthophyllomyces dendrorhous에서했다.
도 4: 다중 유전자 플라스미드 어셈블리. (A)복제 플라스미드 어셈블리. 복제 중간 벡터의 조립은 BsaI 효소를 이용한 mRFP1 드롭아웃 벡터상에 콘 LS', sfGFP 중퇴, 콘 RE', 효모 ORI, 효모 마커 및 대장균 원점 및 마커를 복제하는 것을 포함한다. ConLS 와 ConRE의 사이트는 벡터에 BsmBI 인식 사이트를 소개합니다. 잠재적으로 올바른 어셈블리는 카나마이신이 있는 선택적 플레이트에서 녹색 식민지를 찾아서 선별할 수 있습니다. 이전에 조립된 TUs는 BsmBI 효소를 사용하여 중간 벡터로 복제될 수 있다. 이 플라스미드에는 효모 ORI가 포함되어 있어 효모 호스트에서 복제할 수 있습니다. (B)통합 플라스미드 어셈블리. 통합 중간 벡터의 조립은 BsaI 효소를 사용하여 콘 LS', sfGFP 중퇴, 콘 RE', 5'homology 팔, 3'homology 팔, 효모 마커 및 대장균 원점 및 마커를 복제하는 것을 포함한다. 올바른 어셈블리는 카나마이신이 있는 선택적 플레이트에 녹색으로 표시되어야 합니다. 이전에 만들어진 전사 단위는 BsmBI 효소를 사용하여 복제 중간 벡터로 복제될 수 있다. 이 벡터는 효모 ORI가 없으며 CRISPR 및 상동성 재조합을 통해 표적 궤적에 통합됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이름 | TU1 | TU2 | TU3 | TU4 | 제품 |
| B/E-β 카로틴 | BTS1/ERG20 | crtE | crtYB | crtI | β 카로틴 |
| B/E-리코펜 | BTS1/ERG20 | crtE | crtYBG247A | crtI | 리코펜 |
| e-β 카로틴 | ERG20 | crtE | crtYB | crtI | β 카로틴 |
| E-리코펜 | ERG20 | crtE | crtYBG247A | crtI | 리코펜 |
표 2: 이 연구에서 사용되는 다중 유전자 플라스미드.
그림 5: CRISPR 통합. (A)CRISPR 및 도우미 플라스미드 복제. pCAS 플라스미드에는 gRNA의 최적의 발현을 위해 Cas9 엔도누셀리스 및 성분(tRNA 프로모터, SNR52 터미네이터, HDV 리보지메 및 tracrRNA)이 포함되어 있습니다. 깁슨 복제를 사용하여 선형화된 pCAS로 합성 gRNA를 조립하여 pCAS+gRNA 플라스미드를 복제한다. (B)CRISPR은 유전적 통합을 도왔습니다. 단계 1: pCAS +gRNA는 게놈 궤적을 표적으로 하는 유전자(GOI), 효모 선택적 마커 및 5' 및 3' 호모학 영역을 포함하는 통합 플라스미드와 함께 효모로 공동 변형되었다. 최적의 통합을 위해 통합 플라스미드를 NotI로 선형화합니다. 단계 2: 표적 궤적에서의 통합: 항생제 또는 보조 성축중 효모 마커를 선택적으로 플레이트에 변형 된 효모를 성장시킵니다. 지노티핑을 수행하여 통합을 확인합니다. 3 단계 : 비 선택적 플레이트에 효모를 줄임으로써 pCAS + gRNA 플라스미드를 치료합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 대장균에서 엔트리 벡터 및 전사 단위 레벨 복제의 대표 판. 입력 벡터 pYTK001 아래(A)가시광선 및(B)UV 광으로 유전자의 성공적인 복제의 대표적인 플레이트. 긍정적 인 식민지는 흰색과 부정적인 식민지는 녹색입니다. 전체 식민지 전체의 양수 식민지 비율은 90.35 ± 4.22 %입니다. 전사 단위 레벨 어셈블리 및 녹색/빨간색 선택하에(C)가시광선 및(D)UV 광에 대한 중간 벡터의 성공적인 조립. 긍정적 인 식민지는 녹색입니다. 전체 식민지 전체의 양수 식민지 비율은 17.56 ± 3.32 %입니다. 중간 벡터 및 녹색/백색 스크리닝 하에서의 전사 단위의 성공적인조립(E)가시광선 및(F)UV 광. 긍정적 인 식민지는 흰색과 부정적인 식민지는 녹색입니다. 전체 식민지 전체 의 긍정적 인 식민지의 비율은 : 65.02 ± 3.32 %. 데이터는 세 가지 생물학적 복제에서 나온 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 대장균에서다중 유전자 플라스미드 복제의 대표 판 . 다중 유전자 레벨 어셈블리 및 빨간색/녹색 선택하에 대한 중간 벡터의 어셈블리(A) 가시광선 및(B)UV 광. 긍정적 인 식민지는 녹색이며 부정적인 식민지는 빨간색입니다. 전체 식민지 전체의 양수 식민지 비율은 1.83 ± 0.15%입니다. 가시광선 및(D)UV 광 하에서 중간 벡터 및 녹색/흰색선택(C)에서여러 개의 투우의 성공적인 조립. 긍정적 인 식민지는 흰색입니다. 전체 식민지 전체의 양수 식민지 비율은 93.77 ± 1.65%입니다. 다중 유전자 플라스미드의 최적 조립(E)가시광선 및(F)UV 광. 긍정적 인 식민지의 수는 무시할 수 있습니다. 데이터는 세 가지 생물학적 복제에서 나온 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 효모의 통합 및 복제 플라스미드의 대표 판. 복제 다중 유전자 플라스미드는(A) BTS1-ERG20 융합 TU 및(B) ERG20 TU와 함께 효모로 변형되었다. 각 플레이트에, 왼쪽의 효모에는 β 생산을 위한 crtE TU, crtYB TU 및 crtI TU를 포함하는 플라스미드가 있습니다-오른쪽의 카로틴과 효모에는 crtE TU, crtYB (G247A)TU 및 crtI TU가 함유되어 있습니다. (C)UV-vis 분광계를 사용하여 4개의 다중 유전자 플라스미드로 효모 추출물로부터 β 카로틴 및 리코펜을 정량화한다. 최대 흡수도는 각각 β 카로틴과 리코펜에 대해 450 nm및 470 nm로 기록되었습니다. 절대정량은 정통 표준(보충도서 S3)을사용하여 수행하였다. BTS1-ERG20의 융합은 ERG20에 비해 ~35배 더 높은 β 카로틴 및 ~16.5배 높은 리코펜의 생산에 이르게 한다. GRNA와 도우미DNA(D)와gRNA 및 다중 유전자 통합 플라스미드의 통합에 의한 ADE2 궤적의 붕괴를 위한 대표적인 플레이트및 gRNA 및 다중 유전자 통합 플라스미드를 도우미DNA(E)로한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Lee et al.에 의해 개발된 MoClo 기반 복제 키트는 효모 게놈내로의 복제 또는 통합을 위해 1~5개의 전사 단위를 다중 유전자 플라스미드로 빠르게 조립할 수 있는 우수한 자원을 제공한다. 이 키트의 사용은 효모에서 여러 유전자를 표현하기 위해 자주 존재하는 시간이 많이 소요되는 복제 병목 현상을 제거합니다.
우리는 T4 DNA 리구아제와 골든 게이트 복제의 소화 / 결찰 주기에 대한 다섯 가지 조건을 테스트했다. 37°C에서 5분 동안 37°C, 16°C에서 5분 동안 결단질한 후 50°C에서 최종 소화 단계가 10분 동안 50°C, 단백질 불활성화 단계는 80°C에서 10분 동안 80°C로 나타났으며, 4피스조립(보충 도면 S1)에서잠재적으로 정확한 99.5%의 콜로니를 초래한 것으로 나타났습니다. 16°C의 리구이는 최적의 리구아제 활동과 오버행 어닐링을 보장합니다. 50°C의 최종 소화는 소화된 제품이 재결합을 방지합니다. 이 주기는 달리 지정되지 않는 한 모든 어셈블리 반응에 대해 수행되었습니다.
우리는 또한 최적의 결과에 대한 특별한주의가 필요한 몇 가지 중요한 단계를 발견했습니다. 전사 단위를 조립하기 전에 sfGFP 드롭아웃으로 중간 벡터를 조립하는 것이 좋습니다. 이론적으로, 모든 7개의 부품은 mRFP1을 가진 대장균 벡터로 복제될 수 있고, 그 다음에 는 적색/백색 스크리닝이 뒤따릅니다. 그러나 실제로 mRFP1은 매우 느리게 색상을 개발하고 가시광선 아래에서 옅은 빨간색과 옅은 노란색 대장균 콜로니를 구별하기가 어렵습니다. sfGFP가 UV범위(52)에서흡수됨에 따라 UV 또는 청색광 트랜틸루미네이터를 사용하여 밝은 녹색 식민지에 대한 스크리닝을 용이하게 합니다. 또한 중간 벡터를 복제하면 다양한 프로모터, CDS 및 종착기 조합의 더 많은 촉진 조립이 가능하므로 일반적으로 4개의 부품이 있는 어셈블리가 더 많은 부품을 가진 어셈블리보다 더 긍정적인 콜로니를 생성하기 때문에 쉽게 결합 라이브러리 생성을 가능하게 합니다. 보조 도면 S2는 6피스에서 8피스 어셈블리로 잠재적으로 올바른 콜로니의 비율이 점진적으로 감소하는 것을 보여줍니다.
모든 부품의 농도는 각 부품의 평수 농도를 보장하기 위해 꼼꼼하게 측정되어야 합니다. UV-Vis 분광계를 사용하여 부품을 정량화하는 것은 일반적으로 충분하지만 형광 기반 분석과 같은 더 민감한 방법은 더 나은 결과를 줄 수 있습니다. 모든 부품을 정확하게 정량화하지 못하면 조립 효율이 낮아지는 경우가 많습니다. 하나는 각각 매우 효율적인 Esp3I 및 BsaI-HFv2를 선택해야 합니다. 우리는 T4가 키트의 오버행 모두에 잘 작동하고 원래 종이가 T7 ligase6을권장하지만, 문학36과일치하는 두 부분을 융합하는 데 필요한 사용자 정의 오버행이 필요하다는 것을 관찰했다. 사이클의 수를 증가 하면 어느 정도 잠재적으로 올바른 식민지의 수를 증가 시킬 수 있습니다. 예를 들어, 소화 및 결찰의 25사이클은 3~4개의 부품을 조립하기에 충분하지만 30-35사이클은 더 많은 부품에 더 나은 결과를 제공합니다.
MolClo 전략은 모듈식 및 다재다능한 복제를 허용하기 때문에 대체 다중 부품 조립 방법8,9,10,11,12에 유리합니다. 그러나 부품에 여러 BsmBI, BsaI 또는 NotI 사이트가 있기 때문에 주요 제한은 길들이기 단계입니다. 모든 부품을 돌연변이하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 이 경우 이러한 제한 사이트 없이 CDS를 합성하는 것을 고려할 수 있습니다. 그러나, 프로모터 및 종기의 경우, 단일 뉴클레오티드조차도 돌연변이하는 것이 그들의 기능을 바꿀 수 있다. 따라서 리포터 분석서를 이용하여 이러한 부품의 활성을 검증하는 것이좋습니다(39). 또 다른 제한사항은 이 키트가 다중 유전자 플라스미드에서 최대 5개의 전사 유닛만 허용한다는 것입니다. 더 많은 전사 단위가 원하는 경우, 고도로 호환되는 오버행세트(36)를선택하여 추가 커넥터를 구성할 수 있다.
이 키트는 27명의 프로모터, 6개의 터미네이터, 7개의 효모 선택 마커 및 복제의 효모 원점 2개를 제공합니다. 프로모터 및 종기와 같은 사용자 지정 부품은 네이티브 또는 합성을 통해 이 프로토콜에 따라 항목 벡터로 복제될 수 있습니다. 효모 MoClo 키트는 효모에서 고부가가치 화학 물질을 생산하기 위해 다유전자 대사 경로를 과발현하는 데 주로 사용되어 왔습니다. 이 프로토콜은 효모에서 생물학적 회로에 대한 다른 스위치가 원할 때도 사용할 수 있습니다. 단백질-단백질 상호 작용, 단백질 현지화 및 효소 활동에 대한 기본적인 생물학적 질문에 대한 조사를 위해 이 키트를 적용할 수 있는 엄청난 잠재력도 있습니다. 전반적으로,이 프로토콜은 매우 유연하고 신뢰할 수 있으며 효모 생물학에서 까다로운 복제를 지원할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 뉴욕 주립 대학의 연구 재단 (상 #: 71272)과 버팔로 대학의 영향 상 (상 #: 000077)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
| Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
References
- Endy, D.
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