Summary
Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding te bieden voor het assembleren van multi-gen constructies met behulp van het modulaire kloonsysteem op basis van Golden Gate klonen. Het geeft ook aanbevelingen over kritieke stappen om een optimale montage te garanderen op basis van onze ervaringen.
Abstract
De Golden Gate-kloonmethode maakt een snelle assemblage van meerdere genen in elke door de gebruiker gedefinieerde opstelling mogelijk. Het maakt gebruik van type IIS beperking enzymen die snijden buiten hun herkenning sites en creëren een korte overhang. Dit modulaire kloonsysteem (MoClo) maakt gebruik van een hiërarchische workflow waarin verschillende DNA-onderdelen, zoals promotors, coderingssequenties (CDS) en terminators, eerst worden gekloond tot een invoervector. Meerdere invoervectoren worden vervolgens samengevoegd tot transcriptie-eenheden. Verschillende transcriptie-eenheden verbinden vervolgens met een multi-gen plasmide. De Golden Gate-kloonstrategie is van enorm voordeel omdat het littekenloze, directionele en modulaire assemblage in een one-pot-reactie mogelijk maakt. De hiërarchische workflow maakt het meestal mogelijk om een grote verscheidenheid aan multi-genconstructies te klonen zonder dat er een sequencing nodig is die verder gaat dan invoervectoren. Het gebruik van fluorescerende eiwituitval maakt een eenvoudige visuele screening mogelijk. Dit werk biedt een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor het assembleren van multi-gen plasmiden met behulp van de gist modulair klonen (MoClo) kit. We tonen optimale en suboptimale resultaten van multi-gen plasmide assemblage en bieden een gids voor screening op kolonies. Deze kloonstrategie is zeer toepasbaar voor gist metabole engineering en andere situaties waarin multi-gen plasmide klonen vereist is.
Introduction
Synthetische biologie is gericht op het ontwikkelen van biologische systemen met nieuwe functionaliteiten die nuttig zijn voor de farmaceutische, agrarische en chemische industrie. Het assembleren van grote aantallen DNA-fragmenten op een high-throughput manier is een fundamentele technologie in de synthetische biologie. Een dergelijk ingewikkeld proces kan worden opgesplitst in meerdere niveaus met afnemende complexiteit , een concept dat is ontleend aan fundamentele ingenieurswetenschappen1,2. In de synthetische biologie assembleren DNA-fragmenten meestal hiërarchisch op basis van functionaliteit: (i) Deelniveau: "delen" verwijst naar DNA-fragmenten met een specifieke functie, zoals een promotor, een coderingssequentie, een terminator, een oorsprong van replicatie; ii) Transcriptie-eenheden (TU)-niveau: een TU bestaat uit een promotor, een coderingssequentie en een terminator die in staat is een enkel gen te transcriberen; iii) Multigenniveau: een multigen plasmide bevat meerdere TU's die vaak bestaan uit een volledige metabolische route. Deze hiërarchische assemblage die door de BioBrick-gemeenschap wordt geïntroduceerd, is het basisconcept voor de assemblage van grote sets DSA's in synthetische biologie3.
In het afgelopen decennium4,5,6,7, heeft de Golden Gate-kloontechniek de hiërarchische DNA-assemblage aanzienlijk vergemakkelijkt2. Veel andere meerdelige kloonmethoden, zoals Gibson klonen8, ligatie-onafhankelijk klonen (SLIC)9, uracil excisie-gebaseerd klonen (USER)10, de ligase cycling reaction (LCR)11, en in vivo recombinatie (DNA Assembler)12,13, zijn ook ontwikkeld tot nu toe. Maar Golden Gate klonen is een ideale DNA-assemblagemethode omdat het onafhankelijk is van genspecifieke sequenties, waardoor littekenloze, directionele en modulaire assemblage in een one-pot-reactie mogelijk is. Golden Gate klonen maakt gebruik van type IIS restrictie enzymen die een niet-palindromische sequentie herkennen om verspringende uitsteeksels buiten de herkenningsplaats te creëren2. Een ligase voegt zich vervolgens bij de gegloeide DNA-fragmenten om een meerdelige assemblage te verkrijgen. Het toepassen van deze kloonstrategie op het modulaire kloonsysteem (MoClo) heeft het mogelijk gemaakt om maximaal 10 DNA-fragmenten samen te stellen met meer dan 90% transformanten gescreend met de correct geassembleerde constructie4.
Het MoClo-systeem biedt enorme voordelen die de ontwerp-bouw-testcyclus van synthetische biologie hebben versneld. Ten eerste stellen de verwisselbare onderdelen combinatorisch klonen in staat om een grote ruimte van parameters snel te testen. Bijvoorbeeld, het optimaliseren van een metabolische route vereist meestal fietsen door vele promotors voor elk gen om de route flux in evenwicht te brengen. Het MoClo-systeem kan dergelijke veeleisende kloontaken gemakkelijk aan. Ten tweede moet men het deel plasmide sequencen, maar meestal niet de TU of de multi-gen plasmiden. In de meeste gevallen is screening op kolonie-PCR of restrictievertering voldoende voor verificatie op TU- en multi-gen plasmideniveau. Dit komt omdat het klonen van het onderdeel plasmide de enige stap is die PCR vereist, die vaak mutaties introduceert. Ten derde is het MoClo-systeem ideaal voor het bouwen van multi-gen complexe metabolische routes. Ten slotte kan het deel plasmiden vanwege de universele uitsteeksels worden hergebruikt en gedeeld met de hele bio-engineeringgemeenschap. Momenteel zijn MoClo kits beschikbaar voor planten14,15,5,16,17,schimmels6,18,19,20,21,22,bacteriën7,23,24,25,26,27en dieren28,29. Een multi-koninkrijk MoClo platform is onlangs ook geïntroduceerd30.
Voor Saccharomyces cerevisiaehebben Lee et al.6 een veelzijdige MoClo toolkit ontwikkeld, een uitstekende bron voor de gist synthetische biologie gemeenschap. Deze kit wordt geleverd in een handig 96-well-formaat en definieert acht soorten verwisselbare DNA-onderdelen met een gevarieerde verzameling goed gekarakteriseerde promotors, fluorescerende eiwitten, terminators, peptidetags, selectiemarkers, oorsprong van replicatie en genoombewerkingstools. Deze toolkit maakt de assemblage van maximaal vijf transcriptie-eenheden in een multi-gen plasmide mogelijk. Deze kenmerken zijn waardevol voor gist metabolische engineering, waarin gedeeltelijke of volledige paden worden over-uitgedrukt om gerichte chemicaliën te produceren. Met behulp van deze kit hebben onderzoekers de productie van geraniol, linalool31,penicilline32,muconic acid33,indigo34en betalain35 in gist geoptimaliseerd.
Hier bieden we een gedetailleerd, stapsgewijs protocol om het gebruik van de MoClo-toolkit te begeleiden om multigen-paden te genereren voor episomale of genomische expressie. Door uitgebreid gebruik van deze kit hebben we ontdekt dat het nauwkeurig meten van DNA-concentraties de sleutel is tot het waarborgen van de equimolar verdeling van elk onderdeel in de Golden Gate-reactie. We raden ook de T4 DNA-ligase over de T7 DNA-ligase aan omdat de eerste beter werkt met grotere aantallen uitsteeksels36. Ten slotte moeten alle interne herkenningslocaties van BsmBI en BsaI vóór de montage worden verwijderd of gedomesticeerd. Als alternatief kan men overwegen om onderdelen te synthetiseren om meerdere interne sites te verwijderen en om gelijktijdige codonoptimalisatie te bereiken. We laten zien hoe we deze toolkit kunnen gebruiken door een vijf-gen traject uit te drukken voor β-caroteen en lycopeen productie in S. cerevisiae. We laten verder zien hoe je de ADE2-locus kunt uitschakelen met behulp van de genoombewerkingstools uit deze kit. Deze op kleuren gebaseerde experimenten werden geselecteerd voor eenvoudige visualisatie. We laten ook zien hoe je fusie-eiwitten kunt genereren en aminozuurmutaties kunt maken met behulp van Golden Gate-klonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het hiërarchische kloonprotocol dat in deze toolkit wordt aangeboden, kan worden onderverdeeld in drie belangrijke stappen: 1. Het klonen van deelplasmiden; 2. Klonen van transcriptie-eenheden (TUs); 3. Klonen van multi-gen plasmiden (Figuur 1). Dit protocol begint bij het primerontwerp en eindigt met toepassingen van de gekloonde multi-gen plasmide.
1. Primer ontwerp voor het klonen van het onderdeel plasmide (pYTK001):
- Ontwerp de voorwaartse en omgekeerde primers met flankerende nucleotiden TTT aan het 5'-uiteinde, een BsmBI-herkenningssite met een extra nucleotide (CGTCTCN), een 4-nucleotiden (nt) overhang (TCGG) complementair aan die van de ingangsvector, een BsaI-herkenningssite met een extra nucleotide (GGTCTCN) en een 4-nt deelspecifieke overhang,naast de sjabloon- GoldenBraid 4.037 en GoldenMutagenesis38 zijn enkele van de online software die kan worden gebruikt voor Golden Gate specifiek primerontwerp.
- Als BsaI- of BsmBI-herkenningssites in enig deel aanwezig zijn, gebruikt u een domesticatiestap om deze sites te muteren voordat Golden Gate-assemblage39. Voor integratieve plasmiden (zie stap 4) domesticeert u elke NotI-herkenningssite. Om een deel te domesticeren met één ongewenste herkenningsplaats, verdeelt u het deel in twee subdelen in de buurt van de ongewenste plaats (Figuur 2A):
- Ontwerp de voorwaartse primer van het eerste subdeel op dezelfde manier als in stap 1.1. maar ontwerp de omgekeerde primer met alleen de BsmBI-site en een 4-nt genspecifieke overhang.
- Ontwerp de tweede sub-part forward primer met de BsmBI site en de 4-nt gen-specifieke overhang alleen die overlapt met de omgekeerde primer van het eerste deel. Ontwerp de omgekeerde primer van het tweede deel op dezelfde manier als in stap 1.1.
- Introduceer de gewenste mutatie(s) in de omgekeerde (voor stap 1.2.1) of voorwaartse primer (stap 1.2.2) in het genspecifieke gebied van de primer.
OPMERKING: Als alternatief kan een BsmBI- en BsaI-vrij en codon-geoptimaliseerd onderdeel commercieel worden gesynthetiseerd. Voor coderingssequenties (CDS) kan een synonieme mutatie gemakkelijk worden opgenomen bij de derde nucleotide van een aminozuurcodon. Voor promotors en terminators wordt het echter aanbevolen om de gemuteerde promotor- of terminatoractiviteit te controleren met behulp van een reporter-test39. Als er een ongewenste beperkingsplaats is tegen het einde van de reeks, kan deze worden gemuteerd met behulp van een langere omgekeerde primer. Als er meerdere ongewenste sites aanwezig zijn, kan site-gerichte mutagenese die het muteren van meerdere sites toestaat, worden uitgevoerd40.
- Af en toe is het wenselijk om twee eiwitten als één onderdeel te combineren met een linker ertussen (figuur 2A). De linker draagt bij tot de structurele integriteit van de twee afzonderlijke eiwitten41.
- De voorwaartse primer voor het eerste gen is hetzelfde als in stap 1.1. Neem in de omgekeerde primer een BsmBI-site, een 4-nt genspecifieke overhang en een linkersequentie op. De 4-nt overhang kan de eerste paar nucleotiden van het linker- of tweede gen zijn.
- Ontwerp voor het tweede gen de voorwaartse primer zodanig dat deze een BsmBI-herkenningsplaats heeft en een 4-nt overhang die complementair is aan die van de omgekeerde primer van het eerste gen. Ontwerp de omgekeerde primer van het tweede gen zoals in stap 1.1.
- Om de onderdelen te versterken door polymerasekettingreactie (PCR)42,gebruikt u een high-fidelity DNA-polymerase om de delen te versterken uit een genomisch DNA, een cDNA of een plasmide. Controleer het PCR-product op een 1% agarosegel gevolgd door gelzuivering. Het gebruik van gezuiverd DNA wordt sterk aanbevolen, als gelzuivering arbeidsintensief is, gebruik dan ten minste een spinkolom om het PCR-product te zuiveren.
2. Delen klonen in de invoervector (pYTK001) om deelplasmiden te maken (Figuur 2B)
- Om de Golden Gate-reactiemix in te stellen, voegt u 20 fmol van elk PCR-product en de entryvector (pYTK001), 1 μL 10X T4-ligasebuffer, 0,5 μL Esp3I (een zeer efficiënt isoschizomer van BsmBI) en 0,5 μL T4-ligase toe. Voeg ddH2O toe om het totale volume op 10 μL te brengen.
- Om de kloonreactie in te stellen, voert u het volgende programma uit in een thermocycler: 25-35 cycli van 37 °C gedurende 5 minuten (spijsvertering) en 16 °C gedurende 5 minuten (ligatie), gevolgd door een eindvertering bij 50 °C gedurende 10 minuten en enzyminactivatie bij 80 °C gedurende 10 minuten.
OPMERKING: 35 cycli van spijsvertering/ligatie worden aanbevolen bij het gelijktijdig klonen van meerdere DNA-stukken in de ingangsvector, bijvoorbeeld tijdens het klonen van fusiegenen of het domesticeren van een gen. - Transformeer de gehele reactiemix in de DH5α stam of gelijkwaardige Escherichia coli chemisch competente cellen door hitteschok. Het wordt aanbevolen het volledige gekloonde product van 10 μL om te zetten in 35 μL chemisch competente E. coli-cellen (2 X10 5 kve/ml, cfu wordt berekend door 5 ng pYTK001 om te zetten in 100 μL van de competente cellen). Verspreid over een lysogene bouillonplaat (LB) met 35 μg/ml chlooramfenicol (cm). Incubeer 's nachts bij 37 °C.
- Haal na 16-18 uur de plaat uit de incubator en houd de plaat ongeveer 5 uur op 4 °C om de supermap groen fluorescerend eiwit (sfGFP) te laten ontwikkelen voor een intensere groene kleur.
- Voor een eenvoudigere screening plaatst u de plaat op een ultraviolette (UV) of een blauwlichttransilluminator. De sfGFP die kolonies bevat, fluoresceert onder het UV-licht.
- De groene kolonies zijn negatief omdat ze de ongesneden pYTK001 bevatten. De witte kolonies zijn waarschijnlijk positief. Het klonen is meestal succesvol als er ~30-100% witte kolonies zijn. Voer verdere screening van een paar witte kolonies uit door kolonie PCR of beperkingsverteringen (voorgesteld enzym: BsaI-HFv2).
- Zuiver plasmiden uit een paar van de potentieel correcte kolonies en bevestig de sequenties door Sanger-sequencing.
3. Het assembleren van deelplasmiden in "cassette" plasmiden
OPMERKING: Een cassetteplasmide bevat een door de gebruiker gedefinieerde transcriptie-eenheid (TU) bestaande uit een promotor, een CDS en een terminator. Een cassette plasmide maakt de expressie van een enkel gen mogelijk. Als de cassetteplasmiden worden samengevoegd tot een multi-gen plasmide, dan is de eerste stap het bepalen van het aantal en de volgorde van TUs in de multi-gen plasmide. Deze bepalen welke connectoren in de cassetteplasmiden moeten worden gebruikt, omdat connectoren TUs in de multi-gen plasmide koppelen. De linkerconnector van de eerste TU moet ConLS zijn en de rechterconnector van de laatste TU moet ConRE zijn. Ze zullen overlappen met ConLS' en ConRE' van multi-gen plasmiden. De rest van de connectoren moeten in de toenemende numerieke volgorde zijn. Als de multi-gen plasmide bijvoorbeeld vier TUs bevat, zijn de connectorcombinaties ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 en ConL3-TU4-ConRE (figuur 1).
- Alvorens transcriptie-eenheden te assembleren, wordt aanbevolen een tussenvector te assembleren met de volgende zes delen: de linkerconnector, de sfGFP-dropout (pYTK047), de rechterconnector, een gistselectiemarker, een gistoorsprong van replicatie en het deel plasmide met een mRFP1, een E. coli-oorsprong en het ampicillineresistente gen (pYTK083) (figuur 3).
- Zuiver de bovenstaande zes plasmiden. Registreer hun concentraties met behulp van een UV-Vis spectrofotometer of een fluorescentie-gebaseerde test en verdun elke plasmide met ddH2O, zodat 1 μL 20 fmol DNA heeft. Bereken de DNA-molaire concentratie met behulp van een online calculator.
OPMERKING: Het is erg belangrijk om de DNA-concentraties nauwkeurig te meten en precies te pipeten om de assemblage te laten werken, vooral voor assemblages met vijf- tot zevendelige plasmiden. Kleine fouten in de DNA-concentratie van elke plasmide kunnen een aanzienlijke afname van de kloonefficiëntie veroorzaken. - Voeg 1 μL van elke plasmide, 1 μL 10X T4 ligase buffer, 0,5 μL BsaI-HFv2 (een zeer efficiënte versie van BsaI) en 0,5 μL T4 ligase toe. Maak het volume op tot 10 μL door ddH2O toe te voegen.
- Om de kloonreactie in te stellen, voert u het volgende programma uit in de thermocycler: 25-35 cycli van 37 °C gedurende 5 minuten (spijsvertering) en 16 °C gedurende 5 minuten (ligatie). Laat de laatste spijsverterings- en warmte-inactiveringsstappen weg, omdat de BsaI-locaties in de tussenvector moeten worden bewaard (figuur 3).
- Transformeer de gehele reactiemix in de DH5α stam of andere E. coli competente cellen. Verspreid over een LB-plaat met 50 μg/ml carbenicilline (Cb) of ampicilline. Incubeer 's nachts bij 37 °C.
OPMERKING: Carbenicilline is een stabiele analoog van ampicilline. - Haal na 16-18 uur de plaat uit de incubator. De plaat bevat zowel lichtrode als lichtgroene kolonies (figuren 6C en 6D). Houd de plaat ongeveer 5 uur op 4 °C om de mRFP1 en sfGFP te laten rijpen. Gebruik een UV- of een blauwlichttransilluminator om de groene kolonies te identificeren, die de potentieel correcte tussenvector bevatten.
- Streep de groene kolonies uit op een LB + Cb-plaat en incubeer 's nachts bij 37 °C. De volgende dag weer op een LB + Cm plaat en 's nachts bij 37 °C incuberen. De kolonies die groeien op LB + Cm platen bevatten verkeerd gemonteerde plasmiden omdat Cm resistente deelvectoren behouden blijven.
- Kies de kolonies die niet groeien op de LB + Cm plaat en voer restrictieverteringen uit (voorgestelde enzymen: BsaI-HFv2, Esp3I) om de correct geassembleerde plasmide te bevestigen. U kunt ook kolonie PCR gebruiken voor screening.
- Zuiver de bovenstaande zes plasmiden. Registreer hun concentraties met behulp van een UV-Vis spectrofotometer of een fluorescentie-gebaseerde test en verdun elke plasmide met ddH2O, zodat 1 μL 20 fmol DNA heeft. Bereken de DNA-molaire concentratie met behulp van een online calculator.
- Zodra de tussenliggende vector met succes is geassembleerd, is de volgende stap het assembleren van transcriptie-eenheden. Dit is een 4-delige assemblage met de volgende onderdelen: de tussenvector, een promotor, een CDS en een terminator.
- Zuiver de vierdelige plasmiden. Noteer hun concentraties en verdun elk plasmide zodat 1 μL 20 fmol DNA heeft.
- Volg stap 3.1.2 om de reactiemix in te stellen.
- Volg stap 2.2 om de kloonreactie in te stellen.
- Transformeer de gehele kloonreactiemix in de DH5α of gelijkwaardige E. coli competente cellen en plaat op LB + Cb. Incubeer 's nachts bij 37 °C.
- Haal na 16-18 uur de plaat uit de incubator. Witte en lichtgroene kolonies verschijnen (figuren 6E en 6F). Houd de plaat ongeveer 5 uur op 4 °C om de sfGFP te laten rijpen. Gebruik een UV- of blauwlichttransilluminator om de niet-fluorescerende witte kolonies te identificeren. Deze bevatten de mogelijk correcte transcriptie-eenheden.
- Streep uit en kweek 8-10 witte kolonies en voer een kolonie PCR uit. Zuiver plasmiden uit de kolonies die positief testen van kolonie PCR. Voer een restrictievertering uit (voorgesteld enzym: Esp3I) om de assemblage verder te bevestigen.
OPMERKING: Sequencing transcriptie-eenheden is meestal niet nodig omdat het klonen alleen beperking van de spijsvertering en ligatie omvat. Alle sequenties van belang zijn bevestigd op het deel plasmide niveau.
4. Het assembleren van cassetteplasmiden in "multi-gen" plasmiden:
OPMERKING: Multi-gen plasmiden maken de expressie van meer dan één gen mogelijk. Afhankelijk van de downstream-toepassing kunnen multi-gen plasmiden repliceerbaar of integratief zijn. Replicerende plasmiden hebben de gistoorsprong van replicatie; daarom kan het stabiel worden gehandhaafd wanneer gistcel zich verdeelt. Integratieve plasmiden hebben niet de gistoorsprong van replicatie. In plaats daarvan hebben ze 5' en 3' homologiearmen die de integratie van meerdere genen in specifieke loci van het genoom mogelijk maken door homologe recombinatie.
- Voor multi-gen plasmiden, assembleer eerst een tussenvector.
- Om replicerende tussenvectoren(figuur 4A)te assembleren, monteert u de volgende zes delen: de linkerconnector (ConLS'-pYTK008), de sfGFP-uitval (pYTK047), de rechterconnector (ConRE'-pYTK072), een gistselectiemarker, een gistoorsprong van replicatie en het deel plasmide met mRFP1, een E. coli-oorsprong van replicatie en het kanamycineresistente gen (pYK).
- Volg voor montage de stappen van 3.1.1 tot 3.1.3.
- Transformeer de gehele kloonreactiemix in DH5α of gelijkwaardige E. coli competente cellen, en plaat op LB plus 50 μg/ml kanamycine (Km). Incubeer 's nachts bij 37 °C.
- Voor rood/groene kleurgebaseerde screening volgt u stap 3.1.5.
- Voor het screenen van misassemblies, strepen en groeien van de groene kolonies op een LB + Km plaat. Volg vervolgens stap 3.1.6.
- Bepaal voor integratieve multigenvectoren (figuur 4B) eerst de genomische locus van belang en ontwerp vervolgens ongeveer 500 basisparen van 5' en 3' homologiearmen voor integratie in die locus.
- Kloon de 5' en 3' homologie armen van gist genomisch DNA in de entry vector-pYTK001. Volg stap 1 en 2.
- Monteer de volgende zeven plasmiden: de linkerconnector (ConLS'-pYTK008), de sfGFP dropout (pYTK047), de rechter connector (ConRE'-pYTK072), een gistselectiemarker, de 3' homologie arm, het deel plasmide met mRFP1, E. coli oorsprong van replicatie, en het kanamycine-resistente gen (pYTK090), en de 5' homologie arm.
- Voor montage en screening volgt u stap 4.1.1.
- Om replicerende tussenvectoren(figuur 4A)te assembleren, monteert u de volgende zes delen: de linkerconnector (ConLS'-pYTK008), de sfGFP-uitval (pYTK047), de rechterconnector (ConRE'-pYTK072), een gistselectiemarker, een gistoorsprong van replicatie en het deel plasmide met mRFP1, een E. coli-oorsprong van replicatie en het kanamycineresistente gen (pYK).
- Assemblage van de multi-gen plasmide
- Zuiver plasmiden van de tussenvector verkregen in stap 4.1 en de cassetteplasmiden vanaf stap 3. Registreer hun concentraties met behulp van een UV-Vis spectrofotometer of een fluorescentie-gebaseerde test. Verdun elk in ddH2O zodat 1 μL 20 fmol DNA heeft.
- Voeg 1 μL tussenvector, 1 μL van elke transcriptie-eenheid, 1 μL 10x T4 ligase buffer, 0,5 μL Esp3I en 0,5 μL T4 ligase toe. Breng het volume op 10 μL met ddH2O.
- Volg stap 2.2 om de kloonreactie in te stellen.
- Transformeer de gehele kloonreactiemix in DH5α of gelijkwaardige E. coli competente cellen en plaat op LB + Km. Incubeer 's nachts bij 37 °C.
- Voer de groen/witte screening uit zoals in stap 3.2.5.
- Zuiver plasmiden uit een paar witte kolonies en voer beperkingsverteringen uit. Het gebruik van het NotI-HF-enzym wordt aanbevolen omdat er twee NotI-locaties zijn op respectievelijk de E. coli-oorsprong en het Km-selectiemarkergedeelte (figuur 4B). Als de geassembleerde plasmide erg groot is, kan een andere beperkingsplaats worden gekozen voor verdere bevestiging. U kunt ook screenen met kolonie PCR voordat u doorgaat met het beperken van de spijsvertering.
5. Het toepassen van multi-gen plasmiden voor chromosomale of plasmide-gebaseerde genexpressie
- Integratie van multi-gen plasmide in het gistgenoom voor chromosomale genexpressie (Figuur 5)
- Ontwerp een guide RNA (gRNA) voor de gewenste locus. Het gebruik van meerdere online bronnen, zoals Benchling, CRISPRdirect43en CHOPCHOP44,wordt aanbevolen om de maximale specificiteit op het doel te bepalen.
- Kloon de gesynthetiseerde 20-nt gRNA in de pCASplasmide 45 door Gibson klonen. Lineariseer de pCAS plasmide door PCR met behulp van een omgekeerd primerpaar dat zich bindt aan respectievelijk de 3' van het HDV ribozyme en de 5' van het tracrRNA (Figuur 5). U kunt ook de gRNA klonen in de sgRNA dropout plasmide (pYTK050) en de dropout plasmide assembleren tot een cassette plasmide met linkers. Monteer vervolgens de Cas9 TU met het Cas9 deel plasmide (pYTK036). Monteer ten slotte de Cas9 TU en de sgRNA TU tot een replicative multi-gene plasmide.
- Lineariseer 5-15 μg integratieve multi-gen plasmide met 1 μL NotI-HF enzym 's nachts. Transformeer 1 μg pCAS-gRNA en de lineaire integratieve multigen plasmide in S. cerevisiae. Bereid competente cellen voor met behulp van een in de handel verkrijgbaar gisttransformatiekit of volgens het protocol van Geitz en Schiestl, 200746.
OPMERKING: Het is niet nodig om de lineaire multi-gen plasmide na de NotI-spijsvertering te zuiveren. - Pellet de cellen na herstel, gooi het supernatant weg, was met een gelijk volume water. Plaatgistcellen op de volledige synthetische medium (CSM) dropout plaat of het gistextract pepton dextrose medium (YPD) plaat met antibiotica, afhankelijk van de gist selectieve marker. Incubeer bij 37 °C gedurende twee dagen om kolonies te vormen. Als er geen kolonie wordt waargenomen, incubeer dan nog eens één tot twee dagen bij 30°C.
- Screen gistkolonies voor integratie door kolonie PCR47.
- Om de pCAS te genezen, streept u de kolonie uit met de juiste integratie op een niet-selectieve YPD-plaat. Groei 's nachts bij 30 °C. Streep een kolonie van de YPD-plaat op een verse YPD-plaat. Nogmaals, groei 's nachts bij 30 °C. Streep een kolonie van de tweede YPD-plaat naar een YPD plus 100 μg/ml nourseothricine, de selectiemarker van pCAS. Succesvolle uitharding treedt op wanneer gistcellen niet groeien op de selectieve plaat.
OPMERKING: Als de pCAS plasmide niet wordt genezen in twee rondes van niet-selectieve YPD, streep dan opnieuw op een verse YPD voor nog eens 1-2 ronden.
- Het transformeren van replicerende multi-gen plasmide voor plasmide-gebaseerde genexpressie
- Transformeer 100 ng-1 μg zuivere multi-gen plasmide in S. cerevisiae competente cellen.
- Plaatgistcellen onmiddellijk na transformatie op de CSM-uitvalplaat of YPD plus antibioticumplaat, afhankelijk van de gebruikte gistselectiemarker. Incubeer bij 30°C gedurende 2-3 dagen om kolonies te vormen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier de resultaten van vier replicerende multi-gen plasmiden voor β-caroteen (geel) en lycopeen (rood) productie. Een integratieve multi-gen plasmide voor het verstoren van de ADE2 locus werd gebouwd, waarvan de kolonies rood zijn.
CDSs klonen in de invoervector (pYTK001)
ERG20 werd versterkt uit het gistgenoom en de drie carotenoïde genen crtE, crtYB, crtI van de plasmide pLM49448 in de entry vector pYTK001 zoals beschreven. Gistpromotors pENO2, pTIP1, pPYK1 en pPDC1 en terminators tTDH2, tHSP26, tADH2, tACS2 werden gekloond als deelplasmiden. Een puntmutatie werd geïntroduceerd in CrtYB (G247A) voor de productie van lycopeen en er werd een BTS1-ERG20 fusieconstructie gemaakt om het prenyl-intermediair beter te kanaliseren naar carotenoïden. De figuren 6A en 6B tonen een representatief bord van het succesvol klonen van een deel plasmide en geven een voorbeeld van de groen/witte screening met 90,35 ± 4,22% totale kolonies die mogelijk correct zijn (wit).
Assemblage van transcriptie-eenheden (cassetteplasmiden)
Voordat de cassette plasmide werd geassemblaged, werd het ontwerp van de multi-gen plasmide afgerond. Voor de vier carotenoïde TUs werden vier tussenliggende vectoren met verschillende connectoren eerst gekloond na stap 3.1. De figuren 6C en 6D tonen een representatieve plaat van een succesvolle assemblage van de tussenvector en geven een voorbeeld van de rood/groene screening, waarbij 17,56 ± 3,32% totale kolonies positief (groen) zijn. Hoewel deze verhouding relatief laag is, wordt de screening sterk vergemakkelijkt door de groene fluorescentie.
Vervolgens werden de TUs voor BTS1-ERG20, ERG20, crtE, crtYB, crtYB(G247A)en crtI geassembleerd volgens stap 3.2 (Tabel 1). De figuren 6E en 6F tonen een representatief bord van een succesvolle assemblage van de TU's en geven een voorbeeld van een groen/witte screeningsmethode, waarbij 65,02 ± 4,99% van de totale kolonies positief (wit) is.
Assemblage van multi-gen plasmiden
Vier replicerende en één integratieve multi-gen plasmiden werden geassembleerd. Voor replicerende multi-gen plasmiden werden ERG20, BTS1-ERG20, crtE, crtYB, crtYB (G247A) en crtI in vier verschillende combinaties geassembleerd, waardoor vier plasmiden ontstonden: twee voor β-caroteen en twee voor lycopeenproductie (Tabel 2). De verhouding van potentieel correcte kolonies (groen) voor het klonen van tussenliggende vectoren was 1,83 ± 0,15% (figuren 7A en 7B). Hoewel dit aantal laag lijkt, werd de screening eenvoudig gemaakt door de groene fluorescentie te detecteren (figuur 7B). Zodra de intermediaire plasmide was gekloond, was het slagingspercentage van het assembleren van multi-gen plasmiden (wit) uit het tussenproduct 93,77± 1,65% (figuren 7C en 7D). De figuren 7E en 7F laten een suboptimale verzameling van multi-gen plasmiden zien, omdat het aantal positieve kolonies (wit) verwaarloosbaar was. Na de omzetting in gist groeiden op dag drie kolonies die β caroteen (geel) en lycopeen (rood) produceerden. Vier kolonies van elke plaat werden op verse borden uitgestreept en nog twee dagen gekweekt. De figuren 8A en 8B laten zien dat het samensmelten van de BTS1-ERG20 meer geranylgeranyl-pyrofosfaat naar de carotenoïdproductie leidt, gezien door donkerdere kleuren dan alleen het gebruik van de ERG20. Bij extractie49 en kwantificering van de carotenoïden door UV-Vis spectrofotometrie met authentieke normen, wordt gezien dat fusie van BTS1-ERG20 leidt tot de productie van 0,729 μg/mg β-caroteen, wat ~35 keer hoger is dan 0,021 μg/mg β-caroteen geproduceerd door de stam met ALLEEN ERG20. Evenzo is de productie van lycopeen ~16,5 maal hoger in de stam met BTS1-ERG20 (1,126 μg/mg) in vergelijking met ERG20 (0,068 μg/mg) alleen (Figuur 8C).
Replicerende multi-gen plasmiden omgezet in gist met (A) BTS1-ERG20 fusie TU en (B) ERG20 TU. Op elk bord heeft gist aan de linkerkant plasmiden die crtE TU, crtYB TU en crtI TU bevatten voor de productie van β-caroteen en gist aan de rechterkant heeft plasmiden die crtE TU, crtYB (G247A)TU en crtI TU bevatten voor de productie van lycopeen.
Voor de integratieve plasmide werden de ConLS', sfGFP dropout, ConRE', HIS3 (gistselectiemarker), ADE2 5' en 3' homologiearmen geassembleerd volgens stap 4.1.2. De 5' en 3' homologie armen waren 500 bp uit elkaar, het verwijderen van ~ 180 aminozuren na integratie. Bovendien had de 5' homologie-arm zes stop codons tegen het einde van 3'. De gemuteerde ADE2 resulteerde in rode kolonies50. De ADE2 gRNA 5'-ATTGGGAC GTATGATTGTTGAGG-3'51 werden gebruikt en volgden stap 5.1 voor genomische integratie. Na 3-4 dagen werden rode kolonies waargenomen op de YPD-plaat + 100 μg/ml nourseothricine, wat aangeeft dat ADE2 met succes was verstoord (Cijfers 8D en 8E).
Figuur 1: Overzicht van multi-gen assemblage. De montage vindt plaats in drie niveaus. In0 niveau 1 wordt het CDS, of een ander deel, versterkt uit het genoom of gesynthetiseerd en vervolgens gekloond in de pYTK001 entry vector met behulp van het BsmBI (of Esp3I) enzym. ColE1: E. coli oorsprong van replicatie; CmR: Chlooramfenicol resistent gen. In niveau 2 wordt de transcriptie-eenheid (TU) met een promotor, een CDS en een terminator geassembleerd met behulp van het BsaI-enzym. In niveau 3 worden maximaal vijf transcriptie-eenheden geassembleerd in een multi-gen plasmide met behulp van het BsmBI (of Esp3I) enzym. De multi-gen plasmide kan repliceerbaar of integratief zijn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Primer ontwerp en klonen van deelplasmiden. (A) Primer ontwerp voor het versterken van individuele delen, domesticeren van genen of het creëren van puntmutaties, en het assembleren van fusie-eiwitten. Primers omvatten BsmBI- en BsaI-herkennings- en snijlocaties en de MoClo-overhang voor een goede montage. MoClo-uitsteeksels worden weergegeven als 1, 2, 3, 4 en 5, 6, 7, 8. Interne primers voor domesticatie of het creëren van fusie-eiwit bevatten de BsmBI, maar niet de BsaI-sites. De overhangen hiervoor zijn aangepaste interne sequenties (NNNN en N'N'N'N' in paars). Terminale "ttt" zijn inbegrepen voor een optimale enzymvertering. Goi: gen van belang. (B) Het klonen van versterkte delen in de pYTK001 entry vector met behulp van BsmBI (of Esp3I). Complementaire uitsteeksels leiden tot de integratie van het onderdeel en de verwijdering van de BsmBI-erkenningssite. ColE1: E. coli oorsprong van replicatie; CmR: Chlooramfenicol resistent gen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Montage van transcriptie-eenheden. Voor het assembleren van de TU plasmiden wordt de assemblage van een tussenvector aanbevolen om combinatorische TU-assemblage te vergemakkelijken. Om de tussenliggende vector te assembleren, kloont u de Con LX (X: een van de vijf linkerconnectoren), de sfGFP-uitval, de Con RY (Y: een van de vijf rechterconnectoren), een gist-ORI (oorsprong van replicatie) en een gistmarkerdeel in de mRFP1-uitvalvector met behulp van het BsaI-enzym. De tussenliggende plasmide is bestand tegen ampicilline. De BsaI-herkenningssites blijven behouden voor het klonen van TU plasmide. Om de TU plasmide te klonen, worden een promotor, een CDS en een terminator met behulp van BsaI in de tussenvector geassembleerd. De gekloonde TU zal BsmBI-locaties hebben in de ConLX- en ConRY-regio's voor de volgende stap multi-gen assemblage. De gekloonde TU is ook resistent tegen ampicilline. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Naam | ConLX (linker connector) | Promotor | Cds | Terminator | ConRY (rechter connector) |
| BTS/ERG20 Tu | Ls | pENO2 | BTS1/ERG20 | tTDH2 | R1 |
| ERG20 Tu | Ls | pENO2 | ERG20 | tTDH2 | R1 |
| crtE Tu | L1 | pTIP1 | crtE | tHSP26 | R2 |
| crtYB Tu | L2 | pPDC1 | crtYB | tADH2 | R3 |
| CrtYBG247A Tu | L2 | pPDC1 | CrtYBG247A | tADH2 | R3 |
| crtI Tu | L3 | pPYK1 | crtI | tACS2 | Opnieuw |
Tabel 1: Transcriptie-eenheden die in deze studie worden gebruikt. Promotors en terminators werden versterkt door S. cerevisiae. BTS1 (geranylgeranyldifosfaatsynthase) en ERG20 (farnesylpyrofosfaatsynthetase) werden versterkt uit S. cerevisiae. De genen crtE (geranylgeranyldifosfaatsynthase), crtYB (bifunctionele lycopeencyclase/fyto-enensynthase) en crtI (fyto-enendenaturase) waren afkomstig van Xanthophyllomyces dendrorhous.
Figuur 4: Multi-gen plasmide assemblage. (A) Replicerende plasmide assemblage. De assemblage van de replicerende tussenvector omvat het klonen van de Con LS', de sfGFP dropout, de Con RE', een gist ORI, een gistmarker en een E. coli oorsprong en marker op de mRFP1 dropout vector met behulp van het BsaI enzym. De sites van ConLS en ConRE introduceren BsmBI-herkenningssites in de vector. Potentieel correcte assemblages kunnen worden gescreend door te zoeken naar groene kolonies op een selectieve plaat met kanamycine. De eerder geassembleerde TUs kunnen vervolgens worden gekloond in de tussenvector met behulp van het BsmBI-enzym. Deze plasmide bevat een gist ORI waardoor het zich kan repliceren in een gistgastheer. (B) Integratieve plasmideassemblage. De assemblage van de integratieve tussenvector omvat het klonen van de Con LS', de sfGFP dropout, de Con RE', een 5' homologie arm, een 3' homologie arm, een gist marker, en de E. coli oorsprong en marker in de RFP dropout vector met behulp van het BsaI enzym. Correcte samenstellingen moeten groen lijken op een selectieve plaat met kanamycine. Transcriptie-eenheden die eerder zijn gemaakt, kunnen worden gekloond in de replicerende tussenvector met behulp van het BsmBI-enzym. Deze vector heeft geen gist ORI en zal worden geïntegreerd in de doel locus door CRISPR en homologe recombinatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Naam | TU1 | TU2 | TU3 | TU4 | Product |
| B/E-β-Caroteen | BTS1/ERG20 | crtE | crtYB | crtI | β-caroteen |
| B/E-Lycopeen | BTS1/ERG20 | crtE | CrtYBG247A | crtI | Lycopeen |
| E-β-Caroteen | ERG20 | crtE | crtYB | crtI | β-caroteen |
| E-Lycopeen | ERG20 | crtE | CrtYBG247A | crtI | Lycopeen |
Tabel 2: Multi-gen Plasmiden gebruikt in deze studie.
Figuur 5: CRISPR integratie. (A) CRISPR en helper plasmide klonen. De pCAS plasmide bevat de Cas9 endonuclease en componenten (tRNA promotor, SNR52 terminator, HDV ribozyme en tracrRNA) voor een optimale expressie van een gRNA. Kloon de pCAS+gRNA plasmide door de synthetische gRNA te assembleren met de lineaire pCAS met behulp van Gibson klonen. (B) CRISPR heeft de genetische integratie ondersteund. Stap 1: Cotransformatie: pCAS +gRNA werd medetransformatied in gist met de integratieve plasmide die het gen(en) van belang (GOI) bevat, een gist selectieve marker, en 5' en 3' homologie regio gericht op de genomische locus. Voor een optimale integratie lineariseert u de integratieve plasmide met NotI. Stap 2: Integratie op doel locus: Het kweken van de getransformeerde gist op een plaat selectief voor de gist marker, ofwel antibioticum of auxotrofe. Voer genotypering uit om de integratie te bevestigen. Stap 3: Hard de pCAS + gRNA plasmide uit door gist op een niet-selectieve plaat te strepen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Representatieve platen van het klonen van instapvectoren en transcriptie-eenheden in E. coli. Representatieve platen van het succesvol klonen van een gen in de ingangsvector pYTK001 onder (A) zichtbaar licht en (B) UV-licht. Positieve kolonies zijn wit en negatieve kolonies zijn groen. De verhouding van positieve kolonies in de totale kolonies is 90,35 ± 4,22 %. Succesvolle montage van de tussenvector voor transcriptie-eenheidsniveauassemblage en groen/rode selectie onder (C) zichtbaar licht en (D) UV-licht. Positieve kolonies zijn groen. De verhouding van positieve kolonies in totaal is 17,56 ± 3,32 %. Succesvolle montage van transcriptie-eenheid van de tussenliggende vector en groen/witte screening onder (E) zichtbaar licht en (F) UV-licht. Positieve kolonies zijn wit en negatieve kolonies zijn groen. De verhouding van positieve kolonies over het algemeen is: 65,02 ± 3,32 %. De gegevens zijn van drie biologische replica's. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Representatieve platen van multi-gen plasmide klonen in E. coli. Assemblage van de tussenvector voor assemblage op multigenniveau en rood/groene selectie onder (A) zichtbaar licht en (B) UV-licht. Positieve kolonies zijn groen en negatieve kolonies zijn rood. De verhouding van positieve kolonies in totaal is 1,83 ± 0,15%. Succesvolle assemblage van meerdere TU's uit de tussenliggende vector en groen/witte selectie (C) onder zichtbaar licht en (D) UV-licht. Positieve kolonies zijn wit. De verhouding van positieve kolonies in totaal is 93,77 ± 1,65%. Suboptimale assemblage van multi-gen plasmide onder (E) zichtbaar licht en (F) UV-licht. Het aantal positieve kolonies is verwaarloosbaar. De gegevens zijn van drie biologische replica's. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8: Representatieve platen van integratieve en replicerende plasmiden in gist. Replicerende multi-gen plasmiden omgezet in gist met (A) BTS1-ERG20 fusie TU en (B) ERG20 TU. Op elk bord heeft gist aan de linkerkant plasmiden die crtE TU, crtYB TU en crtI TU bevatten voor de productie van β-caroteen en gist aan de rechterkant heeft plasmiden die crtE TU, crtYB (G247A)TU en crtI TU bevatten voor de productie van lycopeen. (C) kwantificeren van β-caroteen en lycopeen uit gistextract met vier multi-gen plasmiden met behulp van een UV-vis spectrometer. De maximale absorptie werd geregistreerd bij respectievelijk 450 nm en 470 nm voor β-caroteen en lycopeen. De absolute kwantificering werd uitgevoerd aan de hand van authentieke normen (Aanvullend figuur S3). Fusie van BTS1-ERG20 leidt tot de productie van ~35-voudig hoger β-caroteen en ~16,5-voudig hoger lycopeen in vergelijking met ERG20 alleen. Representatieve platen voor de verstoring van de ADE2-locus door de integratie van een multi-gen integratieve plasmide met een gRNA en geen helper-DNA (D) en met gRNA en een multi-gen integratieve plasmide als helper-DNA (E). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende materialen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De moclo gebaseerde kloonkit ontwikkeld door Lee et al. biedt een uitstekende bron voor snelle assemblage van één tot vijf transcriptie-eenheden in een multi-gen plasmide voor replicatie of integratie in het gistgenoom. Het gebruik van deze kit elimineert het tijdrovende kloonknelpunt dat vaak bestaat voor het uitdrukken van meerdere genen in gist.
We hebben vijf verschillende condities getest voor de spijsvertering/ligatie cycli van Golden Gate klonen met T4 DNA ligase. We ontdekten dat 30 cycli van spijsvertering bij 37 °C gedurende 5 minuten en ligatie bij 16 °C gedurende 5 minuten gevolgd door een laatste spijsverteringsstap bij 50 °C gedurende 10 minuten en een eiwitinsactiveringsstap bij 80 °C gedurende 10 minuten resulteerden in kolonies van 99,5% die mogelijk correct waren in een 4-delige assemblage (Aanvullende figuur S1 en tabel S3). Ligatie bij 16 °C zorgt voor optimale ligase activiteit en overhang gloeien. De eindvertering bij 50 °C voorkomt dat verteerd producten opnieuw bruin worden. Deze cyclus werd gevolgd voor alle montagereacties, tenzij anders aangegeven.
We hebben ook enkele kritische stappen gevonden die speciale aandacht nodig hebben voor optimale resultaten. We raden ten zeerste aan om tussenliggende vectoren te assembleren met de sfGFP-uitval voordat u transcriptie-eenheden assembleert. In theorie kunnen alle zeven delen worden gekloond in de E. coli-vector met de mRFP1, gevolgd door rood/witte screening. In de praktijk ontwikkelt mRFP1 echter heel langzaam kleur en is het een uitdaging om onder zichtbaar licht onderscheid te maken tussen lichtrode en lichtgele E. coli kolonies. Zoals sfGFP absorbeert in het UV-bereik52,vergemakkelijkt het gebruik van een UV- of een blauwlichttransilluminator de screening op felgroene kolonies. Ook maakt het klonen van een tussenvector het mogelijk om de verschillende promotor-, CDS- en terminatorcombinaties gemakkelijker te assembleren, waardoor een eenvoudigere combinatorische bibliotheekcreatie mogelijk is, omdat een assemblage met vier delen meestal resulteert in positievere kolonies dan een assemblage met meer onderdelen. Aanvullende figuur S2 toont een geleidelijke afname van de verhouding van potentieel correcte kolonies van een 6-delige naar een 8-delige assemblage.
De concentraties van alle delen moeten nauwkeurig worden gemeten om de equimolarconcentratie van elk onderdeel te garanderen. Het kwantificeren van onderdelen met behulp van een UV-Vis spectrometer is meestal voldoende, maar meer gevoelige methoden, zoals fluorescentie-gebaseerde assays, kunnen betere resultaten opleveren. Het niet nauwkeurig kwantificeren van alle onderdelen resulteert vaak in een lage montage-efficiëntie. Men moet de zeer efficiënte Esp3I en BsaI-HFv2 selecteren, respectievelijk. We hebben opgemerkt dat T4 goed werkt voor zowel overhangen in de kit als aangepaste overhangen nodig zijn om twee delen te fuseren, wat consistent is met literatuur36, hoewel het originele papier T7 ligase6aanbeveelt. Het verhogen van het aantal cycli kan het aantal potentieel correcte kolonies tot op zekere hoogte verhogen. Bijvoorbeeld, 25 cycli van spijsvertering en ligatie zijn genoeg om drie tot vier delen te assembleren, maar 30-35 cycli geven betere resultaten voor meer onderdelen.
De MolClo-strategie is voordelig ten opzichte van alternatieve meerdelige assemblagemethoden8,9,10,11,12 omdat het modulair en zeer veelzijdig klonen mogelijk maakt. De primaire beperking is echter de domesticatiestap, omdat onderdelen soms meerdere BsmBI-, BsaI- of NotI-sites hebben. Het muteren van alle onderdelen kan tijdrovend zijn. In dit geval kan men overwegen om de CDS te synthetiseren zonder deze beperkingssites. Voor promotors en terminators kan het muteren van zelfs een enkele nucleotide hun functionaliteit echter veranderen. Daarom wordt aanbevolen de activiteit van deze onderdelen te valideren met behulp van een reporter-test39. Een andere beperking is dat deze kit slechts maximaal vijf transcriptie-eenheden in een multi-gen plasmide toestaat. Als meer transcriptie-eenheden gewenst zijn, kunnen extra connectors worden geconstrueerd door een set zeer compatibele uitsteeksels te selecteren36.
De kit biedt 27 promotors, zes terminators, zeven gistselectiemarkers en twee gistoorsprongen van replicaties. Aangepaste onderdelen, zoals promotors en terminators, native of synthetisch, kunnen volgens dit protocol worden gekloond in de invoervector. De gist MoClo kit is voornamelijk gebruikt voor het overexpresseren van multi-gen metabolische routes om hoogwaardige chemicaliën in gist te produceren. Dit protocol kan ook worden gebruikt wanneer verschillende schakelaars voor biologische circuits gewenst zijn in gist. Er is ook een enorm potentieel om deze kit toe te passen voor het onderzoek van fundamentele biologische vragen over eiwit-eiwitinteracties, eiwitlokalisatie en enzymactiviteiten. Over het algemeen is dit protocol uiterst flexibel en betrouwbaar en kan het elk veeleisend klonen in de gistbiologie ondersteunen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Research Foundation for the State University of New York (Award #: 71272) en de IMPACT Award of University at Buffalo (Award #: 000077).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
| Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
References
- Endy, D.
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553 (2009).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5 (2008).
- Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622 (2011).
- Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892 (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55 (2007).
- de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
- Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16 (2009).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185 (2018).
- Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
- Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
- Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
- Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123 (2017).
- Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
- Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
- Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
- Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
- Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131 (2019).
- Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965 (2018).
- Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker's yeast. Nature Communications. 8, 15202 (2017).
- Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
- Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
- Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
- Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932 (2019).
- Engler, C., Sylvestre, M. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. 1116, Humana Press. Ch. 9 119-131 (2014).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
- Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, Pt 1 263-273 (1986).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
- Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
- Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931 (2018).
- Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
- Jones, E., et al. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast 181 (1982).
- Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
- Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750 (2014).
