Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine detaillierte, schrittweise Anleitung für die Montage von Multi-Gen-Konstrukten mit dem modularen Klonsystem auf Basis des Golden Gate Klonens bereitzustellen. Es gibt auch Empfehlungen zu kritischen Schritten, um eine optimale Montage auf der Grundlage unserer Erfahrungen zu gewährleisten.
Abstract
Die Golden Gate Klonmethode ermöglicht die schnelle Montage mehrerer Gene in jeder benutzerdefinierten Anordnung. Es verwendet Typ IIS-Restriktionsenzyme, die außerhalb ihrer Erkennungsstellen schneiden und einen kurzen Überhang erzeugen. Dieses modulare Klonsystem (MoClo) verwendet einen hierarchischen Workflow, in dem verschiedene DNA-Teile wie Promotoren, Codierungssequenzen (CDS) und Terminatoren zunächst in einen Eintragsvektor geklont werden. Mehrere Eintragsvektoren werden dann zu Transkriptionseinheiten zusammengesetzt. Mehrere Transkriptionseinheiten verbinden sich dann mit einem Multigen-Plasmid. Die Golden Gate Klonstrategie ist von enormem Vorteil, da sie eine narbenlose, richtungsweisende und modulare Montage in einer Ein-Topf-Reaktion ermöglicht. Der hierarchische Workflow ermöglicht in der Regel das einfache Klonen einer Vielzahl von Multigenkonstrukten, ohne dass eine Sequenzierung über Eingabevektoren hinaus erforderlich ist. Die Verwendung von fluoreszierenden Proteinaussetzern ermöglicht ein einfaches visuelles Screening. Diese Arbeit bietet ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die Zusammenstellung von Multi-Gen-Plasmiden mit dem Hefe-Modul-Klonen (MoClo) Kit. Wir zeigen optimale und suboptimale Ergebnisse der Multi-Gen-Plasmid-Montage und bieten eine Anleitung für das Screening auf Kolonien. Diese Klonstrategie ist hochanwendbar für Hefestoffwechseltechnik und andere Situationen, in denen Multi-Gen-Plasmid-Klonen erforderlich ist.
Introduction
Synthetische Biologie zielt darauf ab, biologische Systeme mit neuen Funktionalitäten zu entwickeln, die für die pharmazeutische, landwirtschaftliche und chemische Industrie nützlich sind. Die Zusammenstellung einer großen Anzahl von DNA-Fragmenten auf hochdurchsatzweise ist eine grundlegende Technologie in der synthetischen Biologie. Solch ein komplizierter Prozess kann in mehrere Ebenen mit abnehmender Komplexität zerbrechen, ein Konzept, das aus den grundlegenden Ingenieurwissenschaftenentlehntist 1,2. In der synthetischen Biologie fügen sich DNA-Fragmente in der Regel hierarchisch auf der Grundlage der Funktionalität zusammen: (i) Bauteilebene: "Teile" bezieht sich auf DNA-Fragmente mit einer bestimmten Funktion, wie z. B. einem Promotor, einer Codierungssequenz, einem Terminator, einem Ursprung der Replikation; ii) Transkriptionseinheiten (TU) Ebene: eine TU besteht aus einem Promotor, einer Kodierungssequenz und einem Terminator, der in der Lage ist, ein einzelnes Gen zu transkribieren; (iii) Multigen-Niveau: Ein Multigen-Plasmid enthält mehrere TUs, die häufig aus einem gesamten Stoffwechselweg bestehen. Diese hierarchische Montage, die von der BioBrick-Community entwickelt wurde, ist das grundlegende Konzept für die Montage großer DNAs-Sets in der Synthetischen Biologie3.
In den letzten zehn Jahren4,5,6,7, hat die Golden Gate Klontechnik die hierarchische DNA-Montage erheblich erleichtert2. Viele andere mehrteilige Klonverfahren, wie Gibson Klonen8, ligationsunabhängiges Klonen (SLIC)9, uracil Exzision-basiertes Klonen (USER)10, die Ligase-Cycling-Reaktion (LCR)11und die in vivo-Rekombination (DNA Assembler)12,13, wurden bisher entwickelt. Aber Golden Gate Klonen ist eine ideale DNA-Montagemethode, da es unabhängig von genspezifischen Sequenzen ist und eine narbenlose, gerichtete und modulare Montage in einer Ein-Topf-Reaktion ermöglicht. Golden Gate Klonen nutzt Typ IIS-Restriktionsenzyme, die eine nicht-palindromische Sequenz erkennen, um gestaffelte Überhänge außerhalb der Erkennungsstelle2zu erzeugen. Ein Ligase schließt sich dann den geglühten DNA-Fragmenten an, um eine mehrteilige Baugruppe zu erhalten. Die Anwendung dieser Klonstrategie auf das modulare Klonsystem (MoClo) hat die Zusammenstellung von bis zu 10 DNA-Fragmenten mit über 90% transformierten Transformationsmitteln ermöglicht, die das richtig montierte Konstrukt4enthalten.
Das MoClo-System bietet enorme Vorteile, die den Design-Build-Test-Zyklus der synthetischen Biologie beschleunigt haben. Erstens ermöglichen die austauschbaren Teile das kombinatorische Klonen, um einen großen Parameterraum schnell zu testen. Zum Beispiel erfordert die Optimierung eines Stoffwechselwegs in der Regel radfahren durch viele Promotoren für jedes Gen, um den Pfadfluss auszugleichen. Das MoClo-System kann solche anspruchsvollen Klonaufgaben problemlos bewältigen. Zweitens muss man das Teilplasmid sequenzieren, aber in der Regel nicht die TU oder die Multi-Gen-Plasmide. In den meisten Fällen reicht ein Screening nach Kolonie-PCR oder Restriktionsverdauung für die Überprüfung auf TU- und Multigen-Plasmid-Ebene aus. Dies liegt daran, dass das Klonen des Teilplasmids der einzige Schritt ist, der PCR erfordert, was häufig Mutationen einführt. Drittens ist das MoClo-System ideal für den Aufbau von multigenkomplexen Stoffwechselwegen. Schließlich können die Teilplasmide aufgrund der universellen Überhänge wiederverwendet und mit der gesamten Bioengineering-Community geteilt werden. Derzeit sind MoClo Kits für Pflanzen14,15,5,16,17, Pilze6,18,19,20,21,22, Bakterien7,23,24,25,26,27, und Tiere28,29. Eine Multi-Königreich MoClo Plattform wurde auch vor kurzemeingeführt 30.
Für Saccharomyces cerevisiaehaben Lee et al.6 ein vielseitiges MoClo Toolkit entwickelt, eine ausgezeichnete Ressource für die Gemeinschaft der synthetischen Hefebiologie. Dieses Kit ist in einem praktischen 96-Well-Format erhältlich und definiert acht Arten austauschbarer DNA-Teile mit einer vielfältigen Sammlung von gut charakterisierten Promotoren, fluoreszierenden Proteinen, Terminatoren, Peptid-Tags, Selektionsmarkern, Herkunft der Replikation und Genombearbeitungswerkzeugen. Dieses Toolkit ermöglicht die Zusammenstellung von bis zu fünf Transkriptionseinheiten in ein Multi-Gen-Plasmid. Diese Eigenschaften sind wertvoll für Hefe-Stoffwechsel-Engineering, in dem teilweise oder ganze Wege überexprimiert werden, um gezielte Chemikalien zu produzieren. Mit diesem Kit, Forscher haben die Produktion von Geraniol optimiert, Linalool31, Penicillin32, Muconic Säure33, Indigo34, und Betalain35 in Hefe.
Hier stellen wir ein detailliertes, Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Verfügung, das die Verwendung des MoClo-Toolkits zur Erzeugung von Multigen-Signalpfaden für episomale oder genomische Expressionen leitet. Durch den umfangreichen Einsatz dieses Kits haben wir festgestellt, dass die genaue Messung von DNA-Konzentrationen der Schlüssel ist, um die Äquimolarverteilung jedes Teils in der Golden Gate-Reaktion sicherzustellen. Wir empfehlen auch die T4 DNA Ligase über die T7 DNA Ligase, weil erstere besser funktioniert mit einer größeren Anzahl von Überhängen36. Schließlich müssen alle internen Erkennungsstellen von BsmBI und BsaI vor der Montage entfernt oder domestiziert werden. Alternativ kann man erwägen, Teile zu synthetisieren, um mehrere interne Sites zu entfernen und gleichzeitige Codon-Optimierung zu erreichen. Wir zeigen, wie dieses Toolkit verwendet wird, indem wir einen Fünf-Gen-Weg für die β-Carotin- und Lycopinproduktion in S. cerevisiae exemiten. Wir zeigen weiter, wie man den ADE2-Lokus mit den Genom-Editing-Tools aus diesem Kit ausschaltet. Diese farbbasierten Experimente wurden für eine einfache Visualisierung ausgewählt. Wir zeigen auch, wie Fusionsproteine erzeugt und Aminosäuremutationen mit Golden Gate Klonen erzeugt werden.
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Protocol
HINWEIS: Das hierarchische Klonprotokoll, das in diesem Toolkit angeboten wird, kann in drei Hauptschritte unterteilt werden: 1. Klonen von Teilplasmiden; 2. Klontranskriptionseinheiten (TUs); 3. Klonen von Multigenplasmiden (Abbildung 1). Dieses Protokoll beginnt mit dem Primer-Design und endet mit Anwendungen des geklonten Multi-Gen-Plasmids.
1. Primer-Design zum Klonen des Teilplasmids (pYTK001):
- Entwerfen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen mit flankierenden Nukleotiden TTT am 5'-Ende, einer BsmBI-Erkennungsstelle mit einem zusätzlichen Nukleotid (CGTCTCN), einem 4-Nukleotiden(nt) Überhang (TCGG), der den des Eintragsvektors ergänzt, eine BsaI-Erkennungssite mit einem zusätzlichen Nukleotid (GGTCTCN) und einem 4-nt-teilspezifischen Überhang zusätzlich zur vorlagenspezifischen Sequenz (Abbildung 2A). GoldenBraid 4.037 und GoldenMutagenesis38 sind einige der Online-Software, die für Golden Gate spezifische Primer Design verwendet werden kann.
- Wenn BsaI- oder BsmBI-Erkennungssites in einem Teil vorhanden sind, verwenden Sie einen Domestizierungsschritt, um diese Standorte vor der Golden Gate-Baugruppe39zu mutieren. Für integrative Plasmide (siehe Schritt 4) domestizieren Sie jede NotI-Erkennungsstelle. Um ein Teil mit einem unerwünschten Erkennungsplatz zu domestizieren, teilen Sie das Teil in zwei Unterteile in der Nähe der unerwünschten Stelle auf (Abbildung 2A):
- Entwerfen Sie die Vorwärtsgrundierung des ersten Teils auf die gleiche Weise wie in Schritt 1.1. entwerfen Sie jedoch die umgekehrte Grundierung mit der BsmBI-Site und einem 4-nt-genspezifischen Überhang.
- Entwerfen Sie den zweiten Teil-Vorwärts-Primer mit der BsmBI-Site und dem 4-nt-genspezifischen Überhang nur, der sich mit der umgekehrten Grundierung des ersten Teils überlappt. Entwerfen Sie die Umgekehrte Grundierung des zweiten Teilteils auf die gleiche Weise wie in Schritt 1.1.
- Führen Sie die gewünschte Mutation(en) entweder in der umgekehrten (für Schritt 1.2.1) oder vorwärts primer (Schritt 1.2.2) in der genspezifischen Region des Primers ein.
HINWEIS: Alternativ kann ein BsmBI- und BsaI-freies und codonoptimiertes Teil kommerziell synthetisiert werden. Für die Codierung von Sequenzen (CDS) kann eine synonyme Mutation leicht am dritten Nukleotid eines Aminosäure-Codons eingebaut werden. Für Promoter und Terminatoren wird jedoch empfohlen, die mutierte Promoter- oder Terminatoraktivität mit einem Reporter-Assay zu überprüfen39. Wenn es eine unerwünschte Einschränkungsstelle gegen Ende der Sequenz gibt, kann sie mit einem längeren Reverse Primer mutiert werden. Wenn mehrere unerwünschte Standorte vorhanden sind, kann eine standortgesteuerte Mutagenese durchgeführt werden, die eine mutation mehrerer Standorte ermöglicht40.
- Gelegentlich ist es wünschenswert, zwei Proteine als ein einzelnes Teil mit einem Linker dazwischen zu verschmelzen (Abbildung 2A). Der Linker trägt dazu bei, die strukturelle Integrität der beiden einzelnen Proteine zu gewährleisten41.
- Die Vorwärtsgrundierung für das erste Gen ist die gleiche wie in Schritt 1.1. In der umgekehrten Grundierung sind eine BsmBI-Site, ein 4-nt-genspezifischer Überhang und eine Linkersequenz enthalten. Der 4-nt-Überhang kann entweder die ersten Nukleotide des Linkers oder des zweiten Gens sein.
- Für das zweite Gen entwerfen Sie die Vorwärtsgrundierung so, dass sie eine BsmBI-Erkennungsstelle und einen 4-nt-Überhang hat, der den des Umgekehrten Primers des ersten Gens ergänzt. Entwerfen Sie die Umgekehrte Grundierung des zweiten Gens wie in Schritt 1.1.
- Um die Teile durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)42zu verstärken, verwenden Sie eine hochtreue DNA-Polymerase, um die Teile entweder aus einer genomischen DNA, einer cDNA oder einem Plasmid zu verstärken. Überprüfen Sie das PCR-Produkt auf einem 1% Agarose-Gel gefolgt von Gel-Reinigung. Die Verwendung von gereinigter DNA wird dringend empfohlen, wenn die Gelreinigung mühsam ist, verwenden Sie mindestens eine Spin-Säule, um das PCR-Produkt zu reinigen.
2. Klonen von Teilen in den Eintragsvektor (pYTK001), um Teilplasmide zu erstellen (Abbildung 2B)
- Um den Golden Gate-Reaktionsmix einzurichten, fügen Sie 20 Fmol jedes PCR-Produkts und den Eintragsvektor (pYTK001), 1 l 10X T4 Ligase-Puffer, 0,5 l Esp3I (ein hocheffizientes Isoschizomer von BsmBI) und 0,5 l T4-Ligase hinzu. Fügen Sie ddH2O hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 L zu erhöhen.
- Um die Klonreaktion einzurichten, führen Sie folgendes Programm in einem Thermocycler durch: 25-35 Zyklen von 37 °C für 5 min (Verdauung) und 16 °C für 5 min (Ligation), gefolgt von einer abschließenden Verdauung bei 50 °C für 10 min und Enzyminaktivierung bei 80 °C für 10 min.
HINWEIS: Beim gleichzeitigen Klonen mehrerer DNA-Stücke in den Eintrittsvektor werden 35 Zyklen der Verdauung/Ligation empfohlen, z. B. beim Klonen von Fusionsgenen oder beim Domestizieren eines Gens. - Verwandeln Sie den gesamten Reaktionsmix durch Hitzeschock in den DH5-Stamm oder gleichwertige escherichia coli chemisch kompetente Zellen. Es wird empfohlen, das gesamte geklonte Produkt von 10 l in 35 l chemisch kompetente E. coli-Zellen (2 X 105 cfu/ml, cfu wird aus der Umwandlung von 5 ng pYTK001 in 100 l der zuständigen Zellen) umzuwandeln. Auf einer Lysogeny-Broth-Platte (LB) mit 35 g/ml Chloramphenicol (Cm) verteilen. Bei 37 °C über Nacht inkubieren.
- Nach 16-18 h die Platte aus dem Inkubator nehmen und die Platte bei 4 °C ca. 5 h halten, um den Superordner grünes fluoreszierendes Protein (sfGFP) für eine intensivere grüne Farbe entwickeln zu lassen.
- Zur einfacheren Abschirmung legen Sie die Platte auf einen ultravioletten (UV) oder einen Blaulichttransilluminator. Die sfGFP enthält Kolonien wird unter dem UV-Licht fluoreszieren.
- Die grünen Kolonien sind negativ, weil sie die ungeschnittene pYTK001 enthalten. Die weißen Kolonien sind wahrscheinlich positiv. Das Klonen ist in der Regel erfolgreich, wenn es 30-100% weiße Kolonien gibt. Führen Sie ein weiteres Screening von einigen weißen Kolonien durch Kolonie PCR oder Einschränkung Verdauungen (vorgeschlagenes Enzym: BsaI-HFv2).
- Reinigen Sie Plasmide aus einigen der potenziell korrekten Kolonien und bestätigen Sie die Sequenzen durch Sanger-Sequenzierung.
3. Zusammenstellung von Teilplasmiden zu "Kassetten"-Plasmiden
HINWEIS: Ein Kassettenplasmid enthält eine benutzerdefinierte Transkriptionseinheit (TU), die aus einem Promotor, einem CDS und einem Terminator besteht. Ein Kassettenplasmid ermöglicht die Expression eines einzelnen Gens. Wenn die Kassettenplasmide zu einem Multi-Gen-Plasmid zusammengesetzt werden, dann ist der erste Schritt, die Anzahl und die Reihenfolge der TUs im Multi-Gen-Plasmid zu bestimmen. Diese bestimmen, welche Steckverbinder in den Kassettenplasmiden verwendet werden sollen, da Steckverbinder TUs im Multigen-Plasmid verbinden. Der linke Stecker der ersten TU sollte ConLS sein, und der rechte Stecker der letzten TU sollte ConRE sein. Sie überschneiden sich mit ConLS' und ConRE' von Multi-Gen-Plasmiden. Der Rest der Steckverbinder sollte in der zunehmenden numerischen Reihenfolge sein. Wenn das Multigen-Plasmid beispielsweise vier TUs enthält, wären die Steckverbinderkombinationen ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 und ConL3-TU4-ConRE (Abbildung 1).
- Vor der Montage von Transkriptionseinheiten wird die Montage eines Zwischenvektors mit den folgenden sechs Teilen empfohlen: der linke Stecker, der sfGFP-Aussetzer (pYTK047), der rechte Stecker, ein Hefeauswahlmarker, ein Hefeursprung der Replikation und das Teilplasmid mit einem mRFP1, ein E. coli-Ursprung und das ampicillinresistente Gen (pYTK083) (Abbildung 3).
- Reinigen Sie die oben genannten sechs Plasmide. Zeichnen Sie ihre Konzentrationen mit einem UV-Vis-Spektrophotometer oder einem fluoreszenzbasierten Assay auf und verdünnen Sie jedes Plasmid mit ddH2O, so dass 1 l 20 Fmol DNA enthält. Berechnen Sie die DNA-Molar-Konzentration mit einem Online-Rechner.
HINWEIS: Es ist sehr wichtig, die DNA-Konzentrationen genau zu messen und präzise zu pipetieren, damit die Baugruppe funktioniert, insbesondere für Baugruppen mit fünf- bis siebenteiligen Plasmiden. Kleine Fehler in der DNA-Konzentration jedes Plasmids können zu einer signifikanten Abnahme der Kloneffizienz führen. - Fügen Sie 1 l von jedem Plasmid, 1 l 10X T4 Ligase Puffer, 0,5 l BsaI-HFv2 (eine hocheffiziente Version von BsaI) und 0,5 l T4 Ligase hinzu. Machen Sie das Volumen auf 10 l, indem Sie ddH2O hinzufügen.
- Um die Klonreaktion einzurichten, führen Sie im Thermocycler folgendes Programm aus: 25-35 Zyklen von 37 °C für 5 min (Verdauung) und 16 °C für 5 min (Ligation). Lassen Sie die letzten Verdauungs- und Wärmeinaktivierungsschritte aus, da die BsaI-Standorte im Zwischenvektor beibehalten werden müssen (Abbildung 3).
- Verwandeln Sie den gesamten Reaktionsmix in den DH5-Stamm oder andere E. coli-kompetente Zellen. Auf einer LB-Platte mit 50 g/ml Carbenicillin (Cb) oder Ampicillin verteilen. Bei 37 °C über Nacht inkubieren.
HINWEIS: Carbenicillin ist ein stabiles Analogon von Ampicillin. - Nach 16-18 h die Platte aus dem Inkubator nehmen. Die Platte wird sowohl blassrote als auch hellgrüne Kolonien enthalten (Abbildungen 6C und 6D). Halten Sie die Platte bei 4 °C für ca. 5 h, um die mRFP1 und sfGFP reifen zu lassen. Verwenden Sie einen UV- oder einen Blaulichttransilluminator, um die grünen Kolonien zu identifizieren, die den potenziell korrekten Zwischenvektor enthalten.
- Die grünen Kolonien auf einer LB + Cb-Platte ausstreifen und über Nacht bei 37 °C bebrüten. Am nächsten Tag wieder auf einer LB + Cm Platte ausstreifen und über Nacht bei 37 °C brüten. Die Kolonien, die auf LB + Cm-Platten wachsen, enthalten falsch zusammengesetzte Plasmide, da Cm-resistente Teilevektoren erhalten bleiben.
- Wählen Sie die Kolonien, die nicht auf der LB + Cm Platte wachsen und führen Einschränkung Verdauungen (empfohlene Enzyme: BsaI-HFv2, Esp3I), um das richtig zusammengesetzte Plasmid zu bestätigen. Alternativ können Sie Kolonie-PCR zum Screening verwenden.
- Reinigen Sie die oben genannten sechs Plasmide. Zeichnen Sie ihre Konzentrationen mit einem UV-Vis-Spektrophotometer oder einem fluoreszenzbasierten Assay auf und verdünnen Sie jedes Plasmid mit ddH2O, so dass 1 l 20 Fmol DNA enthält. Berechnen Sie die DNA-Molar-Konzentration mit einem Online-Rechner.
- Nachdem der Zwischenvektor erfolgreich montiert wurde, besteht der nächste Schritt darin, Transkriptionseinheiten zusammenzustellen. Dies ist eine 4-teilige Baugruppe mit den folgenden Teilen: dem Zwischenvektor, einem Promotor, einem CDS und einem Terminator.
- Reinigen Sie die vier teiligen Plasmide. Zeichnen Sie ihre Konzentrationen auf und verdünnen Sie jedes Plasmid so, dass 1 L 20 Fmol DNA hat.
- Um den Reaktionsmix einzurichten, folgen Sie Schritt 3.1.2.
- Um die Klonreaktion einzurichten, folgen Sie Schritt 2.2.
- Verwandeln Sie den gesamten Klon-Reaktionsmix in die DH5- oder gleichwertige E. coli-fähigen Zellen und Platten auf LB + Cb. Inkubieren Sie bei 37 °C über Nacht.
- Nach 16-18 h die Platte aus dem Inkubator nehmen. Weiße und hellgrüne Kolonien erscheinen (Abbildungen 6E und 6F). Halten Sie die Platte bei 4 °C für ca. 5 h, um die sfGFP reifen zu lassen. Verwenden Sie einen UV- oder einen Blaulichttransilluminator, um die nicht fluoreszierenden weißen Kolonien zu identifizieren. Diese enthalten die potenziell korrekten Transkriptionseinheiten.
- Streifen Sie aus und wachsen 8-10 weiße Kolonien und führen Sie eine Kolonie PCR. Reinigen Sie Plasmide aus den Kolonien, die positiv aus koloniePCR testen. Durchführung der Restriktionsverdauung (vorgeschlagenes Enzym: Esp3I), um die Montage weiter zu bestätigen.
HINWEIS: Die Sequenzierung von Transkriptionseinheiten ist in der Regel nicht erforderlich, da das Klonen nur die Einschränkungderdung und Ligation umfasst. Alle Sequenzen von Interesse wurden auf der Ebene des Teils Plasmid bestätigt.
4. Zusammenstellung von Kassettenplasmiden zu "Multigen"-Plasmiden:
HINWEIS: Multi-Gen-Plasmide ermöglichen die Expression von mehr als einem Gen. Je nach nachgeschalteter Anwendung könnten Multigenplasmide replizierend oder integrativ sein. Replicative Plasmide haben den Hefeursprung der Replikation; Daher kann es stabil beibehalten werden, wenn Hefezelle teilt. Integrative Plasmide haben nicht den Hefeursprung der Replikation. Stattdessen haben sie 5' und 3' Homologiearme, die die Integration mehrerer Gene in spezifische Loci des Genoms durch homologe Rekombination ermöglichen.
- Für Multi-Gen-Plasmide, montieren Sie zuerst einen Zwischenvektor.
- Um replizierende Zwischenvektoren (Abbildung 4A) zu montieren, montieren Sie die folgenden sechs Teile: den linken Stecker (ConLS'-pYTK008), den sfGFP-Aussetzer (pYTK047), den rechten Stecker (ConRE'-pYTK072), einen Hefe-Auswahlmarker, ein Hefeursprung der Replikation und das Teilplasmid mit mRFP1, ein E. coli-Ursprung der Replikation und das Kanamycin-resistente Gen (pYTK084).
- Befolgen Sie für die Montage die Schritte von 3.1.1 bis 3.1.3.
- Verwandeln Sie den gesamten Klon-Reaktionsmix in DH5- oder gleichwertige E. coli-fähige Zellen und Platte auf LB plus 50 g/ml Kanamycin (Km). Bei 37 °C über Nacht inkubieren.
- Befolgen Sie für das rot/grüne farbbasierte Screening Schritt 3.1.5.
- Zum Abschirmen von Fehlbaugruppen streifen und wachsen die grünen Kolonien auf einer LB + Km Platte. Folgen Sie dann Schritt 3.1.6.
- Für integrative Multigenvektoren (Abbildung 4B) bestimmen Sie zunächst den genomischen Ort, der von Interesse ist, und entwerfen Sie dann etwa 500 Basenpaare von 5' und 3' Homologiearmen für die Integration in diesen Ort.
- Klonen Sie die 5' und 3' Homologiearme aus Hefegenom-DNA in den Eintrag syTK001. Befolgen Sie die Schritte 1 und 2.
- Montieren Sie die folgenden sieben Plasmide: den linken Stecker (ConLS'-pYTK008), den sfGFP-Aussetzer (pYTK047), den rechten Stecker (ConRE'-pYTK072), einen Hefeauswahlmarker, der 3' Homologiearm, das Teilplasmid mit mRFP1, e. coli Ursprung der Replikation, und das Kanamycin-resistente Gen (pYTK090) und der 5' Homologiearm.
- Be-Und-Abgleich: Schritt 4.1.1.
- Um replizierende Zwischenvektoren (Abbildung 4A) zu montieren, montieren Sie die folgenden sechs Teile: den linken Stecker (ConLS'-pYTK008), den sfGFP-Aussetzer (pYTK047), den rechten Stecker (ConRE'-pYTK072), einen Hefe-Auswahlmarker, ein Hefeursprung der Replikation und das Teilplasmid mit mRFP1, ein E. coli-Ursprung der Replikation und das Kanamycin-resistente Gen (pYTK084).
- Montage des Multigenplasmids
- Reinigen Sie Plasmide des in Schritt 4.1 erhaltenen Zwischenvektors und der Kassettenplasmide ab Schritt 3. Zeichnen Sie ihre Konzentrationen mit einem UV-Vis-Spektrophotometer oder einem fluoreszenzbasierten Assay auf. Verdünnen Sie jeweils in ddH2O, so dass 1 l 20 Fmol-DNA hat.
- Fügen Sie 1 l Zwischenvektor, 1 l jeder Transkriptionseinheit, 1 l 10x T4-Ligasepuffer, 0,5 l Esp3I und 0,5 l T4-Ligase hinzu. Bringen Sie das Volumen auf 10 L mit ddH2O.
- Um die Klonreaktion einzurichten, folgen Sie Schritt 2.2.
- Verwandeln Sie den gesamten Klon-Reaktionsmix in DH5- oder gleichwertige E. coli-fähige Zellen und Platte auf LB + Km. Inkubieren Sie bei 37 °C über Nacht.
- Führen Sie das Grün-Weiß-Screening wie in Schritt 3.2.5 durch.
- Reinigen Sie Plasmide aus ein paar weißen Kolonien und führen Einschränkung Verdauungen. Die Verwendung des NotI-HF-Enzyms wird empfohlen, da es zwei NotI-Standorte am E. coli-Ursprung bzw. km-Selektionsmarkerteil gibt (Abbildung 4B). Wenn das zusammengesetzte Plasmid sehr groß ist, kann eine weitere Restriktionsstelle zur weiteren Bestätigung ausgewählt werden. Alternativ, Bildschirm mit Kolonie PCR, bevor Sie zur Einschränkung der Verdauung.
5. Anwendung von Multigenplasmiden für chromosomale oder plasmidbasierte Genexpression
- Integration von Multigenplasmid in das Hefegenom zur chromosomalen Genexpression (Abbildung 5)
- Entwerfen Sie eine Führungs-RNA (gRNA) für den gewünschten Ort. Die Verwendung mehrerer Onlineressourcen, z. B. Benchling, CRISPRdirect43und CHOPCHOP44, wird empfohlen, um die maximale Spezifität des Ziels zu bestimmen.
- Klonen Sie die synthetisierte 20-nt gRNA durch Klonen von Gibson in das pCAS-Plasmid45. Linearisieren Sie das pCAS-Plasmid durch PCR unter Verwendung eines umgekehrten Primer-Paares, das an das 3' des HDV-Ribozym bzw. die 5' der tracrRNA bindet (Abbildung 5). Alternativ klonen Sie die gRNA in das sgRNA-Dropout-Plasmid (pYTK050) und montieren Sie das Dropout-Plasmid mit Linkern zu einem Kassettenplasmid. Dann montieren Sie die Cas9 TU mit dem Cas9-Teilplasmid (pYTK036). Schließlich montieren Sie die Cas9 TU und die sgRNA TU zu einem replizierenden Multigenplasmid.
- Linearisieren Sie über Nacht 5-15 g integratives Multigen-Plasmid mit 1 L NotI-HF-Enzym. Transformieren Sie 1 g pCAS-gRNA und das linearisierte integrative Multigenplasmid in S. cerevisiae. Bereiten Sie kompetente Zellen entweder mit einem handelsüblichen Hefetransformationskit oder nach dem Protokoll von Geitz und Schiestl, 200746vor.
HINWEIS: Es ist unnötig, das linearisierte Multigenplasmid nach der NotI-Verdauung zu reinigen. - Pellet die Zellen nach der Erholung, entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie mit einem gleichen Volumen von Wasser. Plattenhefezellen auf der kompletten synthetischen Medium (CSM) Aussetzerplatte oder die Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medium (YPD)-Platte mit Antibiotika, abhängig vom selektiven Hefemarker. Bei 37 °C zwei Tage lang inkubieren, damit sich Kolonien bilden können. Falls keine Kolonie beobachtet wird, brüten Sie für weitere ein bis zwei Tage bei 30°C.
- Bildschirm HefeKolonien für die Integration durch Kolonie PCR47.
- Um das pCAS zu heilen, streifen Sie die Kolonie mit der richtigen Integration auf eine nicht-selektive YPD-Platte aus. Wachsen Sie bei 30 °C über Nacht. Streichen Sie eine Kolonie von der YPD-Platte auf eine frische YPD-Platte. Wieder wachsen bei 30 °C über Nacht. Streichen Sie eine Kolonie von der zweiten YPD-Platte auf eine YPD plus 100 g/ml Nourseothricin, den Selektionsmarker von pCAS. Eine erfolgreiche Aushärtung erfolgt, wenn Hefezellen nicht auf der selektiven Platte wachsen.
HINWEIS: Wenn das pCAS-Plasmid nicht in zwei Runden nicht-selektiver YPD ausgehärtet wird, streifen Sie für weitere 1-2 Runden erneut auf eine frische YPD.
- Transformierung des replizierenden Multigenplasmids für die Plasmid-basierte Genexpression
- Verwandeln Sie 100 ng-1 g reines Multigen-Plasmid in S. cerevisiae kompetente Zellen.
- Plattenhefezellen unmittelbar nach der Umwandlung auf die CSM-Aussetzerplatte oder YPD plus Antibiotikaplatte, abhängig von der verwendeten Hefeauswahlmarker. Bei 30°C für 2-3 Tage inkubieren, damit sich Kolonien bilden können.
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Representative Results
Hier die Ergebnisse von vier replizierenden Multigenplasmiden zur β-Carotin (gelb) und Lycopin (rot). Es wurde ein integratives Multigen-Plasmid zur Störung des ADE2-Lokus konstruiert, dessen Kolonien rot sind.
Klonen von CDS in den Eintragsvektor (pYTK001)
ERG20 wurde aus dem Hefegenom und den drei Carotinoidgenen crtE, crtYB, crtI aus dem Plasmid pLM49448 in den beschriebenen Eintragsvektor pYTK001 verstärkt. Die Hefepromotoren pENO2, pTIP1, pPYK1 und pPDC1 sowie die Terminatoren tTDH2, tHSP26, tADH2, tACS2 wurden als Teilplasmide geklont. Eine Punktmutation wurde in CrtYB (G247A) zur Herstellung von Lycopin eingeführt und ein BTS1-ERG20-Fusionskonstrukt wurde geschaffen, um das Prenyl-Zwischenprodukt besser zu Carotinoiden zu kanalisieren. Die Abbildungen 6A und 6B zeigen eine repräsentative Platte des erfolgreichen Klonens eines Teilplasmids und sind ein Beispiel für das grün-weiße Screening mit 90,35 ± 4,22% Gesamtkolonien potenziell korrekt (weiß).
Montage von Transkriptionseinheiten (Kassettenplasmide)
Vor der Zusammenstellung des Kassettenplasmids wurde das Design des Multigenplasmids abgeschlossen. Für die vier Carotinoid-TUs wurden zunächst vier Zwischenvektoren mit unterschiedlichen Anschlüssen nach Schritt 3.1 geklont. Die Abbildungen 6C und 6D zeigen eine repräsentative Platte aus einer erfolgreichen Montage des Zwischenvektors und sind ein Beispiel für das rot-grüne Screening, wobei 17,56 ± 3,32% der Gesamtkolonien positiv (grün) sind. Obwohl dieses Verhältnis relativ niedrig ist, wird das Screening durch die grüne Fluoreszenz erheblich erleichtert.
Als nächstes wurden die TUs für BTS1-ERG20, ERG20, crtE, crtYB, crtYB (G247A)und crtI nach Schritt 3.2 (Tabelle 1) montiert. Die Abbildungen 6E und 6F zeigen eine repräsentative Platte einer erfolgreichen Montage der TUs und sind ein Beispiel für ein grün-weißes Screening-Verfahren, wobei 65,02 ± 4,99 % der Gesamtkolonien positiv (weiß) sind.
Montage von Multigenplasmiden
Vier reproduzierte und ein integratives Multigenplasmide wurden zusammengesetzt. Für reproduzierbare Multigenplasmide wurden ERG20, BTS1-ERG20, crtE, crtYB, crtYB (G247A) und crtI in vier verschiedenen Kombinationen zusammengesetzt, wodurch vier Plasmide entstanden: zwei für β-Carotin und zwei für die Lycopinproduktion(Tabelle 2). Das Verhältnis der potenziell korrekten Kolonien (grün) für das Zwischenvektorklonen betrug 1,83 ± 0,15% (Abbildungen 7A und 7B). Obwohl diese Zahl gering erscheint, wurde das Screening durch die Erkennung der grünen Fluoreszenz erleichtert (Abbildung 7B). Nach dem Klonen des Zwischenplasmids betrug die Erfolgsrate der Zusammenstellung von Multi-Gen-Plasmiden (weiß) aus dem Zwischenprodukt 93,77± 1,65%(Abbildungen 7C und 7D). Die Abbildungen 7E und 7F zeigen eine suboptimale Zusammenstellung von Multigenplasmiden, da die Anzahl der positiven Kolonien (weiß) vernachlässigbar war. Nach der Umwandlung in Hefe wuchsen am dritten Tag Kolonien, die β-Carotin (gelb) und Lycopin (rot) produzierten. Vier Kolonien von jedem Teller wurden auf frische Teller gestreift und für zwei weitere Tage angebaut. Die Abbildungen 8A und 8B zeigen, dass die Verschmelzung des BTS1-ERG20 mehr Geranylgeranyl-Pyrophosphat in Richtung der Carotinoidproduktion lenkt, wie es bei dunkleren Farben der Fall ist, als die Verwendung des ERG20 allein. Bei der Extraktion49 und der Quantifizierung der Carotinoide durch UV-Vis-Spektrophotometrie mit authentischen Standards wird festgestellt, dass die Fusion von BTS1-ERG20 zur Produktion von 0,729 g/mg β-Carotin führt, was 35-mal höher als 0,021 g/mg β-Carotin ist, das allein durch den Stamm mit ERG20 erzeugt wird. Ebenso ist die Produktion von Lycopin mit BTS1-ERG20 (1,126 g/mg) um das 16,5-fache höher als allein mit ERG20 (0,068 g/mg)(Abbildung 8C).
Replicative Multigenplasmide in Hefe umgewandelt mit (A) BTS1-ERG20 Fusion TU und (B) ERG20 TU. Auf jeder Platte hat Hefe auf der linken Seite Plasmide, die crtE TU, crtYB TU und crtI TU zur Herstellung von β-Carotin und Hefe auf der rechten Seite enthalten, Plasmide enthalten, die crtE TU, crtYB (G247A)TU und crtI TU für die Herstellung von Lycopin enthalten.
Für das integrative Plasmid wurden die ConLS', sfGFP-Aussetzer, ConRE', HIS3 (Hefeauswahlmarker), ADE2 5' und 3' Homologiearme nach Schritt 4.1.2 zusammengesetzt. Die 5' und 3' Homologie arme waren 500 bp auseinander, Löschen von 180 Aminosäuren nach der Integration. Zusätzlich hatte der 5' Homologiearm sechs Stop-Codons gegen ende 3'. Die mutierte ADE2 führte zu roten Kolonien50. Die ADE2 gRNA 5'-ATTGGGAC GTATGATTGTTGAGG-3'51 wurden verwendet und folgten Schritt 5.1 für die genomische Integration. Nach 3-4 Tagen wurden rote Kolonien auf der YPD-Platte + 100 g/ml Nourseothricin beobachtet, was darauf hindeutet, dass ADE2 erfolgreich gestört wurde (Abbildungen 8D und 8E).
Abbildung 1:Übersicht über dieMultigen-Montage. Die Montage erfolgt auf drei Ebenen. In0 Level 1 wird das CDS oder ein anderer Teil aus dem Genom verstärkt oder synthetisiert und dann mit dem BsmBI-Enzym (oder Esp3I) in den pYTK001-Eintragsvektor geklont. ColE1: E. coli Ursprung der Replikation; CmR: Chloramphenicol resistentes Gen. In Stufe 2 wird die Transkriptionseinheit (TU) mit einem Promotor, einem CDS und einem Terminator mit dem BsaI-Enzym zusammengesetzt. In Stufe 3 werden bis zu fünf Transkriptionseinheiten mit dem BsmBI-Enzym (oder Esp3I) zu einem Multi-Gen-Plasmid zusammengesetzt. Das Multigen-Plasmid kann entweder replizierend oder integrativ sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Primer-Design und Klonen von Teilplasmiden. (A) Primer-Design zur Verstärkung einzelner Teile, Domestizieren von Genen oder Erstellen von Punktmutationen und Zusammenbau von Fusionsproteinen. Primer umfassen BsmBI- und BsaI-Erkennungs- und Schnittstellen sowie den MoClo-Überhang für die ordnungsgemäße Montage. MoClo-Überhänge sind als 1, 2, 3, 4 und 5, 6, 7, 8 dargestellt. Interne Primer zur Domestizierung oder Zur Schaffung von Fusionsproteinen enthalten das BsmBI, aber nicht die BsaI-Standorte. Die Überhänge hierfür sind angepasste interne Sequenzen (NNNN und N'N'N'N'N' in Violett). Terminal "ttt" sind für eine optimale Enzymverdauung enthalten. GOI: Gen von Interesse. (B) Klonen verstärkter Teile in den pYTK001-Eintragsvektor mit BsmBI (oder Esp3I). Ergänzende Überhänge führen zur Integration des Teils und zur Entfernung der BsmBI-Erkennungsstelle. ColE1: E. coli Ursprung der Replikation; CmR: Chloramphenicol resistentes Gen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3:Montage der Transkriptionseinheit. Zur Montage der TU-Plasmide wird die Montage eines Zwischenvektors empfohlen, um die kombinatorische TU-Montage zu erleichtern. Um den Zwischenvektor zusammenzusetzen, klonen Sie den Con LX (X: einer der fünf linken Anschlüsse), den sfGFP-Aussetzer, den Con RY (Y: einer der fünf rechten Konnektoren), einen Hefe-ORI (Replikationsursprung) und einen Hefemarkerteil mithilfe des BsaI-Enzyms in den mRFP1-Dropoutvektor. Das Zwischenplasmid ist resistent gegen Ampicillin. Die BsaI-Erkennungsstellen bleiben für das KLonen von TU-Plasmiden erhalten. Um das TU-Plasmid zu klonen, werden ein Promotor, ein CDS und ein Terminator mit BsaI in den Zwischenvektor zusammengesetzt. Die geklonte TU wird BsmBI-Standorte in den Regionen ConLX und ConRY für den nächsten Schritt multi-gene Assembly haben. Die geklonte TU ist auch resistent gegen Ampicillin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Namen | ConLX (linker Stecker) | Projektträger | Cds | Terminator | ConRY (rechter Stecker) |
| BTS/ERG20 Tu | Ls | pENO2 | BTS1/ERG20 | tTDH2 | R1 |
| ERG20 Tu | Ls | pENO2 | ERG20 | tTDH2 | R1 |
| crtE Tu | L1 | pTIP1 | crtE | tHSP26 | R2 |
| crtYB Tu | L2 | pPDC1 | crtYB | tADH2 | R3 |
| crtYBG247A Tu | L2 | pPDC1 | crtYBG247A | tADH2 | R3 |
| crtI Tu | L3 | pPYK1 | crtI | tACS2 | Re |
Tabelle 1: In dieser Studie verwendete Transkriptionseinheiten. Promoter und Terminatoren wurden von S. cerevisiaeverstärkt. BTS1 (Geranylgeranyl diphosphatsynthase) und ERG20 (Farnesylpyrophosphatsynthetase) wurden von S. cerevisiaeverstärkt. Die Gene crtE (Geranylgeranyl diphosphate synthase), crtYB (bifunktionale Lycopincyclase/Phytoensynthase) und crtI (Phytoendesaturase) stammten aus Xanthophyllomyces dendrorhous.
Abbildung 4:Multi-Gen-Plasmid-Baugruppe. (A) Replikierende Plasmid-Baugruppe. Die Montage des replizierenden Zwischenvektors umfasst das Klonen des Con LS', des sfGFP-Aussetzers, des Con RE', eines Hefe-ORI, eines Hefemarkers und eines E. coli-Ursprungs und Markers auf dem mRFP1-Dropoutvektor unter Verwendung des BsaI-Enzyms. Die ConLS- und ConRE-Sites führen BsmBI-Erkennungssites in den Vektor ein. Potenziell korrekte Baugruppen können gescreent werden, indem man auf einer selektiven Platte mit Kanamycin nach grünen Kolonien sucht. Die zuvor montierten TUs können dann mit dem BsmBI-Enzym in den Zwischenvektor geklont werden. Dieses Plasmid enthält ein Hefe-ORI, das es erlaubt, sich in einem Hefewirt zu replizieren. (B) Integrative Plasmid-Montage. Die Montage des integrativen Zwischenvektors umfasst das Klonen des Con LS', des sfGFP-Aussetzers, des Con RE', eines 5' Homologiearms, eines 3' Homologiearms, eines Hefemarkers und des E. coli-Ursprungs und Markers in den RFP-Dropout-Vektor mit dem BsaI-Enzym. Korrekte Baugruppen sollten grün auf einer selektiven Platte mit Kanamycin erscheinen. Zuvor hergestellte Transkriptionseinheiten können mit dem BsmBI-Enzym in den reproduktiven Zwischenvektor geklont werden. Dieser Vektor hat kein Hefe-ORI und wird durch CRISPR und homologe Rekombination in den Zielort integriert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Namen | TU1 | TU2 | TU3 | TU4 | Produkt |
| B/E-β-Carotin | BTS1/ERG20 | crtE | crtYB | crtI | β-Carotin |
| B/E-Lycopin | BTS1/ERG20 | crtE | crtYBG247A | crtI | Lycopin |
| E-β-Carotin | ERG20 | crtE | crtYB | crtI | β-Carotin |
| E-Lycopin | ERG20 | crtE | crtYBG247A | crtI | Lycopin |
Tabelle 2: In dieser Studie verwendete Multi-Gen-Plasmide.
Abbildung 5:CRISPR-Integration. (A) CRISPR und Helfer Plasmid Klonen. Das pCAS-Plasmid enthält die Cas9-Endonuklease und Komponenten (tRNA-Promotor, SNR52-Terminator, HDV-Ribozym und tracrRNA) für eine optimale Expression einer gRNA. Klonen Sie das pCAS+gRNA-Plasmid, indem Sie die synthetische gRNA mit dem linearisierten pCAS unter Verwendung von Gibson Klonen zusammenbauen. (B) CRISPR unterstützte die genetische Integration. Schritt 1: Kotransformation: pCAS +gRNA wurde mit dem integrativen Plasmid, das das(n) von Interesse eiternde Gen(e), einen selektiven Hefemarker und 5' und 3' Homologieregion auf den genomischen Ort abzielt, in Hefe umgewandelt. Für eine optimale Integration linearisieren Sie das integrative Plasmid mit NotI. Schritt 2: Integration am Zielort: Anbau der transformierten Hefe auf einer Platte selektiv für den Hefemarker, entweder Antibiotikum oder Auxotroph. Führen Sie Genotypisierung durch, um die Integration zu bestätigen. Schritt 3: Heilen Sie das pCAS + gRNA Plasmid, indem Sie Hefe auf einer nicht-selektiven Platte streichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Repräsentative Platten des Klonens von Eingangsvektoren und Transkriptionseinheiten in E. coli. Repräsentative Platten des erfolgreichen Klonens eines Gens in den Einstiegsvektor pYTK001 unter (A) sichtbares Licht und (B) UV-Licht. Positive Kolonien sind weiß und negative Kolonien sind grün. Das Verhältnis der positiven Kolonien insgesamt beträgt 90,35 ± 4,22 %. Erfolgreiche Montage des Zwischenvektors für Transkriptionseinheitsebene und grün/rote Auswahl unter (C) sichtbares Licht und (D) UV-Licht. Positive Kolonien sind grün. Das Verhältnis der positiven Kolonien insgesamt beträgt 17,56 ± 3,32 %. Erfolgreiche Montage der Transkriptionseinheit aus dem Zwischenvektor und grün/weiß Screening unter (E) sichtbares Licht und (F) UV-Licht. Positive Kolonien sind weiß und negative Kolonien sind grün. Das Verhältnis der positiven Kolonien insgesamt beträgt: 65,02 ± 3,32 %. Die Daten stammen aus drei biologischen Repliken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Repräsentative Platten des Multigenplasmidklonens in E. coli. Aufbau des Zwischenvektors für die Multigen-Ebene Baugruppe und rot/grüne Auswahl unter (A) sichtbares Licht und (B) UV-Licht. Positive Kolonien sind grün und negative Kolonien rot. Das Verhältnis der positiven Kolonien insgesamt Kolonien ist 1,83 ± 0,15%. Erfolgreiche Montage mehrerer TUs aus dem Zwischenvektor und grün/weiß Auswahl (C) unter sichtbarem Licht und (D) UV-Licht. Positive Kolonien sind weiß. Das Verhältnis der positiven Kolonien insgesamt Beträgt 93,77 ± 1,65%. Suboptimale Montage von Multigenplasmid unter (E) sichtbares Licht und (F) UV-Licht. Die Zahl der positiven Kolonien ist vernachlässigbar. Die Daten stammen aus drei biologischen Repliken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Repräsentative Platten integrativer und repromittativer Plasmide in Hefe. Replicative Multigenplasmide in Hefe umgewandelt mit (A) BTS1-ERG20 Fusion TU und (B) ERG20 TU. Auf jeder Platte hat Hefe auf der linken Seite Plasmide, die crtE TU, crtYB TU und crtI TU zur Herstellung von β-Carotin und Hefe auf der rechten Seite enthalten, Plasmide enthalten, die crtE TU, crtYB (G247A)TU und crtI TU für die Herstellung von Lycopin enthalten. (C) Quantifizierung β-Carotin und Lycopin aus Hefeextrakt mit vier Multigenplasmiden mit einem UV-Vis-Spektrometer. Die maximale Absorption wurde bei 450 nm bzw. 470 nm für β-Carotin bzw. Lycopin aufgezeichnet. Die absolute Quantifizierung erfolgte nach authentischen Standards (Zusatzabbildung S3). Die Fusion von BTS1-ERG20 führt zur Produktion von 35-fach höherem β-Carotin und 16,5-fach höherem Lycopin im Vergleich zu ERG20 allein. Repräsentative Platten für die Störung des ADE2-Lokus durch die Integration eines multigenintegrativen Plasmids mit einer gRNA und keine Helfer-DNA (D) und mit gRNA und einem multigenintegrativen Plasmid als Helfer-DNA (E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das von Lee et al. entwickelte MoClo-basierte Klonkit bietet eine hervorragende Ressource für die schnelle Montage von ein bis fünf Transkriptionseinheiten in ein Multi-Gen-Plasmid, entweder für die Replikation oder Integration in das Hefegenom. Die Verwendung dieses Kits eliminiert den zeitaufwändigen Klonengpass, der häufig für die Exklamierung mehrerer Gene in Hefe besteht.
Wir haben fünf verschiedene Bedingungen für die Verdauungs-/Ligationszyklen des Golden Gate Klonens mit T4 DNA Ligase getestet. Wir fanden heraus, dass 30 Zyklen der Verdauung bei 37 °C für 5 min und Ligation bei 16 °C für 5 min gefolgt von einem letzten Verdauungsschritt bei 50 °C für 10 min und einem Protein-Inaktivierungsschritt bei 80 °C für 10 min zu 99,5% Kolonien führten, die in einer 4-teiligen Baugruppe potenziell korrekt waren (Zusatzabbildung S1 und Tabelle S3). Ligande bei 16 °C sorgt für optimale Ligaseaktivität und Überhangglühen. Die Endverdauung bei 50 °C verhindert eine Religation der verdauten Produkte. Dieser Zyklus wurde für alle Montagereaktionen befolgt, sofern nicht anders angegeben.
Wir haben auch einige kritische Schritte gefunden, die besondere Aufmerksamkeit für optimale Ergebnisse erfordern. Wir empfehlen dringend, Zwischenvektoren mit dem sfGFP-Aussetzer zusammenzusetzen, bevor Transkriptionseinheiten zusammengemontmt werden. Theoretisch können alle sieben Teile mit dem mRFP1 in den E. coli-Vektor geklont werden, gefolgt von einem rot-weißen Screening. In der Praxis entwickelt mRFP1 jedoch sehr langsam Farbe und es ist schwierig, zwischen blassroten und hellgelben E. coli-Kolonien unter sichtbarem Licht zu unterscheiden. Da sfGFP im UV-Bereich52absorbiert, erleichtert die Verwendung eines UV- oder blaulichttransilluminaators das Screening auf hellgrüne Kolonien. Außerdem ermöglicht das Klonen eines Zwischenvektors eine einfachere Montage der verschiedenen Promoter-, CDS- und Terminator-Kombinationen, was eine einfachere kombinationskombinierte Bibliothekserstellung ermöglicht, da eine Baugruppe mit vier Teilen in der Regel zu positiveren Kolonien führt als eine Baugruppe mit mehr Teilen. Ergänzende Abbildung S2 zeigt eine fortschreitende Abnahme des Verhältnisses von potenziell korrekten Kolonien von einer 6-teiligen zu einer 8-teiligen Baugruppe.
Die Konzentrationen aller Teile müssen sorgfältig gemessen werden, um die Äquimolarkonzentration jedes Teils zu gewährleisten. Die Quantifizierung von Teilen mit einem UV-Vis-Spektrometer ist in der Regel ausreichend, aber empfindlichere Methoden, wie z. B. fluoreszenzbasierte Assays, können bessere Ergebnisse liefern. Wenn nicht alle Teile genau quantifiziert werden, führt dies häufig zu einer geringen Montageeffizienz. Man sollte die hocheffizienten Esp3I bzw. BsaI-HFv2 wählen. Wir haben beobachtet, dass T4 gut funktioniert für beide Überhänge im Kit und kundenspezifische Überhänge sind notwendig, um zwei Teile zu verschmelzen, die mit Literatur36übereinstimmt, obwohl das Originalpapier T7 ligase6empfohlen. Die Erhöhung der Anzahl der Zyklen kann die Anzahl der potenziell korrekten Kolonien bis zu einem gewissen Grad erhöhen. Zum Beispiel, 25 Zyklen der Verdauung und Ligation sind genug, um drei bis vier Teile zu montieren, aber 30-35 Zyklen liefern bessere Ergebnisse für mehr Teile.
Die MolClo-Strategie ist vorteilhaft gegenüber alternativen mehrteiligen Montagemethoden8,9,10,11,12, da sie modulares und sehr vielseitiges Klonen ermöglicht. Die primäre Einschränkung ist jedoch der Domestizierungsschritt, da Teile manchmal mehrere BsmBI-, BsaI- oder NotI-Sites haben. Das Mutieren aller Teile kann zeitaufwändig sein. In diesem Fall kann man erwägen, das CDS ohne diese Einschränkung Sonden zu synthetisieren. Bei Promotern und Terminatoren kann jedoch die Mutation selbst eines einzelnen Nukleotids ihre Funktionalität ändern. Daher wird empfohlen, die Aktivität dieser Teile mit einem Reporter-Assay zu validieren39. Eine weitere Einschränkung ist, dass dieses Kit nur bis zu fünf Transkriptionseinheiten in einem Multi-Gen-Plasmid zulässt. Wenn mehr Transkriptionseinheiten gewünscht werden, können zusätzliche Anschlüsse durch Auswahl eines Satzes hochkompatibler Überhänge36erstellt werden.
Das Kit bietet 27 Promotoren, sechs Terminatoren, sieben Hefeauswahlmarker und zwei Hefe-Ursprung der Replikationen. Angepasste Teile, z. B. native oder synthetische Promotoren und Terminatoren, können nach diesem Protokoll in den Eintragsvektor geklont werden. Das Hefe-MoClo-Kit wurde in erster Linie zur Überexzessiz von Multi-Gen-Stoffwechselwegen verwendet, um hochwertige Chemikalien in Hefe zu produzieren. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, wenn verschiedene Schalter für biologische Schaltungen in Hefe gewünscht werden. Es gibt auch ein enormes Potenzial, dieses Kit für die Untersuchung grundlegender biologischer Fragen über Protein-Protein-Wechselwirkungen, Proteinlokalisierung und Enzymaktivitäten anzuwenden. Insgesamt ist dieses Protokoll äußerst flexibel und zuverlässig und kann jedes anspruchsvolle Klonen in der Hefebiologie unterstützen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Research Foundation for the State University of New York (Preis Nr. 71272) und dem IMPACT Award der University at Buffalo (Preis Nr.: 000077) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
| Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
References
- Endy, D.
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553 (2009).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5 (2008).
- Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622 (2011).
- Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892 (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55 (2007).
- de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
- Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16 (2009).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185 (2018).
- Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
- Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
- Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
- Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123 (2017).
- Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
- Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
- Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
- Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
- Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131 (2019).
- Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965 (2018).
- Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker's yeast. Nature Communications. 8, 15202 (2017).
- Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
- Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
- Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
- Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932 (2019).
- Engler, C., Sylvestre, M. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. 1116, Humana Press. Ch. 9 119-131 (2014).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
- Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, Pt 1 263-273 (1986).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
- Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
- Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931 (2018).
- Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
- Jones, E., et al. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast 181 (1982).
- Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
- Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750 (2014).
