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Bioengineering

使用模块化金门克隆的多基因结构快速组装

Published: February 5, 2021 doi: 10.3791/61993
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biological Sciences, University at Buffalo, State University of New York
* These authors contributed equally

Summary

该协议的目标是提供一个详细的，分步指南，以组装多基因结构使用模块化克隆系统的基础上，金门克隆。它还根据我们的经验就确保最佳装配的关键步骤提出了建议。

Abstract

金门克隆法使多个基因在任何用户定义的排列中能够快速组装。它使用 IIS 型限制酶，这些酶在识别站点之外切开，并创建短悬架。此模块化克隆 （MoClo） 系统使用分层工作流，其中不同 DNA 部分（如发起器、编码序列 （CDS） 和终结者）首先被克隆到条目载体中。然后，多个入口载体组装成转录单元。几个转录单元然后连接到多基因质粒。金门克隆战略具有巨大的优势，因为它允许无疤痕、定向和模块化组装在一锅反应中。分层工作流通常能够对多种多基因构造进行传真克隆，无需在进入载体之外进行测序。荧光蛋白的使用使视觉筛查变得简单。这项工作提供了一个详细的，分步协议，使用酵母模块化克隆（MoClo）套件组装多基因质粒。我们展示了多基因质粒组装的最佳和次优结果，并为菌落的筛选提供了指南。这种克隆策略非常适用于酵母代谢工程和其他需要多基因质粒克隆的情况。

Introduction

合成生物学旨在设计具有对制药、农业和化学工业有用的新功能的生物系统。以高通量方式组装大量DNA片段是合成生物学的基础技术。这样一个复杂的过程可以分解成多个层次，降低复杂性，一个概念借用的基础工程科学1，2。在合成生物学中，DNA片段通常根据功能分层组装：（一） 部分级别："部分"是指具有特定功能的 DNA 片段，如发起人、编码序列、终结者、复制来源：（二） 转录单位（TU）水平：TU由发起人、编码序列和能够转录单个基因的终结者组成：（三） 多基因水平：多基因质粒包含多个 TUs，通常由整个代谢通路组成。这种由BioBrick社区开创的分层组装是合成生物学3中大型DNAs组装的基础概念。

在过去的十年里，金门克隆技术极大地促进了分层DNA组装2。许多其他多部分克隆方法，如吉布森克隆8，结扎独立克隆（SLIC）9，尿素切除为基础的克隆（用户）10，韧带循环反应（LCR）11，并在体内重组（DNA组装）12，13，也已开发至今。但金门克隆是一种理想的DNA组装方法，因为它独立于基因特异性序列，允许无疤痕、定向和模块化组装在单锅反应中。金门克隆利用IIS型限制酶，识别非单体序列，在识别站点2外产生交错悬垂。然后，一个韧带加入退化的DNA片段，以获得一个多部分的组装。将这种克隆策略应用于模块化克隆（MoClo）系统，使多达10个DNA片段得以组装，90%以上的转化器被筛选出含有正确组装的构造4。

MoClo 系统提供了巨大的优势，加速了合成生物学的设计构建测试周期。首先，可互换部件使组合克隆能够快速测试大量的参数空间。例如，优化代谢通路通常需要循环通过每个基因的许多促进器来平衡通路通量。MoClo 系统可以轻松地处理如此苛刻的克隆任务。其次，需要对部分质粒进行排序，但通常不是TU或多基因质粒。在大多数情况下，通过菌落 PCR 或限制消化进行筛查足以在 TU 和多基因质粒水平上进行验证。这是因为克隆部分质粒是唯一需要PCR的步骤，它经常引入突变。第三，MoClo系统是构建多基因复杂代谢通路的理想之选。最后，由于普遍悬垂，部分质粒可以重复使用，并与整个生物工程社区共享。目前，MoClo套件可用于植物14，15，5，16，17，真菌6，18，19，20，21，22，细菌7，23，24，25，26，27和动物28，29。一个多王国的MoClo平台也于最近30日推出。

对于糖精，李等人已经开发出一种多才多艺的MoClo工具包，这是酵母合成生物学界的极好资源。该套件采用方便的 96 井格式，定义了八种类型的可互换 DNA 部件，包括各种功能良好的促进剂、荧光蛋白、终结者、肽标签、选择标记、复制源和基因组编辑工具。此工具包允许将多达 5 个转录单元组装成多基因质粒。这些功能对于酵母代谢工程很有价值，在酵母代谢工程中，部分或整个途径被过度表达以产生有针对性的化学物质。利用这个工具包，研究人员优化了杰拉尼奥尔、利纳洛尔31、青霉素32、粘液酸33、蓝蓝34和酵母β35的生产。

在这里，我们提供详细的分步协议，以指导使用 MoClo 工具包生成表皮或基因组表达的多基因通路。通过广泛使用这个工具包，我们发现，DNA浓度的准确测量是确保金门反应中每个部分的等价分布的关键。我们还建议T4DNA韧带超过T7DNA韧带，因为前者更好地工作与更多的悬垂36。最后，BsmBI 和 BsaI 的任何内部识别站点必须在组装前删除或驯化。或者，可以考虑合成部件以删除多个内部站点，并实现同步的 codon 优化。我们演示了如何使用这个工具包，表达一个五基因通路，用于β胡萝卜素和番茄红素生产在 塞雷维西亚。 我们进一步展示如何使用本套件中的基因组编辑工具敲除 ADE2 轨迹。这些基于颜色的实验被选为易于可视化的实验。我们还演示了如何产生融合蛋白，并利用金门克隆产生氨基酸突变。

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Protocol

注：本工具包中提供的分层克隆协议可分为三个主要步骤：1. 克隆部分质粒：2. 克隆转录单位（TUs）：3. 克隆多基因质粒（图1）。此协议从入门设计开始，以克隆多基因质粒的应用结束。

1. 克隆部分质粒（pYTK001） 的引金设计：

  1. 设计包含侧翼核苷酸 TTT 的前进和反向底漆，这是一个具有额外核苷酸 （CGTCTCN） 的 BsmBI 识别站点，一个 4 核苷酸 （nt） 悬垂 （TCGG） 与入口载体的重叠 （TCGG） 相补充， BsaI 识别站点具有额外的核苷酸 （GGTCTCN） 和 4 nt 部分特定悬架，此外还有模板特定序列（图 2A）。金布拉德 4.037 和金图尼西斯 38 是一些在线软件， 可用于金门特定的引言设计。
  2. 如果 BsaI 或 BsmBI 识别站点存在任何部分，请在金门大会39之前使用驯化步骤改变这些站点。对于集成质粒（参见第 4 步），驯化任何 NotI 识别站点。将一部分与一个不良识别站点驯化，将该部分分成两个子部分，靠近不良网站（图2A）：
    1. 以与步骤 1.1 相同的方式设计第一个子部分的前进引金。但设计反向引座与BsmBI网站和4nt基因特异性悬垂只。
    2. 设计第二个子部分前向引座与 BsmBI 站点和 4 nt 基因特异性悬垂只有重叠与第一个子部分的反向引引号。以与步骤 1.1 相同的方式设计第二个子部分的反向引号。
    3. 在引号的基因特定区域，在反向（第 1.2.1 步）或前向引金（步骤 1.2.2）中引入所需的突变。
      注：或者，BsmBI 和 BsaI 无和科顿优化部分可以进行商业合成。对于编码序列（CDS），同义突变可以很容易地结合在氨基酸科顿的第三核苷酸。然而，对于发起人和终结者，建议使用记者分析检查变异的发起人或终结者活动。如果序列末尾有不良限制站点，则可以使用较长的反向引物进行变异。如果存在多个不良网站，则允许突变多个站点的站点定向突变可能会执行40个。
  3. 偶尔，将两种蛋白质与中间的链接器融合为单个部分是可取的（图2A）。该链接器有助于确保两种单个蛋白质41的结构完整性。
    1. 第一个基因的前引因与步骤 1.1 相同。在反向引座中，包括 BsmBI 站点、4 nt 基因特异性悬垂和链接器序列。4 nt悬垂可以是链接器或第二基因的前几个核苷酸。
    2. 对于第二个基因，设计前引因，使其具有 BsmBI 识别位点和 4 nt 悬垂补充第一个基因的反向引因。将第二个基因的反向引引器设计为步骤 1.1。
  4. 要通过聚合酶链反应 （PCR）42放大部件，请使用高保真脱氧核糖核酸聚合酶放大基因组脱氧核糖核酸、cDNA 或质粒中的部件。在 1% 的蔗糖凝胶上检查 PCR 产品，然后进行凝胶净化。强烈建议使用纯化脱氧核糖核酸，如果凝胶纯化是费力的，至少使用旋转柱来净化PCR产品。

2. 将零件克隆到进入载体 （pYTK001） 以创建部分质粒 （图 2B）

  1. 要设置金门反应组合，添加每个 PCR 产品和入口矢量 （pYTK001） 的 20 fmol、10X T4 韧带缓冲器的 1μL、Esp3I 的 0.5μL（BsmBI 的高效异构体）和 0.5μL 的 T4 韧带。添加ddH2O，使总容量达到10μL。
  2. 要建立克隆反应，请在恒温器中运行以下程序：25-35 个周期，37 °C，持续 5 分钟（消化）和 16 °C 5 分钟（液化），然后在 50 °C 进行最终消化 10 分钟，酶在 80 °C 下灭活 10 分钟。
    注：当将多个DNA片段同时克隆到进入载体时，例如在克隆融合基因或驯化基因期间，建议进行35个周期的消化/配结。
  3. 通过热冲击将整个反应混合物转化为DH5+菌株或等效 的大肠杆菌 化学能力细胞。建议将整个 10 μL 克隆产品转换为 35 μL 化学能力 大肠杆菌 细胞（2 X 105 cfu/mL，从将 5 ng pYTK001 转换为主管细胞的 100 μL 计算 cfu）。铺在溶酶体汤 （LB） 板上，含有 35 微克/毫升氯霉素 （Cm）。在37°C的夜间孵化。
  4. 16-18小时后，将盘子从孵化器中取出，并将板保持在4°C约5小时，让超级文件夹绿色荧光蛋白（sfGFP）发展为更强烈的绿色。
  5. 为了便于筛选，将板放在紫外线 （UV） 或蓝光透光器上。含有菌落的sfGFP会在紫外线下荧光。
  6. 绿色殖民地是负面的，因为它们包含未切割的 pYTK001。白人殖民地可能是积极的。克隆通常是成功的，如果有约30-100%的白色殖民地。通过菌落 PCR 或限制消化（建议酶：BsaI-HFv2）对几个白色菌落进行进一步筛查。
  7. 从几个可能正确的殖民地净化斑块，并通过桑格测序确认序列。

3. 将部分质粒组装成"盒式"质粒

注：盒式质粒包含用户定义的转录单元 （TU），由发起人、CDS 和终结者组成。盒式质粒允许单个基因的表达。如果盒式质粒将组装成多基因质粒，那么第一步是确定多基因质粒中 TUs 的数量和顺序。这些将决定在盒式质粒中使用哪些连接器，因为连接器链接多基因质粒中的 TUs。第一个 TU 的左连接器应该是 ConLS，最后一个 TU 的右连接器应该是 ConRE 。它们将与康尔斯和康雷的多基因质粒重叠。其余的连接器应处于不断增加的数字顺序中。例如，如果多基因质粒包含四个 TUs，则连接器组合为康尔斯-TU1-ConR1、康尔1-TU2-康瑞尔 2、康尔2-TU3-康瑞和康尔3-TU4-ConRE（图 1）。

  1. 在组装转录单元之前，建议使用以下六个部分组装中间载体：左连接器、sfGFP 辍学 （pYTK047）、右连接器、酵母选择标记、复制酵母源和具有mRFP1、大肠杆菌原产地和抗双霉素基因 （pYTK083） （图 3）的部分质粒。
    1. 净化上述六个质粒。使用紫外线-维斯光谱仪或荧光测定记录其浓度，并用ddH2O稀释每个质粒，使1μL具有20毫升的DNA。使用在线计算器计算DNA摩尔浓度。
      注：准确测量DNA浓度并精确输送以使组件工作非常重要，尤其是对于具有五到七个部分质粒的组件。每个质粒的DNA浓度小错误可导致克隆效率显著降低。
    2. 添加每个质粒的 1μL、1 μL 的 10X T4 韧带缓冲器、0.5 μL 的 BsaI-HFv2（BsaI 的高效版本）和 0.5 μL 的 T4 韧带。通过添加ddH2O将音量放大到10μL。
    3. 要设置克隆反应，请在恒温器中运行以下程序：25-35 个周期，37 °C，持续 5 分钟（消化），16 °C 5 分钟（液化）。省略最终的消化和热灭活步骤，因为 BsaI 站点需要保留在中间矢量（图 3）中。
    4. 将整个反应组合转换为DH5+菌株或其他大 肠杆菌 能力细胞。铺在 LB 板上，含 50 微克/毫升苯甲酸素 （Cb） 或安比西林。在37°C的夜间孵化。
      注：卡本西林是安培林的一个稳定的模拟。
    5. 16-18小时后，将盘子从孵化器中取出。该板块将包含淡红色和淡绿色殖民地（图6C和6D）。将板保持在4°C约5小时，让mRFP1和sfGFP成熟。使用紫外线或蓝光透光器识别绿色殖民地，其中包含可能正确的中间载体。
    6. 在LB+Cb板上划出绿色殖民地，并在37°C的夜间孵化。第二天，在LB+Cm板上再次出现，并在37°C的夜间孵化。生长在LB+Cm板上的菌落含有组装不当的质粒，因为保留了抗Cm部分载体。
    7. 选择在LB +Cm板上不生长的菌落，并进行限制消化（建议酶：BsaI-HFv2，Esp3I），以确认正确组装的质粒。或者，使用殖民地 PCR 进行筛查。
  2. 中间向量成功组装后，下一步是组装转录单元。这是一个4件装配，具有以下部分：中间矢量、发起人、CDS 和终结者。
    1. 净化四部分质粒。记录其浓度并稀释每个质粒，使 1 μL 具有 20 fmol 的 DNA。
    2. 要设置反应组合，请按照步骤 3.1.2 执行。
    3. 要设置克隆反应，请按照步骤 2.2 执行。
    4. 将整个克隆反应混合物转换为 DH5® 或相当于 LB + Cb 上的 大肠杆菌 称职细胞和板，在 37 °C 的夜间孵化。
    5. 16-18小时后，从孵化器取出盘子。白色和淡绿色的殖民地将出现（图6E和6F）。将盘子保持在4°C左右5小时，让sfGFP成熟。使用紫外线或蓝光半透明灯识别非荧光白色菌落。这些包含可能正确的转录单元。
    6. 条纹和成长8-10个白色殖民地，并执行殖民地PCR。净化来自殖民地的质粒，这些斑块从殖民地PCR检测呈阳性。进行限制消化（建议酶：Esp3I），以进一步确认组装。
      注意：测序转录单元通常没有必要，因为克隆只涉及限制消化和结膜。所有感兴趣的序列已在部分质粒级别得到确认。

4. 将盒式磁带拼贴成"多基因"质粒：

注：多基因质粒允许多个基因的表达。根据下游应用，多基因质粒可以复制或集成。复制质粒具有复制的酵母来源：因此，当酵母细胞分裂时，它可以稳定地维持。整合质粒没有复制的酵母来源。相反，它们有5'和3'的同源性手臂，允许通过同源重组将多个基因整合到基因组的特定部位。

  1. 对于多基因质粒，首先组装中间载体。
    1. 要组装复制的中间矢量（图 4A），组装以下六个部分：左连接器 （ConLS'-pYTK008）、sfGFP 辍学 （pYTK047）、右连接器 （ConRE'-pYTK072）、酵母选择标记、 复制的酵母来源，与mRFP1， 复制大 肠杆菌 起源，和耐卡纳霉素基因（pYTK084）的部分质粒。
      1. 对于装配，请按照步骤从 3.1.1 到 3.1.3。
      2. 将整个克隆反应混合物转换为DH5®或等效 大肠杆菌 称职细胞，在LB上将板加50微克/毫升卡那霉素（Km）。在37°C的夜间孵化。
      3. 对于基于红色/绿色的筛选，请按照步骤 3.1.5 进行。
      4. 用于筛选错误组合，在 LB + Km 板上条纹并生长绿色菌落。然后按照步骤3.1.6。
    2. 对于综合多基因载体（图4B），先确定感兴趣的基因组轨迹，然后设计大约500个5'和3'同源性手臂碱基对，以整合到该轨迹。
      1. 将酵母基因组DNA中的5'和3'同源性手臂克隆到入口载体-pYTK001中。按照步骤1和2。
      2. 组装以下七个质粒：左连接器（康尔斯-pYTK008）、sfGFP辍学（pYTK047）、右连接器（康瑞-pYTK072）、酵母选择标记、 3'同源性手臂，与mRFP1，复制大肠杆菌起源， 和卡那霉素耐药基因（pYTK090）和5'同源性手臂的质粒部分。
      3. 对于组装和筛选，请按照步骤 4.1.1 执行。
  2. 多基因质粒的组装
    1. 净化步骤 4.1 中获得的中间载体的质粒和第 3 步获得的盒式质粒。使用紫外线-视觉光谱仪或荧光测定记录其浓度。在ddH2O中稀释每个，使1μL具有20个fmolDNA。
    2. 添加 1μL 的中间矢量、每个转录单元的 1 μL、1 μL 的 10x T4 连气缓冲器、0.5μL 的 Esp3I 和 0.5 μL 的 T4 连气。将使用ddH2O的音量调至10μL。
    3. 要设置克隆反应，请按照步骤 2.2 执行。
    4. 将整个克隆反应混合物转换为DH5+或等效 大肠杆菌 称职细胞，并在LB+Km.孵化板上过夜37°C。
    5. 按照步骤 3.2.5 执行绿色/白色筛选。
    6. 净化几个白色菌落的质粒，并进行限制消化。建议使用 NotI-HF 酶，因为 大肠杆菌 原产地和 Km 选择标记部分分别有两个 NotI 站点（图 4B）。如果组装的质粒非常大，则可以选择另一个限制站点进行进一步确认。或者，在进行限制消化之前，使用殖民地 PCR 进行筛选。

5. 应用多基因质粒进行染色体或质粒基基因表达

  1. 将多基因质粒整合到酵母基因组中，用于染色体基因表达 （图 5）
    1. 为所需的轨迹设计一个指南RNA（gRNA）。建议使用多个在线资源，如本布林、CRISPR 直流43和 CHOPCHOP44，以确定目标特异性的最大值。
    2. 克隆合成的20nt gRNA到pCAS质粒45 由吉布森克隆。通过 PCR 将 pCAS 质粒线性化，使用与 HDV ribozyme 的 3' 和 5' 分别绑定的倒置引物对 （图 5）。或者，将 gRNA 克隆到 sgRNA 辍学质粒 （pYTK050）， 并将辍学的质粒组装成带链接器的盒式质粒。然后用 Cas9 部分质粒 （pYTK036） 组装 Cas9 TU。最后，将 Cas9 TU 和 sgRNA TU 组装成复制的多基因质粒。
    3. 线性化 5-15 μg 的集成多基因质粒与 1 μL 的 NotI-HF 酶过夜。将 1μg 的 pCAS-gRNA 和线性集成多基因质粒转换为 S. cerevisiae。准备称职的细胞使用市售酵母转化套件或遵循盖茨和席斯特尔的协议，2007年46年。
      注意：在 NotI 消化后，没有必要纯化线性多基因质粒。
    4. 回收后将细胞颗粒化，丢弃超自然体，用等量的水清洗。完全合成介质 （CSM） 辍学板上的板酵母细胞或含有抗生素的酵母提取物肽脱xtrose介质 （YPD） 板，具体取决于酵母选择性标记。在37°C孵化两天，形成殖民地。如果未观察到任何殖民地，在 30°C 下再孵育一到两天。
    5. 屏幕酵母菌群由殖民地PCR47集成。
    6. 要治愈 pCAS，在非选择性 YPD 板上正确集成，将菌落划出。在30°C的夜间生长。将一个菌落从 YPD 板条纹到新鲜的 YPD 板上。同样，在30°C的夜间增长。将殖民地从第二个 YPD 板条纹到 YPD 加 100μg/mL 努尔索西林，这是 pCAS 的选择标记。当酵母细胞不能在选择性板上生长时，就会发生成功的固化。
      注意： 如果 pCAS 质粒在两轮非选择性 YPD 中未固化，则再次在新鲜的 YPD 上进行 1-2 轮。
  2. 将复制的多基因质粒转换为质粒基基因表达
    1. 将 100 ng-1 μg 纯多基因质粒转化为 S. cerevisiae 称职细胞。
    2. 板酵母细胞在转换到CSM辍学板或YPD加抗生素板后立即，取决于使用的酵母选择标记。在30°C孵化2-3天，形成殖民地。

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Representative Results

这里的结果是四个复制的多基因质粒为β胡萝卜素（黄色）和番茄红素（红色）生产。建造了一个用于破坏 ADE2 轨迹的综合多基因质粒，其殖民地是红色的。

将 CDS 克隆到输入载体 （pYTK001）
ERG20从酵母基因组和三个类胡萝卜素基因crtE，crtYB，crtI从质粒plM49448放大到条形载体pYTK001如所述。 酵母促进剂pENO2，pTIP1，pPYK1和pPDC1和终结者tTDH2，tHSP26，tADH2，tACS2被克隆为部分质粒。在CrtYB（G247A）中引入了一个点突变来生产番茄红素，并创建了BTS1-ERG20融合结构，以更好地将前额介质引导到类胡萝卜素。数字 6A 和 6B显示了部分质粒成功克隆的代表性板，并提供了绿色/白色筛选的示例，90.35 ± 4.22% 的菌落总数可能是正确的（白色）。

转录单元的组装（盒式平板）
在组装盒式质粒之前，多基因质粒的设计已经完成。对于四个类胡萝卜素 TUs，在步骤 3.1 之后首先克隆了四个具有不同连接器的中间向量。 图 6C 和 6D显示了中间矢量成功组装的代表性板，并提供了红色/绿色筛选示例，17.56 ± 3.32% 的菌落总数为正（绿色）。虽然这个比例相对较低，但绿色荧光大大促进了筛查。

接下来，BTS1-ERG20、ERG20、crtE、crtYB、crtYB（G247A）和crtI的TU在步骤3.2（表1）之后组装。 数字 6E 和 6F显示了 TUs 成功组装的代表性板，并提供了绿色/白色筛选方法的示例，65.02 ± 4.99% 的菌落总数为阳性（白色）。

多基因质粒的组装
组装了四个复制和一个综合多基因质粒。对于复制的多基因质粒，ERG20、BTS1-ERG20、crtE、crtYB、crtYB （G247A）和crtI被组装成四种不同的组合，形成四种质粒：两种用于β胡萝卜素，两种用于番茄红素生产（表2）。 中等向量克隆的潜在正确菌落（绿色）比率为1.83±0.15%（图7A和7B）。虽然这个数字似乎很低，但通过检测绿色荧光（图7B），筛查变得容易。中间质粒克隆后，从中间组装多基因质粒（白色）的成功率为93.77±1.65%（图7C和7D）。图7E和7F显示多基因质粒的组装不尽如人意，因为阳性菌落（白色）的数量可以忽略不计。在转化为酵母后，生产β胡萝卜素（黄色）和番茄红素（红色）的菌落在第三天生长。每个盘子里有四个菌落被划到新鲜的盘子上，再长两天。数字 8A 和 8B显示，将BTS1-ERG20融合在一起，可将更多的杰拉尼根基-翼磷酸盐引向类胡萝卜素生产，从较深的颜色来看，比单独使用ERG20更明显。通过UV-Vis光谱光谱测量提取49和量化类胡萝卜素与正宗标准， 人们看到，BTS1-ERG20的融合导致生产0.729微克/毫克的β胡萝卜素，这是+35倍，比0.021微克/毫克β胡萝卜素产生的菌株与ERG20单独。同样，番茄红素的产量是+16.5倍的应变与BTS1-ERG20 （1.126μg/mg） 相比，仅ERG20（0.068微克/毫克）（图8C）。

复制的多基因质粒转化为酵母与 （A） BTS1-ERG20 融合 TU 和 （B） ERG20 TU.每个盘子上，左侧的酵母都有含有 crtE TU、crtYB TU 和 crtI TU 的质粒，用于生产β-右侧的胡萝卜素和酵母有含有 crtE TU、crtYB （G247A） TU 和用于生产番茄红素的质粒。

对于集成质粒，ConLS'， sfGFP 辍学， ConRE'， HIS3 （酵母选择标记）， ADE2 5' 和 3' 同源性武器组装后步骤 4.1.2.5' 和 3' 同源臂相距 500 bp，集成后删除约 180 个氨基酸。此外，5'同源臂有6个停止科顿接近其3'结束。变异的ADE2导致红色殖民地50。使用ADE2 gRNA 5'-阿特加克·格拉特加特加格-3'51用于基因组集成，并遵循步骤5.1。3-4天后，在YPD板块+100微克/mL努尔塞奥西林上观察到红色菌落，表明ADE2已被成功破坏（图8D）和8E）。

Figure 1
图1：多基因组装概述。大会分三个层次进行。 在0级1中，CDS或任何其他部分从基因组中放大或合成，然后使用 BsmBI （或 Esp3I） 酶克隆到 pYTK001 条目载体中。ColE1 ： 大肠杆菌 的复制来源：CmR： 氯霉素耐药基因.在 2 级中，使用 BsaI 酶组装包含发起器、CDS 和终结者的转录单元 （TU）。在 3 级中，使用 BsmBI （或 Esp3I） 酶将多达 5 个转录单元组装成多基因质粒。多基因质粒可以是复制的，也可以是集成的。 请单击此处查看此图的更大版本。

Figure 2
图2：引物设计和克隆部分质粒。 （A） 用于放大单个部分、驯化基因或产生点突变以及组装融合蛋白的引物设计。引条包括 BsmBI 和 BsaI 识别和切割站点以及用于正确组装的 MoClo 悬架。MoClo 悬架表示为 1、2、3、4 和 5、6、7、8。驯化或创建融合蛋白的内部引金包含 BsmBI，但不包含 BsaI 站点。这些的悬架是自定义的内部序列（NN 和 N'N'N'紫色）。终端"ttt"包括在内，以获得最佳的酶消化。戈伊：感兴趣的基因。（B） 使用 BsmBI （或 Esp3I） 将克隆部分放大到 pYTK001 条目矢量中。互补悬架导致部分的集成和 BsmBI 识别站点的删除。ColE1 ： 大肠杆菌 的复制来源：CmR： 氯霉素耐药基因. 请单击此处查看此图的更大版本。

Figure 3
图3：转录单元装配。 为了组装 TU 质粒，建议使用中间矢量的组装，以促进组合 TU 组装。要组装中间载体，请使用 BsaI 酶将 Con LX（X：五个左连接器之一）、sfGFP 辍学、Con RY（Y：五个右连接器之一）、酵母 ORI（复制源）和酵母标记部分克隆到 mRFP1 辍学载体中。中间质粒对安皮林具有抗药性。BsaI 识别站点保留用于 TU 质粒克隆。要克隆 TU 质粒，使用 BsaI 将发起人、CDS 和终结者组装到中间载体中。克隆的TU将在康尔克斯和康瑞地区拥有BsmBI站点，用于下一步的多基因组装。克隆的TU对安培素也有抵抗力。 请单击此处查看此图的更大版本。

名字 康尔克斯（左连接器） 促进 光盘 终结者 康瑞（右连接器）
英国电信/埃尔格20 图 LS 佩诺2 BTS1/ERG20 tTDH2 R1
ERG20 图 LS 佩诺2 ERG20 tTDH2 R1
克特 图 L1 pTIP1 克特 tHSP26 R2
克蒂布 图 L2 pPDC1 克蒂布 塔德赫2 R3
克蒂布G247A 图 L2 pPDC1 克蒂布G247A 塔德赫2 R3
克蒂 图 L3 皮克1 克蒂 塔克斯2 再

表1：本研究中使用的转录单元。 发起人和终结者被放大从 塞雷维西亚。 BTS1（ 杰兰基基二磷酸盐合成酶）和 ERG20（ 苯丙磷酸合成酶）从 塞雷维西亚放大。基因 crtE （杰兰基根基二磷酸盐合成酶）， crtYB （双功能番茄红素环状酶 / 植物素合成酶）， 和 crtI （植物素脱盐酶） 来自 桑托菲洛米塞斯巢穴。

Figure 4
图4：多基因质粒组装。 （A） 复制质粒组件。复制中间载体的组装包括克隆康LS'，sfGFP辍学，康RE'，酵母ORI，酵母标记，和 大肠杆菌 的起源和标记在mRFP1辍学载体使用BsaI酶。康尔斯和康雷的网站将 BsmBI 识别站点引入矢量。通过在选择性盘子中寻找带有卡那霉素的绿色菌落，可以筛选出可能正确的组件。然后，以前组装的 TUs 可以使用 BsmBI 酶克隆到中间载体中。这种质粒包含酵母 ORI，允许它在酵母主机中复制。（B） 综合质粒组装。整合中间载体的组装包括克隆康LS'，sfGFP辍学，康RE'，一个5'同源性手臂，一个3'同源性手臂，酵母标记，和 大肠杆菌 的起源和标记到RFP辍学载体使用BSAI酶。正确的组件应显示绿色与卡那霉素的选择性板。以前制造的转录单元可以使用 BsmBI 酶克隆到复制中间载体中。此载体没有酵母 ORI，将通过 CRISPR 和同源重组集成到目标轨迹中。 请单击此处查看此图的更大版本。

名字 图1 图2 图3 图4 产品
B/E-β-胡萝卜素 BTS1/ERG20 克特 克蒂布 克蒂 β胡萝卜素
B/E-番茄红素 BTS1/ERG20 克特 克蒂布G247A 克蒂 番茄红素
电子β-胡萝卜素 ERG20 克特 克蒂布 克蒂 β胡萝卜素
电子番茄红素 ERG20 克特 克蒂布G247A 克蒂 番茄红素

表2：本研究中使用的多基因普拉斯米德。

Figure 5
图 5： CRISPR 集成。 （A） 克里斯普和帮手质粒克隆。pCAS 质粒包含 Cas9 内核素酶和组件（tRNA 促进剂、SNR52 终结者、HDV 核糖核糖核素和跟踪RNA），以最佳表达 gRNA。通过使用吉布森克隆的线性 pCAS 组装合成 gRNA 克隆 pCAS+gRNA 质粒。（B） CRISPR 有助于基因整合。第1步：共转化：pCAS +gRNA与含有感兴趣的基因（GOI）、酵母选择性标记的综合质粒和针对基因组轨迹的5'和3'同源区域共同转化为酵母。为了实现最佳集成，将集成质粒与 NotI 线性化。第 2 步：目标蝗虫的集成：在选择酵母标记的板上生长转化酵母，无论是抗生素还是辅助营养。执行基因型，以确认集成。第3步：通过在非选择性板上条纹酵母来治疗pCAS+gRNA质粒。 请单击此处查看此图的更大版本。

Figure 6
图6：大肠杆菌的进入载体和转录单位水平克隆的代表板。在（A）可见光和（B）紫外线下，成功将一个基因克隆成入口载体 pYTK001 的代表板。积极的殖民地是白色的，消极的殖民地是绿色的。正殖民地整体殖民地的比例为90.35±4.22%。在（C）可见光和（D）紫外线下成功组装转录单元级装配和绿色/红色选择的中间矢量。积极的殖民地是绿色的。正殖民地整体殖民地的比例为17.56±3.32%。在（E）可见光和（F）紫外线下，从中间矢量和绿/白筛选成功组装转录单元。积极的殖民地是白色的，消极的殖民地是绿色的。正殖民地整体殖民地的比例为：65.02±3.32%。数据来自三个生物复制品。请单击此处查看此图的更大版本。

Figure 7
图7：大肠杆菌多基因质粒克隆的代表板。在（A）可见光和（B）紫外线下组装多基因级组装和红/绿选择的中间载体。积极的殖民地是绿色的，消极的殖民地是红色的。正殖民地整体殖民地的比例为1.83±0.15%。在可见光和（D）紫外光下，成功组装了来自中间矢量和绿色/白色选择（C）的多个 TUs。积极的殖民地是白色的。正殖民地整体殖民地的比例为93.77±1.65%。在（E） 可见光和（F）紫外线下多基因质粒的次优组装。积极殖民地的数量可以忽略不计。数据来自三个生物复制品。请单击此处查看此图的更大版本。

Figure 8
图8：酵母中具有代表性的综合和复制质粒板。复制的多基因质粒转化为酵母与 （A） BTS1-ERG20融合 TU 和 （B） ERG20 TU.每个盘子上，左侧的酵母都有含有 crtE TU、crtYB TU 和 crtI TU 的质粒，用于生产β-右侧的胡萝卜素和酵母有含有 crtE TU、crtYB （G247A） TU 和用于生产番茄红素的质粒。（C） 使用紫外线光谱仪用四个多基因质粒从酵母提取物中量化β胡萝卜素和番茄红素。β胡萝卜素和番茄红素的最大吸收量分别记录在450纳米和470纳米。绝对量化使用真实标准（补充图S3）执行。BTS1-ERG20的融合导致仅ERG20的产量就高出35倍，β胡萝卜素和番茄红素的产量提高了16.5倍。通过将多基因整合质粒与 gRNA 和无帮手 DNA（D）以及 gRNA 和多基因整合质粒作为帮手脱氧核糖核酸（E）的整合，对ADE2轨迹的破坏具有代表性的板块。请单击此处查看此图的更大版本。

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Discussion

Lee等人开发的基于MoClo的克隆试剂盒为快速将一到五个转录单元组装成多基因质粒，用于复制或整合到酵母基因组中提供了极好的资源。该试剂盒的使用消除了酵母中表达多个基因时效的克隆瓶颈。

我们用T4DNA韧带测试了金门克隆的消化/配结周期的五种不同条件。我们发现，30个周期的消化在37°C 5分钟和结块在16°C 5分钟，然后最后消化步骤在50°C 10分钟和蛋白质灭活步骤在80°C 10分钟导致99.5%的殖民地，有可能是正确的4件组件（补充图S1和表S3）。16 °C 的液化可确保最佳的韧带活性和悬垂性。50 °C 的最终消化可防止消化的产品重新进行液化。除非另有说明，否则所有装配反应都遵循此周期。

我们还发现了一些关键步骤，需要特别注意以获得最佳结果。我们强烈建议在组装转录单元之前，用 sfGFP 辍学组装中间向量。从理论上讲，所有七个部分都可以用mRFP1克隆成 大肠杆菌 载体，然后进行红/白筛选。然而，在实践中，mRFP1发展颜色非常缓慢，在可见光下区分淡红色和淡黄色 大肠杆菌 群是具有挑战性的。当sfGFP在紫外线范围52吸收时，使用紫外线或蓝光透光器便于筛选明亮的绿色殖民地。此外，克隆中间载体允许各种促进器、CDS 和终结者组合进行更简单的组装，从而实现更简单的组合库创建，因为具有四个部分的组件通常比具有更多部件的组件产生更积极的聚落。 补充图 S2 显示潜在正确的殖民地从 6 件组件到 8 件组件的比例逐渐下降。

必须仔细测量所有部件的浓度，以确保每个部件的等价浓度。使用紫外线-维斯光谱仪对部件进行量化通常足够，但更敏感的方法（如荧光测定）可能会产生更好的效果。未能准确量化所有部件通常会导致装配效率低下。应分别选择高效的 Esp3I 和 BsaI-HFv2。我们观察到，T4适用于套件中的悬垂和定制悬垂，需要融合两个部分，这与文献36一致，尽管原论文建议T7韧带6。增加周期数可以在一定程度上增加可能正确的殖民地的数量。例如，25个周期的消化和结定足以组装三到四个部分，但30-35个周期为更多的部分提供更好的结果。

MolClo 策略优于替代多部分装配方法 8、9、10、11、12，因为它允许模块化和高度通用的克隆。但是，主要限制是驯化步骤，因为零件有时具有多个 BsmBI、BsaI 或 NotI 站点。变异所有部件可能非常耗时。在这种情况下，可以考虑在没有这些限制站点的情况下合成 CDS。然而，对于促进者和终结者，即使一个核苷酸变异也可能改变其功能。因此，建议使用记者分析验证这些部件的活动。另一个限制是，此套件只允许在多基因质粒中最多五个转录单元。如果需要更多转录单元，则可以通过选择一组高度兼容的悬垂36来构建其他连接器。

该套件提供27个发起人、6个终结者、7个酵母选择标记和2个酵母复制源。自定义部件（如本地或合成的促进器和终结者）可在此协议后克隆到条目载体中。酵母MoClo套件主要用于过度表达多基因代谢途径，在酵母中产生高价值化学物质。当酵母中需要生物电路的不同开关时，也可以使用此协议。应用此工具包研究有关蛋白质相互作用、蛋白质定位和酶活动的基本生物学问题也具有巨大的潜力。总的来说，这个协议是非常灵活和可靠的，可以支持酵母生物学中任何苛刻的克隆。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作由纽约州立大学研究基金会（奖 #： 71272）和布法罗大学影响奖（奖 #： 000077）资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Glass beads RPI research products 9831 For lysing yeast cells
Bacto Agar BD & Company 214010 Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto Peptone BD& Company 211677 Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2 New England Biolabs R3733S a highly efficient version of BsaI restriction enzyme
Carbenicillin Fisher Bioreagents 4800-94-6 Antibiotic for screening at the transcription unit level
Chloramphenicol Fisher Bioreagents 56-75-7 Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-His Sunrise Sciences 1006-010 Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Dextrose Fisher Chemical D16-500 Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids BD & Company 291940 Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mix Promega U1515 dNTPs for PCR
Esp3I New England Biolabs R0734S a highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit Zymo Research T2001 For yeast transformation
Hexanes Fisher Chemical H302-1 For carotenoid extraction from yeast cells
Kanamycin Fisher Bioreagents 25389-94-0 Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, Miller Fisher Bioreagents BP1425-2 Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, Miller Fisher Bioreagents BP1426-2 Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Lycopene Cayman chemicals NC1142173 For lycopene quantification
MoClo YTK Addgene 1000000061 Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England Biolabs T1010L For plasmid purification from E.coli
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND2000c For measuring accurate DNA concentrations
NotI-HF New England Biolabs R3189S Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin Sulphate Goldbio N-500-100 Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X) New England Biolabs B0518S Buffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530S High fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494 Addgene 100539 Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz Cuvette Thermo Electron 10050801 For quantifing carotenoids
T4 ligase New England Biolabs M0202S Ligase for Golden Gate cloning
Thermocycler BIO-RAD 1851148 For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue Homogenizer Bullet Blender Model: BBX24 For homogenization of yeast cells
UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific Genesys 150 For quantifing carotenoids
Yeast Extract Fisher Bioreagents BP1422-500 Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-carotene Alfa Aesar AAH6010603 For β-carotene quantification

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References

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生物工程， 第 168 期， Moclo， 糖精脑iae，代谢工程， 异种表达， CRISPR， 基因组编辑
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Mukherjee, M., Caroll, E., Wang, Z.… More

Mukherjee, M., Caroll, E., Wang, Z. Q. Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning. J. Vis. Exp. (168), e61993, doi:10.3791/61993 (2021).

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