Summary
يصف هذا التقرير بروتوكولا للعزل المتزامن للخلايا الأولية قبل الخلايا البنية والبيضاء من الفئران حديثي الولادة. يمكن زراعة الخلايا المعزولة في الثقافة وتحث على التفريق إلى خلايا بيضاء وبنية ناضجة تماما. تمكن هذه الطريقة من التوصيف الوراثي والجزيئي والوظيفي للخلايا الدهنية الأولية في الثقافة.
Abstract
وقد استفاد فهم الآليات الكامنة وراء التمايز adipocyte ووظيفة إلى حد كبير من استخدام خطوط خلايا preadipocyte البيضاء الخالدة. هذه خطوط الخلية المثقفة، ومع ذلك، لديها قيود. وهي لا تلتقط بشكل كامل الطيف الوظيفي المتنوع للسكان الخلايا الدهنية غير المتجانسة التي من المعروف الآن أن تكون موجودة داخل المستودعات الدهنية البيضاء. لتوفير نموذج أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لدراسة تعقيد الأنسجة الدهنية البيضاء ، تم تطوير بروتوكول وتحسينه لتمكين العزل المتزامن لذريات الخلايا الدهنية البيضاء والبنية الأولية من الفئران حديثي الولادة ، وتوسعها السريع في الثقافة ، وتمايزها في المختبر إلى خلايا شحمية ناضجة تعمل بكامل طاقتها. الميزة الأساسية لعزل الخلايا الأولية عن الفئران الوليدة ، بدلا من الفئران البالغة ، هي أن المستودعات الدهنية تتطور بنشاط ، وبالتالي فهي مصدر غني للخلايا المسبقة التكاثر. تفرق الخلايا الأولية السابقة للبديهة المعزولة باستخدام هذا البروتوكول بسرعة عند الوصول إلى التقاء وتصبح ناضجة تماما في 4-5 أيام ، وهي نافذة زمنية تعكس بدقة مظهر منصات الدهون المتقدمة في الفئران حديثي الولادة. ويمكن توسيع الثقافات الأولية المعدة باستخدام هذه الاستراتيجية ودراسة مع استنساخ عالية، مما يجعلها مناسبة للشاشات الوراثية والفينوتيبيك وتمكين دراسة الأنماط الظاهرية للخلايا الدهنية المستقلة من نماذج الماوس الوراثية. يقدم هذا البروتوكول نهجا بسيطا وسريعا وغير مكلف لدراسة تعقيد الأنسجة الدهنية في المختبر.
Introduction
السمنة تنتج عن اختلال مزمن بين استهلاك الطاقة والإنفاق على الطاقة. مع تطور السمنة ، تخضع الخلايا الدهنية البيضاء لتوسع هائل في حجم الخلية يؤدي إلى نقص الأكسيجة في البيئة الدقيقة ، وموت الخلايا ، والالتهاب ، ومقاومة الأنسولين1. مختلة, الخلايا الدهنية hypertrophied لا يمكن تخزين الدهون الزائدة بشكل صحيح, التي تتراكم بدلا من ذلك في الأنسجة الأخرى حيث أنها تضعف عمل الأنسولين2,3. من المتوقع أن تكون العوامل التي تحسن وظيفة الخلايا الدهنية وتعيد تقسيم الدهون الطبيعي بين الأنسجة مفيدة لعلاج الحالات المرتبطة بالسمنة التي تتميز بمقاومة الأنسولين مثل داء السكري من النوع 2. وقد أثبتت الشاشات Phenotypic في الخلايا الدهنية باستخدام خطوط الخلية الخالدة، مثل 3T3-L1، F442A، و 10T 1/2، مفيدة لتحديد العوامل الوراثية التي تنظم تولد الدهون وعزل الجزيئات المؤيدة للشحم مع خصائص مضادة للسكري4،5،6،7. هذه الخطوط الخلية، ومع ذلك، لا تعكس تماما عدم التجانس من أنواع الخلايا الموجودة في المستودعات الدهنية، والتي تشمل الأبيض والبني والبيج، وغيرها من الأنواع الفرعية adipocyte مع خصائص فريدة من نوعها، وكلها تسهم في التوازن الجهازي8،9،10. علاوة على ذلك ، غالبا ما تظهر خطوط الخلايا المثقفة استجابة متضائلة للمحفزات الخارجية.
في المقابل ، فإن ثقافات الخلايا الدهنية الأولية تلخص بشكل أكثر دقة تعقيد في تكوين الدهون في الجسم الحي ، وتظهر الخلايا الدهنية الأولية استجابات وظيفية قوية. عادة ما يتم عزل preadipocytes الأولية من كسر الأوعية الدموية سترومال من مستودعات الدهنية من الفئران البالغة11،12،13،14. ومع ذلك ، لأن المستودعات الدهنية للحيوانات البالغة تتكون في المقام الأول من الخلايا الدهنية الناضجة تماما التي لديها معدل دوران بطيء جدا15،16،17، فإن هذا النهج ينتج كمية محدودة من الخلايا السابقة للديئة بمعدل انتشار منخفض. لذلك ، من الأفضل عزل خلايا ما قبل الخلايا من الفئران حديثي الولادة للحصول على كميات كبيرة من الخلايا سريعة النمو التي يمكن تمييزها في المختبر. هنا، وقد وصف بروتوكول، مستوحاة من العمل الأولي مع الخلايا الدهنية البني الابتدائي من كانوآخرون. 18 لعزل بكفاءة كل من البيض والبني preadipocytes التي يمكن توسيعها وتمييزها في المختبر إلى الخلايا الدهنية الأولية تعمل بكامل طاقتها(الشكل 1A). ميزة عزل الخلايا الأولية عن حديثي الولادة ، بدلا من الفئران البالغة ، هي أن المستودعات الدهنية تنمو بسرعة وبالتالي فهي مصدر غني للخلايا المسبقة التكاثر بنشاط17. تتمتع الخلايا المعزولة باستخدام هذا البروتوكول بقدرة انتشار عالية ، مما يتيح التوسع السريع للثقافات. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر preadipocytes من الجراء حديثي الولادة إمكانات تمييز أعلى من السلف البالغين ، مما يقلل من التباين الجيد في مدى التمايز وبالتالي يزيد من القابلية للاستنساخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع هذا البروتوكول جميع المبادئ التوجيهية IACUC لمعهد سكريبس للبحوث وجامعة ويسكونسن – ماديسون كلية الطب والصحة العامة.
1. جمع وهضم المستودعات الدهنية (اليوم 1)
- إعداد أنبوبين 1.5 مل لكل جرو: واحد للأنسجة الدهنية البنية (BAT) وواحد للأنسجة الدهنية البيضاء (WAT). إضافة 250 ميكرولتر من المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) + 200 ميكرولتر من العازلة العزل 2x (123 mM NaCl، 5 M M KCl, 1.3 mM CaCl2, 5 mM الجلوكوز, 100 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic حمض (HEPES), البنسلين-streptomycin, و 4٪ الأحماض الدهنية خالية من الأحماض البقرية مصل الألبومين) إلى كل أنبوب. الحفاظ على حلول عقيمة وعلى الجليد.
- ضع الجراء في غرف صغيرة (على سبيل المثال ، بئر واحد من لوحة من 6 آبار) ، ووضعها على الجليد حتى تصبح انخفاض حرارة الجسم. تأكد من عدم وجود اتصال مباشر بين الجراء والجليد. وخز مخلب مع طرف لضمان فقدان الوعي، والقتل الرحيم الجراء عن طريق قطع الرأس باستخدام مقص حاد.
ملاحظة: إذا كنت تعمل مع أنماط جينية مختلفة، قم بإعداد أنبوب إضافي لجمع خزعة الذيل (قطع 3 ملم) للكتابة الجينية. إذا تم إجراء الإبادة الجماعية على الفور ، فحافظ على الجراء القتل الرحيم على الجليد حتى تشريحها لجمع المستودعات الدهنية. - حساب ووزن كمية الكولاجيناز اللازمة لهضم جميع المستودعات. إضافة 50 ميكرولتر من 15 ملغ / مل كولاجيناز نوع الأول في العازلة العزلة 2X إلى كل أنبوب. لا تقم بإعادة إنفاق الكولاجينز في عازل العزل حتى يتم جمع جميع الأنسجة.
- لجمع وات تحت الجلد، وقطع الجلد حول بطن الجرو (تجنب تمزق الصفاق)، وسحب الجلد بلطف إلى أسفل أسفل الساقين. دون أخذ الجلد، وجمع بعناية مستودع الدهون، والتي سوف تظهر واضحة (P1 أو أصغر سنا) أو أبيض (P2 وكبار السن)، رقيقة، والأنسجة ممدود تعلق على الداخل أو على رأس quadriceps (الشكل 1B). شطف مستودع الدهون في برنامج تلفزيوني، ووضعه في أحد الأنابيب التي تحتوي على 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + 200 ميكرولتر من العازلة العزل 2x. ابق على الجليد.
ملاحظة: P0 و P1 الفئران تعطي أفضل العائد. في الجراء P0-1 ، فإن مستودع WAT تحت الجلد شفاف تقريبا. في فئران P2 وكبار السن ، من الأسهل تحديد المستودع لأنه يتحول بالفعل إلى اللون الأبيض ، مما يشير إلى وجود خلايا دهون بيضاء ناضجة تماما. - لجمع BAT بين الأغطية، سحب الجلد من شفرات الكتف على رأسه. رفع BAT - النسيج الأحمر العميق بين شفرات الكتف - وجعل بعناية شقوق في كل مكان من حوله لفصله عن الجسم(الشكل 1B). التحقق من الاتساق واللون؛ شطف مع برنامج تلفزيوني; وضعه في أنبوب أخرى تحتوي على 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + 200 ميكرولتر من العازلة العزل 2x؛ والحفاظ على الجليد.
ملاحظة: عند حصاد BAT من الفئران P2 وكبار السن، وإزالة بعناية الأنسجة الدهنية البيضاء المحيطة BAT. وهو يتألف من رقيقة، لينة، ورقة بيضاء من الخلايا الدهنية تقع بين الجلد وBAT، وهو أعمق بين ريش الكتف. - بمجرد جمع جميع المستودعات ، فرم بلطف كل مستودع (4-6 مرات) باستخدام مقص صغير مباشرة داخل الأنابيب.
- Resuspend كولاجيناز نوع الأول في الحجم المناسب من العازلة العزلة 2X للحصول على محلول الأسهم 10x في 15 ملغ / مل. إضافة 50 ميكرولتر من الكولاجين 10x إلى كل أنبوب، والحفاظ على أنابيب على الجليد حتى تم إضافة الكولاجين إلى جميع الأنابيب.
- عكس الأنابيب بسرعة لخلط، ونقل إلى خلاط درجة الحرارة التي تسيطر عليها. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية على شاكر (تردد 1400 دورة في الدقيقة لخلط العينة الفعال).
2. الطلاء preadipocytes (اليوم 1)
- بعد هضم الأنسجة، ضع الأنابيب مرة أخرى على الجليد.
ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، يتم تنفيذ جميع الأعمال في ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية. - سلالة الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنابيب جديدة 50 مل. إذا كان العمل فقط مع فئران WT، أو إذا كانت الأنماط الجينية معروفة، قم بتجميع BATs ذات الصلة والمفككة معا؛ كرر هذا لWATs. لتحقيق أقصى قدر من غلة الخلية، شطف كل أنبوب مع 1 مل من العزلة المتوسطة (دولبيكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) + 20٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 10 M HEPES، 1٪ البنسلين-streptomycin)، وتصفيته من خلال مصفاة الخلية. إذا كنت تعمل مع أنماط جينية غير معروفة، انتقل إلى الخطوة 2.4
ملاحظة: FBS هو محدد أساسي لانتشار الخلايا قبل الصباغية والتمايز. اختبار صارم الكثير مختلفة من FBS لضمان الأداء العالي والاتساق بين الكثير. - تمييع BAT وتعليق WAT إلى الآبار لوحة 2-3 من لوحة 6-جيدا لكل عينة BAT و 4-6 آبار من لوحة 6-جيدا لكل عينة وات. على سبيل المثال، إذا تم تجميع 6 BATs و 6 WATs معا، تخفيف تعليق خلية BAT تصل إلى 24-36 مل وتعليق خلية WAT تصل إلى 48-72 مل. لوحة 2 مل من تعليق الخلية لكل بئر.
- بالنسبة للعينات ذات الأنماط الجينية غير المعروفة، احتفظ بكل عينة منفصلة؛ وضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر على رأس كل بئر من لوحة 6-جيدا، وتصفية عينة واحدة لكل بئر. شطف الأنبوب مع 1.5 مل من العزلة المتوسطة، وتمريره من خلال مصفاة، مما يشكل حجم النهائي إلى 2 مل لكل بئر. تجاهل مصفاة الخلية، ووضع الغطاء على لوحة، ونقل لوحة إلى الحاضنة.
ملاحظة: يجب أن تبدو الوسيلة في الآبار عكرة بسبب خلايا الدم العائمة وحطام الخلايا والدهون من الخلايا المهترئ. - 1-1.5 ساعة بعد الطلاء، يستنشق وسائل الإعلام ويغسل مع 2 مل من DMEM دون مصل. حرض الطبق برفق لفصل خلايا الدم من قاع الآبار. بعد 3 يغسل، إضافة 2 مل من العزلة المتوسطة الطازجة، ونقل الخلايا إلى الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
ملاحظة: تحقق من الخلايا تحت المجهر. يجب أن تكون المواد العائمة (خلايا الدم والحطام الخلوي) ضئيلة. سوف تظهر الخلايا قبل الخلايا البنية كخلايا صغيرة غير شفافة ، في حين أن الخلايا التمهيدية البيضاء ستعرض شكلا أكثر استطالة. يجب أن تكون كل من preadipocytes البني والأبيض تعلق بإحكام على لوحة.
3. توسيع ثقافة ما قبل الصباغية (اليوم 2 إلى اليوم 5)
- في اليوم التالي، يستنشق المتوسط، وغسل الخلايا مع 2 مل من DMEM دون مصل، وإضافة 2 مل من وسيط العزل.
- كرر الخطوة 3.1 مرة واحدة كل يومين حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80-90٪.
ملاحظة: بالنسبة للخلايا الأولية البنية، يمكن أن يستغرق الوصول إلى التقاء 80-90٪ 4-5 أيام. بالنسبة للخلايا الأولية البيضاء ، عادة ما يستغرق الأمر 2-3 أيام. بمجرد أن تصل الخلايا السابقة للخلايا إلى التقاء 60٪ ، يمكن إصابتها بكفاءة بالجسيمات الفيروسية لتجارب الضربة القاضية أو التعبير المفرط. تصيب preadipocytes مع حمولة الفيروسية المناسبة لمدة تصل إلى 8 ساعة. يتم تثبيط استخدام البوليمرات القيصرية لزيادة كفاءة العدوى ، لأنها غالبا ما تؤدي إلى السمية وفي انخفاض كبير في الإمكانات الدهنية للخلايا قبل المعدية المصابة. - لتقسيم الخلايا، معطف لوحات الوجهة الجديدة باستخدام محلول معقم من 0.1٪ ث / الخامس الجيلاتين (المذاب في الماء المقطر؛ لا تستخدم أي حرارة). استخدام ما يكفي من حجم لتغطية الجزء السفلي من البئر / الطبق. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية حتى الخلايا جاهزة لتكون البذور (على الأقل 10 دقيقة).
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية. طلاء لوحات ثقافة الخلية لا يؤثر على العائد أو التمايز المحتملة، لكنه يبسط إلى حد كبير صيانة والتعامل مع الخلايا الدهنية المتمايزة. - عندما تصل الخلايا إلى كثافة الالتقاء الفرعي (85-95٪)، يستنشق المتوسط، يغسل مع برنامج تلفزيوني، وإضافة تريبسين لمدة 3 دقائق لفصل الخلايا. منع نشاط التريبسين بإضافة حجم 2.5x تريبسين من العزلة المتوسطة. ماصة تعليق الخلية صعودا وهبوطا لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش الخلية، ونقل إلى أنبوب جديد. غسل الآبار مع 1 مل من العزلة المتوسطة، وإضافته إلى المجموعة الأولى.
- الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 800-1200 × ز، يستنشق supernatant ، وإعادة إنفاق الخلايا في 3-5 مل من العزلة المتوسطة. عد الخلايا، وتمييعها إلى الكثافة النهائية المطلوبة.
ملاحظة: على سبيل المثال، 50000-80000 خلية/مل (2.5 و 1 و 0.5 مل للوحات 6 و 12 و 24 بئرا على التوالي) ستؤدي إلى آبار التقاء كاملة في غضون 72-96 ساعة. - اسبير حل الطلاء في الخطوة 3.3، وغسل الجيلاتين الزائد مع برنامج تلفزيوني. بذور الخلايا، والعودة لوحات إلى الحاضنة حتى التقاء تماما.
4. التفريق بين الخلايا التمهيدية البيضاء والبني (أيام 7 - 12)
- عندما تصبح preadipocytes التقاء، يستنشق المتوسطة، واستبدالها مع وسيطة التمايز تتكون من 10٪ FBS في DMEM تحتوي على الأنسولين 170 nM، 1 ميكرومتر ديكساميثازون، و 0.5 mM 3-isobuthyl-1-ميثيلكانتين. إذا كان التفريق BAT preadipocytes، إضافة أيضا 1 nM تريودوثيرونين (T3). بمناسبة اليوم الذي يتم فيه التمايز الشحمية كما اليوم 0 من التمايز.
ملاحظة: يمكن أن تفرق كل من الخلايا التمهيدية البيضاء والبنية تلقائيا عند الوصول إلى التقاء. ومع ذلك ، لتحقيق أقصى قدر من التمايز adipocyte ، ينبغي استخدام الكوكتيل التقليدي المؤيد للشحم الموصوف أعلاه (بالإضافة إلى T3 لخلايا BAT preadipocytes). - بعد 48 ساعة (اليوم 2 من التمايز)، تحديث المتوسطة مع صيانة المتوسطة تتكون من 10٪ FBS في DMEM و 170 nM الأنسولين (بالإضافة إلى 1 NM T3 لBAT).
ملاحظة: في اليوم الثاني، يمكن ملاحظة قطرات الدهون الصغيرة المتراكمة في الخلايا تحت المجهر باستخدام حقل مشرق قياسي. - كرر الخطوة 4.2 مرة كل يومين حتى يتم استخدام الخلايا للتجارب.
ملاحظة: في اليوم 4 أو 5 من التمايز، ستظهر غالبية الخلايا محملة بالدهون. يمكن الاحتفاظ بالخلايا الدهنية المتمايزة بشكل نهائي في الثقافة لفترة أطول أو استخدامها في هذه المرحلة للتجارب.
5. إعادة الطلاء لتجارب الجيوجيستيك الحيوية
ملاحظة: إذا كان القصد هو إجراء دراسات الجيوجيات الحيوية في الخلايا الدهنية الناضجة في شكل 96 بئرا، يجب اتخاذ الخطوات التالية. من الناحية المثالية ، يجب استخدام الخلايا التي تم تمييزها بالكامل (اليوم 4 أو 5). يبدأ الإجراء الموضح أدناه من بئر واحد من طبق من 6 آبار.
- قبل الهضم التريبسين، وإعداد طلاء لوحات 96 جيدا. أضف 50 ميكرولتر من الجيلاتين 0.1٪ إلى كل بئر. اترك الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة حتى تصبح الخلايا جاهزة للبذر.
- في اليوم 4 أو 5 من التمايز، يستنشق المتوسط، يغسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، وإضافة 300 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين-إيثيلينديامين حمض رباعي الأسيتيك (ل 1 بئر من لوحة 6-جيدا). إمالة بلطف لوحة لضمان تريبسين يغطي تماما الجزء السفلي من البئر. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. منع عمل تريبسين مع 700 ميكرولتر من صيانة المتوسطة، ماصة صعودا وهبوطا لتحقيق أقصى قدر من استعادة الخلية، ونقل تعليق الخلية في أنبوب 1.5 مل جديدة.
- الطرد المركزي الخلايا في 1200 × غرام لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant، resuspend بيليه في 1 مل من متوسط الصيانة، والعد الخلايا.
ملاحظة: يجب أن ينتج بئر واحد من لوحة 6-well حوالي 1.5-1.8 مليون خلية. - تمييع الخلايا ليكون تركيزها النهائي من 60،000 إلى 80،000 خلية / مل للخلايا الدهنية البني و 100،000 إلى 120،000 خلية / مل للخلايا الدهنية البيضاء. لوحة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر في لوحات الجيلاتين المغلفة 96 جيدا.
ملاحظة: بئر واحد من لوحة 6-جيدا يوفر ما يكفي من الخلايا لمدة تصل إلى اثنين من لوحات 96 بئر. بالنسبة لتجارب الطاقة الحيوية، هناك حاجة إلى الطلاء منخفض الكثافة (التقاء 30-40٪) لتمكين القياس الدقيق لاستهلاك الأكسجين وتجنب استنفاد الأكسجين في الآبار أثناء الفحص. - السماح للخلايا بالالتصاق بأسفل اللوحة لمدة 48 ساعة على الأقل. إذا تم الاحتفاظ بالخلايا في اللوحة لأكثر من 48 ساعة، قم بتحديث الوسط بعد يومين.
- في يوم الفحص، قم بالتكبير على الوسط، واستبدله بمتوسط مقايسة. احتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في حاضنة غير CO2التي تسيطر عليها، وإجراء المقايسة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وسيسفر القسم 1 من البروتوكول عن تعليق غير متجانس للخلايا المرئية تحت المجهر الخفيف القياسي. تصفية الأنسجة المهضومة مع مصفاة الخلية (القسم 2) سوف يزيل الأنسجة غير المهضومة. ومع ذلك، فإن بعض الحطام الخلوي، وخلايا الدم، وخلايا الشحمية ناضجة تمر من خلال (الشكل 1C). يغسل لطيف 1 ح بعد الطلاء سوف إزالة الخلايا غير ذات الصلة كما preadipocytes نعلق بسرعة إلى الجزء السفلي من البئر(الشكل 1C). في القسم 3 ، يتم توسيع السلائف الخلايا الدهنية للحصول على عدد الخلايا المطلوبة للخطة التجريبية. على الرغم من أن كل من البيض والبني preadipocytes معزولة عن الجراء حديثي الولادة لديها قدرة عالية التكاثر، فإن العائد من preadipocytes الأبيض هو عموما ضعف ذلك من preadipocytes البني على أساس لكل مستودع(الشكل 2A). لذلك ، إذا رغبت الثقافات المتزامنة ، يجب حساب الكثافة الأولية للخلايا التمهيدية البيضاء وفقا لذلك. القسم 4 يقدم مبادئ توجيهية للحصول على الخلايا الدهنية ناضجة تماما.
في نهاية التمايز، سوف تظهر الخلايا محملة قطرات الدهون والتعبير عن علامات الكلاسيكية من الخلايا الدهنية البيضاء والبني، على التوالي (الشكل 2B،C). يمكن استخدام كل من الخلايا الدهنية البيضاء والبنية لدراسات الجيوجيات الحيوية كما هو موضح في القسم 5. يظهر تحليل مقارن لاستهلاك الأكسجين في اختبار الإجهاد الميتوكوندريا للخلايا الدهنية البيضاء والبنية الأولية في ظل ظروف القاعدية ، وكذلك استجابة لمحفزات معروفة لوظيفة الميتوكوندريا (على سبيل المثال ، النورادرينالين) في الشكل 2D. عند العزل ، من الممكن أيضا التمييز بين الخلايا الدهنية البيضاء والبنية الأولية على اللوحات التي سيتم استخدامها مباشرة للتجارب الحيوية19. في هذه الحالة ، يتم عزل preadipocytes ومطلية كما هو موضح في القسمين 1 و 2. عندما تصبح الخلايا التقاء، يتم حثهم على التفريق كما هو موضح في القسم 4 حتى تصل إلى التمايز النهائي وجاهزة لتحليل الجيستيك الحيوي. هذا الإجراء شائع لتنسيق لوحة 24 جيدا، ولكن أقل من ذلك لوحات 96 جيدا.
الشكل 1: جمع وتجهيز منصات الدهون. (أ) تمثيل تخطيطي من العزلة الأولية البيضاء (العلوية) والبني (أسفل) adipocyte. (ب) مستودعات تحت الجلد الأبيض (العلوي) والبني (السفلي) الدهنية. في الفئران P0، وات تحت الجلد غير مرئية تقريبا، ولكن يصبح التمييز في ~ اليوم 2 بعد الولادة. في المقابل، BAT له لون داكن متميز حتى في P0. في الجراء القديمة ، تحيط BAT بطبقة سطحية رقيقة من WAT ، والتي تتطلب إزالة عندما يتم تشريح الأنسجة. (ج) صور تمثيلية لخلايا السلائف الأولية البيضاء والبنية بعد الترشيح من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر ، بعد الغسل الأولي ، و 24 ساعة بعد العزل. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. المختصرات: WAT = الأنسجة الدهنية البيضاء. BAT = الأنسجة الدهنية البنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:تمايز السلف الخلايا الشحمية. (أ) متوسط عدد WAT تحت الجلد وBAT preadipocytes التي تم الحصول عليها لكل جرو حديثي الولادة (P0). (ب) صور تمثيلية للخلايا الدهنية البيضاء والبنية المتمايزة بشكل نهائي. للتصوير الفلوري، تم احتضان الخلايا مع النيل الأحمر وهويشست 33342 لتلطيخ الدهون المحايدة والنواة، على التوالي. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر(C) تحليل التعبير الجيني لعلامات الخلايا الدهنية الكلاسيكية وعلامات اللون الأبيض والبيج وعلامات بنية محددة في الخلايا الدهنية البيضاء والبنية الأولية المتمايزة لمدة 6 أيام (n =3). لكل جين، يكون تعبير BAT نسبة إلى مستويات WAT (تعيين إلى 1). (د)OCR من الخلايا الدهنية البيضاء والبني في اختبار الإجهاد الميتوكوندريا واستجابة للنورادرينالين (ن = 3). تظهر الخلايا الدهنية البنية التنفس غير المتين واستجابة قوية للنورادرينالين ، في حين تظهر الخلايا الدهنية البيضاء القليل من التنفس غير المتين ولا توجد استجابة كبيرة لتحفيز الأدرينالين. *p<0.05; **p<0.01، يحدده اختبار Tللطالب ذو الذيلين. المختصرات: WAT = الأنسجة الدهنية البيضاء. BAT = الأنسجة الدهنية البنية; OCR = معدل استهلاك الأكسجين؛ أوليغو = أوليغوميسين; FCCP = سيانيد الكربونيل-4-(ثلاثي فلوريومثوكسي)فينيلهيدرازون; RAA = rotenone، أنتيميسين A؛ PPARγ = البيروكسيسوم مستقبلات التكاثر تنشيط غاما; Acrp30 = بروتين مكمل للخلايا الدهنية من 30 كيلودا؛ Fabp4 = البروتين الأحماض الدهنية ملزمة 4; Glut4 = ناقل الجلوكوز 4; Cd36 = مجموعة من التمايز 36؛ ريتن = resistin; Slc27a1 = عائلة الناقل المذاب 27 عضوا 1؛ Ear2 = المرتبطة باليوزينية، ريبونوكليز A الأسرة 2؛ Pgc1a = PPARγ المعطل 1alpha; Prdm16 = المجال التنظيمي الإيجابي I-ملزم عامل 1 (PRDI-BF1) والورم الأرومي الشبكي التفاعل بين جين إصبع الزنك 1 (RIZ1) مجال متجانس يحتوي على 16; Eva1 = الظهارية V مثل مستضد 1; Cidea = الخلية المسببة لوفيات الحمض النووي عامل تجزئة ألفا مثل التأثير A; Ucp1 = فصل البروتين 1; Dio2 = نوع 2 ديوديناز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأنسجة الدهنية أمر بالغ الأهمية لحساسية الأنسولين الجهازية والجلوكوز التوازن20. يرتبط خلل الخلايا الدهنية المرتبطة بالسمنة ارتباطا وثيقا ببداية مرض السكري من النوع 2. لذلك ، قد يتيح الفهم الأكبر للبيولوجيا الأساسية وعلم وظائف الأعضاء للأنسجة الدهنية تصميم علاجات جديدة للاضطرابات الأيضية. كمكمل للتحليل الوظيفي والنسخي المباشر للخلايا الدهنية الناضجة المعزولة عن مستودعات الدهون21،22، ثبت أن الخلايا الدهنية الأولية المثقفة تلخص العديد من جوانب الفيزيولوجيا المرضية للأنسجة الدهنية ، بما في ذلك إفراز الدهون ، ومقاومة الأنسولين استجابة للمحفزات المؤيدة للالتهابات ، وتحريك برنامج الحرارة23،24،25. على الرغم من أن البروتوكولات السابقة قد وصفت عزل السلائف adipocyte من الفئران البالغة11،12، يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل الخلايا بكفاءة عن الجراء حديثي الولادة. هذه الاستراتيجية تسفر عن عدد أكبر بكثير من السلف الخلايا الدهنية البيضاء والبني مع إمكانات التمايز أعلى, كما مستودعات الدهنية بعد الولادة لا تزال غير متمايزة نسبيا بالمقارنة مع مستودعات الدهنية من الفئران البالغة26. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا المعزولة باستخدام هذه الطريقة ملتزمة بالفعل وتسفر عن خلايا شحمية متباينة تعمل بكامل طاقتها والتي تعبر عن علامات الخلايا الناضجة وتظهر ملامحها الفسيولوجية الفريدة، بما في ذلك تخزين الدهون والقدرة الحرارية.
لا يمكن توسيع الخلايا الأساسية إلى أجل غير مسمى في المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، تبدأ الخلايا الأولية في فقدان إمكاناتها الدهنية بعد عدة مقاطع في الثقافة. وهذا مرجح لأن استمرار زراعة الخلايا يؤدي إلى إثراء جوهري للخلايا الأقل التزاما والأكثر انتشارا. وبالتالي، أحد قيود هذا البروتوكول هو نافذة الوقت التي يمكن خلالها استخدام preadipocytes. يتم الحفاظ على إمكانات Adipogenic بشكل كامل إذا تم حث الخلايا على التفريق في غضون 7-8 أيام من وقت العزل. السلف Adipocyte هي مقاومة بشكل خاص للهضم الأنزيمي، ولكن من المهم مع ذلك أن الوقت بشكل صحيح علاج الكولاجين. قد يؤدي الإفراط في عسر الهضم للأنسجة إلى انخفاض بقاء الخلايا وانخفاض قدرة الخلايا على الالتزام بالصفيحة. طوال مرحلة التوسع ، كل من البيض والبني preadipocytes هي متمسكة بقوة ويمكن أن تتسامح مع يغسل قوية وتبادل وسائل الإعلام المتكررة. ومع ذلك ، يوصى باستخدام الصفائح المغلفة عندما يتم حث preadipocytes على التفريق. وقد انخفضت الخلايا الدهنية الناضجة المحملة بالدهون من التصاق السطح والتفاعلات بين الخلايا، مما أدى إلى الميل إلى الانفصال أثناء التمايز ما لم يتم التعامل معها بلطف. الخطوة الأكثر حساسية من البروتوكول هو تحريض التمايز. يجب اختبار FBS والأنسولين و T3 والأدوية الأخرى ، وتركيزاتها النهائية الأمثل ، للحصول على أعلى مدى من التمايز. يمكن أيضا إضافة ناهض PPARа (على سبيل المثال ، rosiglitazone) لزيادة تحفيز تولد الدهون.
ومن المهم ملاحظة أن ظروف التمايز يمكن تكييفها مع الاحتياجات التجريبية. على سبيل المثال، في الشاشات ذات المكتبات الوراثية أو الكيميائية المصممة لتحديد البروتينات / المركبات التي تعزز التمايز البيض و / أو البني الخلايا الدهنية، يمكن حث preadipocytes للتمييز باستخدام وسيلة متساهلة الحد الأدنى الذي يتضمن 10٪ FBS في DMEM و 170 nM الأنسولين فقط. يوصى بتقييم كل مكون من مكونات كوكتيل التمايز لتحديد نوافذ الفحص المثالية لإجراء فحوصات التمايز. T3 وديكسياميثازون هي الاستغناء عن التمايز الأولية adipocyte الأبيض والبني. هذه الشروط سوف تضمن انخفاض معدل التفريق في خلايا التحكم، وبالتالي زيادة نافذة المقايسة وتعظيم القدرة على الكشف عن العوامل المؤيدة للشحم. ثقافات الخلايا الدهنية البني والأبيض الأولية هي أداة قوية لاستجواب وظيفة الخلية الدهنية المستقلة استجابة للتلاعب الجيني والضغوط الأيضية لاستكمال دراسة الأنسجة الدهنية البني والأبيض في الجسم الحي. ومن ثم، هناك حاجة إلى بروتوكولات لعزل وثقافة الخلايا الأولية قبل الخلايا لتمكين استنساخها، والتحقيقات عالية الإنتاجية من وظيفة adipocyte في المختبر. الاستراتيجية الموصوفة هنا تسمح بدراسة الخلايا الأولية قبل الخلايا البيضاء والبنية التي يمكن تمييزها إلى خلايا شحمية ناضجة تماما واختبارها تحت مجموعة متنوعة من التلاعب التجريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
الكتاب ممتنون لكريستينا جوديو في المركز الوطني للبيوتكنوولوجيا في مدريد، إسبانيا، وماري غانتنر في معهد سكريبس للأبحاث، لا جولا، وأناستازيا كرالي في جامعة جونز هوبكنز، بالتيمور، للمساعدة في تحسين هذا البروتوكول على أساس العمل الأولي لكانوآخرون. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح DK114785 و DK121196 إلى E.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
- Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
- Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
- Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
- Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
- Lynes, M. D., Tseng, Y. H.
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).
- Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
- Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
- Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
- Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).
- Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
- Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
- Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
- Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).
