Summary
Dit rapport beschrijft een protocol voor de gelijktijdige isolatie van primaire bruine en witte preadipocyten van pasgeboren muizen. Geïsoleerde cellen kunnen in cultuur worden gekweekt en worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in volgroeide witte en bruine adipocyten. De methode maakt genetische, moleculaire en functionele karakterisering van primaire vetcellen in cultuur mogelijk.
Abstract
Het begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan adipocytdifferentiatie en functie heeft veel geprofiteerd van het gebruik van vereeuwigde witte preadipocytcellijnen. Deze gekweekte cellijnen hebben echter beperkingen. Ze vangen niet volledig het diverse functionele spectrum van de heterogene adipocytpopulaties waarvan nu bekend is dat ze bestaan in witte vetdepots. Om een meer fysiologisch relevant model te bieden om de complexiteit van wit vetweefsel te bestuderen, is een protocol ontwikkeld en geoptimaliseerd om gelijktijdige isolatie van primaire witte en bruine adipocytvoorlopers van pasgeboren muizen, hun snelle uitbreiding in cultuur en hun differentiatie in vitro in volwassen, volledig functionele adipocyten mogelijk te maken. Het primaire voordeel van het isoleren van primaire cellen van pasgeborenen in plaats van volwassen muizen, is dat de vetdepots zich actief ontwikkelen en daarom een rijke bron zijn van proliferatie van preadipocyten. Primaire preadipocyten geïsoleerd met behulp van dit protocol differentiëren snel bij het bereiken van samenvloeiing en worden volledig volwassen in 4-5 dagen, een tijdelijk venster dat nauwkeurig het uiterlijk van ontwikkelde vetkussens bij pasgeboren muizen weerspiegelt. Primaire culturen die met behulp van deze strategie zijn voorbereid, kunnen met een hoge reproduceerbaarheid worden uitgebreid en bestudeerd, waardoor ze geschikt zijn voor genetische en fenotypische schermen en de studie van de cel-autonome adipocytfenotypes van genetische muismodellen mogelijk worden. Dit protocol biedt een eenvoudige, snelle en goedkope aanpak om de complexiteit van vetweefsel in vitro te bestuderen.
Introduction
Obesitas is het gevolg van een chronische onbalans tussen energie-inname en energieverbruik. Naarmate obesitas zich ontwikkelt, ondergaan witte adipocyten een enorme toename van de celgrootte die resulteert in hypoxie in het micromilieu, celdood, ontsteking en insulineresistentie1. Disfunctionele, hypertrofie adipocyten kunnen overtollige lipiden niet goed opslaan, die zich in plaats daarvan ophopen in andere weefsels waar ze insulinewerking dempen2,3. Middelen die de adipocytfunctie verbeteren en de normale lipidenpartitie tussen weefsels herstellen, worden voorspeld dat ze gunstig zijn voor de behandeling van obesitasgerelateerde aandoeningen die worden gekenmerkt door insulineresistentie zoals diabetes type 2. Fenotypische schermen in adipocyten met behulp van vereeuwigde cellijnen, zoals 3T3-L1, F442A en 10T 1/2, zijn nuttig gebleken om genetische factoren te identificeren die adipogenese reguleren en om pro-adipogenic moleculen te isoleren met antidiabetische eigenschappen4,5,6,7. Deze cellijnen weerspiegelen echter niet volledig de heterogeniteit van celtypen die aanwezig zijn in vetdepots, waaronder witte, bruine, beige en andere adipocytsubtypen met unieke kenmerken, die allemaal bijdragen aan systemische homeostase8,9,10. Verder vertonen gekweekte cellijnen vaak een verminderde reactie op externe stimuli.
Culturen van primaire adipocyten daarentegen vatten de complexiteit van in vivo adipogenese nauwkeuriger samen en primaire adipocyten vertonen robuuste functionele reacties. Primaire preadipocyten zijn meestal geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van vetdepots van volwassen muizen11,12,13,14. Omdat de vetdepots van volwassen dieren echter voornamelijk bestaan uit volgroeide adipocyten met een zeer trage omloopsnelheidvan 15,16,17, levert deze aanpak een beperkte hoeveelheid preadipocyten op met een lage proliferatiesnelheid. Daarom heeft isolatie van preadipocyten van pasgeboren muizen de voorkeur om grote hoeveelheden snelgroeiende cellen te verkrijgen die in vitro kunnen worden onderscheiden. Hier is een protocol beschreven, geïnspireerd op het eerste werk met primaire bruine adipocyten van Kahn et al.18 om zowel witte als bruine preadipocyten efficiënt te isoleren die in vitro kunnen worden uitgebreid en gedifferentieerd tot volledig functionele primaire adipocyten (Figuur 1A). Het voordeel van het isoleren van primaire cellen van pasgeborenen, in tegenstelling tot volwassen muizen, is dat de vetdepots snel groeien en dus een rijke bron zijn van actief proliferatie van preadipocyten17. Cellen die met dit protocol worden geïsoleerd, hebben een hoge proliferatieve capaciteit, waardoor culturen snel kunnen worden opgeschaald. Bovendien vertonen preadipocyten van pasgeboren pups een hoger differentiatiepotentieel dan volwassen voorlopers, wat de variabiliteit in de mate van differentiatie vermindert en zo de reproduceerbaarheid verhoogt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt alle IACUC-richtlijnen van het Scripps Research Institute en de University of Wisconsin – Madison School of Medicine and Public Health.
1. Inzameling en vergisting van vetdepots (dag 1)
- Bereid twee buizen van 1,5 ml voor elke pup: één voor bruin vetweefsel (BBT) en één voor wit vetweefsel (WAT). Voeg 250 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 200 μL 2x isolatiebuffer (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2,5 mM glucose, 100 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES), penicilline-streptocine toe. Houd oplossingen steriel en op ijs.
- Plaats de jongen in kleine kamers (bijv. een put van een 6-put plaat) en zet ze op ijs totdat ze onderkoeld raken. Zorg ervoor dat er geen direct contact is tussen de pups en het ijs. Prik een poot met een punt om bewustzijnsverlies te verzekeren en euthanaseer de pups door onthoofding met een scherpe schaar.
OPMERKING: als u met verschillende genotypen werkt, bereid dan een extra buis voor om een staartbiopsie (3 mm gesneden) te verzamelen voor genotypering. Als genotypering onmiddellijk wordt uitgevoerd, houd de geëuthanaseerde pups op ijs tot de dissectie om vetdepots te verzamelen. - Bereken en weeg de hoeveelheid collagenase af die nodig is om alle depots te verteren. Voeg 50 μL 15 mg/ml collagenase type I in 2x isolatiebuffer toe aan elke buis. Resuspendeer de collagenase niet in een isolatiebuffer totdat alle weefsels zijn verzameld.
- Om onderhuidse WAT te verzamelen, snijdt u de huid rond de buik van de pup (vermijd peritoneale ruptuur) en trekt u de huid voorzichtig onder de benen naar beneden. Zonder de huid in te nemen, verzamelt u voorzichtig het vetdepot, dat verschijnt als een helder (P1 of jonger) of wit (P2 en ouder), dun, langwerpig weefsel dat aan de binnenkant of bovenop de quadriceps is bevestigd (figuur 1B). Spoel het vetdepot af in PBS en plaats het in een van de buizen met 250 μL PBS + 200 μL 2x isolatiebuffer. Blijf op ijs.
OPMERKING: P0- en P1-muizen geven de beste opbrengst. Bij P0-1 pups is het onderhuidse WAT depot bijna transparant. Bij P2-muizen en ouder is het depot gemakkelijker te identificeren omdat het al wit wordt, wat wijst op de aanwezigheid van volgroeide, met lipiden geladen, witte adipocyten. - Om interscapulaire BBT te verzamelen, trekt u de huid van de schouderbladen over het hoofd. Til de BBT - het dieprode weefsel tussen de schouderbladen - op en maak er voorzichtig incisies omheen om deze los te maken van het lichaam (figuur 1B). Controleer op consistentie en kleur; spoelen met PBS; plaats het in de andere buis met 250 μL PBS + 200 μL 2x isolatiebuffer; en blijf op ijs.
OPMERKING: Verwijder bij het oogsten van BBT van P2-muizen en ouder voorzichtig het witte vetweefsel rond de BBT. Het bestaat uit een dun, zacht, wit vel adipocyten tussen de huid en de BBT, dat dieper tussen de schouderbladen ligt. - Zodra alle depots zijn verzameld, gehakt u elk depot voorzichtig (4-6 keer) met een kleine schaar direct in de buizen.
- Resuspend collagenase type I in het juiste volume van 2x isolatiebuffer om een 10x stamoplossing bij 15 mg/ml te verkrijgen. Voeg 50 μL 10x collagenase toe aan elke buis, houd de buizen op ijs totdat collagenase aan alle buizen is toegevoegd.
- Keer de buizen snel om om te mengen en breng over naar een temperatuurgecontroleerde mixer. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 37 °C op een shaker (frequentie van 1.400 tpm voor effectieve monstermenging).
2. Plating preadipocyten (dag 1)
- Na het verteren van de weefsels, plaats de buizen terug op ijs.
OPMERKING: Vanaf deze stap worden alle werkzaamheden uitgevoerd in steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast. - Zeef de verteerd weefsels via een 100 μm celzeef in nieuwe buizen van 50 ml. Als u alleen met WT-muizen werkt of als genotypen bekend zijn, bundelt u de relevante, gedissocieerde BAT's samen; herhaal dit voor de WAT's. Om de celopbrengst te maximaliseren, spoelt u elke buis met 1 ml isolatiemedium (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) + 20% foetale runderserum (FBS), 10 mM HEPES, 1% penicilline-streptomycine) en filtert u deze door de celzeef. Als u met onbekende genotypen werkt, gaat u naar stap 2.4
OPMERKING: FBS is een essentiële determinant van zowel preadipocytproliferatie als differentiatie. Test verschillende partijen FBS grondig om hoge prestaties en consistentie tussen partijen te garanderen. - Verdun BBT- en WAT-suspensussingen tot plaat 2-3 putten van een 6-putplaat voor elk BBT-monster en 4-6 putten van een 6-putplaat voor elk WAT-monster. Als bijvoorbeeld 6 BAT's en 6 WAT's samen werden samengevoegd, verdun dan de BBT-celsuspensie tot 24-36 ml en de WAT-celsuspensie tot 48-72 ml. Plaat 2 ml van de celsuspensingen per put.
- Houd voor monsters met onbekende genotypen elk monster gescheiden; plaats een celzeef van 100 μm op elke put van een plaat met 6 put en filtreer één monster per put. Spoel de buis af met 1,5 ml isolatiemedium en passeer deze door de zeef, waardoor het uiteindelijke volume tot 2 ml per put wordt gevormd. Gooi de celzeef weg, plaats het deksel op de plaat en breng de plaat over naar de incubator.
OPMERKING: Het medium in de putten moet er troebel uitzien als gevolg van zwevende bloedcellen, celresten en lipiden van gelyseerde cellen. - 1-1,5 uur na het plateren, media aspireren en wassen met 2 ml DMEM zonder serum. Roer de plaat voorzichtig om bloedcellen los te maken van de bodem van de putten. Voeg na 3 wasbeurten 2 ml vers isolatiemedium toe en breng de cellen over naar de incubator (37 °C, 5% CO2).
OPMERKING: Controleer de cellen onder de microscoop. Drijvend materiaal (bloedcellen, celresten) moet minimaal zijn. Bruine preadipocyten verschijnen als kleine niet-doorschijnende cellen, terwijl witte preadipocyten een meer langwerpige vorm vertonen. Zowel bruine als witte preadipocyten moeten stevig aan de plaat worden bevestigd.
3. Uitbreiding preadipocytcultuur (dag 2 tot dag 5)
- Aspireer de volgende dag het medium, was de cellen met 2 ml DMEM zonder serum en voeg 2 ml van het isolatiemedium toe.
- Herhaal stap 3.1 eens in de 2 dagen totdat de cellen 80-90% samenvloeiing bereiken.
OPMERKING: Voor primaire bruine preadipocyten kan het bereiken van 80-90% samenvloeiing 4-5 dagen duren. Voor primaire witte preadipocyten duurt het meestal 2-3 dagen. Zodra de preadipocyten 60% samenvloeiing bereiken, kunnen ze efficiënt worden geïnfecteerd met virale deeltjes voor knockdown- of overexpressie-experimenten. Infecteer preadipocyten met een geschikte virale belasting gedurende maximaal 8 uur. Het gebruik van kationische polymeren om de infectie-efficiëntie te verhogen wordt afgeraden, omdat het vaak resulteert in toxiciteit en in een significante vermindering van het adipogene potentieel van geïnfecteerde preadipocyten. - Om de cellen te splitsen, bekleedt u nieuwe bestemmingsplaten met een steriele oplossing van 0,1% w/v gelatine (opgelost in gedestilleerd water; gebruik geen warmte). Gebruik voldoende volume om de bodem van de put/schaal te bedekken. Incubeer platen bij 37 °C totdat de cellen klaar zijn om te worden gezaaid (ten minste 10 min).
OPMERKING: Deze stap is optioneel. Coating van celkweekplaten heeft geen invloed op de opbrengst of differentiatiepotentiaal, maar vereenvoudigt het onderhoud en de behandeling van differentiërende adipocyten aanzienlijk. - Wanneer cellen subconfluente dichtheid bereiken (85-95%), aspireer het medium, was met PBS en voeg trypsine toe gedurende 3 minuten om de cellen los te maken. Blokkeer trypsine-activiteit door 2,5x trypsinevolume van isolatiemedium toe te voegen. Pipetteer de celsuspensie op en neer om het celherstel te maximaliseren en breng over in een nieuwe buis. Was de putten met 1 ml isolatiemedium en voeg het toe aan de eerste collectie.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten op 800-1200 × g, aspireer het supernatant en resuspendeer de cellen in 3-5 ml van het isolatiemedium. Tel de cellen en verdun ze tot de gewenste einddichtheid.
OPMERKING: Bijvoorbeeld, 50.000-80.000 cellen/ml (2,5, 1 en 0,5 ml voor respectievelijk 6-, 12- en 24-putplaten) zullen resulteren in volledig samenvloeiende putten binnen 72-96 uur. - Aspireer de coatingoplossing in stap 3.3 en was overtollige gelatine af met PBS. Zaai de cellen en breng de platen terug naar de incubator totdat ze volledig samenvloeien.
4. Differentiatie van witte en bruine preadipocyten (dag 7 - 12)
- Wanneer preadipocyten samenvloeien, aspireer het medium en vervang het door differentiatiemedium bestaande uit 10% FBS in DMEM met 170 nM insuline, 1 μM dexamethason en 0,5 mM 3-isobuthyl-1-methylxantine. Als u BBT-preadipocyten differentieert, voegt u ook 1 nM triiodothyronine (T3) toe. Markeer de dag waarop adipogene differentiatie wordt geïnduceerd als dag 0 van differentiatie.
OPMERKING: Zowel witte als bruine preadipocyten kunnen spontaan differentiëren bij het bereiken van samenvloeiing. Om de adipocytdifferentiatie te maximaliseren, moet echter de hierboven beschreven traditionele pro-adipogene cocktail (plus T3 voor BBT-preadipocyten) worden gebruikt. - Ververs na 48 uur (dag 2 differentiatie) het medium met onderhoudsmedium bestaande uit 10% FBS in DMEM en 170 nM insuline (plus 1 nM T3 voor BBT).
OPMERKING: Op dag 2 kunnen kleine lipidedruppeltjes die zich ophopen in de cellen onder de microscoop worden waargenomen met behulp van een standaard helder veld. - Herhaal stap 4.2 eens in de 2 dagen totdat cellen worden gebruikt voor experimenten.
OPMERKING: Op dag 4 of 5 van differentiatie verschijnen de meeste cellen vol lipiden. Terminaal onderscheidende adipocyten kunnen langer in cultuur worden gehouden of in dit stadium voor experimenten worden gebruikt.
5. Re-plating voor bio-energetische experimenten
OPMERKING: Als het de bedoeling is om bio-energetische studies uit te voeren in volwassen adipocyten in het 96-well-formaat, moeten de volgende stappen worden genomen. Idealiter moeten cellen worden gebruikt die net volledig zijn gedifferentieerd (dag 4 of 5). De hieronder beschreven procedure begint bij 1 put van een 6-put plaat.
- Bereid de coating voor op 96-wells platen voordat u de trypsine verteert. Voeg 50 μL gelatine van 0,1% toe aan elke put. Laat de plaat in een weefselkweek-incubator totdat de cellen klaar zijn om te worden gezaaid.
- Op dag 4 of 5 van differentiatie, aspireer het medium, was met 1 ml PBS en voeg 300 μL 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetrazijnzuur toe (voor 1 put van een 6-putplaat). Kantel de plaat voorzichtig om ervoor te zorgen dat trypsine de bodem van de put volledig bedekt; incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Blokkeer de werking van trypsine met 700 μL onderhoudsmedium, pipet op en neer om het celherstel te maximaliseren en breng de celsuspensie over in een nieuwe buis van 1,5 ml.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten op 1200 × g. Verwijder het supernatant, resuspend de pellet in 1 ml onderhoudsmedium en tel de cellen.
OPMERKING: Een put van een 6-put plaat moet ongeveer 1,5-1,8 miljoen cellen opleveren. - Verdun de cellen tot een eindconcentratie van 60.000 tot 80.000 cellen/ml voor bruine adipocyten en 100.000 tot 120.000 cellen/ml voor witte adipocyten. Plaat 100 μL van de celsuspensie per put in gelatine gecoate 96-putplaten.
OPMERKING: Een put van een 6-put plaat biedt voldoende cellen voor maximaal twee 96-put platen. Voor bio-energetische experimenten is plateren met lage dichtheid (30-40% samenvloeiing) nodig om de nauwkeurige meting van het zuurstofverbruik mogelijk te maken en zuurstoftekort in de putten tijdens de test te voorkomen. - Laat de cellen minstens 48 uur aan de onderkant van de plaat hechten. Als cellen langer dan 48 uur in de plaat worden bewaard, ververst u het medium na 2 dagen.
- Op de dag van de test, aspireer het medium en vervang het door assay medium. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C in een niet-CO2-gestuurdeincubator en voer de test uit volgens de instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sectie 1 van het protocol zal een heterogene suspensie opleveren van cellen die zichtbaar zijn onder een standaard lichtmicroscoop. Het filteren van verteerd weefsel met een celzeef (sectie 2) zal onverteerd weefsel verwijderen. Sommige cellulaire brokstukken, bloedcellen en volwassen adipocyten zullen echter passeren (Figuur 1C). Zachte wasbeurten 1 uur na het plateren zullen niet-relevante cellen verwijderen, omdat preadipocyten zich snel aan de bodem van de put hechten (figuur 1C). In rubriek 3 worden adipocytprecursoren uitgebreid om het aantal cellen te verkrijgen dat nodig is voor het experimentele plan. Hoewel zowel witte als bruine preadipocyten geïsoleerd van pasgeboren jongen een hoge proliferatieve capaciteit hebben, is de opbrengst van witte preadipocyten over het algemeen tweemaal zo hoog als die van bruine preadipocyten per depot (figuur 2A). Daarom, als gesynchroniseerde culturen gewenst zijn, moet de startdichtheid van witte preadipocyten dienovereenkomstig worden berekend. Sectie 4 biedt richtlijnen voor het verkrijgen van volgroeide adipocyten.
Aan het einde van de differentiatie verschijnen cellen geladen met lipidedruppels en drukken ze klassieke markers uit van respectievelijk witte en bruine adipocyten (figuur 2B,C). Zowel witte als bruine adipocyten kunnen worden gebruikt voor bio-energetische studies zoals beschreven in rubriek 5. Een vergelijkende analyse van het zuurstofverbruik in een mitochondriale stresstest van primaire witte en bruine adipocyten onder basale omstandigheden, evenals als reactie op bekende stimulatoren van de mitochondriale functie (bv. noradrenaline) is weergegeven in figuur 2D. Bij isolatie is het ook mogelijk om primaire witte en bruine adipocyten te onderscheiden op de platen die direct zullen worden gebruikt voor bio-energetische experimenten19. In dit geval worden preadipocyten geïsoleerd en geplateerd zoals beschreven in de secties 1 en 2. Wanneer cellen samenvloeien, worden ze geïnduceerd om te differentiëren zoals beschreven in sectie 4 totdat ze terminale differentiatie bereiken en klaar zijn voor bio-energetische analyse. Deze procedure is gebruikelijk voor een 24-well plaatformaat, maar minder voor 96-well platen.
Figuur 1: Verzameling en verwerking van vetkussens. (A) Schematische weergave van primaire witte (boven) en bruine (onderste) adipocyt isolatie. (B) Onderhuidse witte (boven) en bruine (onderste) vetdepots. Bij P0 muizen is onderhuids WAT bijna onzichtbaar, maar wordt te onderscheiden op ~dag 2 na de geboorte. BAT daarentegen heeft zelfs bij P0 een uitgesproken donkere kleur. Bij oudere pups is de BBT omgeven door een dunne oppervlakkige laag WAT, die verwijdering vereist wanneer het weefsel wordt ontleed. (C) Representatieve beelden van primaire witte en bruine precursorcellen na filtratie door de 100 μm celzeef, na de eerste wasbeurten en 24 uur na isolatie. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: WAT = wit vetweefsel; BBT = bruin vetweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Differentiatie van adipocyt-voorlopers. (A) Gemiddeld aantal subcutane WAT- en BBT-preadipocyten verkregen per pasgeboren (P0) pup. (B) Representatieve afbeeldingen van terminaal gedifferentieerde witte en bruine adipocyten. Voor fluorescentiebeeldvorming werden cellen geïncubeerd met Nile Red en Hoechst 33342 om respectievelijk neutrale lipiden en kernen te beitsen. Schaalstaven = 100 μm.(C) Genexpressieanalyse van klassieke adipocytmarkers, wit-beige markers en bruinspecifieke markers in primaire witte en bruine adipocyten gedifferentieerd gedurende 6 dagen (n=3). Voor elk gen is de BBT-expressie relatief ten opzichte van WAT-niveaus (ingesteld op 1). (D) OCR van witte en bruine adipocyten in een mitochondriale stresstest en als reactie op noradrenaline (n=3). Bruine adipocyten vertonen ontkoppelde ademhaling en een robuuste reactie op noradrenaline, terwijl witte adipocyten weinig ontkoppelde ademhaling vertonen en geen significante reactie op adrenerge stimulatie. *p<0,05; **p<0,01, bepaald door de t-toets van de tweezijdigestudent. Afkortingen: WAT = wit vetweefsel; BBT = bruin vetweefsel; OCR = zuurstofverbruik; Oligo = oligomycine; FCCP = carbonylcyanide-4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon; RAA = rotenon, antimycine A; PPARγ = peroxisome proliferator-geactiveerd receptor gamma; Acrp30 = adipocyt complement-gerelateerd eiwit van 30 kDa; Fabp4 = vetzuurbindend eiwit 4; Glut4 = glucosetransporter 4; Cd36 = cluster van differentiatie 36; Retn = weerstand; Slc27a1 = solute carrier family 27 lid 1; Ear2 = eosinofiel geassocieerd, ribonuclease A familie 2; Pgc1a = PPARγ coactivator 1alpha; Prdm16 = positief regulerend domein I-bindende factor 1 (PRDI-BF1) en retinoblastoom eiwit-interagerend zinkvinger gen 1 (RIZ1) homologe domein met 16; Eva1 = epitheel V-achtig antigeen 1; Cidea = celdood-inducerende DNA fragmentatie factor-alfa-achtige effector A; Ucp1 = ontkoppeling van eiwit 1; Dio2 = type 2 deiodinase. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vetweefsel is van cruciaal belang voor systemische insulinegevoeligheid en glucosehomeostase20. Obesitas-gebonden adipocyt dysfunctie is nauw geassocieerd met het begin van type 2 diabetes. Daarom kan een beter begrip van de basisbiologie en fysiologie van vetweefsel het ontwerp van nieuwe behandelingen voor metabole aandoeningen mogelijk maken. Als aanvulling op directe functionele en transcriptieanalyse van volwassen adipocyten geïsoleerd uit vetdepots21,22, is aangetoond dat gekweekte primaire adipocyten veel aspecten van de pathofysiologie van vetweefsel samenvatten, waaronder afscheiding van adipokines, resistentie tegen insuline als reactie op pro-inflammatoire stimuli en inductie van het thermogene programma 23,24,25. Hoewel eerdere protocollen de isolatie van adipocytprecursoren van volwassen muizen11,12hebben beschreven, biedt dit protocol een methode voor de efficiënte isolatie van cellen van pasgeboren pups. Deze strategie levert een aanzienlijk grotere populatie witte en bruine adipocyt-voorlopers op met een hoger differentiatiepotentieel, omdat postnatale vetdepots nog steeds relatief ongedifferentieerd zijn in vergelijking met de vetdepots van volwassen muizen26. Bovendien zijn cellen die met deze methode zijn geïsoleerd al toegewijd en leveren ze volledig functionele gedifferentieerde adipocyten op die markers van volwassen cellen uitdrukken en hun unieke fysiologische kenmerken vertonen, waaronder lipidenopslag en thermogene capaciteit.
Primaire cellen kunnen niet voor onbepaalde tijd in vitro worden uitgebreid. Bovendien beginnen primaire preadipocyten hun adipogeen potentieel te verliezen na verschillende passages in de cultuur. Dit komt waarschijnlijk omdat continue celkweek resulteert in een intrinsieke verrijking van minder geëngageerde, meer proliferatieve cellen. Een beperking van dit protocol is dus het tijdsvenster waarin preadipocyten kunnen worden gebruikt. Adipogeen potentieel wordt volledig behouden als cellen worden geïnduceerd om te differentiëren binnen 7-8 dagen vanaf het moment van isolatie. Adipocyt-voorlopers zijn bijzonder resistent tegen enzymatische spijsvertering, maar het is niettemin belangrijk om de collagenasebehandeling correct te timen. Overdigestie van weefsels kan leiden tot verminderde celoverleving en verminderd vermogen van cellen om zich aan de plaat te hechten. Gedurende de expansiefase zijn zowel witte als bruine preadipocyten sterk aanhangend en kunnen krachtige wasbeurten en frequente media-uitwisseling verdragen. Het gebruik van gecoate platen wordt echter aanbevolen wanneer preadipocyten worden geïnduceerd om te differentiëren. Volwassen, met lipiden beladen adipocyten hebben een verminderde oppervlakteadhesie en celcelinteracties, wat resulteert in de neiging om los te komen tijdens differentiatie, tenzij voorzichtig behandeld. De meest delicate stap van het protocol is de inductie van differentiatie. FBS, insuline, T3 en andere geneesmiddelen moeten worden getest en hun uiteindelijke concentraties moeten worden geoptimaliseerd om de hoogste mate van differentiatie te verkrijgen. Een PPARγ-agonist (bijv. rosiglitazon) kan ook worden toegevoegd om adipogenese verder te stimuleren.
Het is belangrijk op te merken dat de differentiatievoorwaarden kunnen worden aangepast aan de experimentele behoeften. Bijvoorbeeld, in schermen met genetische of chemische bibliotheken die zijn ontworpen om eiwitten / verbindingen te identificeren die de witte en / of bruine adipocytdifferentiatie verbeteren, kunnen preadipocyten worden geïnduceerd om te differentiëren met behulp van een minimaal permissief medium dat alleen 10% FBS in DMEM en 170 nM insuline bevat. Beoordeling van elk onderdeel van de differentiatiecocktail wordt aanbevolen om ideale testvensters voor differentiatietesten te bepalen. T3 en dexamethason zijn dispensable voor primaire witte en bruine adipocytdifferentiatie. Deze omstandigheden zullen zorgen voor een lage mate van differentiatie in controlecellen, waardoor het venster van de test wordt vergroot en het vermogen om pro-adipogene factoren te detecteren wordt gemaximaliseerd. Culturen van primaire bruine en witte adipocyten zijn een krachtig hulpmiddel om adipocytcel-autonome functie te ondervragen als reactie op genetische manipulatie en metabolische spanningen als aanvulling op de studie van bruin en wit vetweefsel in vivo. Daarom zijn protocollen voor isolatie en kweek van primaire preadipocyten nodig om reproduceerbare onderzoeken met hoge doorvoer van adipocytfunctie in vitro mogelijk te maken. De hier beschreven strategie maakt het mogelijk om primaire witte en bruine preadipocyten te bestuderen die kunnen worden onderscheiden in volgroeide adipocyten en kunnen worden getest onder een verscheidenheid aan experimentele manipulaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs zijn Cristina Godio van het Centro Nacional de Biotecnología in Madrid, Spanje, Mari Gantner van het Scripps Research Institute, La Jolla en Anastasia Kralli van de Johns Hopkins University in Baltimore dankbaar voor hun hulp bij het optimaliseren van dit protocol op basis van het eerste werk van Kahn et al.18. Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidies DK114785 en DK121196 aan E.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
- Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
- Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
- Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
- Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
- Lynes, M. D., Tseng, Y. H.
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).
- Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
- Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
- Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
- Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).
- Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
- Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
- Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
- Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).
