Summary
Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur gleichzeitigen Isolierung von primären braunen und weißen Präadipozyten von neugeborenen Mäusen. Isolierte Zellen können in Kultur gezüchtet und dazu gebracht werden, sich in voll ausgereifte weiße und braune Adipozyten zu differenzieren. Die Methode ermöglicht die genetische, molekulare und funktionelle Charakterisierung primärer Fettzellen in Kultur.
Abstract
Das Verständnis der Mechanismen, die der Differenzierung und Funktion von Adipozyten zugrunde liegen, hat durch die Verwendung immortalisierter weißer Präadipozytenzelllinien stark profitiert. Diese kultivierten Zelllinien haben jedoch Einschränkungen. Sie erfassen nicht vollständig das vielfältige funktionelle Spektrum der heterogenen Adipozytenpopulationen, von denen heute bekannt ist, dass sie in weißen Fettdepots existieren. Um ein physiologisch relevanteres Modell zur Untersuchung der Komplexität von weißem Fettgewebe bereitzustellen, wurde ein Protokoll entwickelt und optimiert, um die gleichzeitige Isolierung primärer weißer und brauner Adipozytenvorläufer von neugeborenen Mäusen, ihre schnelle Expansion in Kultur und ihre Differenzierung in vitro in reife, voll funktionsfähige Adipozyten zu ermöglichen. Der Hauptvorteil der Isolierung von Primärzellen von Neugeborenen und nicht von erwachsenen Mäusen besteht darin, dass sich die Fettdepots aktiv entwickeln und daher eine reiche Quelle für proliferierende Präadipozyten sind. Primäre Präadipozyten, die mit diesem Protokoll isoliert wurden, differenzieren sich schnell nach Erreichen der Konfluenz und werden in 4-5 Tagen vollständig ausgereift, ein zeitliches Fenster, das das Auftreten von entwickelten Fettpolstern bei neugeborenen Mäusen genau widerspiegelt. Primärkulturen, die mit dieser Strategie hergestellt wurden, können mit hoher Reproduzierbarkeit erweitert und untersucht werden, wodurch sie für genetische und phänotypische Screens geeignet sind und die Untersuchung der zellautonomen Adipozytenphänotypen genetischer Mausmodelle ermöglichen. Dieses Protokoll bietet einen einfachen, schnellen und kostengünstigen Ansatz, um die Komplexität von Fettgewebe in vitro zu untersuchen.
Introduction
Fettleibigkeit resultiert aus einem chronischen Ungleichgewicht zwischen Energieaufnahme und Energieverbrauch. Wenn sich Fettleibigkeit entwickelt, durchlaufen weiße Adipozyten eine massive Expansion der Zellgröße, die zu Hypoxie in der Mikroumgebung, Zelltod, Entzündung und Insulinresistenzführt 1. Dysfunktionale, hypertrophierte Adipozyten können überschüssige Lipide nicht richtig speichern, die sich stattdessen in anderen Geweben ansammeln, wo sie die Insulinwirkung2,3dämpfen. Es wird vorhergesagt, dass Mittel, die die Funktion der Adipozyten verbessern und die normale Lipidaufteilung zwischen den Geweben wiederherstellen, für die Behandlung von Adipositas-assoziierten Erkrankungen, die durch Insulinresistenz gekennzeichnet sind, wie Typ-2-Diabetes, von Vorteil sind. Phänotypische Screens in Adipozyten mit immortalisierten Zelllinien wie 3T3-L1, F442A und 10T 1/2 haben sich als nützlich erwiesen, um genetische Faktoren zu identifizieren, die die Adipogenese regulieren, und um pro-adipogene Moleküle mit antidiabetischen Eigenschaften zu isolieren4,5,6,7. Diese Zelllinien spiegeln jedoch nicht vollständig die Heterogenität der Zelltypen wider, die in Fettdepots vorhanden sind, zu denen weiße, braune, beige und andere Adipozytensubtypen mit einzigartigen Eigenschaften gehören, die alle zur systemischen Homöostase beitragen8,9,10. Darüber hinaus zeigen kultivierte Zelllinien oft eine verminderte Reaktion auf äußere Reize.
Im Gegensatz dazu rekapitulieren Kulturen primärer Adipozyten die Komplexität der In-vivo-Adipogenese genauer, und primäre Adipozyten zeigen robuste funktionelle Reaktionen. Primäre Präadipozyten werden typischerweise aus der stromalen vaskulären Fraktion der Fettdepots erwachsener Mäuse isoliert11,12,13,14. Da die Fettdepots erwachsener Tiere jedoch hauptsächlich aus voll ausgereiften Adipozyten bestehen, die eine sehr langsame Fluktuationsrate15,16,17aufweisen, ergibt dieser Ansatz eine begrenzte Menge an Präadipozyten mit einer niedrigen Proliferationsrate. Daher ist die Isolierung von Präadipozyten von neugeborenen Mäusen vorzuziehen, um große Mengen schnell wachsender Zellen zu erhalten, die in vitro differenziert werden können. Hier wurde ein Protokoll beschrieben, inspiriert von den ersten Arbeiten mit primären braunen Adipozyten von Kahn et al.18, um sowohl weiße als auch braune Präadipozyten effizient zu isolieren, die in vitro zu voll funktionsfähigen primären Adipozyten expandiert und differenziert werden können (Abbildung 1A). Der Vorteil der Isolierung von Primärzellen von Neugeborenen im Gegensatz zu erwachsenen Mäusen besteht darin, dass die Fettdepots schnell wachsen und somit eine reiche Quelle für aktiv proliferierende Präadipozyten sind17. Zellen, die mit diesem Protokoll isoliert wurden, haben eine hohe Proliferativkapazität, was ein schnelles Scale-up von Kulturen ermöglicht. Darüber hinaus weisen Präadipozyten von neugeborenen Welpen ein höheres Differenzierungspotenzial auf als erwachsene Vorläufer, was die Well-to-Well-Variabilität im Differenzierungsumfang reduziert und damit die Reproduzierbarkeit erhöht.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt allen IACUC-Richtlinien des Scripps Research Institute und der University of Wisconsin - Madison School of Medicine and Public Health.
1. Sammlung und Verdauung von Fettdepots (Tag 1)
- Bereiten Sie zwei 1,5 ml Röhrchen für jeden Welpen vor: einen für braunes Fettgewebe (BAT) und einen für weißes Fettgewebe (WAT). 250 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) + 200 μL 2x Isolationspuffer (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2,5 mM Glucose, 100 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES), Penicillin-Streptomycin und 4% fettsäurefreies Rinderserumalbumin) werden in jedes Röhrchen gegeben. Halten Sie lösungen steril und auf Eis.
- Legen Sie die Welpen in kleine Kammern (z. B. einen Brunnen einer 6-Well-Platte) und legen Sie sie auf Eis, bis sie unterkühlt sind. Achten Sie darauf, dass kein direkter Kontakt zwischen den Welpen und dem Eis besteht. Stechen Sie eine Pfote mit einer Spitze, um den Verlust des Bewusstseins zu gewährleisten, und euthanasieren Sie die Welpen durch Enthauptung mit einer scharfen Schere.
HINWEIS: Wenn Sie mit verschiedenen Genotypen arbeiten, bereiten Sie ein zusätzliches Röhrchen vor, um eine Schwanzbiopsie (3 mm Schnitt) für die Genotypisierung zu sammeln. Wenn die Genotypisierung sofort durchgeführt wird, halten Sie die eingeschläferten Welpen bis zur Dissektion auf Eis, um Fettdepots zu sammeln. - Berechnen und wiegen Sie die Menge an Kollagenase ab, die benötigt wird, um alle Depots zu verdauen. 50 μL 15 mg/ml Kollagenase Typ I in 2x Isolationspuffer in jedes Röhrchen geben. Die Kollagenase im Isolationspuffer nicht wieder aufschnüsen, bis alle Gewebe gesammelt wurden.
- Um subkutane WAT zu sammeln, schneiden Sie die Haut um den Bauch des Welpen (peritonealen Bruch vermeiden) und ziehen Sie die Haut sanft unter die Beine. Ohne die Haut zu nehmen, sammeln Sie vorsichtig das Fettdepot, das als klares (P1 oder jünger) oder weißes (P2 und älter) dünnes, längliches Gewebe erscheint, das auf der Innenseite oder auf der Oberseite des Quadrizeps befestigt ist (Abbildung 1B). Spülen Sie das Fettdepot in PBS aus und legen Sie es in eines der Röhrchen mit 250 μL PBS + 200 μL 2x Isolationspuffer. Bleibe auf Eis.
HINWEIS: P0- und P1-Mäuse liefern den besten Ertrag. Bei P0-1-Welpen ist das subkutane WAT-Depot nahezu transparent. Bei P2-Mäusen und älteren Ist das Depot leichter zu identifizieren, da es bereits weiß wird, was auf das Vorhandensein von voll ausgereiften, lipidbeladenen, weißen Adipozyten hinweist. - Um interskapuläre BAT zu sammeln, ziehen Sie die Haut von den Schulterblättern über den Kopf. Heben Sie die BAT - das tiefrote Gewebe zwischen den Schulterblättern - an und machen Sie vorsichtig Einschnitte um sie herum, um sie vom Körper zu lösen (Abbildung 1B). Überprüfen Sie auf Konsistenz und Farbe; mit PBS abspülen; Legen Sie es in das andere Röhrchen mit 250 μL PBS + 200 μL 2x Isolationspuffer; und auf Eis bleiben.
HINWEIS: Wenn Sie BAT von P2-Mäusen und älteren Mäusen entnehmen, entfernen Sie vorsichtig das weiße Fettgewebe, das die BAT umgibt. Es besteht aus einem dünnen, weichen, weißen Blatt von Adipozyten, das sich zwischen der Haut und der BAT befindet, die tiefer zwischen den Schulterblättern liegt. - Sobald alle Depots gesammelt sind, hacken Sie jedes Depot vorsichtig (4-6 mal) mit einer kleinen Schere direkt in den Röhren.
- Kollagenase Typ I im entsprechenden Volumen des 2x Isolationspuffers resuspendieren, um eine 10x Stammlösung bei 15 mg/ml zu erhalten. Fügen Sie 50 μL 10x Kollagenase zu jeder Röhre hinzu und halten Sie die Röhrchen auf Eis, bis Kollagenase zu allen Röhrchen hinzugefügt wurde.
- Kehren Sie die Rohre schnell um, um sie zu mischen, und übertragen Sie sie auf einen temperaturgesteuerten Mischer. Inkubieren Sie die Proben für 30 min bei 37 °C auf einem Shaker (1.400 U/min Frequenz für effektives Probenmischen).
2. Beschichtung von Präadipozyten (Tag 1)
- Nachdem Sie das Gewebe verdaut haben, legen Sie die Schläuche wieder auf Eis.
HINWEIS: Ab diesem Schritt werden alle Arbeiten unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt. - Das verdaute Gewebe durch ein 100 μm Zellsieb in neue 50 ml Röhrchen abseihen. Wenn Sie nur mit WT-Mäusen arbeiten oder wenn Genotypen bekannt sind, bündeln Sie die relevanten, dissoziierten BATs zusammen; Wiederholen Sie dies für die WATs. Um die Zellausbeute zu maximieren, spülen Sie jedes Röhrchen mit 1 ml Isolationsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM) + 20% fetales Rinderserum (FBS), 10 mM HEPES, 1% Penicillin-Streptomycin) und filtern Sie es durch das Zellsieb. Wenn Sie mit unbekannten Genotypen arbeiten, fahren Sie mit Schritt 2.4 fort
HINWEIS: FBS ist eine wesentliche Determinante sowohl der Präadipozytenproliferation als auch der Differenzierung. Testen Sie verschiedene FBS-Lots rigoros, um eine hohe Leistung und Konsistenz zwischen den Lots sicherzustellen. - Verdünnen Sie BAT- und WAT-Suspensionen auf Platte 2-3 Vertiefungen einer 6-Well-Platte für jede BAT-Probe und 4-6 Wells einer 6-Well-Platte für jede WAT-Probe. Wenn beispielsweise 6 BATs und 6 WATs zusammengepoolt wurden, verdünnen Sie die BAT-Zellsuspension auf 24-36 ml und die WAT-Zellsuspension auf 48-72 ml. Platte 2 mL der Zellsuspensionen pro Vertiefung.
- Bei Proben mit unbekannten Genotypen jede Probe separat aufbewahren; Legen Sie ein 100 μm Zellsieb auf jede Vertiefung einer 6-Well-Platte und filtern Sie eine Probe pro Vertiefung. Spülen Sie das Röhrchen mit 1,5 ml Isolationsmedium ab und führen Sie es durch das Sieb, wodurch das endde Volumen auf 2 ml pro Vertiefung fällt. Entsorgen Sie das Zellsieb, legen Sie den Deckel auf die Platte und übertragen Sie die Platte in den Inkubator.
HINWEIS: Das Medium in den Vertiefungen sollte aufgrund von schwimmenden Blutzellen, Zelltrümmern und Lipiden aus lysierten Zellen trüb aussehen. - 1-1,5 h nach dem Plattieren, Medien absaugen und mit 2 ml DMEM ohne Serum waschen. Rühren Sie die Platte vorsichtig auf, um Blutzellen vom Boden der Vertiefungen zu lösen. Nach 3 Wäschen 2 ml frisches Isolationsmedium hinzufügen und die Zellen in den Inkubator (37 °C, 5% CO2) überführen.
HINWEIS: Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Schwimmendes Material (Blutzellen, Zelltrümmer) sollte minimal sein. Braune Präadipozyten erscheinen als kleine nicht durchscheinende Zellen, während weiße Präadipozyten eine länglichere Form aufweisen. Sowohl braune als auch weiße Präadipozyten sollten fest an der Platte befestigt werden.
3. Erweiterung der Präadipozytenkultur (Tag 2 bis Tag 5)
- Am nächsten Tag das Medium absaugen, die Zellen mit 2 ml DMEM ohne Serum waschen und 2 ml des Isolationsmediums wieder hinzufügen.
- Wiederholen Sie Schritt 3.1 einmal alle 2 Tage, bis die Zellen 80-90% Konfluenz erreichen.
HINWEIS: Bei primären braunen Präadipozyten kann das Erreichen von 80-90% Konfluenz 4-5 Tage dauern. Für primäre weiße Präadipozyten dauert es normalerweise 2-3 Tage. Sobald die Präadipozyten 60% Konfluenz erreicht haben, können sie effizient mit Viruspartikeln für Knockdown- oder Überexpressionsexperimente infiziert werden. Präadipozyten mit einer entsprechenden Viruslast für bis zu 8 h infizieren. Von der Verwendung kationischer Polymere zur Steigerung der Infektionseffizienz wird abgeraten, da dies häufig zu Toxizität und zu einer signifikanten Verringerung des adirogenen Potenzials infizierter Präadipozyten führt. - Um die Zellen zu spalten, beschichten Sie neue Zielplatten mit einer sterilen Lösung von 0,1% w/v Gelatine (gelöst in destilliertem Wasser; keine Hitze verwenden). Verwenden Sie genügend Volumen, um den Boden des Brunnens / der Schüssel abzudecken. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C, bis die Zellen zur Aussaat bereit sind (mindestens 10 min).
HINWEIS: Dieser Schritt ist optional. Die Beschichtung von Zellkulturplatten hat keinen Einfluss auf die Ausbeute oder das Differenzierungspotenzial, vereinfacht jedoch die Aufrechterhaltung und Handhabung differenzierender Adipozyten erheblich. - Wenn die Zellen eine subkonfluente Dichte (85-95%) erreichen, saugen Sie das Medium ab, waschen Sie es mit PBS und fügen Sie Trypsin für 3 Minuten hinzu, um die Zellen zu lösen. Blockieren Sie die Trypsinaktivität, indem Sie das 2,5-fache Trypsinvolumen des Isolationsmediums hinzufügen. Pipetten Sie die Zellsuspension nach oben und unten, um die Zellerholung zu maximieren, und übertragen Sie sie in ein neues Röhrchen. Waschen Sie die Vertiefungen mit 1 ml Isolationsmedium und fügen Sie es der ersten Sammlung hinzu.
- Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 800-1200 × g,saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie die Zellen in 3-5 ml des Isolationsmediums. Zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie sie auf die gewünschte Enddichte.
HINWEIS: Zum Beispiel führen 50.000-80.000 Zellen / ml (2,5, 1 und 0,5 ml für 6-, 12- und 24-Well-Platten) zu vollständig konfluenten Vertiefungen innerhalb von 72-96 h. - Saugen Sie die Beschichtungslösung in Schritt 3.3 an und waschen Sie überschüssige Gelatine mit PBS ab. Säen Sie die Zellen aus und bringen Sie die Platten in den Inkubator zurück, bis sie vollständig zusammenfließen.
4. Differenzierung von weißen und braunen Präadipozyten (Tage 7 - 12)
- Wenn Präadipozyten konfluent werden, aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie es durch ein Differenzierungsmedium, das aus 10% FBS in DMEM besteht, das 170 nM Insulin, 1 μM Dexamethason und 0,5 mM 3-Isobuthyl-1-methylxanthan enthält. Wenn Sie BAT-Präadipozyten differenzieren, fügen Sie auch 1 nM Trijodthyronin (T3) hinzu. Markieren Sie den Tag, an dem die adipogene Differenzierung induziert wird, als Tag 0 der Differenzierung.
HINWEIS: Sowohl weiße als auch braune Präadipozyten können sich spontan unterscheiden, wenn sie zusammentreffen. Um jedoch die Differenzierung der Adipozyten zu maximieren, sollte der oben beschriebene traditionelle pro-adipogene Cocktail (plus T3 für BAT-Präadipozyten) verwendet werden. - Nach 48 h (Tag 2 der Differenzierung) erfrischen Sie das Medium mit einem Erhaltungsmedium, das aus 10% FBS in DMEM und 170 nM Insulin (plus 1 nM T3 für BAT) besteht.
HINWEIS: An Tag 2 können kleine Lipidtröpfchen, die sich in den Zellen unter dem Mikroskop ansammeln, mit Standard-Hellfeld beobachtet werden. - Wiederholen Sie Schritt 4.2 einmal alle 2 Tage, bis die Zellen für Experimente verwendet werden.
HINWEIS: Am Tag 4 oder 5 der Differenzierung erscheint die Mehrheit der Zellen mit Lipiden beladen. End differenzierende Adipozyten können länger in Kultur gehalten oder in diesem Stadium für Experimente verwendet werden.
5. Re-Plating für bioenergetische Experimente
HINWEIS: Wenn die Absicht besteht, bioenergetische Studien an reifen Adipozyten im 96-Well-Format durchzuführen, müssen die folgenden Schritte unternommen werden. Idealerweise sollten Zellen verwendet werden, die gerade vollständig differenziert sind (Tag 4 oder 5). Das unten beschriebene Verfahren beginnt mit 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte.
- Bereiten Sie vor dem Trypsin-Aufschluss die Beschichtung für 96-Well-Platten vor. Fügen Sie 50 μL 0,1% Gelatine zu jeder Vertiefung hinzu. Lassen Sie die Platte in einem Gewebekultur-Inkubator, bis die Zellen bereit sind, ausgesät zu werden.
- Am Tag 4 oder 5 der Differenzierung das Medium absaugen, mit 1 ml PBS waschen und 300 μL 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (für 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte) hinzufügen. Neigen Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass Trypsin den Boden des Brunnens vollständig bedeckt. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren. Blockieren Sie die Wirkung von Trypsin mit 700 μL Erhaltungsmedium, pipetten Sie nach oben und unten, um die Zellerholung zu maximieren, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1200 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Erhaltungsmedium und zählen Sie die Zellen.
HINWEIS: Eine Vertiefung einer 6-Well-Platte sollte ungefähr 1,5-1,8 Millionen Zellen ergeben. - Verdünnen Sie die Zellen, um eine Endkonzentration von 60.000 bis 80.000 Zellen / ml für braune Adipozyten und 100.000 bis 120.000 Zellen / ml für weiße Adipozyten zu haben. Platte 100 μL der Zellsuspension pro Vertiefung in gelatinebeschichteten 96-Well-Platten.
HINWEIS: Eine Vertiefung einer 6-Well-Platte bietet genügend Zellen für bis zu zwei 96-Well-Platten. Für bioenergetische Experimente ist eine Beschichtung mit niedriger Dichte (30-40% Konfluenz) erforderlich, um die genaue Messung des Sauerstoffverbrauchs zu ermöglichen und Sauerstoffmangel in den Vertiefungen während des Assays zu vermeiden. - Lassen Sie die Zellen mindestens 48 h am Boden der Platte haften. Wenn die Zellen mehr als 48 Stunden in der Platte gehalten werden, erfrischen Sie das Medium nach 2 Tagen.
- Am Tag des Assays das Medium absaugen und durch ein Assaymedium ersetzen. Inkubieren Sie 1 h bei 37 °C ineinemnicht CO 2-kontrollierten Inkubator und führen Sie den Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
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Representative Results
Abschnitt 1 des Protokolls wird eine heterogene Suspension von Zellen ergeben, die unter einem Standard-Lichtmikroskop sichtbar sind. Durch das Filtern von verdautem Gewebe mit einem Zellsieb (Abschnitt 2) wird unverdautes Gewebe entfernt. Einige Zelltrümmer, Blutzellen und reife Adipozyten werden jedoch passieren (Abbildung 1C). Bei sanften Waschgängen 1 h nach dem Plattieren werden nicht relevante Zellen entfernt, da sich Präadipozyten schnell am Boden des Brunnens anlagern (Abbildung 1C). In Abschnitt 3 werden Die Adipozytenvorläufer erweitert, um die für den Versuchsplan erforderliche Anzahl von Zellen zu erhalten. Obwohl sowohl weiße als auch braune Präadipozyten, die aus neugeborenen Welpen isoliert wurden, eine hohe proliferative Kapazität haben, ist die Ausbeute an weißen Präadipozyten im Allgemeinen doppelt so hoch wie die von braunen Präadipozyten pro Depot (Abbildung 2A). Wenn also synchronisierte Kulturen gewünscht werden, muss die Ausgangsdichte der weißen Präadipozyten entsprechend berechnet werden. Abschnitt 4 bietet Richtlinien zur Gewinnung voll ausgereifter Adipozyten.
Am Ende der Differenzierung erscheinen Zellen mit Lipidtröpfchen beladen und exprimieren klassische Marker von weißen bzw. braunen Adipozyten (Abbildung 2B,C). Sowohl weiße als auch braune Adipozyten können für bioenergetische Studien verwendet werden, wie in Abschnitt 5 beschrieben. Eine vergleichende Analyse des Sauerstoffverbrauchs in einem mitochondrialen Stresstest von primären weißen und braunen Adipozyten unter basalen Bedingungen sowie als Reaktion auf bekannte Stimulatoren der mitochondrialen Funktion (z. B. Noradrenalin) ist in Abbildung 2Ddargestellt. Nach der Isolierung ist es auch möglich, primäre weiße und braune Adipozyten auf den Platten zu unterscheiden, die direkt für bioenergetische Experimente verwendet werden19. In diesem Fall werden Präadipozyten wie in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben isoliert und plattiert. Wenn Zellen konfluent werden, werden sie dazu gebracht, sich wie in Abschnitt 4 beschrieben zu differenzieren, bis sie die terminale Differenzierung erreichen und für die bioenergetische Analyse bereit sind. Dieses Verfahren ist für ein 24-Well-Plattenformat üblich, bei 96-Well-Platten jedoch weniger.
Abbildung 1: Sammlung und Verarbeitung von Fettpolstern. (A) Schematische Darstellung der primären weißen (oben) und braunen (unten) Adipozytenisolation. (B) Subkutane weiße (oben) und braune (unten) Fettdepots. Bei P0-Mäusen ist der subkutane WAT fast unsichtbar, wird aber am 2. Tag nach der Geburt unterscheidbar. Im Gegensatz dazu hat BAT auch bei P0 eine ausgeprägte dunkle Farbe. Bei älteren Welpen ist die BAT von einer dünnen oberflächlichen Schicht WAT umgeben, die entfernt werden muss, wenn das Gewebe seziert wird. (C) Repräsentative Bilder von primären weißen und braunen Vorläuferzellen nach der Filtration durch das 100 μm Zellsieb, nach den ersten Waschgängen und 24 h nach der Isolierung. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: WAT = weißes Fettgewebe; BAT = braunes Fettgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Differenzierung der Vorläufer von Adipozyten. (A) Durchschnittliche Anzahl subkutaner WAT- und BAT-Präadipozyten pro neugeborenem (P0) Welpen. (B) Repräsentative Bilder von terminal differenzierten weißen und braunen Adipozyten. Für die Fluoreszenzbildgebung wurden die Zellen mit Nilrot und Hoechst 33342 inkubiert, um neutrale Lipide bzw. Kerne zu färben. Skalenbalken = 100 μm.(C) Genexpressionsanalyse von klassischen Adipozytenmarkern, weiß-beigefarbenen Markern und braunen Markern in primären weißen und braunen Adipozyten, differenziert für 6 Tage (n=3). Für jedes Gen ist die BAT-Expression relativ zu den WAT-Werten (auf 1 gesetzt). (D) OCR von weißen und braunen Adipozyten in einem mitochondrialen Stresstest und als Reaktion auf Noradrenalin (n=3). Braune Adipozyten zeigen eine entkoppelte Atmung und eine robuste Reaktion auf Noradrenalin, während weiße Adipozyten wenig entkoppelte Atmung und keine signifikante Reaktion auf adrenerge Stimulation zeigen. *S<0.05; **S<0,01, ermittelt durch den zweiseitigen Student's t-Test. Abkürzungen: WAT = weißes Fettgewebe; BAT = braunes Fettgewebe; OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; Oligo = Oligomycin; FCCP = Carbonylcyanid-4-(Trifluormethoxy)phenylhydrazon; RAA = Rotenon, Antimycin A; PPARγ = Peroxisomen-Proliferator-aktivierter Rezeptor gamma; Acrp30 = Adipozytenkomplement-bezogenes Protein von 30 kDa; Fabp4 = fettsäurebindendes Protein 4; Glut4 = Glukosetransporter 4; Cd36 = Differenzierungscluster 36; Retn = Resistin; Slc27a1 = Familie der gelösten Träger 27 Mitglied 1; Ear2 = eosinophil-assoziiert, Ribonuklease A-Familie 2; Pgc1a = PPARγ-Koaktivator 1alpha; Prdm16 = positive regulatorische Domäne I-Bindungsfaktor 1 (PRDI-BF1) und Retinoblastom-Protein-interagierendes Zinkfingergen 1 (RIZ1) homologe Domäne mit 16; Eva1 = epitheliales V-ähnliches Antigen 1; Cidea = Zelltod-induzierender DNA-Fragmentierungsfaktor-alpha-like effector A; Ucp1 = Entkopplungsprotein 1; Dio2 = Typ 2 Deiodinase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Fettgewebe ist entscheidend für die systemische Insulinsensitivität und Glukoseöostase20. Adipositas-assoziierte Adipozyten-Dysfunktion ist eng mit dem Auftreten von Typ-2-Diabetes verbunden. Daher kann ein besseres Verständnis der grundlegenden Biologie und Physiologie des Fettgewebes die Entwicklung neuer Behandlungen für Stoffwechselstörungen ermöglichen. Als Ergänzung zur direkten funktionellen und transkriptionellen Analyse reifer Adipozyten, die aus Fettdepots21,22isoliert wurden, wurde gezeigt, dass kultivierte primäre Adipozyten viele Aspekte der Fettgewebepathophysiologie rekapitulieren, einschließlich der Sekretion von Adipokinen, der Insulinresistenz als Reaktion auf entzündungsfördernde Reize und der Induktion des thermogenen Programms23,24,25. Obwohl frühere Protokolle die Isolierung von Adipozytenvorläufern von erwachsenen Mäusen11,12beschrieben haben, bietet dieses Protokoll eine Methode zur effizienten Isolierung von Zellen von neugeborenen Welpen. Diese Strategie ergibt eine signifikant größere Population weißer und brauner Adipozytenvorläufer mit höherem Differenzierungspotenzial, da postnatale Fettdepots im Vergleich zu den Fettdepots erwachsener Mäuse noch relativ undifferenziert sind26. Darüber hinaus sind Zellen, die mit dieser Methode isoliert wurden, bereits gebunden und liefern voll funktionsfähige differenzierte Adipozyten, die Marker reifer Zellen exprimieren und ihre einzigartigen physiologischen Eigenschaften aufweisen, einschließlich Lipidspeicherung und thermogener Kapazität.
Primärzellen können in vitro nicht unbegrenzt expandiert werden. Darüber hinaus beginnen primäre Präadipozyten nach mehreren Passagen in Der Kultur ihr adipotenes Potenzial zu verlieren. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass die kontinuierliche Zellkultur zu einer intrinsischen Anreicherung von weniger engagierten, proliferativeren Zellen führt. Daher ist eine Einschränkung dieses Protokolls das Zeitfenster, in dem Präadipozyten verwendet werden können. Das adiporogene Potenzial bleibt vollständig erhalten, wenn die Zellen innerhalb von 7-8 Tagen nach dem Zeitpunkt der Isolierung zur Differenzierung gebracht werden. Adipozytenvorläufer sind besonders resistent gegen enzymatische Verdauung, aber es ist dennoch wichtig, die Kollagenase-Behandlung richtig zu timen. Überverdauung von Geweben kann zu einem verminderten Zellüberleben und einer verminderten Fähigkeit der Zellen führen, an der Platte zu haften. Während der gesamten Expansionsphase sind sowohl weiße als auch braune Präadipozyten stark haftend und vertragen kräftige Waschungen und häufigen Medienaustausch. Die Verwendung von beschichteten Platten wird jedoch empfohlen, wenn Präadipozyten zur Differenzierung veranlasst werden. Reife, lipidbeladene Adipozyten haben eine verminderte Oberflächenadhäsion und Zell-Zell-Interaktionen, was zu einer Tendenz führt, sich während der Differenzierung zu lösen, wenn sie nicht sanft gehandhabt werden. Der heikelste Schritt des Protokolls ist die Induktion der Differenzierung. FBS, Insulin, T3 und andere Medikamente müssen getestet und ihre Endkonzentrationen optimiert werden, um ein Höchstmaß an Differenzierung zu erzielen. Ein PPARγ-Agonist (z. B. Rosiglitazon) kann ebenfalls hinzugefügt werden, um die Adipogenese weiter zu stimulieren.
Es ist wichtig zu beachten, dass die Differenzierungsbedingungen an die experimentellen Bedürfnisse angepasst werden können. Zum Beispiel können in Screens mit genetischen oder chemischen Bibliotheken, die proteine / verbindungen identifizieren sollen, die die Differenzierung weißer und / oder brauner Adipozyten verbessern, Präadipozyten dazu gebracht werden, sich mit einem minimalen permissiven Medium zu differenzieren, das nur 10% FBS in DMEM und 170 nM Insulin enthält. Die Bewertung jeder Komponente des Differenzierungscocktails wird empfohlen, um ideale Assay-Fenster für Differenzierungsassays zu bestimmen. T3 und Dexamethason sind für die primäre Differenzierung weißer und brauner Adipozyten entbehrlich. Diese Bedingungen sorgen für eine geringe Differenzierungsrate in Kontrollzellen, wodurch das Zeitfenster des Assays vergrößert und die Fähigkeit zum Nachweis pro-adipogener Faktoren maximiert wird. Kulturen primärer brauner und weißer Adipozyten sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die autonome Funktion von Adipozytenzellen als Reaktion auf genetische Manipulation und metabolische Belastungen zu untersuchen, um die Untersuchung von braunem und weißem Fettgewebe in vivo zu ergänzen. Daher werden Protokolle zur Isolierung und Kultur primärer Präadipozyten benötigt, um reproduzierbare Hochdurchsatzuntersuchungen der Adipozytenfunktion in vitro zu ermöglichen. Die hier beschriebene Strategie ermöglicht die Untersuchung primärer weißer und brauner Präadipozyten, die in voll ausgereifte Adipozyten differenziert und unter einer Vielzahl von experimentellen Manipulationen getestet werden können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Cristina Godio vom Centro Nacional de Biotecnología in Madrid, Spanien, Mari Gantner vom Scripps Research Institute, La Jolla, und Anastasia Kralli von der Johns Hopkins University, Baltimore, für die Unterstützung bei der Optimierung dieses Protokolls basierend auf den ersten Arbeiten von Kahn et al.18. Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse DK114785 und DK121196 an E.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
References
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