Summary
Este relatório descreve um protocolo para o isolamento simultâneo de preadipócitos primários marrons e brancos de camundongos recém-nascidos. Células isoladas podem ser cultivadas na cultura e induzidas a se diferenciar em adipócitos brancos e marrons totalmente maduros. O método permite a caracterização genética, molecular e funcional das células de gordura primárias na cultura.
Abstract
A compreensão dos mecanismos subjacentes à diferenciação e função adipócitos beneficiou-se muito do uso de linhas celulares pré-apócidas brancas imortalizadas. Essas linhas de células cultivadas, no entanto, têm limitações. Eles não capturam totalmente o espectro funcional diversificado das populações heterogênios que agora são conhecidas por existirem dentro de depósitos adiposos brancos. Para fornecer um modelo mais fisiologicamente relevante para estudar a complexidade do tecido adiposo branco, um protocolo foi desenvolvido e otimizado para permitir o isolamento simultâneo de progenitores adipócidos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos, sua rápida expansão na cultura e sua diferenciação in vitro em adipócitos maduros e totalmente funcionais. A principal vantagem de isolar células primárias de camundongos recém-nascidos, em vez de camundongos adultos, é que os depósitos adiposos estão se desenvolvendo ativamente e são, portanto, uma rica fonte de proliferação de pré-doenças. Os pré-doenças primários isolados usando este protocolo diferenciam-se rapidamente ao atingir a confluência e tornam-se totalmente maduros em 4-5 dias, uma janela temporal que reflete com precisão o aparecimento de almofadas de gordura desenvolvidas em camundongos recém-nascidos. As culturas primárias preparadas com essa estratégia podem ser expandidas e estudadas com alta reprodutibilidade, tornando-as adequadas para telas genéticas e fenotípicas e possibilitando o estudo dos fenótipos adipócitos autônomos de células de modelos genéticos de camundongos. Este protocolo oferece uma abordagem simples, rápida e barata para estudar a complexidade do tecido adiposo in vitro.
Introduction
A obesidade resulta de um desequilíbrio crônico entre o consumo de energia e o gasto energético. À medida que a obesidade se desenvolve, os adipócitos brancos sofrem uma expansão maciça no tamanho celular que resulta em hipóxia no microambiente, morte celular, inflamação e resistência à insulina1. Adipócitos disfuncionais e hipertróficos não conseguem armazenar adequadamente lipídios em excesso, que se acumulam em outros tecidos onde amortecem a ação da insulina2,3. Prevê-se que agentes que melhoram a função de adipócito e restaurem a partição lipídica normal entre os tecidos são considerados benéficos para o tratamento de condições associadas à obesidade caracterizadas pela resistência à insulina, como diabetes tipo 2. Telas fenotípicas em adipócitos usando linhas celulares imortalizadas, como 3T3-L1, F442A e 10T 1/2, têm se mostrado úteis para identificar fatores genéticos que regulam a adipogênese e isolar moléculas pró-adipogênicas com propriedades anti-diabéticas4,5,6,7. Essas linhas celulares, no entanto, não refletem totalmente a heterogeneidade dos tipos celulares presentes nos depósitos adiposos, que incluem subtipos brancos, marrons, bege e outros adipócitos com características únicas, todos os quais contribuem para a homeostase sistêmica8,9,10. Além disso, as linhas de células cultivadas frequentemente mostram uma resposta reduzida a estímulos externos.
Em contraste, culturas de adipócitos primários recapitulam com mais precisão a complexidade da adipogênese in vivo, e os adipócitos primários apresentam respostas funcionais robustas. Os pré-iícios primários são tipicamente isolados da fração vascular estromica dos depósitos adiposos de camundongos adultos11,12,13,14. No entanto, como os depósitos adiposos de animais adultos consistem principalmente de adipócitos totalmente maduros que têm uma taxa de rotatividade muito lenta15,16,17, essa abordagem produz uma quantidade limitada de pré-doenças com baixa taxa de proliferação. Portanto, o isolamento de preadipócitos de camundongos recém-nascidos é preferível obter grandes quantidades de células de rápido crescimento que podem ser diferenciadas in vitro. Aqui, foi descrito um protocolo, inspirado no trabalho inicial com adipócitos marrons primários de Kahn et al.18 para isolar eficientemente preadipócitos brancos e marrons que podem ser expandidos e diferenciados in vitro em adipócitos primários totalmente funcionais(Figura 1A). A vantagem de isolar células primárias de recém-nascidos, ao contrário dos camundongos adultos, é que os depósitos adiposos estão crescendo rapidamente e são, portanto, uma rica fonte de proliferação ativa de pré-doenças17. Células isoladas usando este protocolo têm alta capacidade de proliferação, permitindo uma rápida ampliação das culturas. Além disso, os pré-nascidos de filhotes apresentam maior potencial de diferenciação do que os progenitores adultos, o que reduz a variabilidade bem-para-bem na extensão da diferenciação e, portanto, aumenta a reprodutibilidade.
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Protocol
Este protocolo segue todas as diretrizes da IACUC do Scripps Research Institute e da University of Wisconsin – Madison School of Medicine and Public Health.
1. Coleta e digestão de depósitos adiposos (dia 1)
- Prepare dois tubos de 1,5 mL para cada filhote: um para tecido adiposo marrom (BAT) e outro para tecido adiposo branco (WAT). Adicionar 250 μL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) + 200 μL de tampão de isolamento de 2x (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2, 5 mM de glicose, 100 mM 4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanethanesulfonic ácido (HEPES), penicilina-estreptomicina, e 4% de albumina de soro bovino livre de ácido graxo) para cada tubo. Mantenha soluções estéreis e no gelo.
- Coloque os filhotes em pequenas câmaras (por exemplo, um poço de uma placa de 6 poços), e coloque-os no gelo até que eles se tornem hipotérmicos. Certifique-se de que não há contato direto entre os filhotes e o gelo. Pique uma pata com uma ponta para garantir a perda de consciência, e eutanásia os filhotes por decapitação usando tesoura afiada.
NOTA: se trabalhar com genótipos diferentes, prepare um tubo adicional para coletar uma biópsia da cauda (corte de 3 mm) para genotipagem. Se a genotipagem for realizada imediatamente, mantenha os filhotes eutanizados no gelo até a dissecação para coletar depósitos adiposos. - Calcule e pese a quantidade de colagem necessária para digerir todos os depósitos. Adicione 50 μL de 15 mg/mL de colagenase tipo I em 2x tampão de isolamento a cada tubo. Não resuspenque a colagem no tampão de isolamento até que todos os tecidos tenham sido coletados.
- Para coletar WAT subcutâneo, corte a pele ao redor do abdômen do filhote (evite ruptura peritoneal) e puxe suavemente a pele para baixo abaixo das pernas. Sem tomar a pele, colete cuidadosamente o depósito de gordura, que aparecerá como um tecido claro (P1 ou mais jovem) ou branco (P2 e mais velho), tecido fino e alongado preso no interior ou em cima do quadríceps(Figura 1B). Enxágüe o depósito de gordura em PBS, e coloque-o em um dos tubos contendo 250 μL de PBS + 200 μL de tampão de isolamento de 2x. Mantenha-se no gelo.
NOTA: Os ratos P0 e P1 dão o melhor rendimento. Em filhotes P0-1, o depósito wat subcutâneo é quase transparente. Em camundongos P2 e mais velhos, o depósito é mais fácil de identificar porque já está ficando branco, indicando a presença de adipócitos brancos totalmente maduros, carregados de lipídios. - Para coletar bat interescapular, puxe a pele das omoplatas sobre a cabeça. Levante o BAT - o tecido vermelho profundo entre as omoplatas - e faça cuidadosamente incisões ao seu redor para desprender-o do corpo(Figura 1B). Verifique se há consistência e cor; enxaguar com PBS; colocá-lo no outro tubo contendo 250 μL de PBS + 200 μL de tampão de isolamento de 2x; e manter no gelo.
NOTA: Ao colher o BAT de ratos P2 e mais velhos, remova cuidadosamente o tecido adiposo branco ao redor do BAT. Consiste em uma fina, macia, folha branca de adipócitos localizados entre a pele e o BAT, que é mais profundo entre as omoplatas. - Uma vez que todos os depósitos tenham sido coletados, pique suavemente cada depósito (4-6 vezes) usando pequenas tesouras diretamente dentro dos tubos.
- Resuspend colagenase tipo I no volume apropriado de tampão de isolamento de 2x para obter uma solução de estoque de 10x a 15 mg/mL. Adicione 50 μL de colagenase de 10x a cada tubo, mantendo os tubos no gelo até que a colagem tenha sido adicionada a todos os tubos.
- Inverta os tubos rapidamente para misturar e transfira para uma batedeira controlada pela temperatura. Incubar as amostras por 30 min a 37 °C em um agitador (frequência de 1.400 rpm para uma mistura eficaz de amostras).
2. Chapeamento de preadipócitos (dia 1)
- Depois de digerir os tecidos, coloque os tubos de volta no gelo.
NOTA: A partir deste passo, todo o trabalho é realizado em condições estéreis em um armário de biossegurança. - Coe os tecidos digeridos através de um coador de células de 100 μm em novos tubos de 50 mL. Se trabalhar apenas com camundongos WT, ou se forem conhecidos genótipos, unindo os BATs relevantes e dissociados juntos; repetir isso para os WATs. Para maximizar o rendimento celular, enxágue cada tubo com 1 mL de meio de isolamento (o meio águia modificado de Dulbecco (DMEM) + 20% de soro bovino fetal (FBS), 10 mM HEPES, 1% penicilina-estreptomicina) e filtre-o através do coador celular. Se trabalhar com genótipos desconhecidos, vá para o passo 2.4
NOTA: A FBS é um determinante essencial tanto da proliferação pré-iedícica quanto da diferenciação. Teste rigorosamente diferentes lotes de FBS para garantir alto desempenho e consistência entre lotes. - Diluir as suspensões BAT e WAT para a placa 2-3 poços de uma placa de 6 poços para cada amostra de BAT e 4-6 poços de uma placa de 6 poços para cada amostra WAT. Por exemplo, se 6 BATs e 6 WATs foram agrupados, diluir a suspensão da célula BAT até 24-36 mL e a suspensão da célula WAT até 48-72 mL. Placa 2 mL das suspensões celulares por poço.
- Para amostras com genótipos desconhecidos, mantenha cada amostra separada; coloque um coador de células de 100 μm em cima de cada poço de uma placa de 6 poços, e filtre uma amostra por poço. Enxágüe o tubo com 1,5 mL de meio de isolamento e passe-o através do coador, com o volume final até 2 mL por poço. Descarte o coador de células, coloque a tampa na placa e transfira a placa para a incubadora.
NOTA: O meio nos poços deve parecer turvo devido a células sanguíneas flutuantes, detritos celulares e lipídios de células líssedas. - 1-1,5 h após o revestimento, aspirar mídia e lavar com 2 mL de DMEM sem soro. Agitar suavemente a placa para separar as células sanguíneas do fundo dos poços. Após 3 lavagens, adicione 2 mL de meio de isolamento fresco e transfira as células para a incubadora (37 °C, 5% CO2).
NOTA: Verifique as células sob o microscópio. O material flutuante (células sanguíneas, detritos celulares) deve ser mínimo. Os pré-apócitos marrons aparecerão como pequenas células não translúcidas, enquanto os pré-apócitos brancos exibirão uma forma mais alongada. Os preadipócitos marrons e brancos devem estar bem presos à placa.
3. Expansão da cultura pré-idílica (dia 2 ao dia 5)
- No dia seguinte, aspire o meio, lave as células com 2 mL de DMEM sem soro e adicione 2 mL do meio de isolamento.
- Repita o passo 3.1 uma vez a cada 2 dias até que as células atinjam 80-90% de confluência.
NOTA: Para preadipócitos marrons primários, atingir 80-90% de confluência pode levar de 4 a 5 dias. Para preadipócitos brancos primários, geralmente leva de 2 a 3 dias. Uma vez que os pré-iadipócitos atingem 60% de confluência, eles podem ser eficientemente infectados com partículas virais para experimentos de knockdown ou superexpressão. Infecte preadipócitos com carga viral apropriada por até 8h. O uso de polímeros cônicos para aumentar a eficiência da infecção é desencorajado, pois muitas vezes resulta em toxicidade e em uma redução significativa do potencial adipogênico de preadipócitos infectados. - Para dividir as células, cubra novas placas de destino usando uma solução estéril de gelatina de 0,1% w/v (dissolvida em água destilada; não use nenhum calor). Use volume suficiente para cobrir a parte inferior do poço/prato. Incubar placas a 37 °C até que as células estejam prontas para serem semeadas (pelo menos 10 min).
NOTA: Esta etapa é opcional. O revestimento de placas de cultura celular não afeta o potencial de rendimento ou diferenciação, mas simplifica substancialmente a manutenção e manuseio de adipócitos diferenciados. - Quando as células atingem densidade subconfluente (85-95%), aspiram o meio, lavam com PBS e adicionam trippsina por 3 minutos para desprender as células. Bloqueie a atividade de trippsina adicionando 2,5x volume de trippsina de meio de isolamento. Pipeta a suspensão da célula para cima e para baixo para maximizar a recuperação celular, e transferir para um novo tubo. Lave os poços com 1 mL de meio de isolamento e adicione-os à primeira coleção.
- Centrifugar as células por 5 min a 800-1200 × g, aspirar o supernasce e resuspensar as células em 3-5 mL do meio de isolamento. Conte as células e dilui-as à densidade final desejada.
NOTA: Por exemplo, 50.000-80.000 células/mL (2,5, 1 e 0,5 mL para placas de 6, 12 e 24 poços, respectivamente) resultarão em poços totalmente confluentes dentro de 72-96 h. - Aspire a solução de revestimento na etapa 3.3 e lave o excesso de gelatina com PBS. Semear as células, e devolver as placas à incubadora até ficar totalmente confluente.
4. Diferenciação de preadipócitos brancos e marrons (dias 7 a 12)
- Quando os pré-iadócitos se tornam confluentes, aspiram o meio e substituem-no por meio de diferenciação composto por 10% de FBS em DMEM contendo insulina de 170 nM, 1 μM dexametasona e 0,5 mM 3-isobuthyl-1-metilxantina. Se diferenciar os pré-apócis do BAT, adicione também triiodothronina de 1 nM (T3). Marque o dia em que a diferenciação adipogênica é induzida como dia 0 de diferenciação.
NOTA: Tanto os preadipócitos brancos quanto os marrons podem diferenciar-se espontaneamente ao atingir a confluência. No entanto, para maximizar a diferenciação de adipócito, deve ser utilizado o tradicional coquetel pró-adipogênico descrito acima (mais T3 para pré-apócitos bat). - Após 48h (dia 2 de diferenciação), atualize o meio com meio de manutenção composto por 10% de FBS em DMEM e insulina de 170 nM (mais 1 nM T3 para BAT).
NOTA: No dia 2, pequenas gotículas lipídicas acumuladas nas células sob o microscópio podem ser observadas usando campo brilhante padrão. - Repita o passo 4.2 uma vez a cada 2 dias até que as células sejam usadas para experimentos.
NOTA: No dia 4 ou 5 de diferenciação, a maioria das células aparecerá carregadas de lipídios. Adipócitos de diferenciação terminal podem ser mantidos na cultura por mais tempo ou usados nesta fase para experimentos.
5. Re-revestimento para experimentos de bioenergésicos
NOTA: Se a intenção é realizar estudos de bioenergésticos em adipócitos maduros no formato de 96 poços, as seguintes etapas precisam ser tomadas. Idealmente, devem ser utilizadas células que tenham apenas totalmente diferenciado (dia 4 ou 5). O procedimento descrito abaixo começa a partir de 1 poço de uma placa de 6 poços.
- Antes da digestão da trippsina, prepare o revestimento para placas de 96 poços. Adicione 50 μL de gelatina de 0,1% a cada poço. Deixe a placa em uma incubadora de cultura tecidual até que as células estejam prontas para serem semeadas.
- No dia 4 ou 5 de diferenciação, aspire o meio, lave com 1 mL de PBS e adicione 300 μL de 0,25% de ácido tetraacético trypsin-etilenodiamina (para 1 poço de uma placa de 6 poços). Incline suavemente a placa para garantir que a trippsina cubra completamente a parte inferior do poço; incubar por 2 min em temperatura ambiente. Bloqueie a ação da trippsina com 700 μL de meio de manutenção, pipeta para cima e para baixo para maximizar a recuperação celular e transfira a suspensão da célula para um novo tubo de 1,5 mL.
- Centrifugar as células a 1200 × g por 5 min. Remova o supernasal, resuspense a pelota em 1 mL de meio de manutenção e conte as células.
NOTA: Um poço de uma placa de 6 poços deve render aproximadamente 1,5-1,8 milhões de células. - Diluir as células para ter uma concentração final de 60.000 a 80.000 células/mL para adipócitos marrons e 100.000 a 120.000 células/mL para adipócitos brancos. Placa 100 μL da suspensão celular por poço em placas revestidas de gelatina 96-well.
NOTA: Um poço de uma placa de 6 poços fornece células suficientes para até duas placas de 96 poços. Para experimentos de bioenergésicos, o revestimento de baixa densidade (30-40% de confluência) é necessário para permitir a medição precisa do consumo de oxigênio e evitar o esgotamento de oxigênio nos poços durante o ensaio. - Deixe as células aderirem ao fundo da placa por pelo menos 48 h. Se as células forem mantidas na placa por mais de 48h, refresque o meio após 2 dias.
- No dia do ensaio, aspire o meio e substitua-o por meio de ensaio. Incubar por 1h a 37 °C em uma incubadora não controlada por CO2e realizar o ensaio de acordo com as instruções do fabricante.
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Representative Results
A seção 1 do protocolo produzirá uma suspensão heterogênea de células que são visíveis sob um microscópio de luz padrão. A filtragem de tecidos digeridos com um coador celular (seção 2) removerá tecido não digerido. No entanto, alguns detritos celulares, células sanguíneas e adipócitos maduros passarão(Figura 1C). Lavagens suaves 1 h após o revestimento removerão células não relevantes à medida que os preadipócitos se prendem rapidamente à parte inferior do poço(Figura 1C). Na seção 3, os precursores de adipócitos são expandidos para obter o número de células necessárias para o plano experimental. Embora os pré-apócis brancos e marrons isolados de filhotes recém-nascidos tenham alta capacidade de proliferação, o rendimento de pré-nascidos brancos é geralmente o dobro dos preadipócitos marrons em uma base por depósito(Figura 2A). Portanto, se forem desejadas culturas sincronizadas, a densidade inicial dos preadipócitos brancos deve ser calculada em conformidade. A Seção 4 oferece diretrizes para obter adipócitos totalmente maduros.
Ao final da diferenciação, as células aparecerão carregadas com gotículas lipídicas e marcadores clássicos expressos de adipócitos brancos e marrons,respectivamente (Figura 2B,C). Adipócitos brancos e marrons podem ser usados para estudos de bioenergetics descritos na seção 5. Uma análise comparativa do consumo de oxigênio em um teste de estresse mitocondrial de adipócitos brancos e marrons primários em condições basais, bem como em resposta aos estimuladores conhecidos da função mitocondrial (por exemplo, norepinefrina) é mostrada na Figura 2D. Após o isolamento, também é possível diferenciar adipócitos brancos e marrons primários nas placas que serão diretamente utilizadas para experimentos bioenergésicos19. Neste caso, os pré-apócitos são isolados e emplacados como descrito nas seções 1 e 2. Quando as células se tornam confluentes, elas são induzidas a diferenciar-se como descrito na seção 4 até atingirem a diferenciação terminal e estiverem prontas para a análise bioenergetics. Este procedimento é comum para um formato de placa de 24 poços, mas menos para placas de 96 poços.
Figura 1: Coleta e processamento de almofadas de gordura. (A) Representação esquemática do isolamento adipócito branco primário (superior) e marrom (inferior). (B) Depósitos de adiposos brancos subcutâneos (superior) e marrom (inferior). Em camundongos P0, wat subcutâneo é quase invisível, mas torna-se distinguível no ~dia 2 após o nascimento. Em contraste, o BAT tem uma cor escura distinta mesmo em P0. Em filhotes mais velhos, o BAT é cercado por uma fina camada superficial de WAT, que requer remoção quando o tecido é dissecado. (C) Imagens representativas das células precursoras brancas e marrons primárias após a filtragem através do coador de células de 100 μm, após as lavagens iniciais, e 24 horas após o isolamento. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: WAT = tecido adiposo branco; BAT = tecido adiposo marrom. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diferenciação de progenitores adipócitos. (A) Número médio de pré-iadipócitos subcutâneos WAT e BAT obtidos por filhote de recém-nascido (P0). (B) Imagens representativas de adipócitos brancos e marrons terminantemente diferenciados. Para a imagem de fluorescência, as células foram incubadas com Nilo Vermelho e Hoechst 33342 para manchar lipídios neutros e núcleos, respectivamente. Barras de escala = 100 μm.(C) Análise de expressão genética de marcadores adipócitos clássicos, marcadores bege-branco e marcadores específicos marrons em adipócitos brancos e marrons primários diferenciados por 6 dias (n=3). Para cada gene, a expressão BAT é relativa aos níveis de WAT (definidos como 1). (D) OCR de adipócitos brancos e marrons em um teste de estresse mitocondrial e em resposta à norepinefrina (n=3). Adipócitos marrons mostram respiração não acoplada e uma resposta robusta à norepinefrina, enquanto os adipócitos brancos mostram pouca respiração nãocopada e nenhuma resposta significativa à estimulação adrenérgica. *p<0,05; **p<0.01, determinado pelo teste t-de-t do aluno de duas caudas. Abreviaturas: WAT = tecido adiposo branco; BAT = tecido adiposo marrom; OCR = taxa de consumo de oxigênio; Oligo = oligomicina; FCCP = cianeto carbonil-4-(trifluorometoxy)fenilhidrazone; RAA = rotenona, antimicina A; PPARγ = gama de receptor ativado por peroxicante; Acrp30 = proteína complementante adipócito de 30 kDa; Fabp4 = proteína de ligação de ácidos graxos 4; Glut4 = transportador de glicose 4; Cd36 = cluster de diferenciação 36; Retn = resistin; Slc27a1 = família transportadora solute 27 membro 1; Ear2 = eosinófilo associado, ribonuclease A família 2; Pgc1a = PPARγ coativador 1alpha; Prdm16 = domínio regulatório positivo Fator de ligação I 1 (PRDI-BF1) e retinoblastoma gene de dedo de zinco interagindo proteína 1 (RIZ1) domínio homólogo contendo 16; Eva1 = antígeno epitelial v-like 1; Cidea = célula indutor de DNA de fragmentação de fator-alfa-efeito A; Ucp1 = proteína de desacoplamento 1; Dio2 = deiodinase tipo 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O tecido adiposo é fundamental para a sensibilidade sistêmica da insulina e a homeostase de glicose20. A disfunção adipócito ligada à obesidade está fortemente associada ao aparecimento do diabetes tipo 2. Portanto, uma maior compreensão da biologia básica e fisiologia do tecido adiposo pode permitir a concepção de novos tratamentos para distúrbios metabólicos. Como complemento à análise funcional e transcricional direta de adipócitos maduros isolados dos depósitos de gordura21,22, adipócitos primários cultivados têm sido mostrados para recapitular muitos aspectos da fisiopatologia tecidual adiposa, incluindo secreção de adipocinas, resistência à insulina em resposta a estímulos pró-inflamatórios e indução do programa termogênico23,24,25. Embora protocolos anteriores tenham descrito o isolamento de precursores adipócitos de camundongos adultos11,12, este protocolo fornece um método para o isolamento eficiente das células de filhotes recém-nascidos. Essa estratégia produz uma população significativamente maior de progenitores adipócidos brancos e marrons com maior potencial de diferenciação, uma vez que os depósitos adiposos pós-natal ainda são relativamente indiferenciados em comparação com os depósitos adiposos de camundongos adultos26. Além disso, as células isoladas usando este método já estão comprometidas e produzem adipócitos diferenciados totalmente funcionais que expressam marcadores de células maduras e exibem suas características fisiológicas únicas, incluindo armazenamento lipídico e capacidade termogênica.
As células primárias não podem ser expandidas indefinidamente in vitro. Além disso, os pré-iedócitos primários começam a perder seu potencial adipogênico após várias passagens na cultura. Isso é provável porque a cultura celular contínua resulta em um enriquecimento intrínseco de células menos comprometidas e mais proliferativas. Assim, uma limitação deste protocolo é a janela de tempo durante a qual os preadipócitos podem ser usados. O potencial adipogênico é totalmente preservado se as células forem induzidas a se diferenciar dentro de 7-8 dias a partir do momento do isolamento. Progenitores adipócitos são particularmente resistentes à digestão enzimática, mas é importante, no entanto, cronometrar corretamente o tratamento de colagemnase. A superdigestão dos tecidos pode resultar em redução da sobrevida celular e diminuição da capacidade das células de aderir à placa. Ao longo da fase de expansão, os preadipócitos brancos e marrons são fortemente adeptos e podem tolerar lavagens vigorosas e trocas de mídia frequentes. No entanto, o uso de placas revestidas é recomendado quando os pré-apócitos são induzidos a diferenciar. Adipócitos maduros e carregados de lipídios diminuíram a adesão superficial e as interações célula-células, resultando em uma tendência a se desprender durante a diferenciação, a menos que manuseada suavemente. O passo mais delicado do protocolo é a indução da diferenciação. FBS, insulina, T3 e outras drogas devem ser testadas, e suas concentrações finais otimizadas, para obter a maior extensão de diferenciação. Um agonista PPARγ (por exemplo, rosiglitazone) também pode ser adicionado para estimular ainda mais a adipogênese.
É importante ressaltar que as condições de diferenciação podem ser adaptadas às necessidades experimentais. Por exemplo, em telas com bibliotecas genéticas ou químicas projetadas para identificar proteínas/compostos que melhoram a diferenciação de adipócitos brancos e/ou marrons, os preadipócitos podem ser induzidos a diferenciar usando um meio permissivo mínimo que inclui 10% de FBS apenas em DMEM e 170 nM apenas insulina. Recomenda-se a avaliação de cada componente do coquetel de diferenciação para determinar janelas de ensaios ideais para ensaios de diferenciação. T3 e dexametasona são dispensáveis para diferenciação de adipócito branco e marrom primário. Essas condições garantirão uma baixa taxa de diferenciação nas células de controle, aumentando assim a janela do ensaio e maximizando a capacidade de detectar fatores pró-adipogênicos. Culturas de adipócitos primários marrons e brancos são uma poderosa ferramenta para interrogar a função autônoma de células adipócitos em resposta à manipulação genética e às tensões metabólicas para complementar o estudo do tecido adiposo marrom e branco in vivo. Assim, protocolos de isolamento e cultura de preadipócitos primários são necessários para permitir investigações reprodutíveis e de alto rendimento da função adipócito in vitro. A estratégia descrita aqui permite o estudo de preadipócitos brancos e marrons primários que podem ser diferenciados em adipócitos totalmente maduros e testados sob uma variedade de manipulações experimentais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Cristina Godio no Centro Nacional de Biotecnología em Madrid, Espanha, Mari Gantner no The Scripps Research Institute, La Jolla, e Anastasia Kralli na Universidade Johns Hopkins, baltimore, por assistência otimizando este protocolo com base no trabalho inicial de Kahn et al.18. Este trabalho foi financiado pelas bolsas NIH DK114785 e DK121196 para E.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
References
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