Summary
דו"ח זה מתאר פרוטוקול לבידוד בו זמנית של preadipocytes חום ולבן ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו. תאים מבודדים ניתן לגדל בתרבות המושרה להבדיל לתוך adipocytes לבן וחום בוגר לחלוטין. השיטה מאפשרת אפיון גנטי, מולקולרי ותפקודי של תאי שומן ראשוניים בתרבות.
Abstract
ההבנה של המנגנונים שבבסיס הבידול והתפקוד של אדיפוציטים נהנתה מאוד מהשימוש בקווי תאים פרה-דיספוציטים לבנים מונצחים. עם זאת, לקווי תאים מתורבתים אלה יש מגבלות. הם אינם לוכדים באופן מלא את הספקטרום התפקודי המגוון של אוכלוסיות האדיפוציטים הטרוגניות הידועות כיום כקיימות בתוך מחסני שומן לבנים. כדי לספק מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית כדי לחקור את המורכבות של רקמת שומן לבנה, פרוטוקול פותח ואופטימיזציה כדי לאפשר בידוד בו זמנית של אבות אדיפוציטים לבנים וחומים ראשוניים מעכברים שזה עתה נולדו, ההתפשטות המהירה שלהם בתרבות, והבידול שלהם במבחנה לתוך בוגרת, פונקציונלית לחלוטין adipocytes. היתרון העיקרי של בידוד תאים ראשוניים מהיילוד, ולא עכברים בוגרים, הוא שמחסני השומן מתפתחים באופן פעיל והם, אם כן, מקור עשיר של preadipocytes מתרבים. preadipocytes ראשי מבודד באמצעות פרוטוקול זה להבדיל במהירות עם ההגעה המפגש ולהיות בוגר לחלוטין ב 4-5 ימים, חלון זמן המשקף במדויק את המראה של רפידות שומן מפותחות בעכברים שזה עתה נולדו. תרבויות ראשוניות שהוכנו באמצעות אסטרטגיה זו ניתן להרחיב וללמוד עם רבייה גבוהה, מה שהופך אותם מתאימים מסכים גנטיים פנוטיפיים ומאפשר את המחקר של פנוטיפים אדיפוציטים תא אוטונומי של מודלים עכבר גנטי. פרוטוקול זה מציע גישה פשוטה, מהירה וזולה כדי ללמוד את המורכבות של רקמת שומן במבחנה.
Introduction
השמנת יתר נובעת מחוסר איזון כרוני בין צריכת האנרגיה להוצאות האנרגיה. כמו השמנת יתר מתפתחת, adipocytes לבן לעבור התרחבות מסיבית בגודל התא שתוצאתה היפוקסיה microenvironment, מוות תאי, דלקת, עמידות לאינסולין1. מתפקדת, adipocytes hypertrophied לא יכול כראוי לאחסן שומנים עודפים, אשר מצטברים במקום ברקמות אחרות שבו הם לעמעם פעולתאינסולין 2,3. סוכנים המשפרים את תפקוד adipocyte ולשחזר חלוקה שומנים נורמלית בין רקמות צפויים להיות מועיל לטיפול של תנאים הקשורים להשמנה המאופיינים תנגודת לאינסולין כגון סוכרת מסוג 2. מסכי פנוטיפית ב adipocytes באמצעות קווי תאים מונצחים, כגון 3T3-L1, F442A, ו 10T 1/2, הוכיחו שימושי כדי לזהות גורמים גנטיים המווסתים adipogenesis ולבודד מולקולות pro-adipogenic עם תכונות אנטי סוכרתיות4,5,6,7. קווי תאים אלה, לעומת זאת, אינם משקפים באופן מלא את ההטרוגניות של סוגי התאים הקיימים במחסני שומן, הכוללים תת-סוגים לבנים, חומים, בז 'ותתי-סוגים אחרים של אדיפוציטים בעלי מאפיינים ייחודיים, כולם תורמים להומאוסטזיס מערכתי8,9,10. יתר על כן, קווי תאים מתורבתים מראים לעתים קרובות תגובה מופחתת לגירויים חיצוניים.
לעומת זאת, תרבויות של adipocytes ראשי recapitulate בצורה מדויקת יותר את המורכבות של in vivo adipogenesis, ו adipocytes ראשי להראות תגובות תפקודיות חזקות. preadipocytes ראשוניים מבודדים בדרך כלל מן החלק הסטרומלי של מחסני שומן של עכברים בוגרים11,12,13,14. עם זאת, מכיוון שמחסני השומן של בעלי חיים בוגרים מורכבים בעיקר מאדיפוציטים בוגרים לחלוטין שיש להם שיעור מחזור איטי מאוד15,16,17, גישה זו מניבה כמות מוגבלת של preadipocytes עם שיעור התפשטות נמוך. לכן, בידוד של preadipocytes מעכברים שזה עתה נולד עדיף להשיג כמויות גדולות של תאים הגדלים במהירות שניתן להבדיל במבחנה. כאן תואר פרוטוקול, בהשראת העבודה הראשונית עם אדיפוציטים חומים ראשוניים של קאהן ואח '18 כדי לבודד ביעילות פרה-אפוציטים לבנים וחומים שניתן להרחיב ולהבדיל ביניהם במבחנה לאדיפוציטים ראשוניים מתפקדים במלואם(איור 1A). היתרון של בידוד תאים ראשוניים מהיילוד, בניגוד לעכברים בוגרים, הוא כי מחסני השומן גדלים במהירות ולכן הם מקור עשיר של שגשוג פעיל preadipocytes17. לתאים המבודדים באמצעות פרוטוקול זה יש יכולת התפשטות גבוהה, המאפשרת הרחבה מהירה של תרבויות. בנוסף, preadipocytes של גורים שזה עתה נולדו להציג פוטנציאל בידול גבוה יותר מאשר אבות מבוגרים, אשר מפחית את השונות היטב עד היטב בהיקף של בידול ובכך מגביר את הרבייה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה פועל בהתאם לכל הנחיות IACUC של מכון המחקר סקריפס ואוניברסיטת ויסקונסין – בית הספר לרפואה ובריאות הציבור במדיסון.
1. איסוף ועיכול של מחסני שומן (יום 1)
- הכינו שני צינורות 1.5 מ"ל לכל גור: אחד לרקמת שומן חומה (BAT) ואחד לרקמת שומן לבנה (WAT). הוסף 250 μL של מלוחים אגירת פוספט (PBS) + 200 μL של מאגר בידוד 2x (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM CaCl2, 5 מ"מ גלוקוז, 100 מ"מ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), פניצילין סטרפטומיצין, ו 4% חומצת שומן ללא סרום סרום אלבומין) לכל צינור. שמור על פתרונות סטריליים ועל קרח.
- מניחים את הגורים בתאים קטנים (למשל, באר אחת של צלחת של 6 בארות), ומניחים אותם על קרח עד שהם הופכים להיפותרמיים. ודא כי אין מגע ישיר בין הגורים והקרח. דוקרים כפה עם קצה כדי להבטיח אובדן הכרה, ולהרדים את הגורים על ידי עריפת ראש באמצעות מספריים חדים.
הערה: אם אתם עובדים עם גנוטיפים שונים, הכינו צינור נוסף לאיסוף ביופסיית זנב (חתך של 3 מ"מ) לגנוטיפינג. אם genotyping מבוצע באופן מיידי, לשמור את הגורים המתת חסד על הקרח עד הניתוח כדי לאסוף מחסני שומן. - לחשב ולשקול את כמות הקולגנאז הדרושה כדי לעכל את כל המחסנים. הוסף 50 μL של 15 מ"ג / מ"ל קולגנאז סוג אני ב 2x מאגר בידוד לכל צינור. אין להשתמש מחדש בקולגנאז במאגר בידוד עד שכל הרקמות ייאספו.
- כדי לאסוף WAT תת עורי, לחתוך את העור סביב הבטן של הגור (למנוע קרע הצפק), בעדינות למשוך את העור מתחת לרגליים. מבלי לקחת את העור, לאסוף בזהירות את מחסן השומן, אשר יופיע ברור (P1 ומטה) או לבן (P2 ומעלה), דק, רקמה מוארכת מחובר מבפנים או על גבי quadriceps (איור 1B). לשטוף את מחסן השומן PBS, ומניחים אותו באחד הצינורות המכילים 250 μL של PBS + 200 μL של חיץ בידוד 2x. שמור על קרח.
הערה: עכברי P0 ו- P1 נותנים את התשואה הטובה ביותר. בגורים P0-1, מחסן WAT התת עורי הוא כמעט שקוף. בעכברים P2 ומעלה, המחסן קל יותר לזהות כי זה כבר הופך לבן, המציין את נוכחותם של בוגרת לחלוטין, שומנים טעונים, adipocytes לבן. - כדי לאסוף BAT בין-עיני, משוך את העור מהשכמות מעל הראש. הרימו את ה-BAT - הרקמה האדומה העמוקה שבין השכמות - ובצעו בזהירות חתכים מסביבו כדי לנתק אותו מהגוף(איור 1B). בדוק עקביות וצבע; יש לשטוף עם PBS; למקם אותו בצינור השני המכיל 250 μL של PBS + 200 μL של מאגר בידוד 2x; ולשמור על קרח.
הערה: בעת קצירת BAT מעכברי P2 ומעלה, הסר בזהירות את רקמת השומן הלבנה המקיפה את ה- BAT. הוא מורכב גיליון דק, רך, לבן של adipocytes הממוקם בין העור לבין BAT, אשר עמוק יותר בין השכמות. - לאחר שנאספו כל המחסנים, בעדינות לטחון כל מחסן (4-6 פעמים) באמצעות מספריים קטנים ישירות בתוך הצינורות.
- Resuspend קולגנאז סוג אני בנפח המתאים של 2x מאגר בידוד כדי לקבל פתרון מלאי 10x ב 15 מ"ג / מ"ל. מוסיפים 50 μL של קולגנאז 10x לכל צינור, שמירה על הצינורות על הקרח עד קולגנאז נוספה לכל הצינורות.
- הפוך את הצינורות במהירות לערבב, ולהעביר מערבל מבוקר טמפרטורה. דגירה את הדגימות במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר (1,400 סל"ד תדירות לערבוב מדגם יעיל).
2. ציפוי מראש (יום 1)
- לאחר עיכול הרקמות, מניחים את הצינורות בחזרה על הקרח.
הערה: משלב זה ואילך, כל העבודה מתבצעת בתנאים סטריליים בארון biosafety. - מסננים את הרקמות המתעכלות באמצעות מסננת תאים של 100 מיקרומטר לצינורות חדשים של 50 מ"ל. אם אתם עובדים רק עם עכברי WT, או אם ידועים גנוטיפים, אספו יחד את ה-BATs הרלוונטיים והניתקים; חזור על זה עבור WATs. כדי למקסם את תפוקת התאים, יש לשטוף כל צינור עם 1 מ"ל של מדיום בידוד (מדיום הנשר שהשתנה של Dulbecco (DMEM) + 20% סרום שור עוברי (FBS), 10 מ"מ HEPES, 1% פניצילין-סטרפטומיצין), ולסנן אותו דרך מסננת התא. אם אתה עובד עם גנוטיפים לא ידועים, עבור לשלב 2.4
הערה: FBS הוא דטרמיננטה חיונית הן של התפשטות מראש והן של בידול. בדוק בקפדנות המון FBS כדי להבטיח ביצועים גבוהים ועקביות בין מגרשים. - לדלל BAT ו WAT השעיות צלחת 2-3 בארות של צלחת 6-באר עבור כל מדגם BAT ו 4-6 בארות של צלחת 6-באר עבור כל מדגם WAT. לדוגמה, אם 6 BATs ו 6 WATs אוגדו יחד, לדלל את ההשעיה תא BAT עד 24-36 מ"ל ואת ההשעיה תא WAT עד 48-72 מ"ל. צלחת 2 מ"ל של המתלים התא לכל באר.
- לדגימות עם גנוטיפים לא ידועים, יש להפריד בין כל דגימה; מניחים מסננת תאים 100 מיקרומטר על גבי כל באר של צלחת 6-well, ולסנן מדגם אחד לכל באר. לשטוף את הצינור עם 1.5 מ"ל של מדיום בידוד, ולהעביר אותו דרך מסננת, מה שהופך את הנפח הסופי ל 2 מ"ל לכל באר. השליכו את מסננת התאים, הניחו את המכסה על הצלחת והעבירו את הצלחת לאינקובטור.
הערה: המדיום בבארות צריך להיראות עכור עקב תאי דם צפים, פסולת תאים, ושומנים מתאי ליתוס. - 1-1.5 שעות לאחר ציפוי, לשאוף מדיה ולשטוף עם 2 מ"ל של DMEM ללא סרום. בעדינות להתסיס את הצלחת כדי לנתק את תאי הדם מתחתית בארות. לאחר 3 שוטף, להוסיף 2 מ"ל של מדיום בידוד טרי, ולהעביר את התאים לאינקובטור (37 °C (37 °C ( 70 °F, 5% CO2).
הערה: בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ. חומר צף (תאי דם, פסולת תאית) צריך להיות מינימלי. preadipocytes חום יופיעו תאים קטנים שאינם שקופים, ואילו preadipocytes לבן יציג צורה מוארכת יותר. יש לחבר לצלחת גם פרה-אפוציטים חומים וגם לבנים.
3. הרחבת תרבות הפרה-דיספוציטים (היום 2 עד יום 5)
- למחרת, לשאוף את המדיום, לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של DMEM ללא סרום, ולהוסיף בחזרה 2 מ"ל של מדיום הבידוד.
- חזור על שלב 3.1 פעם ביומיים עד שהתאים מגיעים 80-90% מפגש.
הערה: עבור preadipocytes חום ראשי, להגיע 80-90% מפגש יכול לקחת 4-5 ימים. עבור preadipocytes לבן ראשי, זה בדרך כלל לוקח 2-3 ימים. ברגע preadipocytes להגיע 60% מפגש, הם יכולים להיות נגועים ביעילות עם חלקיקים ויראליים עבור ניסויים לדפוק או overexpression. להדביק preadipocytes עם עומס ויראלי מתאים עד 8 שעות. השימוש פולימרים קטיוניים כדי להגביר את יעילות הזיהום הוא מיואש, כפי שהוא לעתים קרובות גורם רעילות בהפחתה משמעותית של הפוטנציאל adipogenic של preadipocytes נגוע. - כדי לפצל את התאים, מעיל צלחות יעד חדשות באמצעות פתרון סטרילי של 0.1% w / v ג'לטין (מומס במים מזוקקים; לא להשתמש בכל חום). השתמש בנפח מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של הבאר / צלחת. צלחות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עד התאים מוכנים להיות זרע (לפחות 10 דקות).
הערה: שלב זה הוא אופציונלי. ציפוי של לוחות תרבות התא אינו משפיע על פוטנציאל התשואה או הבידול, אך הוא מפשט באופן משמעותי את התחזוקה והטיפול בהבחנה בין אדיפוציטים. - כאשר תאים מגיעים לצפיפות תת-מפגשית (85-95%), שאפו את המדיום, שטפו עם PBS והוסיפו טריפסין למשך 3 דקות כדי לנתק את התאים. חסום את פעילות הנסיון על-ידי הוספת נפח טריפסין של 2.5x של אמצעי בידוד. פיפטה השעיית התא למעלה ולמטה כדי למקסם את התאוששות התא, ולהעביר לצינור חדש. לשטוף את הבארות עם 1 מ"ל של מדיום בידוד, ולהוסיף אותו לאוסף הראשון.
- צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 800-1200 × גרם, לשאוף את supernatant, ולהזרים מחדש את התאים ב 3-5 מ"ל של מדיום הבידוד. לספור את התאים, ולדלל אותם לצפיפות הסופית הרצויה.
הערה: לדוגמה, 50,000-80,000 תאים/מ"ל (2.5, 1 ו- 0.5 מ"ל עבור לוחות של 6, 12 ו- 24 בארות, בהתאמה) יגרמו לבארות משולבות לחלוטין בטווח של 72-96 שעות. - לשאוף את פתרון הציפוי בשלב 3.3, ולשטוף את ג'לטין עודף עם PBS. זרעו את התאים, והחזירו את הצלחות לאינקובטור עד לסיכום מלא.
4. בידול של פרה-פשטיטים לבנים וחומים (ימים 7 - 12)
- כאשר preadipocytes להיות confluent, לשאוף את המדיום, ולהחליף אותו עם מדיום בידול המורכב 10% FBS ב DMEM המכיל 170 ננומטר אינסולין, 1 מיקרומטר dexamethasone, ו 0.5 מ"מ 3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין. אם אתה מבדיל בין preadipocytes BAT, גם להוסיף 1 nM triiodothyronine (T3). סמן את היום שבו התמיינות adipogenic הוא המושרה כמו יום 0 של בידול.
הערה: הן לבן והן חום preadipocytes יכול להבדיל באופן ספונטני עם הגעה להתכנסות. עם זאת, כדי למקסם את הבידול adipocyte, הקוקטייל המסורתי pro-adipogenic המתואר לעיל (בתוספת T3 עבור preadipocytes BAT) יש להשתמש. - לאחר 48 שעות (יום 2 של בידול), לרענן את המדיום עם מדיום תחזוקה המורכב 10% FBS ב DMEM ו 170 ננומטר אינסולין (בתוספת 1 ננומטר T3 עבור BAT).
הערה: ביום השני, טיפות שומנים קטנות המצטברות בתאים שמתחת למיקרוסקופ ניתן לראות באמצעות שדה בהיר סטנדרטי. - חזור על שלב 4.2 אחת ליומיים עד שהתאים ישמשו לניסויים.
הערה: ביום 4 או 5 של בידול, רוב התאים יופיעו טעונים עם שומנים. ניתן לשמור על אדיפוציטים מבדילים סופניים בתרבות זמן רב יותר או להשתמש בהם בשלב זה לניסויים.
5. ציפוי מחדש לניסויים ביו-אנלגיים
הערה: אם הכוונה היא לבצע מחקרים ביו-אנלגיים באדיפוציטים בוגרים בפורמט של 96 באר, יש לנקוט בצעדים הבאים. באופן אידיאלי, יש להשתמש בתאים שזה עתה נבדלו במלואם (יום 4 או 5). ההליך המתואר להלן מתחיל מ 1 באר של צלחת 6-באר.
- לפני עיכול טריפסין, להכין ציפוי עבור צלחות 96-באר. מוסיפים 50 μL של 0.1% ג'לטין לכל באר. השאירו את הצלחת באינקובטור של תרבית רקמות עד שהתאים יהיו מוכנים לזרע.
- ביום 4 או 5 של בידול, לשאוף את המדיום, לשטוף עם 1 מ"ל של PBS, ולהוסיף 300 μL של 0.25% טריפסין-אתילנדיאמין חומצה טטראאצטית (עבור 1 גם של צלחת 6-well). להטות בעדינות את הצלחת כדי להבטיח טריפסין מכסה לחלוטין את החלק התחתון של הבאר; דגירה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. לחסום את הפעולה של טריפסין עם 700 μL של אמצעי תחזוקה, פיפטה למעלה ולמטה כדי למקסם את התאוששות התא, ולהעביר את המתלה התא לתוך צינור חדש 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה התאים ב 1200 × g במשך 5 דקות. הסר את supernatant, resuspend גלולה ב 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה, ולספור את התאים.
הערה: באר אחת של צלחת 6 באר צריך להניב כ 1.5-1.8 מיליון תאים. - לדלל את התאים יש ריכוז סופי של 60,000 כדי 80,000 תאים / מ"ל עבור adipocytes חום ו 100,000 כדי 120,000 תאים / מ"ל עבור adipocytes לבן. צלחת 100 μL של השעיית התא לכל באר בצלחות מצופות ג'לטין 96-באר.
הערה: באר אחת של צלחת 6 באר מספק מספיק תאים עבור עד שתי צלחות 96-באר. עבור ניסויים ביו-אנרגיה, ציפוי בצפיפות נמוכה (30-40% מפגש) יש צורך לאפשר מדידה מדויקת של צריכת חמצן ולמנוע דלדול חמצן בבארות במהלך ההסתייגות. - אפשר לתאים לדבוק בתחתית הצלחת לפחות 48 שעות. אם התאים נשמרים בצלחת יותר מ 48 שעות, לרענן את המדיום לאחר 2 ימים.
- ביום ההסתעפות, שאף את המדיום והחלף אותו במדיום מבחנים. דגירה במשך 1 שעות ב 37 °C (69 °F) באינקובטור שאינו CO2מבוקר, ולבצע את ההסתעפות לפי הוראות היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף 1 של הפרוטוקול יניב השעיה הטרוגנית של תאים הנראים תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי. סינון של רקמות מתעכלות עם מסננת תאים (סעיף 2) יסיר רקמה מעוכלת. עם זאת, כמה פסולת תאית, תאי דם, ו adipocytes בוגר יעבור דרך (איור 1C). שטיפות עדינות של שעה לאחר הציפוי יסירו תאים שאינם רלוונטיים, שכן הפרה-דיאדיפוציטים מתחברים במהירות לתחתית הבאר (איור 1C). בסעיף 3, מבשרי אדיפוציטים מורחבים כדי להשיג את מספר התאים הדרושים לתוכנית הניסוי. למרות שלפראדיפוציטים לבנים וחומים המבודדים מגורים שזה עתה נולדו יש יכולת שגשוג גבוהה, התשואה של פרה-פשטיטים לבנים היא בדרך כלל כפולה מהתפוקה של פרה-דיפוציטים חומים על בסיס לכל מחסן(איור 2A). לכן, אם תרבויות מסונכרנות רצויות, יש לחשב בהתאם את צפיפות ההתחלה של preadipocytes לבן. סעיף 4 מציע קווים מנחים להשגת אדיפוציטים בוגרים לחלוטין.
בסוף הבידול, התאים יופיעו עמוסים בטיפות שומנים ויביעו סמנים קלאסיים של אדיפוציטים לבנים וחומים, בהתאמה (איור 2B,C). אדיפוציטים לבנים וחומים יכולים לשמש למחקרים ביו-אנזיטים כמתואר בסעיף 5. ניתוח השוואתי של צריכת חמצן במבחן מאמץ מיטוכונדריאלי של אדיפוציטים לבנים וחומים ראשוניים בתנאים בסיסיים, כמו גם בתגובה לגירויים ידועים של תפקוד המיטוכונדריה (למשל, נוראדרנלין) מוצג באיור 2D. עם הבידוד, ניתן גם להבדיל בין אדיפוציטים לבנים וחומים ראשוניים על הצלחות שישמשו ישירות לניסויים ביו-אנרגטיים19. במקרה זה, preadipocytes מבודדים מצופים כמתואר בסעיפים 1 ו -2. כאשר תאים הופכים להיות משולבים, הם מושרים להבדיל כמתואר בסעיף 4 עד שהם מגיעים לבידול מסוף ומוכנים לניתוח bioenergetics. הליך זה נפוץ עבור פורמט צלחת 24-well, אבל פחות עבור צלחות 96-well.
איור 1: איסוף ועיבוד של רפידות שומן. (A) ייצוג סכמטי של בידוד אדיפוציטים לבן ראשי (עליון) וחום (תחתון). (B)מחסני שומן לבנים תת עוריים (עליונים) וחומים (תחתונים). בעכברים P0, WAT תת עורי הוא כמעט בלתי נראה, אבל הופך להיות להבחין על ~ יום 2 לאחר הלידה. לעומת זאת, ל-BAT יש צבע כהה מובהק אפילו ב-P0. בגורים ישנים יותר, ה- BAT מוקף בשכבה שטחית דקה של WAT, הדורשת הסרה כאשר הרקמה מנותחת. (C) תמונות מייצגות של תאים מבשרים לבנים וחומים ראשוניים לאחר סינון דרך מסננת התא 100 מיקרומטר, לאחר הכביסה הראשונית, ו 24 שעות לאחר הבידוד. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: WAT = רקמת שומן לבנה; BAT = רקמת שומן חומה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בידול של אבות אדיפוציטים. (A) מספר ממוצע של פרה-אידוציטים תת עוריים של WAT ו- BAT שהושגו לכל גור שזה עתה נולד (P0). (B)תמונות מייצגות של אדיפוציטים לבנים וחומים מובחנים סופניים. להדמיית פלואורסצנטיות, התאים דגירו עם הנילוס האדום והוצ'סט 33342 כדי להכתים שומנים וגרעינים ניטרליים, בהתאמה. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר.(C) ניתוח ביטוי גנים של סמני אדיפוציטים קלאסיים, סמני בז' לבנים וסמנים ספציפיים לחום באדיפוציטים לבנים וחומים ראשוניים המובחנים במשך 6 ימים (n = 3). עבור כל גן, ביטוי BAT הוא יחסי לרמות WAT (מוגדר ל- 1). (D)זיהוי תווים אופטי (OCR) של אדיפוציטים לבנים וחומים במבחן מאמץ מיטוכונדריאלי ובתגובה לנוראפינפרין (n = 3). אדיפוציטים חומים מראים נשימה לא מגובבת ותגובה איתנה לנוראפינפרין, ואילו אדיפוציטים לבנים מראים מעט נשימה לא מגובבת וללא תגובה משמעותית לגירוי adrenergic. *עמ<0.05; **p<0.01, נקבע על ידי מבחן tשל סטודנט דו-זנבי. קיצורים: WAT = רקמת שומן לבנה; BAT = רקמת שומן חומה; זיהוי תווים אופטי (OCR) = קצב צריכת חמצן; אוליגו = אוליגומיצין; FCCP = קרבוניל ציאניד-4-(טריפלואורומטוקסי)פנילהידרזון; RAA = רוטנון, אנטימיצין A; PPARγ = פרוקסיזום פרוקסיזום מופעל קולטן גמא; Acrp30 = חלבון משלים adipocyte הקשורים של 30 kDa; Fabp4 = חלבון מחייב חומצות שומן 4; Glut4 = טרנספורטר גלוקוז 4; Cd36 = אשכול של בידול 36; Retn = התנגדות; Slc27a1 = משפחת מנשא מסיס 27 חבר 1; Ear2 = אאוזינופיל הקשורים, ריבונוקלאאז משפחה 2; Pgc1a = PPARγ קואקטיביטור 1alpha; Prdm16 = תחום רגולטורי חיובי I-binding פקטור 1 (PRDI-BF1) ו רטינובלסטומה חלבון אינטראקציה אבץ אצבע גן 1 (RIZ1) תחום הומולוגי המכיל 16; Eva1 = אפיתל V דמוי אנטיגן 1; Cidea = גורם פיצול DNA גרימת מוות של תאים-אפקט דמוי אלפא A; Ucp1 = ניתוק חלבון 1; Dio2 = סוג 2 דיודינאז. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רקמת שומן היא קריטית עבור רגישות לאינסולין מערכתית הומאוסטזיס גלוקוז20. תפקוד לקוי של אדיפוציטים הקשורים להשמנה קשור קשר הדוק עם הופעת סוכרת מסוג 2. לכן, הבנה טובה יותר של הביולוגיה הבסיסית והפיזיולוגיה של רקמת השומן עשויה לאפשר תכנון של טיפולים חדשים להפרעות מטבוליות. כהשלמה לניתוח פונקציונלי ותעתיקי ישיר של אדיפוציטים בוגרים מבודדים ממחסני שומן21,22, adipocytes ראשוניים מתורבתים הוכחו לסיכום היבטים רבים של פתופיזיולוגיה רקמת שומן, כולל הפרשת אדיפוקינים, עמידות לאינסולין בתגובה לגירויים פרו דלקתיים, אינדוקציה של התוכנית התרמוגנית23,24,25. למרות פרוטוקולים קודמים תיארו את הבידוד של מבשרי adipocyte מעכברים בוגרים11,12, פרוטוקול זה מספק שיטה לבידוד יעיל של תאים מן הגורים שזה עתה נולדו. אסטרטגיה זו מניבה אוכלוסייה גדולה משמעותית של אבות אדיפוציטים לבנים וחומים עם פוטנציאל בידול גבוה יותר, שכן מחסני שומן לאחר הלידה עדיין לא מובחנים יחסית בהשוואה למחסני השומן של עכברים בוגרים26. יתר על כן, תאים מבודדים בשיטה זו כבר מחויבים ומניבים adipocytes מובחנים תפקודית מלאה המבטאים סמנים של תאים בוגרים ומציגים את התכונות הפיזיולוגיות הייחודיות שלהם, כולל אחסון שומנים ויכולת תרמוגנית.
אין אפשרות להרחיב תאים ראשיים במבחנה ללא הגבלת זמן. בנוסף, preadipocytes העיקרי מתחילים לאבד את הפוטנציאל adipogenic שלהם לאחר מספר קטעים בתרבות. הסיבה לכך היא ככל הנראה כי תרבות התא המתמשך גורמת להעשרה מהותית של תאים פחות מחויבים, יותר מתרבים. לפיכך, מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא חלון הזמן שבמהלכו ניתן להשתמש בקדם-רכיבים. פוטנציאל Adipogenic נשמר באופן מלא אם תאים מושרים להבדיל בתוך 7-8 ימים מזמן הבידוד. אבות אדיפוציטים עמידים במיוחד לעיכול אנזימטי, אך בכל זאת חשוב לתזמן נכון את הטיפול בקולגנאז. עיכול יתר של רקמות עלול לגרום להישרדות תאים מופחתת ויכולת מופחתת של תאים לדבוק בצלחת. לאורך כל שלב ההתפשטות, הן לבן חום preadipocytes הם חסידים מאוד והוא יכול לסבול שטיפות נמרצות חילופי מדיה תכופים. עם זאת, השימוש בצלחות מצופות מומלץ כאשר preadipocytes הם המושרה להבדיל. בוגרת, אדיפוציטים עמוסי שומנים ירדו הידבקות פני השטח ואינטראקציות תאים, וכתוצאה מכך נטייה להתנתק במהלך הבידול אלא אם כן טיפל בעדינות. הצעד העדין ביותר של הפרוטוקול הוא אינדוקציה של בידול. FBS, אינסולין, T3, ותרופות אחרות חייב להיבדק, ואת הריכוזים הסופיים שלהם אופטימיזציה, כדי להשיג את ההיקף הגבוה ביותר של בידול. אגוניסט PPARγ (למשל, rosiglitazone) ניתן גם להוסיף כדי לעורר עוד יותר אדיפוגנזה.
חשוב לציין כי ניתן להתאים את תנאי הבידול לצרכים הניסיוניים. לדוגמה, במסכים עם ספריות גנטיות או כימיות שנועדו לזהות חלבונים/תרכובות המשפרים את הבידול לבן ו/או חום adipocyte, preadipocytes ניתן לגרום להבדיל באמצעות מדיום מתירני מינימלי הכולל 10% FBS ב DMEM ו 170 ננומטר אינסולין בלבד. הערכה של כל רכיב של קוקטייל הבידול מומלץ לקבוע חלונות מבחנים אידיאליים עבור מבחני בידול. T3 ו dexamethasone ניתנים לוותר על בידול לבן וחום ראשוני adipocyte. תנאים אלה יבטיחו שיעור נמוך של בידול בתאי בקרה, ובכך להגדיל את החלון של ההסתערות ולמקסם את היכולת לזהות גורמים פרו-אדיפוגניים. תרבויות של אדיפוציטים חומים ולבנים ראשוניים הם כלי רב עוצמה לחקור תפקוד אוטונומי של תאים אדיפוציטים בתגובה למניפולציה גנטית ולחצים מטבוליים כדי להשלים את המחקר של רקמת שומן חום ולבן ב vivo. לפיכך, פרוטוקולים לבידוד ותרבות של preadipocytes ראשי נדרשים כדי לאפשר רבייה, חקירות תפוקה גבוהה של פונקציית adipocyte במבחנה. האסטרטגיה המתוארת כאן מאפשרת מחקר של preadipocytes לבן וחום ראשוני שניתן להבדיל לתוך adipocytes בוגרת לחלוטין נבדק תחת מגוון רחב של מניפולציות ניסיוניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים אסירי תודה לכריסטינה גודיו בסנטרו נאסיונאל דה ביוטקנולוגיה במדריד, ספרד, מארי גנטנר במכון המחקר סקריפס, לה ג'ולה ואנסטסיה קראלי באוניברסיטת ג'ונס הופקינס, בולטימור, על סיוע באופטימיזציה של פרוטוקול זה בהתבסס על העבודה הראשונית של קאהן ואח'. עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקים DK114785 ו DK121196 כדי E.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
- Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
- Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
- Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
- Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
- Lynes, M. D., Tseng, Y. H. Deciphering adipose tissue heterogeneity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).
- Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
- Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
- Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
- Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).
- Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
- Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
- Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
- Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).
