Summary
Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de monstervoorbereiding bij het plannen van experimenten met MALDI MSI om metabole en moleculaire detectie in biologische monsters te maximaliseren.
Abstract
Metabolomics, de studie om kleine moleculen en metabolieten in een experimenteel monster te identificeren en te kwantificeren, is naar voren gekomen als een belangrijk hulpmiddel om de biologische activiteiten tijdens ontwikkeling en ziekten te onderzoeken. Metabolomics-benaderingen worden op grote schaal gebruikt in de studie van kanker, voeding / dieet, diabetes en andere fysiologische en pathologische aandoeningen met metabole processen. Een voordelig hulpmiddel dat helpt bij metabolomische profilering die in dit artikel wordt bepleit, is matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie massaspectrometrie beeldvorming (MALDI MSI). Het vermogen om metabolieten in situ te detecteren zonder etikettering, structurele modificaties of andere gespecialiseerde reagentia, zoals die worden gebruikt bij immunostaining, maakt MALDI MSI een uniek hulpmiddel bij het bevorderen van methodologieën die relevant zijn op het gebied van metabolomica. Een geschikt monstervoorbereidingsproces is van cruciaal belang om optimale resultaten te behalen en zal de focus van dit artikel zijn.
Introduction
Metabolieten, de tussenproducten of eindproducten van het metabolisme, waaronder nucleotiden, aminozuren of organische zuren, lipiden, zijn belangrijke componenten voor biologische functies en processen. Metabolomics, de studie van metabolieten, maakt het mogelijk om hun biochemische interacties te verkennen en hun rol te begrijpen in de context van fundamenteel, translationeel en klinisch onderzoek. Metabolieten zijn sterk geassocieerd met de fenotypen van organismen en geven informatie over biochemische activiteiten die optreden tijdens het cellulaire metabolisme1. Daarom is metabolomica, naast genomica en proteomica, naar voren gekomen als een belangrijk hulpmiddel bij het begrijpen van zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. Metabolomics wordt bijvoorbeeld gebruikt bij het ophelderen van de mechanismen achter bestaande geneesmiddelen en hun tolerantie. Bij de ontwikkeling van geneesmiddelen is xenobiotisch metabolisme nuttig bij het beoordelen van de activiteit of toxiciteit van metabolieten tussen soorten, wat zich later vertaalt in het ondersteunen van gepersonaliseerde geneeskunde2. Ondanks de brede toepassing van metabolomica kan beeldvorming van metabolieten een uitdaging zijn vanwege de chemische reactiviteit van metabolieten, structurele heterogeniteit en een breed concentratiebereik3. De concentraties van labiele metabolieten, waaronder hoogenergetische verbindingen, glucose, lactaat, glycolytisch, pentose shuntroute en TCA-cyclustussenproducten, fosfolipiden, neurotransmitters, signaleringsverbindingen, kunnen echter binnen enkele seconden veranderen en in de loop van minuten vorderen wanneer weefselenzymen actief zijn tijdens weefseloogstprocedures, zoals postmortale ischemie bij het oogsten van de hersenen4,5,6 . Om nauwkeurige metabolomics-gegevensverzameling te garanderen, is een geschikte en zorgvuldige monstervoorbereiding van cruciaal belang7,8. Huidige gevestigde platforms voor het meten van metabolieten omvatten NMR, enzymtests en massaspectrometrie (inclusief vloeistof- en gaschromatografie), waarvan de laatste hieronder verder wordt besproken.
MALDI-MSI is een state-of-the-art techniek die de analyse van complexe monsters mogelijk maakt door de detectie van individuele moleculaire soorten. MALDI MSI biedt het voordeel van het snel en reproduceerbaar kunnen meten van verschillende moleculaire verbindingen in biologische monsters. Massaspectrometrie beeldvorming maakt het verder mogelijk om beelden te produceren die weefselbiologie vertegenwoordigen op basis van de samengestelde metabolieten, en doet dit met behoud van de ruimtelijke verdeling van de metabolieten in het monster9. MALDI's vermogen om analyten in een monster te detecteren zonder het gebruik van antilichaametikettering, structurele modificaties of andere gespecialiseerde reagentia, zoals die worden gebruikt bij immunostaining, in combinatie met het vermogen om honderden moleculen binnen één experiment te monitoren, omvat slechts enkele van de voordelen die MS-beeldvorming biedt als het gaat om metabole profilering10, 11. Naast veelgebruikte matrix zoals 2,5-dihydroxybenzoëzuur (DHB) en 9-aminoacridine (9-AA), heeft onlangs ontdekte nieuwe matrix N-(1-Naftyl) Ethyleendiamine Dihydrochloride (NEDC), die zeer geschikt is voor analyses van verschillende metabolieten met een laag molecuulgewicht, de toepassing van MALDI MSI in metabole profilering verder verbeterd12.
Ondanks de brede toepassing van MALDI MSI verhinderen de hoge kosten van het instrument en de complexiteit van de experimentele procedure de bredere implementatie ervan in individuele onderzoekslaboratoria. Daarom worden de meeste MALDI MSI-onderzoeken ondersteund door gedeelde kernfaciliteiten. De monstervoorbereiding, inclusief diavoorbereiding en matrixcoating, is de meest kritieke stap in MALDI MSI. De diavoorbereiding wordt echter normaal gesproken uitgevoerd in het laboratorium van individuele onderzoekers, wat potentiële variaties creëert in latere MALDI MSI-acquisitie. Hier willen we een gedetailleerd protocol bieden voor de monstervoorbereiding van biologische monsters voordat we doorgaan met MALDI MSI-metingen en een metabolomische profilering van ontwikkelingsmuishersenen als voorbeeld gebruiken.
Protocol
Het protocol volgt de richtlijnen van de City University of New York (CUNY) Advanced Science Research Center (ASRC) 's institutionele animal care and use committee (IACUC).
1. Oogst het weefsel
- Bereid de aluminium boot voor. Bereid een rechthoek aluminium 10cm x 20 cm voor, vouw in het midden om 10 cm dubbellaag vierkant te maken. Label de monsterinformatie aan de ene kant en vouw de andere kant om een boot te vormen met een bodemoppervlak van ongeveer 4 cm x 4 cm.
- Koel de boot voor op de vloeibare stikstof (LN2) in een piepschuimen doos.
OPMERKING: Als de boot te klein is, kan het monster uit de boot vallen en over bevroren raken door rechtstreeks contact te maken met LN2,wat kan leiden tot fragmentatie tijdens cryosectie. - Euthanaseer het dier door cervicale dislocatie volgens institutionele IACUC-richtlijnen, ontleed onmiddellijk het weefsel van belang.
- Houd het interval tussen dierlijke anesthesie en snap freezing zo kort mogelijk, om de verandering van metabolieten tijdens het oogsten van weefsel te minimaliseren, vooral de labiale metabolieten in de hersenen als gevolg van postmortale ischemie.
OPMERKING: Perfusie van het dier met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zal de duur van ischemie verlengen, waardoor de concentraties van labiele metabolieten verder veranderen en de artefactuele resultaten worden overdreven. Daarom wordt perfusie of het wassen van het weefsel met PBS niet aanbevolen, tenzij de besmetting van bloed of lichaamsvloeistof van meer zorg is dan metabolieten verslechtering of uitwas voor individuele project.
- Houd het interval tussen dierlijke anesthesie en snap freezing zo kort mogelijk, om de verandering van metabolieten tijdens het oogsten van weefsel te minimaliseren, vooral de labiale metabolieten in de hersenen als gevolg van postmortale ischemie.
- Plaats het weefsel onmiddellijk in de aluminium boot die drijft op vloeibare stikstof, sluit het deksel van de piepschuimdoos en vries gedurende 2-10 minuten in, afhankelijk van de grootte van het weefsel: respectievelijk 2 min, 5 min, 7 min voor postnatale dag 1 (P1), P21, P60 muizenhersenen en 10 minuten voor P60 rattenhersenen.
OPMERKING: Vries het weefsel niet in voor langere tijd (bijv. 5 minuten voor P1-muizenhersenen) omdat de overgevroren kan leiden tot weefselfragmentatie tijdens cryosectie. - Verwijder de boot met een tang, vouw de folie om het weefsel te wikkelen, transporteer op droogijs en bewaar bij -80 °C voor later gebruik. Indien gevolgd door onmiddellijke sectie, vervoert u de monsters op droogijs naar de cryostaat.
OPMERKING: Om de metabolieten beter te behouden, heeft het de voorkeur om het monster in intact weefsel op te slaan en het te sectien vlak voordat u overgaat tot MALDI-beeldvorming. Het weefsel kan tot 24 maanden in -80 °C worden bewaard.
2. Cryosectie van het weefsel
OPMERKING: Draag te allen tijde handschoenen bij het hanteren van de Indium tinoxide (ITO) dia's. Vermijd directe ademhaling op de dia of draag maskers (optioneel) om besmetting van menselijk speeksel op het weefselgedeelte te voorkomen.
- Voordat u het weefsel doorsneert, verzamelt u het gewenste aantal MALDI-compatibele ITO-gecoate glasplaten.
- Test de geleidbaarheid van de dia met behulp van een voltmeter die is ingesteld op weerstand. Label de kant waar een weerstandsmeting wordt gelezen: dit is de kant waar de weefselsecties zich aan hechten. Plaats de glijbaan altijd op een schone papieren handdoek om besmetting te voorkomen.
- Koel de dia's voor in een cryostaat ingesteld op -20 °C.
- Als weefselmonsters van de -80 °C werden verwijderd, laat het weefsel dan ongeveer 45-60 minuten in de cryostaatkamer balanceren, afhankelijk van de grootte van het weefsel. Als monsters uit droogijs worden verwijderd, moet u deze gedurende ongeveer 30 minuten in evenwicht brengen.
- Reinig de cryostaat grondig met 70% ethanol. Koel al het benodigde gereedschap voor, inclusief een dunne borstel en een tang in de cryostaatkamer.
- Stel de temperatuur van de cryostaatkamer en de monsterkop in volgens het type weefsel: -14 °C voor lever, -20 °C voor spieren en -25 °C voor huid9.
- Monteer het weefsel op de klauwplaat met behulp van cryoweefsel dat verbinding OCT insluit, waardoor OCT uit het interessegebied wordt vermeden.
- Plaats een schoon mes in het podium en vergrendel. Pas de positie van het podium en de hoek van het monster aan om de gewenste snijhoek te bereiken.
OPMERKING: Als verschillende soorten/genotypen weefsel moeten worden gesneden, moet u het monster herpositioneren zodat een schoon deel van het mes wordt gebruikt, of overschakelen op een nieuw mes voordat u het volgende monster snijdt om kruisbesmetting te voorkomen. - Ga door met snijden totdat het gebied van belang (bijv. Corpus callosum in de hersenen) is gevonden. Zorg ervoor dat je het podium schoon houdt door extra stukken weg te poetsen met een kunstenaarsborstel die in de cryostaat in evenwicht is gebracht.
- Zodra het gewenste gebied is onthuld, snijdt u kleinere secties van 10-12 μm dikte. Als de sectie de neiging heeft om te schilferen of gemakkelijk uit elkaar te vallen, verhoogt u de temperatuur van de cryostaat en blijft u in het bereik van -22 °C tot -11 °C. We hebben ontdekt dat de optimale snijtemperatuur voor hersenweefsel -15 °C tot - 18 °C is.
- Zodra een goede sectie is gesneden, plakt u deze op de ITO-dia (bedien deze in de cryostaatkamer).
- Breng een deel van het weefsel over op ITO-dia's met behulp van de punt van de penseel van de kunstenaar.
- Verwarm de sectie met de vinger door een vinger onder de schuif te plaatsen om het gedeelte op te warmen voor een veilige montage. Het weefselgedeelte wordt eerst transparant in 5-10 s en wordt vervolgens ondoorzichtig in ongeveer 30-60 s.
- Zet de schuif voorzichtig opzij in de cryostaat.
- Herhaal de stappen voor andere weefselmonsters en zorg ervoor dat elk deel van het weefsel gelijkmatig op de dia wordt geplaatst en zo goed mogelijk is uitgelijnd.
- Omdat het MALDI-doel maximaal twee dia's kan bevatten, plaatst u de secties van meerdere monsters van hetzelfde cohort op een enkele dia of op twee dia's, om ervoor te zorgen dat ze tegelijkertijd kunnen worden geanalyseerd.
- Als u klaar bent, plaatst u ITO-dia's in een vacuümdoos en breng u deze over naar eensiccator met droogmiddel. Droog de glijbaan vacuüm gedurende 45-60 minuten.
OPMERKING: Als er geen vacuümsiccator beschikbaar is in het laboratorium, houd de dia's dan altijd onder -20 °C om verslechtering van de metabolieten te voorkomen. - Opslag en verzending van dia's: tenzij het monster is voorbereid door de MALDI imaging-kernfaciliteiten om rechtstreeks naar MALDI imaging te gaan, de dia's op te slaan bij -80 °C of te verzenden naar kernfaciliteiten of andere MALDI-onderzoekslaboratoria op droogijs.
- Om de monsters zo goed mogelijk te bewaren, plaatst u de dia's in de schuiftransporter, vult u deze met stikstof (optioneel), verzegelt u deze met parafilm, plaatst u ze in een ritszak, die vervolgens in een andere ritszak met droogmiddel wordt geplaatst. Label de buitenste ritszak.
- Ga naar opslag bij -80 °C (tot 6 maanden) of verzend met voldoende droogijs.
3. Matrix voorbereiding
- Bereid de matrix voor.
OPMERKING: Alle reagentia moeten hplc-kwaliteit zijn.- Bereid NEDC in een concentratie van 10 mg / ml. Bereid 10 ml matrix opgelost in een oplosmiddel van 70% methanol (100 mg NEDC, 7 ml methanol, 3 ml H2O).
- Bereid bovendien een extra 10 ml 70% methanol:wateroplossing voor om het sproeisysteem te spoelen voordat u de matrix vult.
- Zodra de dia's zijn uitgedroogd in stap 2.17, plaatst u "X" -markeringen op de lege ruimte van de glasplaat buiten de weefselsecties met behulp van een vetgedrukte zilveren puntmarkering en plaatst u vervolgens een tweede "x" met een fijne punt zwarte marker bovenop de zilveren "X". De zwarte "X" met een scherp contrast uit de zilveren achtergrond (de vetgedrukte zilveren "X") zal later dienen als fiduciaire marker voor de latere massaspectra-acquisitie in het MALDI-instrument.
- Plaats de schuif in het metalen MALDI-schuifdoel. Gebruik een plastic hoes en teken/schets waar de monsters zich op de plastic hoes bevinden. Gereserveerd.
- Scan de afbeelding van de dia samen met het MALDI-doel met behulp van een flatbedscanner. De schroeven op het oppervlak van het doelwit dienen als afstandsplaats om schade of besmetting van het weefselgedeelte door de scanner te voorkomen. Bekijk een voorvertoning en scan het geselecteerde diagebied in 16-bits grijswaarden en 2400 dpi. Sla de afbeelding op voor later gebruik in MALDI MSI.
4. Matrix depositie
OPMERKING: Er zijn meerdere methoden om een gelijkmatige laag matrix in fijne kristalgrootte op de MALDI-dia aan te brengen, inclusief sublimatie, druppelinkjetdruk, automatische matrixspuit en handmatige spray met behulp van artist airbush9. We zullen automatische matrixspuit als voorbeeld gebruiken in dit protocol vanwege de hoge reproduceerbaarheid.
- Opstarten: Schakel de matrixsproeiereenheid in, zorg ervoor dat de klep op LOAD is geplaatst en start de spuitsoftware. Controleer of de afzuigventilator goed werkt. Start de oplosmiddelpomp niet als de actieve ontluchting niet goed werkt.
- Bevestig op het tabblad Comms dat alles communiceert en start vervolgens de oplosmiddelpomp op .1 ml/min, met een tegendruk van ~500 psi (of 3,4 MPa).
- Start de persluchtstroom naar de matrixspuit door de stikstoftank in te stellen op 30 psi. Stel vervolgens de drukregelaar aan de voorkant van de sproeier in op 10 psi en stel de temperatuur van de spuitmond naar wens in.
OPMERKING: Als de luchtdruk in gebed lager is dan 5 psi, kan de spuitmond niet opwarmen voor bescherming. - Gebruik een spuit om de lus te spoelen met 7 ml 70% methanol en vul de lus vervolgens met 6 ml matrix.
- Plaats het weefselglijden in de houders in de sproeier, plak beide uiteinden af om beweging te voorkomen en om een matrixvrije rand te behouden om te voorkomen dat de metalen klem op het MALDI-doel door de matrix wordt besmet.
OPMERKING: Het testen van matrixspray op een lege microscoopglaasje eerst voordat u doorgaat met kostbare monsterglaasjes wordt ten zeerste aanbevolen. - Controleer of het debiet en de temperatuur stabiel zijn om te beginnen met spuiten.
- Selecteer de gewenste methode die vooraf is getest met behulp van blanco glasplaat.
- Druk op Start. Hiermee wordt de mondstuktemperatuur ingesteld en wordt het pompdebiet aangepast aan de geselecteerde methode. Schakel de klep van load naar spray-positie en bevestig door op Doorgaante klikken.
- Laat het systeem draaien, wat 5-20 minuten per dia duurt, afhankelijk van de methode. Schakel de klep van Spray naar Load-positie en bevestig vervolgens door op Doorgaan te klikken wanneer u klaar bent.
- Verwijder de dia('s) uit de spuit, onderzoek het patroon van de matrixcoating onder de microscoop om een gelijkmatige laag fijn matrixkristal te garanderen.
- Plaats na matrixafzetting de dia('s) in de metalen MALDI-houder voor onmiddellijk gebruik. Als er slechts één monsterdia is, voegt u nog een lege dia toe om de twee ruimtes van de MALDI-houder te vullen.
- Reinig het systeem onmiddellijk na het gebruik volgens de instructies van de fabrikant om verstopping van de spuitmond te voorkomen.
- Nadat de monsterdia is bedekt met matrix, gaat u onmiddellijk naar het MALDI-beeldvormingsinstrument of verzendt u het met droogijs met hetzelfde preparaat met dubbele ritszak als beschreven in stap 2.19.
OPMERKING: In noodsituaties zoals het MALDI-instrument is niet beschikbaar voor onmiddellijk gebruik, bewaar de gecoate glaas in vacuümconditie of bij -20 °C gedurende maximaal 24 uur, hoewel de verslechtering van sommige metabolieten kan optreden tijdens de opslag, die niet grondig is bestudeerd.
Representative Results
Het representatieve experiment werd uitgevoerd volgens de workflow in figuur 1. De ontwikkelings-C57BL wildtype muizenhersenen van postnatale dag 1, 21, 60 (volwassene) werden geoogst zoals hierboven beschreven volgens cuny IACUC-richtlijnen en werden respectievelijk 2, 5 en 7 minuten bevroren op een aluminium boot die op vloeibare stikstof dreef. De ingevroren weefsels werden gecryosectied bij secties met een dikte van 10 μm bij −15 °C voor zowel de monsterkop als de kamer. De cryosecties van het weefsel werden vervolgens voorzichtig overgebracht op de voorgekoelde geleidende kant van ITO-gecoate glasglaasjes voor MALDI-beeldvorming. Gemonteerde cryosecties op ITO-dia's werden gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in vacuüm uitgedroogd, gevolgd door matrixafzetting met behulp van automatische matrixsproeier. Matrix NEDC werd gebruikt om metabolieten te detecteren en een matrixoplossing van 10 mg/ml in methanol/water (70/30, v/v) werd afgezet met een debiet van 0,1 ml/min en een mondstuktemperatuur van 75 °C gedurende 12 cycli met 5 s drogen tussen elke cyclus. Er werd gebruik gemaakt van een sproeisnelheid van 1300 mm/min, spoorafstand van 2 mm, N2 gasdruk van 10 psi en debiet van 3 L/min en nozzlehoogte van 40 mm.
MALDI-massaspectra werden in negatieve ionenmodus verkregen door het MALDI time of flight (TOF) MSI-instrument. 0,5-1 μL rode fosfor (Pn-clusters met n = 1 - 90) emulsie in methanol werd afgezet op de ITO-dia's, naast de gemonteerde weefsels, en gebruikt om het instrument te kalibreren in het massabereik van 100 - 1000 m/z door kwadratische kalibratiecurve13toe te passen . De laserspotdiameters werden gericht op "Medium" gemoduleerd straalprofiel voor een rasterbreedte van 50 μm. Spectra binnen het massabereik van m/z 50 tot 1000 werden verkregen bij een 1000 Hz voor 500 opnamen. Massaspectragegevens werden geregistreerd en de beeldvorming werd verder geanalyseerd met behulp van geavanceerde MALDI MSI-gegevensanalysesoftware. Ionenafbeeldingen werden gegenereerd met RMS-normalisatie (root-mean square) bij een binbreedte van ±0,25 Da.
De resultaten in figuur 2 tonen uitvoerbeelden van MALDI MSI-data-analysesoftware van m/z-spectra, geselecteerd uit elk daltoninterval van 100 Dalton, waarbij duidelijk het nut wordt weergegeven voor de identificatie van spectra van metabolieten van kleine moleculen tot lipiden met een hoog molecuulgewicht. Elke rij toont de respectievelijke ionenwarmtekaarten met zowel ruimtelijke als spectrale informatie van een bepaalde metabolietsoort over drie weefsels verzameld op postnatale dag 1, 21 en 60. Voor elke representatieve m/z kan analyse van regionale verspreiding en ionen abundanties worden gebruikt om relatieve hoeveelheden van overeenkomstige soorten tussen verschillende leeftijden te vergelijken. Een kracht van de MALDI MSI-methodologie is het vermogen om de specificiteit van bepaalde soorten geïdentificeerd door m / z te onderscheiden tot ontwikkelingsmijlpalen of specifieke anatomische structuren. Sommige metabolieten worden waargenomen als verrijkt in P1-pasgeborenen (m/z 320.1), verrijkt bij P60-volwassenen (m/z 846.5) of uniform verdeeld over leeftijden (m/z 480.3); andere moleculaire soorten zijn specifiek verrijkt met grijze stof (m/z 117.1; 524.3; 765.1), witte stof (m/z 673.4; 846.5) of CSF/ventrikels (m/z 239.0) (Figuur 2A). De ruimtelijke verdeling van representatieve metabolieten waaronder hypoxanthine (m/z 135.0), N-Acetyl-L-asparaginezuur (m/z 174.0), Arachidonzuur (m/z 303.2) en verschillende lipiden zoals lysofosfatidylethanolamine LPE (18:1) (m/z 478.3), LPE(20:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), fosfatidylethanolamine PE (44:10) (m/z 838.5), Fosfatidylinositol PI(38:4) (m/z 885.6) wordt ook getoond (Figuur 2B).
Figuur 1. Workflow van MALDI- time of flight (TOF) massaspectrometrie beeldvorming. Het snap bevroren weefsel wordt cryrosectioned in cryostaat en gemonteerd op ITO slide. → De dia met weefselsecties is bedekt met een fijne laag matrix met behulp van een automatische matrixspuit. → Mass spectra wordt verzameld door MALDI-TOF MSI instrument op een raster van 20-200um. → De gegevens worden geanalyseerd en de beelden worden gegenereerd met behulp van geavanceerde MALDI MSI-software voor gegevensanalyse. Schaalbalk: 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Representatieve output met geselecteerde m/z spectra uit massaspectrometrie verkregen bij 50 μm laterale resolutie. (A) Een heatmap toont de ruimtelijke verdeling van specifieke metabolietsoorten geselecteerd uit elk 100 Dalton m/z-interval over de drie ontwikkelingsmijlpalen geïdentificeerd bij P1, P21 en P60. B)De ruimtelijke verdeling van representatieve metabolieten bij P1, P21 en P60, waaronder: hypoxanthine, N-Acetyl-L-asparaginezuur, Arachidonzuur en verschillende lipidesoorten zoals lysofosfatidylethanolamine (LPE), fosfatidylethanolamine (PE), Fosfatidylinositol (PI). Schaalbalk, 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
MALDI-Imaging (MALDI-MSI) is een labelvrije beeldvormingstechniek waarmee onderzoekers de distributie van verschillende biomoleculen en hun modificaties in weefsel, de moleculaire basis van pathologie, kunnen onderzoeken. Gecombineerd gebruik van MALDI-MSI met traditionele LC-MS-benaderingen voor weefselanalyse biedt dezelfde moleculaire diepte als traditionele Omics-workflows, maar behoudt ook de ruimtelijke relatie van die signalen binnen het cellulaire netwerk. De monstervoorbereiding is de meest kritische stap in MALDI MSI en houdt rekening met de variatie in de uiteindelijke uitleestingen van metabolomics-studies die in verschillende laboratoria zijn uitgevoerd4. Hier bieden we een uitgebreid maar praktisch protocol om de monstervoorbereiding voor metabolomische profilering te standaardiseren met behulp van MALDI MSI, in de hoop dat het een brede onderzoeksgemeenschap ten goede komt om MALDI MSI te implementeren in hun huidige en toekomstige onderzoek van basisbiologie tot translationele studies.
Men moet altijd rekening houden met alle voorzorgsmaatregelen om veranderingen in de moleculaire profielen (zowel abundanties als ruimtelijke verdeling) tijdens monsterpreparaten te minimaliseren en verontreiniging te voorkomen. Ten eerste, minimaliseer de tijd tussen dierlijke euthanasie en weefseloogst, zoals bevroren in situ of verwarmd door microgolffixatie om enzymen in de hersenen te inactiveren om de aansprakelijkheid voor postmortale ischemie te verminderen4,5,6. Ten tweede is de snap-vriestoestand van het monster van cruciaal belang. Onvoldoende bevriezing zal de afbraak en het verlies van de metabolieten veroorzaken, terwijl overvriezen zal leiden tot weefselfragmentatie tijdens cryosectie. De vriestijd moet altijd eerst worden getest volgens eerdere gerapporteerde studies, en de studie van ontwikkelingsmuishersenen die in dit artikel wordt gepresenteerd, biedt de referentiepunten voor hersenweefsel van knaagdieren. Ten derde vereist het snijden van biologische weefsels en het overbrengen van hun secties naar de ITO-dia's adequate oefening. Het is belangrijk op te merken dat tijdens het gebruik van de borstel om het gedeelte van het podium op te pakken, de borstel voorzichtig moet worden gebruikt. Laat de borstelharen alleen in contact komen met de randen van het weefselgedeelte om het risico op besmetting en fragmentatie van de sectie te verminderen. Vlak het gedeelte op de glijbaan zoveel mogelijk af, dit voorkomt het krullen van het gedeelte tijdens het opwarmen van de vingers. Ten vierde, zorg er tijdens de montage op de ITO-dia voor dat het hele gedeelte goed is bevestigd aan de ITO-dia, omdat verschillende delen van het weefsel mogelijk verschillende tijd van vingerverwarming vereisen. Hersentumorweefsel heeft bijvoorbeeld een langere opwarmingstijd nodig dan normaal hersenweefsel. Een slechte montage kan leiden tot loslating en fragmentatie van het weefsel tijdens MALDI-MS-scanning. Houd er rekening mee dat de vingeropwarming enzymwerking en metabolisme mogelijk kan maken die artefactuele veranderingen van metabolieten veroorzaken. Ten vijfde speelt een fijne en uniforme afzetting van de MALDI-matrix een belangrijke rol bij het verkrijgen van nauwkeurige ruimtelijke informatie en een sterk MALDI-MS-signaal. Het wordt aanbevolen om de matrixspuiten op een lege dia te testen en het kristalpatroon onder een microscoop te observeren om de juiste dekking te verifiëren, voordat u doorgaat met de coating van kostbare monsterglaas. En ten slotte, aangezien een individuele onderzoeker de weefseloogst en glijpreparaat met verschillende snelheden uitvoert, zou het ideaal zijn om één persoon te hebben om de monstervoorbereiding voor het monster in hetzelfde cohort te behandelen, om de variatie te minimaliseren.
Het hierboven verstrekte protocol beschrijft standaardprocedures, die kunnen worden afgestemd op de behoeften van bepaalde experimenten. Een cryo-sectioning gel OCT, die normaal gesproken wordt gebruikt bij cryo-sectioning van het monster, kan bijvoorbeeld verder worden gebruikt als een montagelijm op de weefselhouder (zoals in de hierboven beschreven studie). Eerdere studies hebben aangetoond dat de polymeercomponent in OCT een sterke ionenonderdrukking veroorzaakt14. Het insluiten van het monster kan echter onvermijdelijk zijn in de gevallen waarin het weefsel te kwetsbaar is om te worden gesneden zonder extra ondersteuning van een polymeergel. Om signaalonderdrukking in deze gevallen te bestrijden, moeten de weefsels mogelijk worden gewassen met serieel wassen in 70% ethanol en 95% ethanol om resterende OCT te verwijderen voor de detectie van eiwitten of lipiden, terwijl het wassen niet wordt aanbevolen voor de detectie van kleine moleculairemetabolieten 9.
MALDI MSI is steeds relevanter geworden in zowel het onderzoekslaboratorium als de klinische praktijk. MALDI MSI is bijvoorbeeld onlangs nuttig gebleken in studies van proteomics om de fenotypische functionele status van een organisme te karakteriseren15, en bij het fungeren als een agent voor microbiële identificatie en diagnose van volgende ziekte16. Hoewel MALDI MSI een breed scala aan toepassingen ondersteunt, zijn er enkele beperkingen verbonden aan het uitsluitend vertrouwen op deze techniek, vooral als het gaat om het onderscheiden van vergelijkbare soorten of metabolieten en de identificatie van specifieke doelen. Een andere uitdaging is de kwantificering van de metabolietenconcentratie volgens MALDI MSI-signalen. Vaak wordt aangenomen dat ionen abundanties in MALDI MSI spectra en de ruimtelijke verdeling (of relatieve abundanties) van overeenkomstige moleculaire soorten over ontlede weefsels goed gecorreleerd zijn. Men moet echter altijd in gedachten houden dat de relatie tussen ionenintensiteit en de hoeveelheid overeenkomstige moleculaire soorten wordt gecompliceerd door tal van factoren, waaronder, maar niet beperkt tot, effecten van ionenonderdrukking, veranderingen in weefselstructuur en ion-molecuulreacties17. Technieken die gebruik maken van interne standaarden kunnen worden geïmplementeerd voor absolute kwantificering (μmol/g weefsel) in MALDI-MSI18. Deze twee uitdagingen worden meestal aangepakt met de gecombineerde workflow van MALDI MSI met vloeistofchromatografie tandem MS (LC-MS / MS) -technieken, waarbij MALDI-MS het mogelijk maakt om het interessante gebied in kaart te brengen, dat later wordt onderworpen aan micro-extractie en LC-MS / MS om meer informatie te bieden voor het identificeren van de metaboliet19.
Ms-gebaseerde beeldvormingsmethoden zijn de afgelopen jaren ontwikkeld als een alternatieve modaliteit voor eerdere technieken voor het afbeelden van metabolieten van kleine moleculen. Met de vooruitgang en groeiende populariteit van MALDI MSI, wordt verwacht dat MALDI imaging een nieuw standaard hulpmiddel zal worden voor het visualiseren van kleine moleculen. Beeldvorming van lipide en endogene kleine moleculen (bijv. neurotransmitters en metabolieten) in de biologische context, evenals beeldvorming van xenobiotica voor de ontwikkeling van nieuwe farmaceutische agentia zijn van bijzonder belang. Deze drie gebieden zullen naar verwachting in de nabije toekomst snelle vooruitgang hebben met de toepassing van MALDI MSI20.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Ye He en Rinat Abzalimov worden ondersteund door het Professional Staff Congress-City University of New York (PSC-CUNY) Research Award Program. Yuki Chen en Kelly Veerasammy worden ondersteund door het Alfred P. Sloan Foundation CUNY Summer Undergraduate Research Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| Autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC219095000 | |
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC) | Millipore Sigma Aldrich | 222488 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Watkins, S. M., German, J. B. Metabolomics and biochemical profiling in drug discovery and development. Current Opinion in Molecular Therapeutics. 4, 224-228 (2002).
- Fernie, A. R., Trethewey, R. N., Krotzky, A. J., Willmitzer, L. Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 763-769 (2004).
- Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J., Wilson, I. D. Liquid chromatography-mass spectrometry based global metabolite profiling: a review. Analytica Chimica Acta. 711, 7-16 (2012).
- Dienel, G. A. Metabolomic and Imaging Mass Spectrometric Assays of Labile Brain Metabolites: Critical Importance of Brain Harvest Procedures. Neurochemistry Research. 45, 2586-2606 (2020).
- Dienel, G. A. Metabolomic Assays of Postmortem Brain Extracts: Pitfalls in Extrapolation of Concentrations of Glucose and Amino Acids to Metabolic Dysregulation In Vivo in Neurological Diseases. Neurochemistry Research. 44, 2239-2260 (2019).
- Wasek, B., Arning, E., Bottiglieri, T. The use of microwave irradiation for quantitative analysis of neurotransmitters in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 307, 188-193 (2018).
- Andres, D. A., et al. Improved workflow for mass spectrometry-based metabolomics analysis of the heart. Journal of Biological Chemistry. 295, 2676-2686 (2020).
- Lu, W., et al. Metabolite Measurement: Pitfalls to Avoid and Practices to Follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113, 2309-2342 (2013).
- Miura, D., et al. Ultrahighly sensitive in situ metabolomic imaging for visualizing spatiotemporal metabolic behaviors. Analytical Chemistry. 82, 9789-9796 (2010).
- Han, J., et al. Towards high-throughput metabolomics using ultrahigh-field Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Metabolomics. 4, 128-140 (2008).
- Wang, J., et al. MALDI-TOF MS imaging of metabolites with a N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride matrix and its application to colorectal cancer liver metastasis. Analytical Chemistry. 87, 422-430 (2015).
- Sladkova, K., Houska, J., Havel, J. Laser desorption ionization of red phosphorus clusters and their use for mass calibration in time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19, 3114-3118 (2019).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38, 699-708 (2003).
- Greco, V., et al. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics. Expert Review of Proteomics. 15, 683-696 (2018).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in Microbiology. 6, 791 (2015).
- Hankin, J. A., Murphy, R. C. Relationship between MALDI IMS intensity and measured quantity of selected phospholipids in rat brain sections. Analytical Chemistry. 82 (20), 8476-8484 (2010).
- Prentice, B. M., Chumbley, C. W., Caprioli, R. M. Absolute Quantification of Rifampicin by MALDI Imaging Mass Spectrometry Using Multiple TOF/TOF Events in a Single Laser Shot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (1), 136-144 (2017).
- Quanico, J., Franck, J., Wisztorski, M., Salzet, M., Fournier, I. Combined MALDI Mass Spectrometry Imaging and Parafilm-Assisted Microdissection-Based LC-MS/MS Workflows in the Study of the Brain. Methods in Molecular Biology. 1598, 269-283 (2017).
- Trim, P. J., Snel, M. F. Small molecule MALDI MS imaging: Current technologies and future challenges. Methods. 104, 127-141 (2016).
