Summary
Målet med denne protokol er at give detaljeret vejledning om prøveforberedelsen, når der planlægges forsøg med MALDI MSI for at maksimere metabolisk og molekylær detektion i biologiske prøver.
Abstract
Metabolomics, undersøgelsen for at identificere og kvantificere små molekyler og metabolitter, der er til stede i en eksperimentel prøve, har vist sig som et vigtigt redskab til at undersøge de biologiske aktiviteter under udvikling og sygdomme. Metabolomics tilgange er almindeligt anvendt i studiet af kræft, ernæring / kost, diabetes, og andre fysiologiske og patologiske forhold, der involverer metaboliske processer. Et fordelagtigt værktøj, der hjælper med metabolomisk profilering, der anbefales i dette papir, er matrixassisteret laserdesorption / ioniseringsmassespektrometribilleddannelse (MALDI MSI). Dens evne til at opdage metabolitter in situ uden mærkning, strukturelle modifikationer eller andre specialiserede reagenser, såsom dem, der anvendes til immunstaining, gør MALDI MSI til et unikt værktøj til at fremme metoder, der er relevante inden for metabolomics. En passende prøveforberedelsesproces er afgørende for at give optimale resultater og vil være i fokus i dette papir.
Introduction
Metabolitter, mellemprodukter eller slutprodukter af stofskiftet, herunder nukleotider, aminosyrer eller organiske syrer, lipider, er nøglekomponenter til biologiske funktioner og processer. Metabolomics, studiet af metabolitter, giver mulighed for udforskning af deres biokemiske interaktioner og forståelsen af deres roller i forbindelse med grundlæggende, translationel og klinisk forskning. Metabolitter er stærkt forbundet med fænotyper af organismer og give oplysninger om biokemiske aktiviteter, der opstår under cellulær metabolisme1. Ud over genomforskning og proteomics har metabolomics derfor vist sig som et vigtigt redskab til at forstå både fysiologiske og patologiske forhold. For eksempel anvendes metabolomics til at belyse mekanismerne bag eksisterende lægemidler samt deres tolerance. I lægemiddeludvikling er xenobiotisk metabolisme nyttig til vurdering af metabolitternes aktivitet eller toksicitet på tværs af arter, hvilket senere kan oversættes til at understøtte personlig medicin2. På trods af den brede anvendelse af metabolomics kan billeddannelse af metabolitter være udfordrende på grund af metabolitternes kemiske reaktivitet, strukturel heterogenitet og bredt koncentrationsområde3. Men koncentrationerne af labile metabolitter, herunder højenergiforbindelser, glukose, laktat, glykolytisk, pentose shunt vej, og TCA cyklus mellemprodukter, fosfolipider, neurotransmittere, signalering forbindelser, kan ændre sig inden for få sekunder og fremskridt over minutter, når væv enzymer er aktive under væv høst procedurer, såsom postmortem iskæmi i hjernen høst4,5,6 . For at sikre nøjagtig erhvervelse af metabolomics-data er passende og omhyggelig prøveforberedelse afgørende7,8. Nuværende etablerede platforme til måling af metabolitter omfatter NMR, enzymanalyser og massespektrometri (herunder flydende og gaskromatografi), hvoraf den sidste diskuteres yderligere nedenfor.
MALDI-MSI er en state-of-the-art teknik, der giver mulighed for analyse af komplekse prøver gennem påvisning af individuelle molekylære arter. MALDI MSI giver fordelen ved hurtigt og reproducerligt at kunne måle forskellige molekylære forbindelser i biologiske prøver. Massespektrometribilleddannelse giver yderligere mulighed for produktion af billeder, der repræsenterer vævsbiologi baseret på dets sammensatte metabolitter, og gør det samtidig med at metabolitternes rumlige fordeling bevares i prøve9. MALDI's evne til at detektere analytter i en prøve uden brug af antistofmærkning, strukturelle modifikationer eller andre specialiserede reagenser, såsom dem, der anvendes til immunstainning, kombineret med dets evne til at overvåge hundredvis af molekyler inden for et enkelt eksperiment omfatter blot nogle få af de fordele, MS-billeddannelse giver, når det kommer til metabolisk profilering10, 11. Ud over almindeligt anvendt matrix såsom 2,5-dihydroxybenzosyre (DHB) og 9-aminoacridin (9-AA), nyligt opdaget nye matrix N -(1-Naphthyl) Ethylenediamin Dihydrochlorid (NEDC), som er velegnet til analyser af forskellige lav molekylvægt metabolitter, har yderligere forbedret anvendelsen af MALDI MSI i metabolisk profilering12.
På trods af den brede anvendelse af MALDI MSI forhindrer de høje omkostninger ved instrumentet og forsøgsprocedurens kompleksitet dens bredere gennemførelse i de enkelte forskningslaboratorier. Derfor understøttes de fleste af MALDI MSI-undersøgelserne gennem fælles kernefaciliteter. Prøveforberedelsen, herunder slideforberedelse og matrixbelægning, er det mest kritiske trin i MALDI MSI. Diaspræparatet udføres dog normalt i den enkelte forskers laboratorium, hvilket skaber potentielle variationer i senere MALDI MSI-erhvervelse. Her sigter vi mod at levere en detaljeret protokol til prøvepræparat af biologiske prøver, før vi går videre til MALDI MSI-målinger, og bruge en metabolomisk profilering af udviklingsmushjerne som et eksempel.
Protocol
Protokollen følger retningslinjerne fra City University of New York (CUNY) Advanced Science Research Center (ASRC)s institutionelle dyrepleje og brug udvalg (IACUC).
1. Høst vævet
- Gør aluminiumsbåden klar. Forbered et rektangel aluminium 10cm x 20 cm, fold i midten for at gøre 10 cm dobbelt lag firkantet. Mærk prøveoplysningerne på den ene side, og fold den anden side for at danne en båd med bundflade ca. 4 cm x 4 cm.
- Forkøl båden på det flydende nitrogen (LN2) i en Styrofoam-kasse.
BEMÆRK: Hvis båden er for lille, kan prøven falde ud af båden og blive over frosset ved direkte at kontakte LN2, hvilket kan resultere i fragmentering under kryosektion. - Aflive dyret ved cervikal dislokation efter institutionelle IACUC retningslinjer, straks dissekere ud væv af interesse.
- Hold intervallet mellem dyrebedøvelse og snap frysning så kort som muligt, for at minimere ændringen af metabolitter under væv høst, især labial metabolitter i hjernen på grund af postmortem iskæmi.
BEMÆRK: Perfusion dyret med fosfat-buffered saltvand (PBS) vil øge varigheden af iskæmi, yderligere ændre koncentrationer af labile metabolitter og overdrive artefaktiske resultater. Derfor anbefales det ikke at perfusion eller vaske vævet med PBS, medmindre forureningen af blod eller kropsvæske er mere bekymret end metabolitters forringelse eller udvaskning til individuelt projekt.
- Hold intervallet mellem dyrebedøvelse og snap frysning så kort som muligt, for at minimere ændringen af metabolitter under væv høst, især labial metabolitter i hjernen på grund af postmortem iskæmi.
- Placer straks vævet i aluminiumsbåden, der flyder på flydende nitrogen, luk låget på Styrofoam-kassen og frys i 2-10 min afhængigt af vævets størrelse: 2 min, 5 min, 7 min for postnatal dag 1 (P1), P21, P60 mushjerne og 10 min til P60 rottehjerne.
BEMÆRK: Opfrys ikke vævet i længere tid (f.eks. 5 min. for P1-musehjernen), da den overfrosne kan føre til vævsfragmentering under kryosektion. - Fjern båden med sammenkrammer, fold folien for at pakke vævet, transporteres på tøris og opbevares ved -80 °C til senere brug. Hvis det efterfølges af øjeblikkelig indsnit, skal du bære prøverne på tøris til kryostat.
BEMÆRK: For bedre at bevare metabolitterne foretrækkes det at opbevare prøven i intakt væv og dele den lige før du fortsætter til MALDI-billeddannelse. Vævet kan opbevares i -80 °C i op til 24 måneder.
2. Cryosection vævet
BEMÆRK: Brug handsker til enhver tid, når du håndterer indium tinoxid (ITO) dias. Undgå direkte vejrtrækning på diaset eller bære masker (valgfrit) for at forhindre forurening af human spyt på vævssektionen.
- Før du sectioning vævet, samle det ønskede antal MALDI kompatible ITO belagt glas dias.
- Test ledningsevnen af diaset ved hjælp af et voltmeter indstillet til modstand. Mærk den side, hvor en modstandsmåling læses: Dette vil være den side, som vævssektionerne klæber til. Placer altid rutsjebanen på et rent køkkenrulle for at undgå forurening.
- Forkøl diasene i en kryostat, der er indstillet til -20 °C.
- Hvis vævsprøverne blev fjernet fra -80 °C, skal vævet ekvilibrere i kryostatkammeret i ca. 45-60 min afhængigt af vævets størrelse. Hvis prøverne fjerner fra tøris, skal du ekvilibrere det i ca. 30 minutter.
- Rengør kryostaten grundigt med 70% ethanol. Forkøl alle de nødvendige værktøjer, herunder tyndspidset kunstnerbørste og sammentrækninger i kryostatkammeret.
- Indstil temperaturen på kryostatkammeret og prøvehovedet efter vævstypen: -14 °C for lever, -20 °C for muskler og -25 °C for hud9.
- Monter vævet til chuck ved hjælp af cryo væv indlejring sammensatte OLT, undgå OLT fra området af interesse.
- Placer en ren klinge på scenen og lås. Juster placeringen af scenen og vinklen på prøven for at opnå den ønskede skærevinkel.
BEMÆRK: Hvis der skal skæres forskellige typer/genotyper af væv, skal du enten flytte prøven, så der anvendes en ren del af klingen , eller skifte til en ny klinge, før du skærer den næste prøve for at forhindre krydskontaminering. - Fortsæt med at skære, indtil området af interesse (f.eks corpus callosum i hjernen) er fundet. Sørg for at holde scenen ren ved at børste ekstra stykker af med en kunstnerbørste, der er blevet ekvilibreret i kryostat.
- Når den ønskede region er afsløret, skæres mindre sektioner på 10-12 μm tykkelse. Hvis afsnittet har tendens til at flage eller falde let fra hinanden, skal du hæve temperaturen på kryostat, opholder sig i -22 °C til -11 °C rækkevidde. Vi har konstateret, at den optimale skæretemperatur for hjernevæv er -15 °C til - 18 °C.
- Når en god sektion er blevet skåret, skal du klæbe den til ITO-diaset (fungere i kryostatkammeret).
- Overfør en del af vævet til ITO-dias ved hjælp af spidsen af kunstnerbørste.
- Finger-varm sektionen ved at placere en finger under diaset for at varme sektionen op for at sikre sikker montering. Vævssektionen vil først blive gennemsigtig i 5-10 s og derefter blive uigennemsigtig i omkring 30-60 s.
- Sæt forsigtigt rutsjebanen til side i kryostat.
- Gentag trin for andre vævsprøver, sikre, at hver del af vævet er placeret jævnt på diaset og er så justeret som muligt.
- Da MALDI-målet kan rumme op til to dias, skal du placere sektionerne fra flere prøver af den samme kohorte på et enkelt dias eller på to dias for at sikre, at de kan analyseres på samme tid.
- Når du er færdig, skal du placere ITO-dias i en vakuumkasse og overføre til en ekssikkator med tørremiddel. Støvsug rutsjebanen i 45-60 min.
BEMÆRK: Hvis der ikke er en vakuumafsiccator i laboratoriet, skal du holde diasene under -20 °C hele tiden for at undgå forringelse af metabolitterne. - Diasopbevaring og -forsendelse: Medmindre prøven er udarbejdet af MALDI-billeddannelseskernefaciliteterne til at gå direkte til MALDI-billeddannelse, skal diasene opbevares ved -80 °C eller sende til kernefaciliteter eller andre MALDI-forskningslaboratorier på tøris.
- For bedst at bevare prøverne skal du placere diasene i diastransportøren, fylde den med nitrogen (valgfrit), forsegle med parafilm, placeres i en zip-pose, som derefter placeres i en anden lynlåspose indeholdende tørremiddel. Mærk den ydre lynlåspose.
- Fortsæt til opbevaring ved -80 °C (op til 6 måneder) eller forsendelse med tilstrækkelig tøris.
3. Matrix Forberedelse
- Forbered matrixen.
BEMÆRK: Alle reagenser skal være HPLC-kvalitet.- Nedc forberedes i en koncentration på 10 mg/mL. Der fremstilles 10 mL matrix opløst i et opløsningsmiddel på 70 % methanol (100 mg NEDC, 7 mL methanol, 3 mL H2O).
- Derudover forberede en ekstra 10 mL af 70% methanol:vand løsning til at skylle sprøjtesystemet, før påfyldning i matrixen.
- Når diasene er dehydreret i trin 2.17, skal du placere "X"-mærker på det tomme rum i glassliden uden for vævssektionerne ved hjælp af en fed punkt sølvmarkør og derefter placere et andet "x" med en finpunkt sort markør oven på sølv "X". Den sorte "X" med en skarp kontrast ud af sølv baggrund (den dristige sølv "X") vil senere tjene som betroede markør for den senere massespektre erhvervelse i MALDI instrument.
- Læg rutsjebanen ind i MALDI-slidemetalmålet. Brug plastdæksel og tegning/kontur, hvor prøverne er på plastdækslet. Afsat.
- Scan billedet af diaset sammen med MALDI-målet ved hjælp af flatbedscanneren. Skruerne på overfladen af målet vil tjene som afstands til at forhindre skader eller forurening af vævssektionen ved scanneren. Få vist og scan det markerede diasområde i 16-bit gråtoneskala og 2400 dpi. Gem billedet til senere brug i MALDI MSI.
4. Matrix deposition
BEMÆRK: Der er flere metoder til at anvende et jævnt lag af matrix i fin krystalstørrelse på MALDI-diaset, herunder sublimering, dråbeblækjetudskrivning, automatisk matrixsprøjte og manuel spray ved hjælp af kunstneren airbush9. Vi vil bruge automatisk matrixsprøjte som et eksempel i denne protokol for dens høje reproducerbarhed.
- Start op: Tænd for matrixsprøjteenheden, og sørg for, at ventilen er placeret ved LOAD, og start sprøjtesoftwaren. Kontroller, at udstødningsventilatoren fungerer godt. Opløsningsmiddelpumpen må ikke startes, hvis den aktive udluftning ikke fungerer korrekt.
- Bekræft under fanen Comms, at alt kommunikerer, og start derefter opløsningsmiddelpumpen ved 0,1 mL/min med et rygtryk på ~ 500 psi (eller 3,4 MPa).
- Start trykluftstrømmen til matrixsprøjten ved at indstille nitrogentanken til 30 psi. Juster derefter trykregulatoren på forsiden af sprøjten til 10 psi, og indstil sprøjtedysetemperaturen efter ønske.
BEMÆRK: Hvis lufttrykket i bøn er lavere end 5 psi, vil sprøjtedysen ikke kunne varme op til beskyttelse. - Da ventilen stadig er i LOAD-positionen, skal du bruge en sprøjte til at skylle løkken med 7 mL 70% methanol, og fyld derefter løkken med 6 mL matrix.
- Placer vævet glider ind i holderne i sprøjten, tape ned begge ender for at forhindre bevægelse, og for at bevare en matrix-fri kant for at undgå forurening af metal klemme på MALDI mål af matrix.
BEMÆRK: Test matrix spray på et tomt mikroskop dias først, før du fortsætter til dyrebare prøve dias anbefales stærkt. - Kontroller, at strømningshastigheden og temperaturen er stabil for at begynde sprøjtning.
- Vælg den ønskede metode, der er testet på forhånd ved hjælp af blank glasdias.
- Tryk på Start. Dette vil indstille dysetemperaturen og justere pumpestrømshastigheden, så den svarer til den valgte metode. Skift ventilen fra load til spray position og derefter bekræfte ved at klikke på Fortsæt.
- Tillad systemet at køre, hvilket vil tage 5-20 min pr dias afhængigt af metoden. Skift ventilen fra Spray til belastning position derefter bekræfte ved at klikke på Fortsæt, når du er færdig.
- Fjern diasene fra sprøjten, undersøg mønsteret af matrixbelægning under mikroskop for at sikre et jævnt lag af fin matrixkrystal.
- Efter matrixaflejring skal rutsjebanerne placeres i MALDI-holderen af metal til øjeblikkelig brug. Hvis der kun er ét prøvedias, skal du tilføje endnu et tomt dias for at udfylde de to mellemrum i MALDI-holderen.
- Ryd op i systemet umiddelbart efter brug efter producentens anvisninger for at forhindre tilstopning af sprøjtedyse.
- Når prøvediaset er belagt med matrix, skal du enten straks gå til MALDI-billedinstrumentet eller sende det med tøris ved hjælp af det samme dobbelte lynlåsposepræparat, der er beskrevet i trin 2.19.
BEMÆRK: Under nødsituationer som MALDI-instrumentet er ikke tilgængelig til øjeblikkelig brug, opbevares den coatede rutsjebane i vakuumtilstand eller ved -20 °C i op til 24 timer, selv om forringelsen af nogle metabolitter kan ske under opbevaringen, som ikke er blevet grundigt undersøgt.
Representative Results
Det repræsentative eksperiment blev udført i overensstemmelse med den arbejdsgang, der er vist i figur 1. De udviklingsmæssige C57BL wildtype musehjerner på postnatal dag 1, 21, 60 (voksen) blev høstet som beskrevet ovenfor efter CUNY IACUC retningslinjer og blev snap frosset i henholdsvis 2, 5 og 7 min på en aluminiumsbåd flydende på flydende nitrogen. Det frosne væv blev kryosektioneret ved 10 μm tykkelsessektioner ved −15 °C indstillet til både prøvehoved og kammeret. Vævsvævsråbesektionerne blev derefter forsigtigt overført til den forkølede ledende side af ITO-coatede glasrutschebaner til MALDI-billeddannelse. Monterede kryosections på ITO dias blev udtørret i vakuum i 45 min ved stuetemperatur, efterfulgt af matrix aflejring ved hjælp af automatisk matrix sprøjte. Matrix NEDC blev anvendt til at detektere metabolitter, og en matrixopløsning på 10 mg/ml i methanol/vand (70/30, v/v) blev deponeret med en strømningshastighed på 0,1 ml/min og en dysetemperatur på 75 °C i 12 cyklusser med 5 s tørring mellem hver cyklus. Der blev anvendt en sprøjtehastighed på 1300 mm/min, sporafstand på 2 mm, N2 gastryk på 10 psi og strømningshastighed på 3 L/min og dysehøjde på 40 mm.
MALDI massespektre blev erhvervet i negativ ion mode af MALDI tidspunktet for flyvning (TOF) MSI instrument. 0,5-1 μL rødt fosfor (Pn klynger med n = 1 - 90) emulsion i methanol blev deponeret på ITO dias, ved siden af de monterede væv, og bruges til at kalibrere instrumentet i 100 - 1000 m / z masseområdet ved at anvende kvadratisk kalibrering kurve13. Laserpletdiametre var fokuseret på "Medium" moduleret stråleprofil for 50 μm rasterbredde. Spektre inden for masseområdet fra m / z 50 til 1000 blev erhvervet på en 1000 Hz for 500 skud. Massespektredata blev registreret, og billeddannelsen blev yderligere analyseret ved hjælp af avanceret MALDI MSI-dataanalysesoftware. Ion billeder blev genereret med root-mean square (RMS) normalisering på en bin bredde på ±0,25 Da.
Resultaterne i figur 2 viser outputbilleder fra MALDI MSI-dataanalysesoftware af m/z-spektre udvalgt fra hvert 100 Dalton-interval, der tydeligt viser spektret til identifikation af spektre fra små molekyle metabolitter til lipider med høj molekylvægt. Hver række skildrer respektive ionvarmekort, der indeholder både rumlige og spektrale oplysninger om en bestemt metabolitart på tværs af tre væv indsamlet på postnatal dag 1, 21 og 60. For hver repræsentativ m/z kan analyse af regionale fordelings- og ion-overflod anvendes til at sammenligne relative mængder af tilsvarende arter mellem forskellige aldre. En styrke ved MALDI MSI-metoden er evnen til at skelne specificiteten af visse arter, der er identificeret ved m/z, til udviklingsmæssige milepæle eller specifikke anatomiske strukturer. Nogle metabolitter observeres at blive beriget med P1 nyfødte (m/z 320.1), beriget hos P60 voksne (m/z 846,5) eller ensartet fordelt på aldre (m/z 480,3); andre molekylære arter er specielt beriget med gråt stof (m/z 117.1; 524.3; 765.1), hvidt stof (m/z 673,4; 846,5) eller CSF/hjertekamre (m/z 239,0) (figur 2A). Den rumlige fordeling af repræsentative metabolitter, herunder hypoxanthine (m/z 135.0), N-Acetyl-L-aspartsyre (m/z 174.0), arachinonsyre (m/z 303.2) og flere lipider såsom lysophosphatidylethanolamin LPE (18:1) (m/z 478,3), LPE(478.3), LPE(478.3), LPE(478.3), LPE(478.3), LPE(478.3), LPE(478.3) 20:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), fosfatylethanolamin PE (44:10) (m/z 838.5), Phosphatidylinositol PI(38:4) (m/z 885.6) er også vist (Figur 2B).
Figur 1. Arbejdsgang for MALDI- tidspunktet for flyvning (TOF) massespektrometribilleddannelse. Snap frosne væv er cryrosectioned i cryostat og monteret på ITO dias. → Diaset med vævssektioner er belagt med et fint lag matrix ved hjælp af automatisk matrixsprøjte. → Massespektre indsamles af MALDI-TOF MSI instrument på en raster på 20-200um. → Dataene analyseres, og billederne genereres ved hjælp af avanceret MALDI MSI-dataanalysesoftware. Skalalinje: 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentativ ydelse med udvalgte m/z-spektre fra massespektrometri erhvervet ved 50 μm laterale opløsning. (A) Et varmekort viser den geografiske fordeling af specifikke metabolitarter, der udvælges fra hvert 100 Dalton m/z-interval på tværs af de tre udviklingsmilepæle, der er identificeret ved P1, P21 og P60. (B) Den geografiske fordeling af repræsentative metabolitter ved P1, P21 og P60, herunder: hypoxanthine, N-Acetyl-L-asparticsyre, arachidonsyre og forskellige lipidarter såsom lysophosphatidylethanolamin (LPE), fosfattidylethanolamin (PE), Phosphatidylinositol (PI). Skalalinje, 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
MALDI-Imaging (MALDI-MSI) er en etiketfri billedteknik, der gør det muligt for forskere at undersøge fordelingen af forskellige biomolekyler og deres modifikationer i væv, det molekylære grundlag for patologi. Kombineret brug af MALDI-MSI med traditionelle LC-MS-tilgange til vævsanalyse giver samme molekylære dybde som traditionelle Omics-arbejdsgange, men som også bevarer det rumlige forhold mellem disse signaler inden for mobilnetværket. Prøveforberedelsen er det mest kritiske trin i MALDI MSI og tegner sig for variationen i de endelige udlæsninger af metabolomics-undersøgelser udført i forskellige laboratorier4. Her leverer vi en omfattende, men praktisk protokol til standardisering af prøveforberedelsen til metabolomisk profilering ved hjælp af MALDI MSI i håb om, at det gavner et bredt forskningsmiljø at implementere MALDI MSI i deres nuværende og fremtidige forskning fra grundlæggende biologi til translationelle undersøgelser.
Man skal altid huske på alle forholdsregler for at minimere ændringer i molekylære profiler (både overflod og rumlig fordeling) under prøvepræparater og undgå forurening. For det første minimere tiden mellem animalsk aktiv dødshjælp og væv høst, såsom frosset in situ eller opvarmet ved mikrobølge fiksering til at inaktivere enzymer i hjernen for at reducere ansvaret for postmortem iskæmi4,5,6. For det andet er prøvens snapfrysningstilstand kritisk. Utilstrækkelig frysning vil forårsage nedbrydning og tab af metabolitterne, mens over frysning vil føre til vævsfragmentering under kryosektion. Frysetiden bør altid testes først i henhold til tidligere rapporterede undersøgelser, og studiet af udviklingsmushjernen, der præsenteres i dette papir, giver referencepunkterne for gnaverhjernevæv. For det tredje vil skæring af biologisk væv og overførsel af deres sektioner til ITO-dias kræve tilstrækkelig praksis. Det er vigtigt at bemærke, at mens du bruger børsten til at afhente sektionen fra scenen, skal børsten bruges delikat. Lad børstebørster kun komme i kontakt med kanterne af vævssektionen for at mindske risikoen for forurening og sektionsfragmentering. Samkopier afsnittet på diaset så meget som muligt, dette vil forhindre curling af sektionen under finger-opvarmning. For det fjerde, mens montering på ITO dias, sørg for hele afsnittet er godt knyttet til ITO dias som forskellige regioner i vævet kan kræve forskellige tid af finger-opvarmning. For eksempel kræver hjernetumorvæv længere opvarmningstid end normalt hjernevæv. En dårlig montering kan føre til løsrivelse og fragmentering af vævet under MALDI-MS scanning. Husk på, at finger opvarmning kan muliggøre enzym handling og stofskifte forårsager artifactual ændringer af metabolitter. For det femte spiller en fin og ensartet aflejring af MALDI-matrixen en vigtig rolle med hensyn til at opnå nøjagtig geografisk information og et stærkt MALDI-MS-signal. Det anbefales at teste matrixsprøjtningen på et tomt dias og observere krystalmønsteret under et mikroskop for at kontrollere korrekt dækning, før du fortsætter til belægningen af dyrebar prøvedias. Og endelig, da en individuel forsker udfører væv høst og slide forberedelse ved forskellige hastigheder, ville det være ideelt at have en person til at håndtere prøven forberedelse til prøven i samme kohorte, for at minimere variationen.
Protokollen ovenfor beskriver standardprocedurer, som kan skræddersys til behovene i forbindelse med bestemte eksperimenter. For eksempel kan en kryo-sektionsgel OCT, som normalt bruges i kryosektion af prøven, yderligere anvendes som en monteringslim til vævspatronen (som i den ovenfor beskrevne undersøgelse). Tidligere undersøgelser har vist, at polymerkomponenten i OCT forårsager stærk ionundertrykkelse14. Indlejring af prøven kan dog være uundgåelig i de tilfælde, hvor vævet er for skrøbeligt til at blive skåret uden yderligere støtte fra en polymergel. For at bekæmpe signalundertrykkelse i disse tilfælde kan det være nødvendigt at vaske vævene med seriel vask i 70% ethanol og 95% ethanol for at fjerne resterende OLT til påvisning af proteiner eller lipider, mens vask ikke anbefales til påvisning af små molekylære metabolitter9.
MALDI MSI er blevet mere og mere relevant i både forskningslaboratoriet og klinisk praksis. For eksempel har MALDI MSI for nylig vist sig nyttig i undersøgelser af proteomics for at karakterisere den fænotypiske funktionelle status for en organisme15, og i at fungere som et middel til mikrobiel identifikation og diagnose af efterfølgende sygdom16. Mens MALDI MSI understøtter en bred vifte af applikationer, er der nogle begrænsninger forbundet med udelukkende at stole på denne teknik, især når det kommer til at skelne mellem lignende arter eller metabolitter og identifikation af specifikke mål. En anden udfordring er kvantificeringen af metabolitternes koncentration i henhold til MALDI MSI-signaler. Det antages ofte, at ion overflod i MALDI MSI spektre og den rumlige fordeling (eller relative overflod) af tilsvarende molekylære arter på tværs af dissekerede væv er godt korreleret. Man skal dog altid huske på, at forholdet mellem ionintensitet og mængden af tilsvarende molekylære arter kompliceres af mange faktorer, herunder, men ikke begrænset til, virkninger af ionundertrykkelse, ændringer i vævsstruktur og ionmolekylereaktioner17. Teknikker, der gør brug af interne standarder, kan implementeres til absolut kvantificering (μmol/g væv) i MALDI-MSI18. Disse to udfordringer håndteres typisk med den kombinerede arbejdsgang for MALDI MSI med flydende kromatografi tandem MS(LC-MS/MS) teknikker, hvorved MALDI-MS giver mulighed for kortlægning af interesseområdet, som senere udsættes for mikroextraction og LC-MS/MS for at give flere oplysninger til identifikation af metabolit19.
MS-baserede billeddannelsesmetoder er blevet udviklet i de senere år som en alternativ modalitet til tidligere teknikker til billeddannelse af små molekyle metabolitter. Med fremskridt og stigende popularitet af MALDI MSI forventes det, at MALDI-billeddannelse bliver et nyt standardværktøj til visualisering af små molekyler. Billeddannelse af lipid og endogene små molekyler (f.eks. neurotransmittere og metabolitter) i biologisk sammenhæng samt billeddannelse af xenobiotika til udvikling af nye lægemidler er af særlig interesse. Disse tre områder forventes at have hurtige fremskridt med anvendelsen af MALDI MSI i den nærmeste fremtid20.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Ye He og Rinat Abzalimov støttes af Professional Staff Congress-City University of New York (PSC-CUNY) Research Award Program. Yuki Chen og Kelly Veerasammy er støttet af Alfred P. Sloan Foundation CUNY Summer Undergraduate Research Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| Autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC219095000 | |
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC) | Millipore Sigma Aldrich | 222488 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Watkins, S. M., German, J. B. Metabolomics and biochemical profiling in drug discovery and development. Current Opinion in Molecular Therapeutics. 4, 224-228 (2002).
- Fernie, A. R., Trethewey, R. N., Krotzky, A. J., Willmitzer, L. Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 763-769 (2004).
- Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J., Wilson, I. D. Liquid chromatography-mass spectrometry based global metabolite profiling: a review. Analytica Chimica Acta. 711, 7-16 (2012).
- Dienel, G. A. Metabolomic and Imaging Mass Spectrometric Assays of Labile Brain Metabolites: Critical Importance of Brain Harvest Procedures. Neurochemistry Research. 45, 2586-2606 (2020).
- Dienel, G. A. Metabolomic Assays of Postmortem Brain Extracts: Pitfalls in Extrapolation of Concentrations of Glucose and Amino Acids to Metabolic Dysregulation In Vivo in Neurological Diseases. Neurochemistry Research. 44, 2239-2260 (2019).
- Wasek, B., Arning, E., Bottiglieri, T. The use of microwave irradiation for quantitative analysis of neurotransmitters in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 307, 188-193 (2018).
- Andres, D. A., et al. Improved workflow for mass spectrometry-based metabolomics analysis of the heart. Journal of Biological Chemistry. 295, 2676-2686 (2020).
- Lu, W., et al. Metabolite Measurement: Pitfalls to Avoid and Practices to Follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113, 2309-2342 (2013).
- Miura, D., et al. Ultrahighly sensitive in situ metabolomic imaging for visualizing spatiotemporal metabolic behaviors. Analytical Chemistry. 82, 9789-9796 (2010).
- Han, J., et al. Towards high-throughput metabolomics using ultrahigh-field Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Metabolomics. 4, 128-140 (2008).
- Wang, J., et al. MALDI-TOF MS imaging of metabolites with a N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride matrix and its application to colorectal cancer liver metastasis. Analytical Chemistry. 87, 422-430 (2015).
- Sladkova, K., Houska, J., Havel, J. Laser desorption ionization of red phosphorus clusters and their use for mass calibration in time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19, 3114-3118 (2019).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38, 699-708 (2003).
- Greco, V., et al. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics. Expert Review of Proteomics. 15, 683-696 (2018).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in Microbiology. 6, 791 (2015).
- Hankin, J. A., Murphy, R. C. Relationship between MALDI IMS intensity and measured quantity of selected phospholipids in rat brain sections. Analytical Chemistry. 82 (20), 8476-8484 (2010).
- Prentice, B. M., Chumbley, C. W., Caprioli, R. M. Absolute Quantification of Rifampicin by MALDI Imaging Mass Spectrometry Using Multiple TOF/TOF Events in a Single Laser Shot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (1), 136-144 (2017).
- Quanico, J., Franck, J., Wisztorski, M., Salzet, M., Fournier, I. Combined MALDI Mass Spectrometry Imaging and Parafilm-Assisted Microdissection-Based LC-MS/MS Workflows in the Study of the Brain. Methods in Molecular Biology. 1598, 269-283 (2017).
- Trim, P. J., Snel, M. F. Small molecule MALDI MS imaging: Current technologies and future challenges. Methods. 104, 127-141 (2016).
