Summary
מטרת פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת על הכנת המדגם בעת תכנון ניסויים באמצעות MALDI MSI כדי למקסם זיהוי מטבולי ומולקולרי בדגימות ביולוגיות.
Abstract
מטבולומיה, המחקר לזיהוי וכימות מולקולות קטנות ומטבוליטים הנמצאים במדגם ניסיוני, הופיע ככלי חשוב לחקור את הפעילות הביולוגית במהלך התפתחות ומחלות. גישות מטבולומיה מועסקות באופן נרחב בחקר הסרטן, תזונה/דיאטה, סוכרת, ומצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים אחרים המערבים תהליכים מטבוליים. כלי מועיל המסייע ביצירת פרופיל מטבולומי הנתמך במאמר זה הוא הדמיית ספקטרומטריית מסת דסורפציה/יינון בסיוע מטריצה (MALDI MSI). היכולת לזהות מטבוליטים במקום ללא תיוג, שינויים מבניים, או ריאגנטים מיוחדים אחרים, כגון אלה המשמשים חיסונים, הופכת את MALDI MSI לכלי ייחודי בקידום מתודולוגיות רלוונטיות בתחום חילוף החומרים. תהליך הכנת מדגם מתאים הוא קריטי כדי להניב תוצאות אופטימליות ויהיה המוקד של נייר זה.
Introduction
מטבוליטים, מתווכים או תוצרי קצה של חילוף החומרים, כולל נוקלאוטידים, חומצות אמינו או אורגניות, שומנים, הם מרכיבים מרכזיים לתפקודים ותהליכים ביולוגיים. מטבולומיה, חקר מטבוליטים, מאפשר לחקור את האינטראקציות הביוכימיות שלהם ואת הבנת תפקידם בהקשר של מחקר בסיסי, תרגומי וקליני. מטבוליטים קשורים מאוד פנוטיפים של אורגניזמים ולספק מידע על פעילויות ביוכימיות המתרחשות במהלך חילוף החומרים התאי1. לכן, בנוסף לגנומיקה ופרוטומיה, מטבולומיה התפתחה ככלי חשוב בהבנת התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים כאחד. לדוגמה, מטבולומיקה משמשת כדי לפרט את המנגנונים מאחורי תרופות קיימות, כמו גם את הסובלנות שלהם. בפיתוח תרופות, חילוף החומרים קסנוביוטי שימושי בהערכת הפעילות או הרעילות של מטבוליטים על פני מינים, אשר מאוחר יותר מתרגם לתמיכה ברפואה מותאמת אישית2. למרות היישום הרחב של מטבולומיה, הדמיה של מטבוליטים יכולה להיות מאתגרת עקב תגובתיות כימית של מטבוליטים, הטרוגניות מבנית, וטווח ריכוז רחב3. עם זאת, הריכוזים של מטבוליטים שפתיים כולל תרכובות אנרגיה גבוהה, גלוקוז, לקטט, גליקוליטי, מסלול דלף פנטוז, ומתווכים מחזור TCA, פוספוליפידים, נוירוטרנסמיטורים, תרכובות איתות, יכול להשתנות בתוך שניות ולהתקדם על פני דקות כאשר אנזימי רקמות פעילים במהלך הליכי קצירת רקמות, כגון איסכמיה לאחר המוות במוחקצירת 4,5,6 . כדי להבטיח רכישת נתונים מטבולומית מדויקת, הכנה מדגם מתאים וזהיר הוא קריטי7,8. הפלטפורמות הנוכחיות למדידת מטבוליטים כוללות NMR, בדיקות אנזימים וספקטרומטריית מסה (כולל כרומטוגרפיה נוזלית וגז), האחרונה שבהן נידונה בהמשך.
MALDI-MSI היא טכניקה חדשנית המאפשרת ניתוח של דגימות מורכבות באמצעות זיהוי של מינים מולקולריים בודדים. MALDI MSI מעניק את היתרון של היכולת למדוד במהירות ובשחזור תרכובות מולקולריות שונות בדגימות ביולוגיות. הדמיית ספקטרומטריית מסה מאפשרת עוד יותר לייצור תמונות המייצגות ביולוגיה של רקמות בהתבסס על המטבוליטים המורכבים שלה, ועושה זאת תוך שמירה על ההתפלגות המרחבית של המטבוליטים במדגם9. היכולת של MALDI לזהות ניתוחים במדגם ללא שימוש בסימון נוגדנים, שינויים מבניים, או ריאגנטים מיוחדים אחרים, כגון אלה המשמשים לחיסון, יחד עם יכולתה לפקח על מאות מולקולות בתוך ניסוי אחד מהווים רק כמה מהיתרונות של מענקים להדמיית MS כשמדובר בפרופיל מטבולי10, 11. בנוסף מטריצה נפוצה כגון 2,5-דיהידרוקסיבנזואית (DHB) ו 9-אמינואקרידין (9-AA), גילה לאחרונה מטריצה חדשנית N -(1-Naphthyl) אתילנדיאמין דיהידרוכלוריד (NEDC), אשר מתאים היטב עבור ניתוחים של מטבוליטים שונים במשקל מולקולרי נמוך, שיפר עוד יותר את היישום של MALDI MSI בפרופיל מטבולי12.
למרות היישום הרחב של MALDI MSI, העלות הגבוהה של המכשיר ומורכבות ההליך הניסיוני מונעת את יישומו הרחב יותר במעבדות מחקר בודדות. לכן, רוב מחקרי ה- MSI של MALDI נתמכים באמצעות מתקני ליבה משותפים. הכנת המדגם, כולל הכנת שקופיות וציפוי מטריצה, היא השלב הקריטי ביותר ב- MALDI MSI. עם זאת, הכנת השקופית מתבצעת בדרך כלל במעבדה של חוקר בודד, אשר יוצר וריאציות פוטנציאליות מאוחר יותר MALDI MSI לרכוש. כאן אנו שואפים לספק פרוטוקול מפורט להכנת מדגם של דגימות ביולוגיות לפני שתמשיך למדידות MALDI MSI, ולהשתמש בפרופיל מטבולומי של מוח עכבר התפתחותי כדוגמה.
Protocol
הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות של אוניברסיטת העיר ניו יורק (CUNY) מרכז מחקר מדעי מתקדם (ASRC) של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדית ושימוש (IACUC).
1. לקצור את הרקמה
- הכן את סירת האלומיניום. הכן אלומיניום מלבן 10 ס"מ על 20 ס"מ, לקפל באמצע כדי להפוך 10 ס"מ שכבה כפולה מרובעת. סמן את המידע לדוגמה בצד אחד, ומקפל את הצד השני ליצירת סירה עם משטח תחתון כ-4 ס"מ על 4 ס"מ.
- יש להקדים את הסירה על החנקן הנוזלי (LN2)בקופסת קלקר.
הערה: אם הסירה קטנה מדי, המדגם עלול ליפול מהסירה ולהיות קפוא יתר על המידה על ידי פנייה ישירה LN2, אשר עלול לגרום פיצול במהלך cryosectioning. - להרדים את החיה על ידי נקע צוואר הרחם בעקבות הנחיות IACUC מוסדיות, מיד לנתח את רקמת העניין.
- שמור על המרווח בין הרדמה של בעלי חיים להקפאה קצרה ככל האפשר, כדי למזער את השינוי של מטבוליטים במהלך קצירת רקמות, במיוחד מטבוליטים labial במוח עקב איסכמיה לאחר המוות.
הערה: זלוף החיה עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) יגדיל את משך איסכמיה, ישנה עוד יותר את הריכוזים של מטבוליטים שפתיים והגזים בתוצאות הממצאיות. לכן, זלוף או שטיפת הרקמה עם PBS אינו מומלץ, אלא אם כן זיהום של דם או נוזל גוף הוא מודאג יותר מאשר הידרדרות מטבוליטים או שטיפה לפרויקט בודד.
- שמור על המרווח בין הרדמה של בעלי חיים להקפאה קצרה ככל האפשר, כדי למזער את השינוי של מטבוליטים במהלך קצירת רקמות, במיוחד מטבוליטים labial במוח עקב איסכמיה לאחר המוות.
- מיד למקם את הרקמה לתוך סירת האלומיניום צף על חנקן נוזלי, לסגור את המכסה של תיבת קלקר, ולהקפיא במשך 2-10 דקות בהתאם לגודל הרקמה: 2 דקות, 5 דקות, 7 דקות ליום לאחר ההולדה 1 (P1), P21, מוח עכבר P60, בהתאמה, ו 10 דקות עבור מוח חולדה P60.
הערה: אין להקפיא את הרקמה למשך זמן ממושך (למשל, 5 דקות למוח העכבר P1) מכיוון שהקפאת יתר עלולה להוביל לפיצול רקמות במהלך קריוזקציה. - הסר את הסירה על ידי מלקחיים, לקפל את נייר הכסף כדי לעטוף את הרקמה, להעביר על קרח יבש ולאחסן ב -80 °C (80 °F) לשימוש מאוחר יותר. אם ואחריו חתך מיידי, לשאת את הדגימות על קרח יבש להקפאה.
הערה: כדי לשמר טוב יותר את המטבוליטים, עדיף לאחסן את המדגם ברקמה שלמה ולחלק אותה ממש לפני שתמשיך להדמיית MALDI. הרקמה יכולה להיות מאוחסנת ב -80 °C (70 °F) עד 24 חודשים.
2. קריוזקציה הרקמה
הערה: ללבוש כפפות בכל עת בעת טיפול שקופיות indium tinoxide (ITO). הימנע נשימה ישירה על השקופית או ללבוש מסכות (אופציונלי) כדי למנוע זיהום של רוק אנושי על קטע הרקמה.
- לפני החלקת הרקמה, לאסוף את המספר הרצוי של מגלשות זכוכית מצופה ITO תואם MALDI.
- בדוק את המוליכות של השקופית באמצעות מד וולטמטר המוגדר להתנגדות. סמן את הצד שבו נקראת מדידת התנגדות: זה יהיה הצד שמקטעי הרקמה נצמדים אליו. תמיד למקם את השקופית על מגבת נייר נקיה כדי למנוע זיהום.
- קררו מראש את השקופיות בהקפאה שנקבעה ל-20 מעלות צלזיוס.
- אם דגימות רקמה הוסרו מ -80 °C (80 °F), תן לרקמה להיות משווית בתא הקריוסטט במשך כ 45-60 דקות בהתאם לגודל הרקמה. אם דגימות מסירות מקרח יבש, יש לתעד אותו במשך כ -30 דקות.
- לנקות ביסודיות את cryostat עם 70% אתנול. קררו מראש את כל הכלים הדרושים, כולל מברשת אמן דקה ומלקחיים בתא הקריוסטט.
- הגדר את הטמפרטורה של תא cryostat וראש דגימה על פי סוג הרקמה: -14 °C (70 °F) לכבד, -20 °C (70 °F) לשרירים ו -25 °C (70 °F) לעור9.
- הר את הרקמה לצ'אק באמצעות רקמת הקפאה הטמעה תרכובת OCT, הימנעות OCT מאזור העניין.
- מניחים להב נקי על הבמה ומנעולים. התאם את מיקום הבמה ואת זווית הדגימה כדי להשיג את זווית החיתוך הרצויה.
הערה: אם סוגים שונים / גנוטיפים של רקמות יש לחתוך, הקפד למקם מחדש את המדגם כך חלק נקי של הלהב משמש , או לשנות להב חדש לפני חיתוך המדגם הבא כדי למנוע זיהום צולב. - המשך לחתוך עד לאזור העניין (למשל, קורפוס קלוסאום במוח) נמצא. הקפידו לשמור על הבמה נקייה על ידי צחצוח חתיכות נוספות עם מברשת אמן כי כבר שיווי משקל בקריוסטט.
- לאחר האזור הרצוי מתגלה, לחתוך חלקים קטנים יותר של עובי 10-12 מיקרומטר. אם החלק נוטה להתקלף או להתפרק בקלות, להעלות את הטמפרטורה של cryostat, להישאר בטווח -22 °C (50 °F) עד -11 °C (50 °F). מצאנו כי טמפרטורת חיתוך אופטימלית עבור רקמת המוח הוא -15 °C (5 °F) עד - 18 °C (50 °F).
- לאחר קטע טוב נחתך, לדבוק בו שקופית ITO (לפעול בתא cryostat).
- העבר מקטע אחד של הרקמה לשקופיות ITO באמצעות קצה מברשת האמן.
- חמם את המקטע באצבע על-ידי הנחת אצבע מתחת לשקופית כדי לחמם את המקטע כדי להבטיח הרכבה מאובטחת. קטע הרקמה יהפוך תחילה לשקוף ב 5-10 s ולאחר מכן להפוך אטום בערך 30-60 s.
- הניחו בזהירות את השקופית בצד בהקפאה.
- חזור על שלבים עבור דגימות רקמות אחרות, להבטיח כי כל חלק של הרקמה ממוקם באופן שווה על השקופית והוא מיושר ככל האפשר.
- מאחר שיעד MALDI יכול להכיל עד שתי שקופיות, מקם את המקטעים מדגימות מרובות של אותה קבוצה על שקופית אחת או על שתי שקופיות, כדי להבטיח שניתן יהיה לנתח אותם בו-זמנית.
- בסיום, מקם שקופיות ITO בתיבת ואקום והעבר לחיטוי עם חיטוי. ייבשו את המגלשה בוואקום במשך 45-60 דקות.
הערה: אם ייבשן ואקום אינו זמין במעבדה, לשמור על השקופיות מתחת -20 °C (70 °F) כל הזמן כדי למנוע הידרדרות מטבוליטים. - אחסון שקופיות ומשלוח: אלא אם המדגם מוכן על ידי מתקני ליבת ההדמיה MALDI להמשיך ישירות להדמיית MALDI, לאחסן את השקופיות ב -80 °C (70 °F) או לשלוח למתקני ליבה או מעבדות מחקר MALDI אחרות על קרח יבש.
- כדי לשמר בצורה הטובה ביותר את הדגימות, מניחים את השקופיות לתוך משגר השקופיות, ממלאים אותו בחנקן (אופציונלי), אוטמים בפרפילם, מניחים בשקית רוכסן, אשר לאחר מכן ממוקמת בשקית רוכסן נוספת המכילה חיטוי. תייג את שקית הרוכסן החיצונית.
- המשך לאחסון ב-80 °C (עד 6 חודשים) או משלוח עם קרח יבש נאות.
3. הכנת מטריצה
- הכן את המטריצה.
הערה: כל הריאגנטים חייבים להיות ברמת HPLC.- הכן NEDC בריכוז של 10 מ"ג / מ"ל. הכן 10 מ"ל של מטריצה מומסת בממס של 70% מתנול (100 מ"ג של NEDC, 7 מ"ל של מתנול, 3 מ"ל של H2O).
- בנוסף להכין תוספת 10 מ"ל של 70% מתנול:פתרון מים לשטוף את מערכת מרסס לפני מילוי המטריצה.
- לאחר שהמגלשות מיובשות בשלב 2.17, מקם סימני "X" על החלל הריק של שקופית הזכוכית מחוץ למקטעי הרקמה באמצעות סמן כסף בנקודה מודגשת, ולאחר מכן מקם "x" שני עם סמן שחור בנקודה עדינה על גבי הכסף "X". ה-X השחור עם ניגודיות חדה מרקע הכסף (ה-X הכסוף הנועז) ישמש מאוחר יותר כסמן נאמנות לרכישת ספקטרום המסה המאוחרת יותר במכשיר MALDI.
- טען את השקופית לתוך המטרה מתכת שקופית MALDI. השתמש כיסוי פלסטיק לצייר / קו מתאר שבו הדגימות הן על כיסוי הפלסטיק. מניחים בצד.
- סרוק את תמונת השקופית יחד עם יעד ה- MALDI באמצעות סורק שטוח. הברגים על פני השטח של המטרה ישמשו כמרווח כדי למנוע את הנזק או הזיהום של קטע הרקמה על ידי הסורק. תצוגה מקדימה וסריקה של אזור השקופית שנבחר בגווני אפור של 16 סיביות וב- 2400 dpi. שמור את התמונה לשימוש מאוחר יותר ב- MALDI MSI.
4. תצהיר מטריקס
הערה: ישנן שיטות מרובות כדי להחיל שכבה זוגית של מטריצה בגודל גביש עדין על שקופית MALDI, כולל סובלימציה, הדפסת הזרקת דיו טיפה, מרסס מטריצה אוטומטי ותרסיס ידני באמצעות airbushאמן 9. נשתמש בריסוס מטריצה אוטומטי כדוגמה בפרוטוקול זה לשחזור הגבוה שלו.
- התחלה: הפעל את יחידת מרסס המטריצה, להיות בטוח כי השסתום ממוקם ב LOAD ולהשיק את תוכנת מרסס. בדוק כי מאוורר הפליטה פועל היטב. אין להפעיל את משאבת הממס אם האוורור הפעיל אינו מתפקד כראוי.
- אשר בכרטיסיה Comms שהכל מתקשר, ולאחר מכן התחל את משאבת הממס ב- .1 מ"ל / דקה, עם לחץ אחורי של ~ 500 psi (או 3.4 MPa).
- התחל זרימת אוויר דחוסה למרסס המטריצה על ידי הגדרת מיכל החנקן ל -30 פסאיי. לאחר מכן, להתאים את וסת הלחץ על החלק הקדמי של מרסס ל 10 פסאיי, ולהגדיר טמפרטורת זרבובית מרסס כרצונו.
הערה: אם לחץ האוויר בתפילה נמוך מ 5 פסאיי, זרבובית המרסס לא תוכל להתחמם להגנה. - עם השסתום עדיין במצב LOAD, להשתמש מזרק כדי לשטוף את הלולאה עם 7 מ"ל של 70% מתנול, ולאחר מכן למלא את הלולאה עם 6 מ"ל של מטריצה.
- מניחים את הרקמה מחליקה לתוך המחזיקים במרסס, מדביקים את שני הקצוות כדי למנוע תנועה, ולשמור על קצה ללא מטריצה כדי למנוע זיהום של מלחצי המתכת על המטרה MALDI על ידי המטריצה.
הערה: בדיקת תרסיס מטריצה בשקופית מיקרוסקופ ריקה תחילה לפני שתמשיך לשקופיות לדוגמה יקרות מומלץ מאוד. - בדוק כי קצב הזרימה והטמפרטורה יציבים כדי להתחיל ריסוס.
- בחר את השיטה הרצויה שנבדקה מראש באמצעות שקופית זכוכית ריקה.
- לחץ על התחל. פעולה זו תקבע את טמפרטורת הזרבובית ותתאים את קצב זרימת המשאבה כך שתתאים לשיטה שנבחרה. החלף את השסתום ממצב עומס לתרסיס ולאחר מכן אשר על-ידי לחיצה על המשך .
- אפשר למערכת לפעול, אשר ייקח 5-20 דקות לשקופית בהתאם לשיטה. החלף את השסתום ממיקום ספריי לטעינה ולאחר מכן אשר על-ידי לחיצה על המשך בסיום.
- הסר את השקופיות מהמרסס, בדוק את דפוס ציפוי המטריצה מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח שכבה אחידה של גביש מטריצה עדין.
- לאחר תצהיר מטריצה, למקם את השקופיות לתוך מחזיק MALDI מתכת לשימוש מיידי. אם קיימת שקופית דגימה אחת בלבד, הוסף שקופית ריקה נוספת כדי למלא את שני הרווחים של מחזיק MALDI.
- נקה את המערכת מיד לאחר השימוש בעקבות הוראת היצרן, כדי למנוע סתימה של זרבובית מרסס.
- לאחר שקופית המדגם מצופה מטריצה, המשך מיד למכשיר הדמיה MALDI, או שלח אותו עם קרח יבש באמצעות אותה הכנת שקית רוכסן כפולה המתוארת בשלב 2.19.
הערה: בנסיבות חירום כגון מכשיר MALDI אינו זמין לשימוש מיידי, לאחסן את השקופית מצופה במצב ואקום או ב -20 °C (20 °F) עד 24 שעות, אם כי ההידרדרות של כמה מטבוליטים עלולה לקרות במהלך האחסון, אשר לא נחקר ביסודיות.
Representative Results
הניסוי הייצוגי בוצע בהתאם לזרימת העבודה המוצגת באיור 1. מוחות עכברי ה-C57BL ההתפתחותיים של היום שלאחר ההילדה 1, 21, 60 (מבוגר) נקצרו כמתואר לעיל בעקבות הנחיות CUNY IACUC והוקפאו למשך 2, 5 ו -7 דקות, בהתאמה, על סירת אלומיניום צפה על חנקן נוזלי. הרקמות הקפואות היו cryosectioned ב 10 μm קטעים ב −15 °C מוגדר הן ראש דגימה ואת התא. קריוזציות הרקמה הועברו בעדינות לצד המוליך מקורר מראש של שקופיות זכוכית מצופות ITO להדמיית MALDI. קריוזקציה רכובה על שקופיות ITO היו מיובשות בוואקום במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו תצהיר מטריצה באמצעות מרסס מטריצה אוטומטי. מטריקס NEDC שימש לזיהוי מטבוליטים, ופתרון מטריצה של 10 מ"ג / מ"ל במתנול / מים (70/30, v / v) הופקד בקצב זרימה של 0.1 מ"ל / דקה וטמפרטורת זרבובית של 75 ° C במשך 12 מחזורים עם 5 s ייבוש בין כל מחזור. מהירות ספריי של 1300 מ"מ / דקה, מרווח מסלול של 2 מ"מ, לחץ גז N2 של 10 פסאיי וקצב זרימה של 3 L / min וגובה זרבובית של 40 מ"מ שימש.
ספקטרום מסה MALDI נרכשו במצב יון שלילי על ידי MALDI זמן טיסה (TOF) מכשיר MSI. 0.5-1 μL של זרחן אדום (אשכולות Pn עם n = 1 - 90) אמולסיה במתנול הופקד על שקופיות ITO, ליד הרקמות המותקנות, ושימש לכיול המכשיר בטווח המסה של 100 - 1000 מ '/z על ידי החלת עקומת כיול ריבועית13. קטרי ספוט הלייזר התמקדו בפרופיל קרן מאופנן "בינוני" לרוחב רסטר של 50 מיקרומטר. ספקטרום בטווח המסה מ m / z 50 ל 1000 נרכשו ב 1000 הרץ עבור 500 יריות. נתוני ספקטרום מסה נרשמו, וההדמיה נותחה עוד יותר באמצעות תוכנת ניתוח נתונים מתקדמת של MALDI MSI. תמונות יון נוצרו עם נורמליזציה ריבועית ממוצעת שורש (RMS) ברוחב סל של ±0.25 Da.
התוצאות באיור 2 מציגות תמונות פלט מתוכנת ניתוח הנתונים של MALDI MSI של ספקטרום m/z שנבחרה מכל מרווח של 100 דלטון, המתארת בבירור את התועלת לזיהוי ספקטרום ממטבוליטים של מולקולות קטנות ועד שומנים במשקל מולקולרי גבוה. כל שורה מתארת מפות חום יונים בהתאמה המכילות מידע מרחבי וספקטרלי של מינים מטבוליטים מסוימים על פני שלוש רקמות שנאספו ביום שלאחר ההולדה 1, 21 ו - 60. עבור כל נציג m/z, ניתוח של התפלגות אזורית ושפע יונים יכול לשמש כדי להשוות כמויות יחסיות של מינים מקבילים בין הגילאים השונים. כוחה של מתודולוגיית ה-MSI של MALDI הוא היכולת להבחין בספציפיות של מינים מסוימים שזוהו על ידי m/z לאבני דרך התפתחותיות או למבנים אנטומיים ספציפיים. כמה מטבוליטים נצפים להיות מועשר ביילודים P1 (m / z 320.1), מועשר P60 מבוגרים (m / z 846.5), או מחולק באופן אחיד על פני גילאים (m / z 480.3); מינים מולקולריים אחרים מועשרים במיוחד בחומר אפור (m/z 117.1; 524.3; 765.1), חומר לבן (m/z 673.4; 846.5), או CSF/חדרים (m/z 239.0)(איור 2A). ההתפלגות המרחבית של מטבוליטים מייצגים כולל היפוקסנתין (m/z 135.0), חומצה N-אצטיל-L-אספרטית (m/z 174.0), חומצה ארכידונית (m/z 303.2), ומספר שומנים כגון ליסופופוספטידילטנולמין LPE (18:1) (m/z 478.3), LPE(18:1) (m/z 478.3), LPE(18:1) (m/z 478.3), LPE(18:1) 20:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), פוספטידילטנולמין PE (44:10) (m/z 838.5), פוספטידילינוזיטול PI(38:4) (מ'/z 885.6) מוצגים גם(איור 2B).
איור 1. זרימת עבודה של MALDI - זמן טיסה (TOF) הדמיית ספקטרומטריית מסה. הרקמה הקפואה של הצמד מוקפאת בקריוסטט ומורכבת על שקופית ITO. → השקופית עם מקטעי רקמות מצופה בשכבה עדינה של מטריצה באמצעות מרסס מטריצה אוטומטי. ספקטרום מסה → נאסף על ידי מכשיר MSI MALDI-TOF ברסטר של 20-200um. → הנתונים מנותחים, והתמונות נוצרות באמצעות תוכנת ניתוח נתונים מתקדמת של MALDI MSI. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. פלט מייצג עם ספקטרום m/z נבחר מפרטטרומטריית מסה שנרכשה ברזולוציה רוחבית של 50 מיקרומטר. (A)מפת חום מתארת את ההתפלגות המרחבית של מינים מטבוליטים ספציפיים שנבחרו מכל מרווח של 100 דלטון m/z על פני שלוש אבני הדרך ההתפתחותיות שזוהו ב- P1, P21 ו- P60. (B)ההתפלגות המרחבית של מטבוליטים מייצגים ב- P1, P21 ו- P60, כולל: היפוקסנתין, חומצה N-אצטיל-L-אספרטית, חומצה ארכידונית, ומינים שומנים שונים כגון ליסופוספטידילטנולמין (LPE), פוספטידילטנולמין (PE), פוספטידילינוזולמין (PI). סרגל קנה מידה, 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
MALDI-Imaging (MALDI-MSI) היא טכניקת הדמיה ללא תוויות המאפשרת לחוקרים לחקור את ההפצה של ביומולקולות שונות ואת השינויים שלהם ברקמה, הבסיס המולקולרי של הפתולוגיה. שימוש משולב ב- MALDI-MSI עם גישות LC-MS מסורתיות לניתוח רקמות מספק את אותו עומק מולקולרי כמו זרימות עבודה Omics מסורתיות, אך גם שומר על הקשר המרחבי של אותות אלה בתוך הרשת הסלולרית. הכנת המדגם היא הצעד הקריטי ביותר ב- MALDI MSI ומהווה את השונות בקריאה הסופית של מחקרי מטבולומיה שבוצעו במעבדות שונות4. כאן אנו מספקים פרוטוקול מקיף אך מעשי כדי לתקנן את הכנת המדגם ליצירת פרופיל מטבולומי באמצעות MALDI MSI, בתקווה שהוא מועיל לקהילת מחקר רחבה ליישם MALDI MSI במחקר הנוכחי והעתידי שלהם מביולוגיה בסיסית למחקרים תרגומיים.
תמיד יש לזכור את כל אמצעי הזהירות כדי למזער את השינויים בפרופילים המולקולריים (הן שפע והן התפלגות מרחבית) במהלך ההכנות המדגם ולהימנע זיהום. ראשית, למזער את הזמן בין המתת חסד של בעלי חיים וקצירת רקמות, כגון קפוא במקום או מחומם על ידי קיבוע מיקרוגל כדי לנטרל אנזימים במוח כדי להפחית את האחריות איסכמיה לאחר המוות4,5,6. שנית, מצב הקפאת ההצמדה של המדגם הוא קריטי. הקפאה לקויה תגרום להשפלה ולאובדן של המטבוליטים, בעוד הקפאה יתר תוביל לפיצול רקמות במהלך קריוזקציה. זמן ההקפאה תמיד צריך להיבדק תחילה על פי מחקרים קודמים שדווחו, ומחקר מוח העכבר ההתפתחותי המוצג במאמר זה מספק את נקודות ההתייחסות לרקמת המוח של המכרסם. שלישית, חיתוך רקמות ביולוגיות והעברת החלקים שלהם לשקופיות ITO ידרשו תרגול הולם. חשוב לציין כי בעת השימוש במברשת כדי להרים את החלק מהבמה, יש להשתמש במברשת בעדינות. אפשר לזיפים של מברשת לבוא במגע רק עם הקצוות של קטע הרקמה כדי להקטין את הסיכון של זיהום ופיצול סעיף. שיטוח המקטע בשקופית ככל האפשר, פעולה זו תמנע את קרלינג המקטע במהלך התחממות האצבעות. רביעית, בעת הרכבה על שקופית ITO, ודא שהמקטע כולו מחובר היטב לשקופית ITO מכיוון שאזורים שונים של הרקמה עשויים לדרוש זמן שונה של התחממות האצבעות. לדוגמה, רקמת גידול במוח דורשת זמן התחממות ארוך יותר מרקמת מוח רגילה. הרכבה לקויה עלולה להוביל לניתוק ופיצול של הרקמה במהלך סריקת MALDI-MS. זכור כי התחממות האצבעות עשויה לאפשר פעולת אנזימים ומטבוליזם הגורמים לשינויים חפצים של מטבוליטים. חמישית, תצהיר עדין ואחיד של מטריצת MALDI ממלא תפקיד חשוב בהשגת מידע מרחבי מדויק ואות MALDI-MS חזק. מומלץ לבדוק את ריסוס המטריצה על שקופית ריקה, ולבחון את דפוס הקריסטל מתחת למיקרוסקופ כדי לאמת כיסוי מתאים, לפני שתמשיך לציפוי של שקופית דגימה יקרה. ולבסוף, מאז חוקר בודד מבצע את קצירת הרקמות והכנת שקופיות במהירויות שונות, זה יהיה אידיאלי יש אדם אחד להתמודד עם הכנת המדגם עבור הדגימה באותה קבוצה, כדי למזער את השונות.
הפרוטוקול שסופק לעיל מפרט נהלים סטנדרטיים, אשר ניתן להתאים לצרכים של ניסויים מסוימים. לדוגמה, ג'ל חתך הקפאה OCT, המשמש בדרך כלל בחתך קריו של המדגם, יכול לשמש עוד יותר כמו דבק הרכבה לצ'אק הרקמה (כמו במחקר שתואר לעיל). מחקרים קודמים הראו כי רכיב הפולימר ב OCT גורם לדיכוי יונים חזק14. עם זאת, הטמעת המדגם עשויה להיות בלתי נמנעת במקרים שבהם הרקמה שברירית מכדי להיחתך ללא תמיכה נוספת מג'ל פולימר. על מנת להילחם בדיכוי אותות במקרים אלה, ייתכן שיהיה צורך לשטוף את הרקמות בשטיפה סדרתית ב -70% אתנול ו -95% אתנול כדי להסיר את שאריות OCT לגילוי חלבונים או שומנים, בעוד הכביסה אינה מומלצת לגילוי מטבוליטים מולקולריים קטנים9.
MALDI MSI הפך רלוונטי יותר ויותר הן במעבדת המחקר והן בסביבת הפרקטיקה הקלינית. לדוגמה, MALDI MSI הוכיח לאחרונה שימושי במחקרים של פרוטאומיקס על מנת לאפיין את המצב התפקודי הפנוטיפי של אורגניזם15, ובפעולה כסוכן לזיהוי מיקרוביאלי ואבחון של מחלה עוקבת16. בעוד MALDI MSI תומך במגוון רחב של יישומים, ישנן כמה מגבלות הקשורות להסתמכות אך ורק על טכניקה זו, במיוחד כשמדובר להבדיל בין מינים דומים או מטבוליטים, וזיהוי של מטרות ספציפיות. אתגר נוסף הוא כימות ריכוז המטבוליטים על פי אותות MSI MALDI. לעתים קרובות מניחים כי שפע יונים בספקטרום MSI MALDI ואת ההתפלגות המרחבית (או שפע יחסי) של מינים מולקולריים תואמים על פני רקמות ניתחו הם מתואמים היטב. עם זאת, יש לזכור תמיד כי הקשר בין עוצמת היונים לבין כמות המינים המולקולריים המתאימים מסובך על ידי גורמים רבים כולל, אך לא רק, השפעות של דיכוי יונים, שינויים במבנה הרקמה ותגובות מולקולת יונים17. טכניקות שעושות שימוש בתקנים פנימיים ניתן ליישם לכימות מוחלט (רקמת μmol /g) ב MALDI-MSI18. שני אתגרים אלה מטופלים בדרך כלל עם זרימת העבודה המשולבת של MALDI MSI עם טכניקות MS(LC-MS/MS) נוזליות, לפיהן MALDI-MS מאפשרת מיפוי של אזור העניין, אשר מאוחר יותר נתון מיקרו-ניסיון ו- LC-MS / MS כדי לספק מידע נוסף לזיהוי המטבוליט19.
שיטות הדמיה מבוססות טרה-אס פותחו בשנים האחרונות כמודל חלופי לטכניקות קודמות להדמיית מטבוליטים של מולקולות קטנות. עם ההתקדמות והפופולריות הגוברת של MALDI MSI, צפוי כי הדמיית MALDI תהפוך לכלי סטנדרטי חדש להדמיה של מולקולות קטנות. הדמיה של מולקולות קטנות שומנים אנדוגני (למשל נוירוטרנסמיטורים ומטבוליטים) בהקשר הביולוגי, כמו גם הדמיה של קסנוביוטיקס לפיתוח סוכני תרופות חדשים הם עניין מיוחד. שלושה אזורים אלה צפויים להיות התקדמות מהירה עם יישום של MALDI MSI בעתיד הקרוב20.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
יה הוא ורינת אבזלימוב נתמכים על ידי תוכנית פרס המחקר של אוניברסיטת ניו יורק (PSC-CUNY). יוקי צ'ן וקלי וראסאמי נתמכים על ידי תוכנית המחקר לתואר ראשון של קרן אלפרד פ. סלואן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| Autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC219095000 | |
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC) | Millipore Sigma Aldrich | 222488 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Watkins, S. M., German, J. B. Metabolomics and biochemical profiling in drug discovery and development. Current Opinion in Molecular Therapeutics. 4, 224-228 (2002).
- Fernie, A. R., Trethewey, R. N., Krotzky, A. J., Willmitzer, L. Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 763-769 (2004).
- Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J., Wilson, I. D. Liquid chromatography-mass spectrometry based global metabolite profiling: a review. Analytica Chimica Acta. 711, 7-16 (2012).
- Dienel, G. A. Metabolomic and Imaging Mass Spectrometric Assays of Labile Brain Metabolites: Critical Importance of Brain Harvest Procedures. Neurochemistry Research. 45, 2586-2606 (2020).
- Dienel, G. A. Metabolomic Assays of Postmortem Brain Extracts: Pitfalls in Extrapolation of Concentrations of Glucose and Amino Acids to Metabolic Dysregulation In Vivo in Neurological Diseases. Neurochemistry Research. 44, 2239-2260 (2019).
- Wasek, B., Arning, E., Bottiglieri, T. The use of microwave irradiation for quantitative analysis of neurotransmitters in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 307, 188-193 (2018).
- Andres, D. A., et al. Improved workflow for mass spectrometry-based metabolomics analysis of the heart. Journal of Biological Chemistry. 295, 2676-2686 (2020).
- Lu, W., et al. Metabolite Measurement: Pitfalls to Avoid and Practices to Follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113, 2309-2342 (2013).
- Miura, D., et al. Ultrahighly sensitive in situ metabolomic imaging for visualizing spatiotemporal metabolic behaviors. Analytical Chemistry. 82, 9789-9796 (2010).
- Han, J., et al. Towards high-throughput metabolomics using ultrahigh-field Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Metabolomics. 4, 128-140 (2008).
- Wang, J., et al. MALDI-TOF MS imaging of metabolites with a N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride matrix and its application to colorectal cancer liver metastasis. Analytical Chemistry. 87, 422-430 (2015).
- Sladkova, K., Houska, J., Havel, J. Laser desorption ionization of red phosphorus clusters and their use for mass calibration in time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19, 3114-3118 (2019).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38, 699-708 (2003).
- Greco, V., et al. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics. Expert Review of Proteomics. 15, 683-696 (2018).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in Microbiology. 6, 791 (2015).
- Hankin, J. A., Murphy, R. C. Relationship between MALDI IMS intensity and measured quantity of selected phospholipids in rat brain sections. Analytical Chemistry. 82 (20), 8476-8484 (2010).
- Prentice, B. M., Chumbley, C. W., Caprioli, R. M. Absolute Quantification of Rifampicin by MALDI Imaging Mass Spectrometry Using Multiple TOF/TOF Events in a Single Laser Shot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (1), 136-144 (2017).
- Quanico, J., Franck, J., Wisztorski, M., Salzet, M., Fournier, I. Combined MALDI Mass Spectrometry Imaging and Parafilm-Assisted Microdissection-Based LC-MS/MS Workflows in the Study of the Brain. Methods in Molecular Biology. 1598, 269-283 (2017).
- Trim, P. J., Snel, M. F. Small molecule MALDI MS imaging: Current technologies and future challenges. Methods. 104, 127-141 (2016).
