Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Prøvepreparering for metabolsk profilering ved bruk av MALDI-massespektrometriavbildning

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/62008
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1, 1, 1, 1,2, 3, 1, 1, 4,5, 1,5
1The Graduate Center - Advanced Science Research Center, Neuroscience Initiative, The City University of New York, 2The City College of New York, CUNY, 3The Bronx High School of Science, 4The Graduate Center - Advanced Science Research Center, Structural Biology Initiative, The City University of New York, 5The Graduate Center - Advanced Science Research Center, MALDI MS Imaging Joint Core Facility, The City University of New York
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne protokollen er å gi detaljert veiledning om prøveprepareringen ved planlegging av eksperimenter ved hjelp av MALDI MSI for å maksimere metabolsk og molekylær deteksjon i biologiske prøver.

Abstract

Metabolomics, studien for å identifisere og kvantifisere små molekyler og metabolitter tilstede i en eksperimentell prøve, har dukket opp som et viktig verktøy for å undersøke de biologiske aktivitetene under utvikling og sykdommer. Metabolomics tilnærminger er mye brukt i studiet av kreft, ernæring / kosthold, diabetes, og andre fysiologiske og patologiske forhold som involverer metabolske prosesser. Et fordelaktig verktøy som hjelper til med metabolomisk profilering som er fremmet i dette dokumentet, er matriseassistert laseravledning / ionisering massespektrometriavbildning (MALDI MSI). Dens evne til å oppdage metabolitter in situ uten merking, strukturelle modifikasjoner eller andre spesialiserte reagenser, for eksempel de som brukes i immunostaining, gjør MALDI MSI til et unikt verktøy for å fremme metoder som er relevante innen metabolomics. En passende prøveforberedelsesprosess er avgjørende for å gi optimale resultater og vil være fokus for dette papiret.

Introduction

Metabolitter, mellomprodukter eller sluttprodukter av metabolisme, inkludert nukleotider, aminosyrer eller organiske syrer, lipider, er viktige komponenter til biologiske funksjoner og prosesser. Metabolomics, studiet av metabolitter, muliggjør utforskning av deres biokjemiske interaksjoner og forståelsen av deres roller i sammenheng med grunnleggende, translasjonell og klinisk forskning. Metabolitter er sterkt forbundet med fenotyper av organismer og gir informasjon om biokjemiske aktiviteter som oppstår under cellulær metabolisme1. Derfor, i tillegg til genomikk og proteomikk, metabolomics har dukket opp som et viktig verktøy for å forstå både fysiologiske og patologiske forhold. For eksempel brukes metabolomics til å belyse mekanismene bak eksisterende stoffer så vel som deres toleranse. I narkotikautvikling er xenobiotisk metabolisme nyttig for å vurdere aktiviteten eller toksisiteten til metabolitter på tvers av arter, som senere oversettes til å støtte personlig medisin2. Til tross for den brede anvendelsen av metabolomics, kan avbildning av metabolitter være utfordrende på grunn av metabolitters kjemiske reaktivitet, strukturell heterogenitet og bredt konsentrasjonsområde3. Imidlertid kan konsentrasjonene av labile metabolitter, inkludert høyenergiforbindelser, glukose, laktat, glykolytisk, pentose shuntbane og TCA-syklus mellomprodukter, fosfolipider, nevrotransmittere, signalforbindelser, endres i løpet av sekunder og fremgang over minutter når vevsenzymer er aktive under vevshøstingsprosedyrer, for eksempel postmortem ischemia i hjernehøsting4,5,6 , . For å sikre nøyaktig datainnsamling av metabolomics er passende og nøye prøvepreparering kritisk7,8. Nåværende etablerte plattformer for måling av metabolitter inkluderer NMR, enzymanalyser og massespektrometri (inkludert væske- og gasskromatografi), hvorav den siste er diskutert lenger nedenfor.

MALDI-MSI er en toppmoderne teknikk som muliggjør analyse av komplekse prøver gjennom påvisning av individuelle molekylære arter. MALDI MSI gir fordelen av å kunne raskt og reprodusere ulike molekylære forbindelser i biologiske prøver. Massespektrometriavbildning muliggjør videre produksjon av bilder som representerer vevsbiologi basert på komposittmetabolitter, og gjør det samtidig som den romlige fordelingen av metabolittene iprøven 9. MALDs evne til å oppdage analytter i en prøve uten bruk av antistoffmerking, strukturelle modifikasjoner eller andre spesialiserte reagenser, for eksempel de som brukes i immunostaining, kombinert med sin evne til å overvåke hundrevis av molekyler i et enkelt eksperiment, utgjør bare noen få av fordelene MS-bildestipender når det gjelder metabolsk profilering10, 11. I tillegg til ofte brukte matriser som 2,5-dihydroksybenzosyre (DHB) og 9-aminoacridine (9-AA), nylig oppdaget ny matrise N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC), som er godt egnet for analyser av ulike lavmolekylære metabolitter, har ytterligere forbedret anvendelsen av MALDI MSI i metabolsk profilering1 .

Til tross for den brede anvendelsen av MALDI MSI, forhindrer den høye prisen på instrumentet og kompleksiteten i den eksperimentelle prosedyren dens bredere implementering i individuelle forskningslaboratorier. Derfor støttes de fleste av MALDI MSI-studiene gjennom felles kjernefasiliteter. Prøveprepareringen, inkludert lysbildeforberedelse og matrisebelegg, er det mest kritiske trinnet i MALDI MSI. Imidlertid utføres lysbildeforberedelsene normalt i den enkelte forskers laboratorium, noe som skaper potensielle variasjoner i senere MALDI MSI-oppkjøp. Her tar vi sikte på å gi en detaljert protokoll for prøvepreparering av biologiske prøver før vi går videre til MALDI MSI-målinger, og bruker en metabolomisk profilering av utviklingsmushjerne som eksempel.

Protocol

Protokollen følger retningslinjene til City University of New York (CUNY) Advanced Science Research Center (ASRC)s institusjonelle dyrepleie- og brukskomité (IACUC).

1. Høst vevet

  1. Forbered aluminiumsbåten. Forbered et rektangel aluminium 10cm x 20 cm, brett i midten for å lage 10 cm dobbeltlags firkant. Merk prøveinformasjonen på den ene siden, og brett den andre siden for å danne en båt med bunnoverflate ca. 4 cm x 4 cm.
  2. Forkjøl båten på det flytende nitrogenet (LN2) i en Styrofoam-boks.
    MERK: Hvis båten er for liten, kan prøven falle ut av båten og bli overfrossen ved å kontakte LN2direkte , noe som kan føre til fragmentering under kryooseksjon.
  3. Euthanize dyret ved cervical dislokasjon etter institusjonelle IACUC retningslinjer, umiddelbart dissekere ut vev av interesse.
    1. Hold intervallet mellom animalsk anestesi og snap frysing så kort som mulig, for å minimere endringen av metabolitter under vevshøsting, spesielt de labiale metabolittene i hjernen på grunn av postmortem iskemi.
      MERK: Perfusjon av dyret med fosfatbufret saltvann (PBS) vil øke varigheten av iskemi, ytterligere endre konsentrasjonene av labile metabolitter og overdrive de artefaktuelle resultatene. Derfor anbefales ikke perfusjon eller vasking av vevet med PBS, med mindre forurensning av blod eller kroppsvæske er mer bekymret enn metabolitter forverring eller utvasking for individuelt prosjekt.
  4. Plasser straks vevet i aluminiumsbåten som flyter på flytende nitrogen, lukk lokket på Styrofoam-boksen og frys i 2-10 min avhengig av størrelsen på vevet: henholdsvis 2 min, 5 min, 7 min for postnatal dag 1 (P1), P21, P60 musehjerne og 10 min for P60 rottehjerne.
    MERK: Ikke frys vevet over lengre tid (f.eks. 5 min for P1-musehjernen), da de overfryste kan føre til vevsfragmentering under kryooseksjon.
  5. Fjern båten med tang, brett folien for å pakke vevet, transportere på tørris og lagre ved -80 °C for senere bruk. Hvis etterfulgt av umiddelbar seksjonering, bær prøvene på tørris til kryostaten.
    MERK: For bedre å bevare metabolittene, er det foretrukket å lagre prøven i intakt vev og seksjonere den rett før du går videre til Maldivens avbildning. Vevet kan lagres i -80 °C i opptil 24 måneder.

2. Kryoseksjon vevet

MERK: Bruk hansker til enhver tid når du håndterer INDium tinoxide (ITO)-skliene. Unngå direkte innånding på lysbildet eller bruk masker (valgfritt) for å forhindre kontaminering av menneskelig spytt på vevsdelen.

  1. Før du seksjonerer vevet, samle ønsket antall MALDI-kompatible ITO-belagte glasssklier.
  2. Test ledningsevnen til lysbildet ved hjelp av et voltmeter satt til motstand. Merk siden der en motstandsmåling leses: Dette vil være siden som vevsdelene holder seg til. Plasser alltid lysbildet på et rent papirhåndkle for å unngå forurensning.
  3. Forkjøl lysbildene i en kryostat satt til -20 °C.
  4. Hvis vevsprøver ble fjernet fra -80 °C, la vevet likevekte i kryostatkammeret i ca. 45-60 min avhengig av vevets størrelse. Hvis prøver fjernes fra tørris, likevekt det i ca 30 min.
  5. Rengjør kryostaten grundig med 70% etanol. Forkjøl alle nødvendige verktøy, inkludert tynnspisset kunstnerbørste og tang i kryostatkammeret.
  6. Still inn temperaturen på kryostatkammeret og prøvehodet i henhold til vevstypen: -14 °C for lever, -20 °C for muskel og -25 °C for hud9.
  7. Monter vevet på chucken ved hjelp av kryovevsinnbyggingsforbindelsen OCT, og unngå OKT fra interesseområdet.
  8. Plasser et rent blad i scenen og lås. Juster posisjonen til scenen og vinkelen på prøven for å oppnå ønsket skjærevinkel.
    MERK: Hvis forskjellige typer/genotyper av vev skal kuttes, må du enten omplassere prøven slik at en ren del av bladet brukes , eller bytte til et nytt blad før du kutter neste prøve for å forhindre krysskontaminering.
  9. Fortsett å kutte til interesseområdet (f.eks. corpus callosum i hjernen) er funnet. Sørg for å holde scenen ren ved å pusse av ekstra stykker med en kunstnerbørste som har blitt likevektet i kryostaten.
  10. Når ønsket region er avslørt, kutt mindre seksjoner på 10-12 μm tykkelse. Hvis delen har en tendens til å flake eller falle lett fra hverandre, øk temperaturen på kryostaten, og hold deg i -22 ° C til -11 ° C-området. Vi har funnet ut at den optimale skjæretemperaturen for hjernevev er -15 °C til - 18 °C.
  11. Når en god seksjon er kuttet, fester du den til ITO-lysbildet (bruk i kryostatkammeret).
  12. Overfør en del av vevet til ITO-lysbilder ved hjelp av spissen av kunstnerbørsten.
  13. Varm opp delen ved å plassere en finger under lysbildet for å varme opp delen for å sikre sikker montering. Vevsseksjonen vil først bli gjennomsiktig i 5-10 s og deretter slå ugjennomsiktig i ca 30-60 s.
  14. Sett forsiktig gliden til side i kryostaten.
  15. Gjenta trinn for andre vevsprøver, og sørg for at hver del av vevet er plassert jevnt på lysbildet og er så justert som mulig.
  16. Siden MALDI-målet kan inneholde opptil to lysbilder, plasserer du inndelingene fra flere prøver av samme kohort på ett enkelt lysbilde eller på to lysbilder for å sikre at de kan analyseres samtidig.
  17. Når du er ferdig, plasserer du ITO-lysbilder i en vakuumboks og overføres til en tørkemiddel med tørkemiddel. Støvsug skredet i 45-60 min.
    MERK: Hvis en vakuumdesiccator ikke er tilgjengelig i laboratoriet, må du holde lysbildene under -20 °C hele tiden for å unngå metabolitter.
  18. Lysbildelagring og frakt: Med mindre prøven er utarbeidet av Maldivens bildebehandlingskjernefasiliteter for å gå direkte til Maldivens bildebehandling, lagrer du lysbildene ved -80 °C eller sendes til kjerneanlegg eller andre MALDI-forskningslaboratorier på tørris.
  19. For best å bevare prøvene, plasser lysbildene i lysbildetransportøren, fyll den med nitrogen (valgfritt), forsegle med parafilm, plasser i en zip-pose, som deretter plasseres i en annen glidelåspose som inneholder tørkemiddel. Merk den ytre glidelåsposen.
  20. Fortsett til oppbevaring ved -80 °C (opptil 6 måneder) eller frakt med tilstrekkelig tørris.

3. Matrise forberedelse

  1. Forbered matrisen.
    MERK: Alle reagensene må være AV HPLC-grad.
    1. Forbered NEDC i en konsentrasjon på 10 mg/ml. Forbered 10 ml matrise oppløst i et løsningsmiddel på 70% metanol (100 mg NEDC, 7 ml metanol, 3 ml H2O).
    2. I tillegg forberede en ekstra 10 ml 70% metanol: vannløsning for å skylle sprøytesystemet før du fyller matrisen.
  2. Når lysbildene er dehydrert i trinn 2.17, plasserer du "X"-merker på det tomme rommet på glassskuffen utenfor vevsdelene ved hjelp av en sølvmarkør med fet punkt, og deretter plasserer du en ekstra "x" med en finpunkts svart markør på toppen av sølvet "X". Den svarte "X" med en skarp kontrast ut av sølvbakgrunnen (den dristige sølv "X") vil senere tjene som fiduciary markør for senere massespektra oppkjøp i MALDI instrument.
  3. Legg skredet inn i maldivets skredmetallmål. Bruk plastdeksel og tegn/omriss der prøvene er på plastdekselet. Sette.
  4. Skann bildet av lysbildet sammen med MALDI-målet ved hjelp av planskanner. Skruene på overflaten av målet vil fungere som avstandsstykke for å forhindre skade eller forurensning av vevsdelen av skanneren. Forhåndsvis og skann det merkede lysbildeområdet i 16-biters gråtoner og 2400 ppt. Lagre avbildningen for senere bruk i MALDI MSI.

4. Matrix avsetning

MERK: Det er flere metoder for å bruke et jevnt lag matrise i fin krystallstørrelse på MALDI-lysbildet, inkludert sublimering, dråpeblekkskriverutskrift, automatisk matrisesprøyte og manuell spray ved hjelp av artist airbush9. Vi vil bruke automatisk matrisesprøyter som et eksempel i denne protokollen for sin høye reproduserbarhet.

  1. Oppstart: Slå på matrisesprøyteenheten, sørg for at ventilen er plassert ved LOAD og start sprøyteprogramvaren. Kontroller at eksosviften fungerer som den skal. Ikke start løsningsmiddelpumpen hvis den aktive ventilasjonen ikke fungerer som den skal.
  2. Bekreft på Comms-fanen at alt kommuniserer, og start deretter løsningsmiddelpumpen på .1 ml/ min, med et tilbaketrykk på ~ 500 psi (eller 3,4 MPa).
  3. Start trykkluftstrømmen til matrisesprøyten ved å sette nitrogentanken til 30 psi. Juster deretter trykkregulatoren på forsiden av sprøyten til 10 psi, og sett sprøytedysetemperaturen etter ønske.
    MERK: Hvis lufttrykket i bønnen er lavere enn 5 psi, vil sprøytedysen ikke kunne varmes opp for beskyttelse.
  4. Med ventilen fortsatt i LOAD-posisjon, bruk en sprøyte til å skylle løkken med 7 ml 70% metanol, og fyll deretter løkken med 6 ml matrise.
  5. Plasser vevet glir inn i holderne i sprøyten, tappe ned begge ender for å forhindre bevegelse, og for å bevare en matrisefri kant for å unngå forurensning av metallklemmen på MALDI-målet av matrisen.
    MERK: Det anbefales på det sterkeste å teste matrisespray på et tomt mikroskopsklie før du går videre til dyrebare prøvelysbilder.
  6. Kontroller at strømningshastigheten og temperaturen er stabile for å begynne å sprøyte.
  7. Velg ønsket metode forhåndstestet ved hjelp av blank glasssklie.
  8. Trykk Start. Dette vil stille inn dysetemperaturen og justere pumpestrømningshastigheten slik at den samsvarer med den valgte metoden. Bytt ventilen fra belastning til sprøyteposisjon, og bekreft deretter ved å klikke Fortsett.
  9. La systemet kjøre, noe som vil ta 5-20 minutter per lysbilde, avhengig av metoden. Bytt ventilen fra spray til lasteposisjon, og bekreft deretter ved å klikke fortsett når du er ferdig.
  10. Fjern lysbildet(e) fra sprøyten, undersøk mønsteret av matrisebelegg under mikroskopet for å sikre et jevnt lag med finmatrisekrystall.
  11. Etter matriseavsetning plasserer du lysbildene i MALDI-metallholderen for umiddelbar bruk. Hvis det bare er ett prøvelysbilde, legger du til et nytt tomt lysbilde for å fylle de to områdene på MALDI-holderen.
  12. Rydd opp i systemet umiddelbart etter bruk etter produsentens anvisning, for å forhindre tilstopping av sprøytedyse.
  13. Etter at prøvesklie er belagt med matrise, kan du enten gå umiddelbart til Maldivens bildeinstrument, eller sende det med tørris ved hjelp av samme doble zipbag-forberedelse som er beskrevet i trinn 2.19.
    MERK: Under nødstilfeller som MALDI-instrumentet er ikke tilgjengelig for umiddelbar bruk, oppbevar den belagte sklien i vakuumtilstand eller ved -20 °C i opptil 24 timer, selv om forverringen av noen metabolitter kan skje under lagringen, som ikke er grundig studert.

Representative Results

Det representative eksperimentet ble utført i henhold til arbeidsflyten som vises i figur 1. Den utviklingsmessige C57BL wildtype musehjerner av postnatal dag 1, 21, 60 (voksen) ble høstet som beskrevet ovenfor etter CUNY IACUC retningslinjer og ble snap frosset i henholdsvis 2, 5 og 7 min, på en aluminiumsbåt som flyter på flytende nitrogen. Det frosne vevet ble gråtoseksjonert ved 10 μm tykkelsesseksjoner ved −15 °C satt for både prøvehode og kammer. Vevsroposeksjonene ble deretter forsiktig overført til den forhåndskjølte ledende siden av ITO-belagte glasssklier for MALDSidiv avbildning. Monterte kryoser på ITO-lysbilder ble tørket i vakuum i 45 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av matriseavsetning ved hjelp av automatisk matrisesprøyte. Matrix NEDC ble brukt til å oppdage metabolitter, og en matriseløsning på 10 mg/ml i metanol/vann (70/30, v/v) ble avsatt med en strømningshastighet på 0,1 ml/min og en dysetemperatur på 75 °C i 12 sykluser med 5 s tørking mellom hver syklus. Det ble brukt en sprayhastighet på 1300 mm/min, sporavstand på 2 mm, N2 gasstrykk på 10 psi og strømningshastighet på 3 L/min og dysehøyde på 40 mm.

MALDI massespektra ble anskaffet i negativ ionmodus av MALDI-flytidsinstrument (TOF). 0,5-1 μL rødt fosfor (Pn-klynger med n = 1 - 90) emulsjon i metanol ble avsatt på ITO-lysbildene, ved siden av det monterte vevet, og brukes til å kalibrere instrumentet i 100 - 1000 m / z masseområdet ved å bruke kvadratisk kalibreringskurve13. Laserpunktdiametrene var fokusert på "Medium" modulert stråleprofil for 50 μm rasterbredde. Spectra innenfor masseområdet fra m / z 50 til 1000 ble kjøpt på en 1000 Hz for 500 skudd. Massespektradata ble registrert, og avbildningen ble videre analysert ved hjelp av avansert MALDI MSI-dataanalyseprogramvare. Ion-bilder ble generert med normalisering av rotgjennomsnittet kvadratisk (RMS) med en intervallbredde på ±0,25 Da.

Resultatene i figur 2 viser utdatabilder fra MALDI MSI-dataanalyseprogramvare for m/z-spektra valgt fra hvert 100 Dalton-intervall, som tydelig viser verktøyet for identifisering av spektra fra små molekylmetabolitter til lipider med høy molekylvekt. Hver rad viser respektive ionvarmekart som inneholder både romlig og spektral informasjon om en bestemt metabolittart over tre vev samlet på postnatal dag 1, 21 og 60. For hver representant m/z kan analyse av regional fordeling og ionoverflod brukes til å sammenligne relative mengder tilsvarende arter mellom ulike aldre. En styrke av MALDI MSI-metodikken er evnen til å skjelne spesifisiteten til visse arter identifisert av m / z til utviklingsmilepæler eller spesifikke anatomiske strukturer. Noen metabolitter er observert å være beriket i P1 neonater (m/z 320,1), beriket hos P60 voksne (m/z 846,5), eller jevnt fordelt over aldre (m/z 480,3); andre molekylære arter er spesielt beriket i grå materie (m/z 117,1; 524,3; 765,1), hvit materie (m/z 673,4; 846,5) eller CSF/ventrikler (m/z 239,0) (Figur 2A). Den romlige fordelingen av representative metabolitter inkludert hypoksantin (m/z 135,0), N-Acetyl-L-asparaginsyre (m/z 174,0), arakidonsyre (m/z 303,2) og flere lipider som lysofosfatidyletanolamin LPE (18:1) (m/z 478,3), LPE(18:1) (m/z 478,3), LPE(18:1) 20:4) (m/z 500,3), LPE (22:6) (m/z 524,3), fosfatidylethanolamin PE (44:6)10) (m/z 838,5), Fosfatidylinositol PI(38:4) (m/z 885,6) vises også (Figur 2B).

Figure 1
Figur 1. Arbeidsflyt av MALDIV- flytid (TOF) massespektrometriavbildning. Det snap frosne vevet er kryoroseksjonert i kryostat og montert på ITO-lysbilde. → Lysbildet med vevsseksjoner er belagt med et fint lag matrise ved hjelp av automatisk matrisesprøyte. → Mass spectra samles inn av MALDI-TOF MSI instrument på en raster på 20-200um. → Dataene analyseres, og bildene genereres ved hjelp av avansert MALDI MSI-dataanalyseprogramvare. Skalastang: 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Representativ utgang med valgt m/z spektra fra massespektrometri ervervet ved 50 μm lateral oppløsning. (A) Et varmekart viser romlig fordeling av spesifikke metabolittarter valgt fra hvert 100 Dalton m/z-intervall på tvers av de tre utviklingsmilepælene identifisert ved P1, P21 og P60. (B) Den romlige fordelingen av representative metabolitter ved P1, P21 og P60, inkludert: hypoksantin, N-Acetyl-L-aspartiginsyre, arakidonsyre og forskjellige lipidarter som lysofosfatidyletanolamin (LPE), fosfafatidyletanolamin (PE), Fosfatidylinositol (PI). Skalalinje, 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

MALDI-Imaging (MALDI-MSI) er en etikettfri bildeteknikk som gjør det mulig for forskere å undersøke fordelingen av ulike biomolekyler og deres modifikasjoner i vev, det molekylære grunnlaget for patologi. Kombinert bruk av MALDI-MSI med tradisjonelle LC-MS-tilnærminger for vevsanalyse gir samme molekylære dybde som tradisjonelle Omics-arbeidsflyter, men som også beholder det romlige forholdet mellom disse signalene i mobilnettverket. Prøveprepareringen er det mest kritiske trinnet i MALDI MSI og står for variasjonen i de endelige opplesningene av metabolomikkstudier utført i forskjellige laboratorier4. Her tilbyr vi en omfattende, men praktisk protokoll for å standardisere prøveforberedelsene for metabolomisk profilering ved hjelp av MALDI MSI, i håp om at det gagner et bredt forskningsmiljø å implementere MALDI MSI i sin nåværende og fremtidige forskning fra grunnleggende biologi til translasjonsstudier.

Man må alltid huske på alle forholdsregler for å minimere endringer i molekylære profiler (både overflod og romlig distribusjon) under prøvepreparater og unngå forurensning. For det første, minimere tiden mellom animalsk eutanasi og vevshøsting, for eksempel frossen in situ eller oppvarmet ved mikrobølgefiksering for å inaktivere enzymer i hjernen for å redusere ansvaret for postmortem iskemi4,5,6. For det andre er snap-frysetilstanden til prøven kritisk. Utilstrekkelig frysing vil føre til nedbrytning og tap av metabolittene, mens over frysing vil føre til vevsfragmentering under kryooseksjon. Frysetiden bør alltid testes først i henhold til tidligere rapporterte studier, og studien av utviklingsmushjerne presentert i dette dokumentet gir referansepunktene for gnagerhjernevev. For det tredje vil kutting av biologisk vev og overføring av seksjonene til ITO-lysbildene kreve tilstrekkelig praksis. Det er viktig å merke seg at når du bruker børsten til å hente delen fra scenen, bør børsten brukes delikat. La børstehårene bare komme i kontakt med kantene på vevsdelen for å redusere risikoen for forurensning og seksjonsfragmentering. Flat delen på lysbildet så mye som mulig, dette vil forhindre krølling av delen under fingeroppvarming. For det fjerde, mens du monterer på ITO-lysbildet, må du sørge for at hele delen er godt festet til ITO-lysbildet, da forskjellige områder av vevet kan kreve forskjellig tid for fingeroppvarming. For eksempel krever hjernesvulstvev lengre oppvarmingstid enn normalt hjernevev. En dårlig montering kan føre til løsrivelse og fragmentering av vevet under MALDI-MS-skanning. Husk at fingeroppvarming kan muliggjøre enzymvirkning og metabolisme som forårsaker artefaktuelle endringer av metabolitter. For det femte spiller en fin og ensartet avsetning av MALDI-matrise en viktig rolle i å oppnå nøyaktig romlig informasjon og sterkt MALDI-MS-signal. Det anbefales å teste matrisesprøytingen på et tomt lysbilde, og observere krystallmønsteret under et mikroskop for å verifisere riktig dekning, før du fortsetter til belegget av dyrebar prøvesklie. Og til slutt, siden en individuell forsker utfører vevshøsting og glideforberedelse i forskjellige hastigheter, ville det være ideelt å ha en person til å håndtere prøvepreparatet for prøven i samme kohort, for å minimere variasjonen.

Protokollen ovenfor beskriver standardprosedyrer, som kan skreddersys mot behovene til bestemte eksperimenter. For eksempel kan en kryo-seksjoneringsgel OCT, som vanligvis brukes i kryo-seksjonering av prøven, videre brukes som monteringslim til vevschucken (som i studien beskrevet ovenfor). Tidligere studier har vist at polymerkomponenten i OCT forårsaker sterk ionundertrykkelse14. Imidlertid kan innebygging av prøven være uunngåelig i tilfeller der vevet er for skjøre til å bli kuttet uten ekstra støtte fra en polymergel. For å bekjempe signalundertrykking i disse tilfellene, kan vevet måtte vaskes med seriell vask i 70% etanol og 95% etanol for å fjerne gjenværende OCT for påvisning av proteiner eller lipider, mens vaskingen ikke anbefales for påvisning av små molekylære metabolitter9.

MALDI MSI har blitt stadig mer relevant i både forskningslaboratoriet og klinisk praksis. For eksempel har MALDI MSI nylig vist seg nyttig i studier av proteomikk for å karakterisere fenotypisk funksjonell status for en organisme15, og i å fungere som et middel for mikrobiell identifikasjon og diagnose av etterfølgende sykdom16. Mens MALDI MSI støtter et bredt spekter av applikasjoner, er det noen begrensninger forbundet med å stole utelukkende på denne teknikken, spesielt når det gjelder å skille mellom lignende arter eller metabolitter, og identifisering av spesifikke mål. En annen utfordring er kvantifiseringen av metabolittenes konsentrasjon i henhold til MALDI MSI-signaler. Det antas ofte at ionoverflod i MALDI MSI-spektra og romlig fordeling (eller relative overflod) av tilsvarende molekylære arter på tvers av dissekert vev er godt korrelert. Imidlertid bør man alltid huske på at forholdet mellom ionintensitet og mengden av tilsvarende molekylære arter er komplisert av mange faktorer, inkludert, men ikke begrenset til, effekter av ionundertrykking, endringer i vevsstruktur og ionmolekylreaksjoner17. Teknikker som benytter seg av interne standarder kan implementeres for absolutt kvantifisering (μmol/g vev) i Maldiv-MSI18. Disse to utfordringene løses vanligvis med den kombinerte arbeidsflyten til MALDI MSI med flytende kromatografi tandem MS(LC-MS/MS)-teknikker, der MALDI-MS tillater kartlegging av interesseområdet, som senere blir utsatt for mikroekstraksjon og LC-MS/MS for å gi mer informasjon for å identifisere metabolitten19.

MS-baserte avbildningsmetoder har blitt utviklet de siste årene som en alternativ modalitet til tidligere teknikker for avbildning av små molekylmetabolitter. Med fremskrittene og den økende populariteten til MALDI MSI, forventes det at Maldives avbildning vil bli et nytt standardverktøy for visualisering av små molekyler. Avbildning av lipid og endogene små molekyler (f.eks. nevrotransmittere og metabolitter) i den biologiske konteksten, samt avbildning av xenobiotika for utvikling av nye farmasøytiske midler er av spesiell interesse. Disse tre områdene forventes å ha raske fremskritt med anvendelse av MALDI MSI i nær fremtid20.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Ye He og Rinat Abzalimov støttes av Professional Staff Congress-City University of New York (PSC-CUNY) Research Award Program. Yuki Chen og Kelly Veerasammy støttes av Alfred P. Sloan Foundation CUNY Summer Undergraduate Research Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Fisher Scientific  14-373-65
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE Fisher Scientific  50-111-2302
Autoflex speed MALDI-TOF MS system Bruker Daltonics Inc MALDI-TOF MS instrument
BD Syringe with Luer-Lok Tips Fisher Scientific  14-823-16E
BD Vacutainer General Use Syringe Needles Fisher Scientific  23-021-020
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG Fisher Scientific  NC0380464
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics  Fisher Scientific AC219095000
Epson Perfection V600 Photo Scanner Amazon Perfection V600
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer Fisher Scientific  HS15986
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter Fisher Scientific  01-241-1
FlexImaging v3.0 Bruker Daltonics Inc Bruker MS imaging analysis software
HPLC Grade Methanol Fisher Scientific  MMX04751
HPLC Grade Water Fisher Scientific  W5-1
HTX M5 Sprayer HTX Technologies, LLC Automatic heated matrix sprayer
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Fisher Scientific  06-666A
MSC Ziploc Freezer Bag Fisher Scientific  50-111-3769
N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC) Millipore Sigma Aldrich 222488
SCiLS Lab (2015b) SCiLS Lab Advanced MALDI MSI data analysis software
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat Fisher Thermo Scientific 95-713-0
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator Fisher Scientific  08-642-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watkins, S. M., German, J. B. Metabolomics and biochemical profiling in drug discovery and development. Current Opinion in Molecular Therapeutics. 4, 224-228 (2002).
  2. Fernie, A. R., Trethewey, R. N., Krotzky, A. J., Willmitzer, L. Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 763-769 (2004).
  3. Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J., Wilson, I. D. Liquid chromatography-mass spectrometry based global metabolite profiling: a review. Analytica Chimica Acta. 711, 7-16 (2012).
  4. Dienel, G. A. Metabolomic and Imaging Mass Spectrometric Assays of Labile Brain Metabolites: Critical Importance of Brain Harvest Procedures. Neurochemistry Research. 45, 2586-2606 (2020).
  5. Dienel, G. A. Metabolomic Assays of Postmortem Brain Extracts: Pitfalls in Extrapolation of Concentrations of Glucose and Amino Acids to Metabolic Dysregulation In Vivo in Neurological Diseases. Neurochemistry Research. 44, 2239-2260 (2019).
  6. Wasek, B., Arning, E., Bottiglieri, T. The use of microwave irradiation for quantitative analysis of neurotransmitters in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 307, 188-193 (2018).
  7. Andres, D. A., et al. Improved workflow for mass spectrometry-based metabolomics analysis of the heart. Journal of Biological Chemistry. 295, 2676-2686 (2020).
  8. Lu, W., et al. Metabolite Measurement: Pitfalls to Avoid and Practices to Follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  9. Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113, 2309-2342 (2013).
  10. Miura, D., et al. Ultrahighly sensitive in situ metabolomic imaging for visualizing spatiotemporal metabolic behaviors. Analytical Chemistry. 82, 9789-9796 (2010).
  11. Han, J., et al. Towards high-throughput metabolomics using ultrahigh-field Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Metabolomics. 4, 128-140 (2008).
  12. Wang, J., et al. MALDI-TOF MS imaging of metabolites with a N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride matrix and its application to colorectal cancer liver metastasis. Analytical Chemistry. 87, 422-430 (2015).
  13. Sladkova, K., Houska, J., Havel, J. Laser desorption ionization of red phosphorus clusters and their use for mass calibration in time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19, 3114-3118 (2019).
  14. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38, 699-708 (2003).
  15. Greco, V., et al. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics. Expert Review of Proteomics. 15, 683-696 (2018).
  16. Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in Microbiology. 6, 791 (2015).
  17. Hankin, J. A., Murphy, R. C. Relationship between MALDI IMS intensity and measured quantity of selected phospholipids in rat brain sections. Analytical Chemistry. 82 (20), 8476-8484 (2010).
  18. Prentice, B. M., Chumbley, C. W., Caprioli, R. M. Absolute Quantification of Rifampicin by MALDI Imaging Mass Spectrometry Using Multiple TOF/TOF Events in a Single Laser Shot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (1), 136-144 (2017).
  19. Quanico, J., Franck, J., Wisztorski, M., Salzet, M., Fournier, I. Combined MALDI Mass Spectrometry Imaging and Parafilm-Assisted Microdissection-Based LC-MS/MS Workflows in the Study of the Brain. Methods in Molecular Biology. 1598, 269-283 (2017).
  20. Trim, P. J., Snel, M. F. Small molecule MALDI MS imaging: Current technologies and future challenges. Methods. 104, 127-141 (2016).

Tags

Biologi Utgave 166 MALDI Massespektrometri Metabolomics Prøvepreparering Metabolisme hjerne metabolitt avbildningsteknikker
Prøvepreparering for metabolsk profilering ved bruk av MALDI-massespektrometriavbildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Veerasammy, K., Chen, Y. X., Sauma,… More

Veerasammy, K., Chen, Y. X., Sauma, S., Pruvost, M., Dansu, D. K., Choetso, T., Zhong, T., Marechal, D., Casaccia, P., Abzalimov, R., He, Y. Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging. J. Vis. Exp. (166), e62008, doi:10.3791/62008 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter