Summary
Bu protokolün amacı, biyolojik örneklerde metabolik ve moleküler tespiti en üst düzeye çıkarmak için MALDI MSI kullanarak deneyler planlarken numune hazırlama konusunda ayrıntılı rehberlik sağlamaktır.
Abstract
Deneysel bir örneklemde bulunan küçük molekülleri ve metabolitleri tanımlama ve ölçme çalışması olan metabolomik, gelişim ve hastalıklar sırasında biyolojik faaliyetleri araştırmak için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Metabolomics yaklaşımları kanser, beslenme/diyet, diyabet ve metabolik süreçleri içeren diğer fizyolojik ve patolojik durumların incelenmesinde yaygın olarak bunların içinde dirilmektedir. Bu makalede savunulan metabolomik profillemede yardımcı olan avantajlı bir araç matris destekli lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi görüntülemesidir (MALDI MSI). Metabolitleri etiketlemeden, yapısal değişiklikler yapmadan veya immünostainingde kullanılanlar gibi diğer özel reaktifleri yerinde tespit etme yeteneği, MALDI MSI'ı metabolomik alanda ilgili metodolojileri ilerletmede benzersiz bir araç haline getirir. Uygun bir numune hazırlama işlemi en iyi sonuçları vermek için kritik öneme sahiptir ve bu makalenin odak noktası olacaktır.
Introduction
Metabolitler, nükleotitler, amino veya organik asitler, lipitler de dahil olmak üzere metabolizmanın ara ürünleri veya son ürünleri, biyolojik fonksiyonların ve süreçlerin temel bileşenleridir. Metabolitlerin çalışması olan metabolomics, biyokimyasal etkileşimlerinin araştırılmasına ve temel, çevirisel ve klinik araştırmalar bağlamında rollerinin anlaşılmasına izin verir. Metabolitler organizmaların fenotipleri ile güçlü bir şekilde ilişkilidir ve hücresel metabolizma sırasında meydana gelen biyokimyasal aktiviteler hakkında bilgi sağlar1. Bu nedenle, genomik ve proteomiklere ek olarak, metabolomik hem fizyolojik hem de patolojik durumları anlamada önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, metabolomik, mevcut ilaçların arkasındaki mekanizmaların yanı sıra toleranslarını da aydınlatırken kullanılır. İlaç geliştirmede, ksenobiyotik metabolizma, metabolitlerin türler arasında aktivitesini veya toksisitesini değerlendirmede yararlıdır, bu da daha sonra kişiselleştirilmiş tıbbı desteklemeye dönüşür2. Metabolomiklerin geniş uygulamasına rağmen, metabolitlerin kimyasal reaktivitesi, yapısal heterojenliği ve geniş konsantrasyon aralığı3nedeniyle metabolitlerin görüntülenmesi zor olabilir. Bununla birlikte, yüksek enerji bileşikleri, glikoz, laktat, glikolit, pentoz şant yolu ve TCA döngüsü ara maddeleri, fosfolipidler, nörotransmitterler, sinyal bileşikleri dahil olmak üzere labile metabolitlerinin konsantrasyonları saniyeler içinde değişebilir ve beyin hasadında ölüm sonrası iskemi gibi doku enzimleri aktif olduğunda dakikalar içinde ilerleyebilir4,5,6 . Doğru metabolomik veri alımını sağlamak için uygun ve dikkatli numune hazırlama kritiktir7,8. Metabolitleri ölçmek için mevcut yerleşik platformlar arasında NMR, enzim tahlilleri ve kütle spektrometresi (sıvı ve gaz kromatografisi dahil) bulunmaktadır ve bunlardan sonuncusu aşağıda daha fazla tartışılmaktadır.
MALDI-MSI, karmaşık örneklerin bireysel moleküler türlerin tespiti yoluyla analiz edilmesine izin veren son teknoloji ürünü bir tekniktir. MALDI MSI, biyolojik numunelerdeki çeşitli moleküler bileşikleri hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçebilme avantajı sağlar. Kütle spektrometresi görüntüleme ayrıca kompozit metabolitlerine dayanarak doku biyolojisini temsil eden görüntülerin üretilmesine izin verir ve bunu örnekteki metabolitlerin mekansal dağılımını korurkenyapar 9. MALDI'nin antikor etiketlemesi, yapısal değişiklikler veya immünostainingde kullanılanlar gibi diğer özel reaktifler kullanmadan bir numunedeki analizleri tespit etme yeteneği, tek bir deneyde yüzlerce molekülü izleme yeteneği ile birleştiğinde, metabolik profilleme söz konusu olduğunda MS görüntülemenin sağladığı avantajlardan sadece birkaçını içerir10, 11. 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) ve 9-aminoasridin (9-AA) gibi yaygın olarak kullanılan matrise ek olarak, yakın zamanda keşfedilen yeni matris N -(1-Naftalin) Etilenediamine Dihidrochloride (NEDC), çeşitli düşük moleküler ağırlık metabolitlerinin analizleri için çok uygundur, metabolik profil oluşturmada MALDI MSI uygulamasını daha da geliştirmiştir12.
MALDI MSI'ın geniş uygulamasına rağmen, cihazın yüksek maliyeti ve deneysel prosedürün karmaşıklığı, bireysel araştırma laboratuvarlarında daha geniş bir şekilde uygulanmasını engellemektadır. Bu nedenle, MALDI MSI çalışmalarının çoğu ortak temel tesisler aracılığıyla desteklenmektedir. Slayt hazırlama ve matris kaplama dahil olmak üzere numune hazırlama, MALDI MSI'daki en kritik adımdır. Bununla birlikte, slayt hazırlığı normalde bireysel araştırmacının laboratuvarında gerçekleştirilir ve bu da daha sonra MALDI MSI alımında potansiyel varyasyonlar yaratır. Burada, MALDI MSI ölçümlerine geçmeden önce biyolojik örneklerin numune hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sağlamayı ve örnek olarak gelişimsel fare beyninin metabolomik profillemeyi kullanmayı hedefliyoruz.
Protocol
Protokol, New York Şehir Üniversitesi (CUNY) İleri Bilim Araştırma Merkezi'nin (ASRC) kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesinin (IACUC) yönergelerini takip ediyor.
1. Dokuyu hasat edin
- Alüminyum tekneyi hazırlayın. Dikdörtgen alüminyum 10cm x 20 cm hazırlayın, 10 cm çift katmanlı kare yapmak için ortada katlayın. Örnek bilgileri bir tarafa etiketlenin ve alt yüzeyi yaklaşık 4 cm x 4 cm olan bir tekne oluşturmak için diğer tarafı katlayın.
- Tekneyi sıvı nitrojen (LN2)üzerinde bir strafor kutusunda ön soğutma.
NOT: Tekne çok küçükse, numune tekneden düşebilir ve doğrudan LN2ile iletişime geçerek donmuş olabilir, bu da kriyoseksiyon sırasında parçalanmaya neden olabilir. - Kurumsal IACUC yönergelerini izleyerek hayvanı servikal çıkık ile ötenazi yapın, hemen ilgi dokusunu parçalara çıkarın.
- Doku hasadı sırasında metabolitlerin, özellikle de ölüm sonrası iskemi nedeniyle beyindeki labial metabolitlerin değişimini en aza indirmek için hayvan anestezisi ve çıtçıt dondurma arasındaki aralığı mümkün olduğunca kısa tutun.
NOT: Fosfat tamponlu salin (PBS) ile hayvanın perfüzyonu iskemi süresini artıracak, labile metabolit konsantrasyonlarını daha da değiştirecek ve artekötik sonuçları abartacaktır. Bu nedenle, kan veya vücut sıvısının kirlenmesi, bireysel proje için metabolitlerin bozulmasından veya yıkanmasından daha fazla endişe edilmediği sürece, dokunun PBS ile perfüzyonu veya yıkanması önerilmez.
- Doku hasadı sırasında metabolitlerin, özellikle de ölüm sonrası iskemi nedeniyle beyindeki labial metabolitlerin değişimini en aza indirmek için hayvan anestezisi ve çıtçıt dondurma arasındaki aralığı mümkün olduğunca kısa tutun.
- Hemen dokuyu sıvı nitrojen üzerinde yüzen alüminyum tekneye yerleştirin, strafor kutusunun kapağını kapatın ve dokunun boyutuna bağlı olarak 2-10 dakika dondurun: doğum sonrası 1 (P1), P21, P60 fare beyni için sırasıyla 2 dk, 5 dk, 7 dk ve P60 sıçan beyni için 10 dk.
NOT: Aşırı donmuş kriyoseksiyon sırasında doku parçalanmasına yol açabileceğinden, dokuyu uzun süre (örneğin, P1 fare beyni için 5 dk) dondurmayın. - Tekneyi forsepsle çıkarın, dokuyu sarmak için folyoyu katlayın, kuru buz üzerinde taşıyın ve daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın. Hemen kesitle takip edilirse, kuru buz üzerindeki örnekleri kriyostat'a taşıyın.
NOT: Metabolitleri daha iyi korumak için, NUMUNENIN MALDI görüntülemeye geçmeden hemen önce sağlam dokuda ve bölümde saklanması tercih edilir. Doku -80 °C'de 24 aya kadar saklanabilir.
2. Doku kriyoseksiyon
NOT: Indium tinoxide (ITO) slaytlarını kullanırken her zaman eldiven giyin. İnsan tükürüğünün doku bölümüne bulanmasını önlemek için kaydırağa doğrudan nefes almaktan kaçının veya maske takın (isteğe bağlı).
- Dokuyu bölümlemeden önce, istediğiniz sayıda MALDI uyumlu ITO kaplı cam kaydırak toplayın.
- Direnç olarak ayarlanmış bir voltmetre kullanarak slaydın iletkenliğini test edin. Direnç ölçümünün okunduğu tarafı etiketle: Bu, doku bölümlerinin yapışdığı taraf olacaktır. Kirlenmeyi önlemek için kaydırağı her zaman temiz bir kağıt havluya yerleştirin.
- Slaytları -20 °C'ye ayarlanmış bir kriyostatta önceden soğutun.
- Doku örnekleri -80 °C'den çıkarılmışsa, dokunun büyüklüğüne bağlı olarak yaklaşık 45-60 dakika kriyostat odasında dokuya dengeyi sağla. Numuneler kuru buzdan çıkarılıyorsa, yaklaşık 30 dakika boyunca dengeyi kurutun.
- Kriyostatı% 70 etanol ile iyice temizleyin. Kriyostat odasında ince uçlu sanatçı fırçası ve tostu da dahil olmak üzere gerekli tüm aletleri önceden soğutun.
- Kriyostat odasının ve numune kafasının sıcaklığını dokunun türüne göre ayarlayın: karaciğer için -14 °C, kas için -20 °C ve cilt için -25 °C9.
- Bileşik OCT gömen kriyo dokusunu kullanarak dokuyu aynaya monte edin, ilgi çekici bölgeden OCT'den kaçının.
- Sahne alanına temiz bir bıçak yerleştirin ve kilitleyin. İstenilen kesme açısını elde etmek için sahnenin konumunu ve numunenin açısını ayarlayın.
NOT: Farklı doku tipleri/genotipleri kesilecekse, bıçağın temiz bir parçasının kullanılması için numuneyi yeniden konumlandırdığınızı veya çapraz kontaminasyonu önlemek için bir sonraki örneği kesmeden önce yeni bir bıçağa değiştirdiğinizden emin olun. - İlgi alanı (örneğin, beyindeki corpus callosum) bulunana kadar kesmeye devam edin. Kriyostatta dengelenmiş bir sanatçı fırçası ile ekstra parçaları fırçalayarak sahneyi temiz tuttuğunuzdan emin olun.
- İstenilen bölge ortaya çıktıktan sonra, 10-12 μm kalınlığında daha küçük bölümler kesin. Bölüm kolayca pullanma veya parçalanma eğilimindeyse, -22 °C ila -11 °C aralığında kalarak kriyostatın sıcaklığını yükseltin. Beyin dokusu için en uygun kesme sıcaklığının -15 °C ila - 18 °C olduğunu bulduk.
- İyi bir bölüm kesildikten sonra, ITO slaydına yapışın (kriyostat odasında çalıştırın).
- Dokuların bir bölümünü sanatçı fırçasının ucunu kullanarak ITO slaytlarına aktarın.
- Güvenli montaj sağlamak için bölümü ısıtmak için slaydın altına bir parmak yerleştirerek bölümü parmakla ısıtın. Doku bölümü önce 5-10 s'de şeffaf hale gelecek ve daha sonra yaklaşık 30-60 s'de opak hale gelecektir.
- Slaytı kriyostatta dikkatlice bir kenara koyun.
- Diğer doku örnekleri için adımları tekrarlayın, dokunun her bölümünün kaydırağın üzerine eşit olarak yerleştirildiklerinden ve mümkün olduğunca hizalı olduğundan emin oluruz.
- MALDI hedefi en fazla iki slayt tutabildiğinden, aynı kohordun birden fazla örneğinden bölümleri tek bir slayta veya iki slayta yerleştirin, böylece aynı anda analiz edilebilmelerini sağlayın.
- İşiniz bittiğinde, ITO slaytlarını bir vakum kutusuna yerleştirin ve kurutuculu bir kurutucuya aktarın. Kaydırağı 45-60 dakika vakumla kurulayın.
NOT: Laboratuvarda bir vakum kurutucu yoksa, metabolitlerin bozulmasını önlemek için slaytları her zaman -20 °C'nin altında tutun. - Slayt depolama ve nakliye: Numune, MALDI görüntüleme çekirdek tesisleri tarafından doğrudan MALDI görüntülemesine devam etmek için hazırlanmadığı sürece, slaytları -80 °C'de saklayın veya kuru buz üzerinde çekirdek tesislere veya diğer MALDI araştırma laboratuvarlarına sevk edin.
- Numuneleri en iyi şekilde korumak için, slaytları slayt taşıyıcısına yerleştirin, azotla doldurun (isteğe bağlı), parafilm ile kapatın, bir zip torbasına yerleştirin, daha sonra kurutucu içeren başka bir zip torbasına yerleştirilir. Dış fermuar çantasını etiketle.
- -80 °C'de (6 aya kadar) depolamaya veya yeterli kuru buzla nakliyeye devam edin.
3. Matris Hazırlama
- Matrisi hazırlayın.
NOT: Tüm reaktifler HPLC sınıfı olmalıdır.- NEDC'i 10 mg/mL konsantrasyonda hazırlayın. % 70 metanol çözücüde çözünmüş 10 mL matris hazırlayın (100 mg NEDC, 7 mL metanol, 3 mL H2O).
- Ayrıca matrisi doldurmadan önce püskürtücü sistemini yıkamak için ekstra 10 mL%70 metanol:su çözeltisi hazırlayın.
- 2.17. adımda slaytlar susuz kaldıktan sonra, kalın nokta gümüş işaretçisi kullanarak doku bölümlerinin dışındaki cam slaytın boş alanına "X" işaretleri yerleştirin ve ardından gümüş "X" nin üzerine ince nokta siyah işaretleyicili ikinci bir "x" yerleştirin. Gümüş arka plan dışında keskin bir kontrasta sahip siyah "X" (cesur gümüş "X") daha sonra MALDI enstrümanında daha sonraki kütle spektrumu alımı için güven verici bir işaret görevi görecektir.
- Slaydı MALDI slayt metal hedefine yükleyin. Plastik kapak kullanın ve numunelerin plastik kapağın üzerine olduğu yeri çizin / çizin. Kenara.
- Düz yataklı tarayıcı kullanarak slaytın görüntüsünü MALDI hedefiyle birlikte tarayın. Hedefin yüzeyindeki vidalar, doku bölümünün tarayıcı tarafından hasar görmesini veya kirlenmesini önlemek için aralayıcı görevi görecektir. Seçili slayt alanını 16 bit gri tonlamalı ve 2400 dpi olarak önizleyin ve tarayın. Görüntüyü daha sonra MALDI MSI'da kullanmak üzere kaydedin.
4. Matris ifadesi
NOT: MALDI slaydına ince kristal boyutunda çift matris katmanı uygulamak için süblimasyon, damlacık mürekkep püskürtmeli baskı, otomatik matris püskürtücü ve sanatçı airbush9kullanarak manuel sprey dahil olmak üzere birden fazla yöntem vardır. Yüksek tekrarlanabilirliği için bu protokolde örnek olarak otomatik matris püskürtücü kullanacağız.
- Başlatma: Valfin LOAD'a konumlandırıldığından emin olarak matris püskürtücü ünitesini açın ve püskürtücü yazılımını başlatın. Egzoz fanı iyi çalışıyor olup olmadığını kontrol edin. Aktif havalandırma düzgün çalışmıyorsa çözücü pompayı çalıştırmayın.
- İletişim sekmesinde her şeyin iletişim kurduğunu onaylayın ve ardından çözücü pompayı ~500 psi (veya 3,4 MPa) geri basınçla .1 mL /dak'da başlatın.
- Azot tankını 30 psi'ye ayarlayarak matris püskürtücüye basınçlı hava akışını başlatın. Ardından, püskürtücünün ön önü üzerindeki basınç regülatörü 10 psi'ye ayarlayın ve püskürtücü nozül sıcaklığını istediğiniz gibi ayarlayın.
NOT: Namazda hava basıncı 5 psi'den düşükse, püskürtücü nozül koruma için ısınamaz. - Valf hala LOAD konumundayken, döngüyü% 70 metanol 7 mL ile yıkamak için bir şırınna kullanın ve ardından döngüyü 6 mL matrisle doldurun.
- Hareketi önlemek için her iki ucunun da bantlanarak ve METAL KELEPÇENIN MALDI hedefi üzerindeki matris tarafından kirlenmesini önlemek için matrissiz bir kenarı korumak için doku slaytlarını püskürtücüdeki tutuculara yerleştirin.
NOT: Değerli numune slaytlarına geçmeden önce matris spreyin boş bir mikroskop kaydıraktan test etmesi şiddetle tavsiye edilir. - Püskürtmeye başlamak için akış hızının ve sıcaklığın stabil olup olmadığını kontrol edin.
- Boş cam slayt kullanılarak önceden test edilmiş istenen yöntemi seçin.
- Başlat 'abasın. Bu, nozul sıcaklığını ayarlar ve pompa akış hızını seçilen yönteme uyacak şekilde ayarlar. Vanayı Yükle'den Sprey konumuna geçirin ve Devam'ı tıklatarak onaylayın.
- Yönteme bağlı olarak slayt başına 5-20 dakika sürecek sistemin çalışmasına izin verin. Vanayı Sprey'den Yük konumuna geçirin ve tamamlandığında Devam'ı tıklatarak onaylayın.
- Slaytları püskürtücüden çıkarın, ince matris kristalinin eşit bir tabakasını sağlamak için mikroskop altında matris kaplama desenini inceleyin.
- Matris biriktirmeden sonra, slaytları hemen kullanmak üzere metal MALDI tutucuya yerleştirin. Yalnızca bir örnek slayt varsa, MALDI tutucunun iki alanını doldurmak için başka bir boş slayt ekleyin.
- Püskürtücü nozülün tıkanmasını önlemek için, üreticinin talimatını takiben kullanımdan hemen sonra sistemi temizleyin.
- Örnek slayt matrisle kaplandıktan sonra, hemen MALDI görüntüleme cihazına ilerleyin veya adım 2.19'da açıklanan çift fermuarlı torba hazırlığını kullanarak kuru buzla sevk edin.
NOT: MALDI cihazı gibi acil durumlarda, kaplamalı slaydı vakum durumunda veya -20 °C'de 24 saate kadar saklayın, ancak depolama sırasında bazı metabolitlerin bozulması meydana gelebilir, bu da kapsamlı bir şekilde incelenmemiştir.
Representative Results
Temsili deney Şekil 1'degösterilen iş akışına göre gerçekleştirildi. Doğum sonrası 1, 21, 60 (yetişkin) doğum sonrası C57BL wildtype fare beyinleri CUNY IACUC yönergelerine uyarak yukarıda açıklandığı gibi hasat edildi ve sıvı nitrojen üzerinde yüzen bir alüminyum teknede sırasıyla 2, 5 ve 7 dakika donduruldu. Donmuş dokular hem numune kafası hem de oda için −15 °C'de 10 μm kalınlığında bölümlere kriyoseksiyon yapıldı. Doku kriyoseksiyonları daha sonra MALDI görüntüleme için ITO kaplı cam slaytların önceden soğutulmuş iletken tarafına hafifçe aktarıldı. ITO slaytlarına monte edilen kriyoseksiyonlar, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca vakumda kurutüldü ve ardından otomatik matris püskürtücü kullanılarak matris birikimi yapıldı. Matrix NEDC metabolitleri tespit etmek için kullanıldı ve metanol/suda (70/30, v/v) 10 mg/mL'lik bir matris çözeltisi 0.1 mL/dk akış hızında ve her döngü arasında 5 s kurutma ile 12 döngü için 75 °C nozul sıcaklığında birikti. 1300 mm/dk püskürtme hızı, 2 mm palet aralığı, 10 psi N2 gaz basıncı ve 3 L/dk debi ve 40 mm nozul yüksekliği kullanılmıştır.
MALDI kütle spektrası, MALDI uçuş süresi (TOF) MSI cihazı ile negatif iyon modunda elde edildi. Metanoldeki 0,5-1 μL kırmızı fosfor (n = 1 - 90 ile Pn kümeleri) emülsiyonu, monte edilen dokuların yanındaki ITO slaytlarına biriktirildi ve ikinci dereceden kalibrasyon eğrisi13uygulanarak cihazı 100 - 1000 m/z kütle aralığında kalibre etmek için kullanıldı. Lazer nokta çapları 50 μm raster genişliği için "Orta" modüle ışın profiline odaklanmıştır. M/z 50 ile 1000 arasında kütle aralığındaki spektra, 500 çekim için 1000 Hz'de elde edildi. Kütle spektra verileri kaydedildi ve görüntüleme gelişmiş MALDI MSI veri analiz yazılımı kullanılarak daha da analiz edildi. İyon görüntüleri, kök-ortalama kare (RMS) normalleştirmesi ile ±0,25 Da'lık bir depo gözü genişliğinde oluşturulmuştır.
Şekil 2'deki sonuçlar, her 100 Dalton aralığından seçilen m/z spektrumunun MALDI MSI veri analiz yazılımından çıktı görüntülerini gösterir ve küçük molekül metabolitlerinden yüksek moleküler ağırlıklı lipitlere kadar spektrumların tanımlanması için yardımcı programı açıkça göstermektedir. Her satır, doğum sonrası 1, 21 ve 60. Her temsilci m/z için, bölgesel dağılım ve iyon bolluklarının analizi, farklı yaşlar arasındaki karşılık gelen türlerin göreceli miktarlarını karşılaştırmak için kullanılabilir. MALDI MSI metodolojisinin bir gücü, m/z tarafından tanımlanan belirli türlerin gelişimsel kilometre taşlarına veya belirli anatomik yapılara özgüllüğünü ayırt etme yeteneğidir. Bazı metabolitlerin P1 yenidoğanlarında (m/z 320.1), P60 yetişkinlerde (m/z 846.5) zenginleştirilmiş veya yaşlara eşit olarak dağıtıldığı gözlenir (m/z 480.3); diğer moleküler türler özellikle gri madde (m/z 117.1; 524.3; 765.1), beyaz madde (m/z 673.4; 846.5) veya CSF/ventriküller (m/z 239.0)(Şekil 2A)ile zenginleştirilmiştir. Hipoksantin (m/z 135.0), N-Asetil-L-aspartik asit (m/z 174.0), Araşidonik asit dahil olmak üzere temsili metabolitlerin mekansal dağılımı (m/z 303.2) ve lizosfatidilenthanolamine LPE (18:1) (m/z 478.3), LPE gibi çeşitli lipitler (20:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), fosfatidylethanolamine PE (44:10) (m/z 838.5), Fosfatidylinositol PI(38:4) (m/z 885.6) da gösterilmiştir (Şekil 2B).
Şekil 1. MALDI uçuş zamanı (TOF) kütle spektrometresi görüntüleme iş akışı. Çıtçıtlı donmuş doku kriyostat içinde kriyozctioned ve ITO slayt monte edilir. → Doku bölümleri içeren slayt, otomatik matris püskürtücü kullanılarak ince bir matris tabakası ile kaplanmıştır. → Kütle spektrumları MALDI-TOF MSI enstrümanı tarafından 20-200um rasterinde toplanır. → Veriler analiz edilir ve görüntüler gelişmiş MALDI MSI veri analizi yazılımı kullanılarak oluşturulur. Ölçek çubuğu: 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. 50 μm yanal çözünürlükte elde edilen kütle spektrometresinden seçilen m/z spektrumlu temsili çıkış. (A) Isı haritası, P1, P21 ve P60'ta tanımlanan üç gelişimsel kilometre taşı boyunca her 100 Dalton m/z aralığından seçilen belirli metabolit türlerinin mekansal dağılımını gösterir. (B) P1, P21 ve P60'taki temsili metabolitlerin mekansal dağılımı: hipoksantin, N-Asetil-L-aspartik asit, Araşidonik asit ve lizosfatidylethanolamine (LPE), fosfatidylethanolamine (PE), Fosfatidylinositol (PI) gibi farklı lipit türleri. Ölçek çubuğu, 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
MALDI-Imaging (MALDI-MSI), araştırmacıların patolojinin moleküler temeli olan çeşitli biyomoleküllerin dağılımını ve dokudaki modifikasyonlarını araştırmalarını sağlayan etiketsiz bir görüntüleme tekniğidir. MALDI-MSI'ın doku analizi için geleneksel LC-MS yaklaşımlarıyla birlikte kullanılması, geleneksel Omics iş akışlarıyla aynı moleküler derinliği sağlar, ancak aynı zamanda bu sinyallerin hücresel ağ içindeki mekansal ilişkisini de korur. Örnek hazırlık, MALDI MSI'daki en kritik adımdır ve farklı laboratuvarlarda yürütülen metabolomik çalışmaların son okumalarındaki varyasyonu hesaplar4. Burada, temel biyolojiden çeviri çalışmalarına kadar mevcut ve gelecekteki araştırmalarında MALDI MSI'ı uygulamak için geniş bir araştırma topluluğuna fayda sağlaması umuduyla, MALDI MSI kullanarak metabolomik profilleme için örnek hazırlığı standartlaştırmak için kapsamlı ama pratik bir protokol sunuyoruz.
Numune preparatları sırasında moleküler profillerdeki değişiklikleri (hem bolluk hem de mekansal dağılım) en aza indirmek ve kirlenmeyi önlemek için her zaman tüm önlemleri göz önünde bulundurmalıdır. İlk olarak, hayvan ötenazisi ile doku hasadı arasındaki süreyi en aza indirin, örneğin donmuş yerinde veya mikrodalga fiksasyonu ile ısıtılarak beyindeki enzimleri inaktive etmek için ölüm sonrası iskemi 4,5,6. İkincisi, numunenin çıtçıt dondurma durumu kritiktir. Yetersiz donma metabolitlerin bozulmasına ve kaybına neden olurken, aşırı donma kriyoseksiyon sırasında doku parçalanmasına yol açacaktır. Donma süresi her zaman önce bildirilen çalışmalara göre test edilmelidir ve bu makalede sunulan gelişimsel fare beyninin çalışması kemirgen beyin dokusu için referans noktaları sağlar. Üçüncü olarak, biyolojik dokuların kesilmesi ve bölümlerinin İTO slaytlarına aktarılması yeterli uygulamayı gerektirecektir. Bölümü sahneden almak için fırçayı kullanırken, fırçanın hassas bir şekilde kullanılması gerektiğini unutmayın. Kontaminasyon ve kesit parçalanma riskini azaltmak için fırça kıllarının sadece doku bölümünün kenarlarıyla temas etmesine izin verin. Slayttaki bölümü mümkün olduğunca düzleştirin, bu parmak ısınması sırasında bölümün kıvrılmasını önleyecektir. Dördüncü olarak, ITO slaydına monte edilirken, dokunun farklı bölgeleri farklı parmak ısınması zamanı gerektirebileceğinden, tüm bölümün ITO kaydırağında iyi takıldığından emin olun. Örneğin, beyin tümörü dokusu normal beyin dokusundan daha uzun ısınma süresi gerektirir. Kötü bir montaj, MALDI-MS taraması sırasında dokunun kopmasına ve parçalanmasına neden olabilir. Parmak ısınmasının enzim etkisini ve metabolitlerin artektual değişikliklerine neden olan metabolizmayı sağlayabileceğini unutmayın. Beşinci olarak, MALDI matrisinin ince ve düzgün bir şekilde birikmesi, doğru mekansal bilgi ve güçlü MALDI-MS sinyali elde etmede önemli bir rol oynar. Değerli numune kaydırasının kaplamasına geçmeden önce matris püskürtmenin boş bir slaytta test etmesi ve uygun kapsama alanını doğrulamak için kristal desenini mikroskop altında gözlemlemeniz önerilir. Ve son olarak, bireysel bir araştırmacı doku toplama ve kayma hazırlığını farklı hızlarda yürüttüğünden, varyasyonu en aza indirmek için numunenin numune hazırlığını aynı kohortta ele almak için bir kişinin olması ideal olacaktır.
Yukarıda verilen protokol, belirli deneylerin ihtiyaçlarına göre uyarlanabilen standart prosedürleri detaylandırmaktadır. Örneğin, normalde numunenin kriyo kesitinde kullanılan bir kriyo-kesitleme jeli OCT, doku aynasına bir montaj tutkalı olarak daha fazla kullanılabilir (yukarıda açıklanan çalışmada olduğu gibi). Önceki çalışmalar, OCT'deki polimer bileşeninin güçlü iyon bastırmaya neden olduğunu göstermiştir14. Bununla birlikte, dokunun polimer jelden ek destek almadan kesilemeyecek kadar kırılgan olduğu durumlarda numunenin gömülmesi kaçınılmaz olabilir. Bu durumlarda sinyal bastırma ile mücadele etmek için, dokuların proteinlerin veya lipitlerin tespiti için artık OCT'yi çıkarmak için% 70 etanol ve% 95 etanolde seri yıkama ile yıkanması gerekebilir, yıkama ise küçük moleküler metabolitlerin tespiti için önerilmez9.
MALDI MSI, hem araştırma laboratuvarı hem de klinik uygulama ortamında giderek daha alakalı hale gelmiştir. Örneğin, MALDI MSI son zamanlarda bir organizmanın fenotipik fonksiyonel durumunu karakterize etmek için proteomik çalışmalarda yararlı olduğunu kanıtlamıştır15ve sonraki hastalığın mikrobiyal tanımlanması ve teşhisi için bir ajan olarak hareketetme 16. MALDI MSI çok çeşitli uygulamaları desteklerken, özellikle benzer türler veya metabolitler arasında ayrım yapmak ve belirli hedeflerin tanımlanması söz konusu olduğunda, yalnızca bu tekniğe güvenmekle ilgili bazı sınırlamalar vardır. Diğer bir zorluk, metabolit konsantrasyonunun MALDI MSI sinyallerine göre ölçülmesidir. Genellikle MALDI MSI spektrumlarındaki iyon bolluklarının ve incelenmiş dokular arasında karşılık gelen moleküler türlerin mekansal dağılımının (veya göreceli bolluklarının) iyi ilişkili olduğu varsayılır. Bununla birlikte, iyon yoğunluğu ve karşılık gelen moleküler türlerin miktarı arasındaki ilişkinin, iyon bastırmanın etkileri, doku yapısındaki değişiklikler ve iyon molekül reaksiyonları dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çok sayıda faktör tarafından karmaşık olduğunu her zaman akılda tutarız17. MALDI-MSI18'demutlak niceleme (μmol/g doku) için iç standartlardan yararlanılan teknikler uygulanabilir. Bu iki zorluk tipik olarak MALDI MSI'ın sıvı kromatografi tandem MS (LC-MS/MS) teknikleri ile birleştirilmiş iş akışı ile ele alınır, böylece MALDI-MS, daha sonra metabolit19'utanımlamak için daha fazla bilgi sağlamak için mikroextraction ve LC-MS / MS'e tabi tutulan ilgi alanının haritalanmasına izin verir.
MS tabanlı görüntüleme yöntemleri son yıllarda küçük molekül metabolitlerinin görüntülenmesinde önceki tekniklere alternatif bir yöntem olarak geliştirilmiştir. MALDI MSI'ın ilerlemesi ve artan popülaritesi ile MALDI görüntülemenin küçük molekülleri görselleştirmek için yeni bir standart araç haline gelmesi beklenmiştir. Lipid ve endojen küçük moleküllerin (örneğin nörotransmitterler ve metabolitler) biyolojik bağlamda görüntülenmesi ve yeni farmasötik ajanların gelişimi için ksenobiyotiklerin görüntülenmesi özellikle ilgi çekicidir. Bu üç alanın yakın gelecekte MALDI MSI uygulaması ile hızlı ilerlemeler olması beklenmektedir20.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Ye He ve Rinat Abzalimov, New York Şehir Üniversitesi (PSC-CUNY) Araştırma Ödül Programı tarafından desteklenmektedir. Yuki Chen ve Kelly Veerasammy, Alfred P. Sloan Vakfı CUNY Yaz Lisans Araştırma Programı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| Autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC219095000 | |
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC) | Millipore Sigma Aldrich | 222488 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Watkins, S. M., German, J. B. Metabolomics and biochemical profiling in drug discovery and development. Current Opinion in Molecular Therapeutics. 4, 224-228 (2002).
- Fernie, A. R., Trethewey, R. N., Krotzky, A. J., Willmitzer, L. Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 763-769 (2004).
- Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J., Wilson, I. D. Liquid chromatography-mass spectrometry based global metabolite profiling: a review. Analytica Chimica Acta. 711, 7-16 (2012).
- Dienel, G. A. Metabolomic and Imaging Mass Spectrometric Assays of Labile Brain Metabolites: Critical Importance of Brain Harvest Procedures. Neurochemistry Research. 45, 2586-2606 (2020).
- Dienel, G. A. Metabolomic Assays of Postmortem Brain Extracts: Pitfalls in Extrapolation of Concentrations of Glucose and Amino Acids to Metabolic Dysregulation In Vivo in Neurological Diseases. Neurochemistry Research. 44, 2239-2260 (2019).
- Wasek, B., Arning, E., Bottiglieri, T. The use of microwave irradiation for quantitative analysis of neurotransmitters in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 307, 188-193 (2018).
- Andres, D. A., et al. Improved workflow for mass spectrometry-based metabolomics analysis of the heart. Journal of Biological Chemistry. 295, 2676-2686 (2020).
- Lu, W., et al. Metabolite Measurement: Pitfalls to Avoid and Practices to Follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113, 2309-2342 (2013).
- Miura, D., et al. Ultrahighly sensitive in situ metabolomic imaging for visualizing spatiotemporal metabolic behaviors. Analytical Chemistry. 82, 9789-9796 (2010).
- Han, J., et al. Towards high-throughput metabolomics using ultrahigh-field Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Metabolomics. 4, 128-140 (2008).
- Wang, J., et al. MALDI-TOF MS imaging of metabolites with a N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride matrix and its application to colorectal cancer liver metastasis. Analytical Chemistry. 87, 422-430 (2015).
- Sladkova, K., Houska, J., Havel, J. Laser desorption ionization of red phosphorus clusters and their use for mass calibration in time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19, 3114-3118 (2019).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38, 699-708 (2003).
- Greco, V., et al. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics. Expert Review of Proteomics. 15, 683-696 (2018).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in Microbiology. 6, 791 (2015).
- Hankin, J. A., Murphy, R. C. Relationship between MALDI IMS intensity and measured quantity of selected phospholipids in rat brain sections. Analytical Chemistry. 82 (20), 8476-8484 (2010).
- Prentice, B. M., Chumbley, C. W., Caprioli, R. M. Absolute Quantification of Rifampicin by MALDI Imaging Mass Spectrometry Using Multiple TOF/TOF Events in a Single Laser Shot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (1), 136-144 (2017).
- Quanico, J., Franck, J., Wisztorski, M., Salzet, M., Fournier, I. Combined MALDI Mass Spectrometry Imaging and Parafilm-Assisted Microdissection-Based LC-MS/MS Workflows in the Study of the Brain. Methods in Molecular Biology. 1598, 269-283 (2017).
- Trim, P. J., Snel, M. F. Small molecule MALDI MS imaging: Current technologies and future challenges. Methods. 104, 127-141 (2016).
