Fabricación De Plataformas Magnéticas Para La Organización A Escala De Micras De Las Neuronas Interconectadas
Summary
Este trabajo presenta un enfoque ascendente para la ingeniería de las fuerzas magnéticas locales para el control de la organización neuronal. Las células similares a neuronas cargadas con nanopartículas magnéticas (MNPs) están plateadas encima y controladas por una plataforma micro-modelada con magnetización perpendicular. También se describen la caracterización magnética, la absorción celular de MNP, la viabilidad celular y el análisis estadístico.
Abstract
La capacidad de dirigir las neuronas a redes neuronales organizadas tiene grandes implicaciones para la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos y la bio-interfaz. Muchos estudios han tenido como objetivo dirigir las neuronas utilizando señales químicas y topográficas. Sin embargo, los informes de control organizacional a escala de micras sobre grandes áreas son escasos. Aquí, se ha descrito un método eficaz para colocar neuronas en sitios preestablecidos y guiar la consecuencia neuronal con resolución a escala de micras, utilizando plataformas magnéticas incrustadas con micro-patrones, elementos magnéticos. Se ha demostrado que la carga de neuronas con nanopartículas magnéticas (MNPs) las convierte en unidades magnéticas sensibles que pueden ser influenciadas por gradientes magnéticos. Siguiendo este enfoque, se ha fabricado una plataforma magnética única en la que las células PC12, un modelo común similar a una neurona, se platearon y se cargaron con nanopartículas superparamagnéticas. Se depositaron películas delgadas de multicapas ferromagnéticas (FM) con magnetización perpendicular estable para proporcionar fuerzas de atracción efectivas hacia los patrones magnéticos. Estas células PC12 cargadas de MNP, plateadas y diferenciadas encima de las plataformas magnéticas, se unieron preferentemente a los patrones magnéticos, y la excrecencia de neurita estaba bien alineada con la forma del patrón, formando redes orientadas. Los métodos cuantitativos de la caracterización de las propiedades magnéticas, de la absorción celular de MNP, de la viabilidad de la célula, y del análisis estadístico de los resultados se presentan. Este enfoque permite el control de la formación de redes neuronales y mejora la interfaz neurona-electrodo a través de la manipulación de fuerzas magnéticas, que puede ser una herramienta eficaz para estudios in vitro de redes y puede ofrecer nuevas direcciones terapéuticas de biointerfase.
Introduction
Micropatterning de neuronas tiene un gran potencial para la regeneración de tejidos1,2,3,4,5 y el desarrollo de dispositivos neuroelectr electrónicos6,7,8. Sin embargo, el posicionamiento a escala micronescular de las neuronas a alta resolución espacial, como en los tejidos biológicos, plantea un desafío significativo. La formación de estructuras prediseñadas a esta escala requiere la guía de los procesos de las células nerviosas mediante el control local de la motilidad del soma y la excrecencia axonal. Estudios anteriores han sugerido el uso de señales químicas y físicas9,10,11,12 para guiar el crecimiento neuronal. Aquí, un nuevo enfoque se centra en el control del posicionamiento celular mediante gradientes de campo magnético13,14,15,16,17,convirtiendo las células cargadas con MNPs en unidades sensibles magnéticas, que pueden ser manipuladas remotamente.
Kunze et al., que caracterizaron la fuerza necesaria para inducir respuestas celulares utilizando células cargadas con chip magnético y MNP, demostraron que el alargamiento axonal temprano puede ser desencadenado por la tensión mecánica dentro de las células18. Tay et al. confirmaron que los sustratos microfabricados con gradientes de campo magnético mejorados permiten la estimulación inalámbrica de circuitos neuronales dosificados con MNPs utilizando colorantes indicadores de calcio19. Además, Tseng et al. unieron nanopartículas dentro de las células, dando lugar a fuerzas localizadas mediadas por nanopartículas que se acercaron a la tensión celular20. Esto condujo a la fabricación de patrones definidos de sustratos micromagnéticos que ayudaron a estudiar la respuesta celular a las fuerzas mecánicas. La tensión celular derivada de la aplicación de fuerzas localizadas mediadas por nanopartículas se logró mediante la fusión de nanopartículas dentro de las células20. Un sistema híbrido microfluídico-semiconductor complementario de óxido metálico (CMOS) fue desarrollado por Lee et al., quienes integraron una matriz de microelectroimanes en el chip CMOS para controlar el movimiento de células individuales etiquetadas con perlas magnéticas21.
Utilizaron almohadillas magnéticas preprogramadas a microescala como “puntos calientes” magnéticos para localizar las células22. La actividad específica también podría estimularse dentro de las células utilizando matrices magnéticas micro-modeladas para localizar nanopartículas en ubicaciones subcelulares específicas23. La absorción celular de MNP se ha demostrado con éxito en las neuronas primarias de sanguijuela, rata y ratón24,25,26. Aquí, esto se ha demostrado en una línea celular del feocromocitoma pc12 de la rata, que se ha divulgado previamente para demostrar la alta absorción de MNPs27. En los últimos años, ha habido varias aplicaciones médicas de los MNPs, incluyendo la administración de fármacos y la termoterapia en tratamientos contra el cáncer28,29,30,31. En concreto, los estudios se ocupan de la aplicación de MNPs y redes neuronales32,33,34,35. Sin embargo, la organización magnética de las neuronas que utilizan MNPs a nivel unicelular merece una mayor investigación.
En este trabajo, se ha descrito un enfoque ascendente para diseñar fuerzas magnéticas locales a través de plataformas prediseñadas para controlar la disposición neuronal. Se ha presentado la fabricación de patrones a escala micron de multicapas fm. Esta estructura única de múltiples capas de FM crea una magnetización perpendicular estable que resulta en fuerzas de atracción efectivas hacia todos los patrones magnéticos. A través de la incubación, los MNPs se cargaron en células PC12, transformándolas en unidades magnéticas sensibles. Las células cargadas de MNP, plateadas y diferenciadas sobre las plataformas magnéticas, se unieron preferentemente a los patrones magnéticos, y la consecuencia de la neurita se alineó bien con la forma del patrón, formando redes orientadas. Se han descrito varios métodos para caracterizar las propiedades magnéticas de las multicapas fm y los MNPs, y también se han presentado técnicas para la absorción celular de MNP y ensayos de viabilidad celular. Además, se detallan los parámetros morfométricos del crecimiento neuronal y el análisis estadístico de los resultados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los resultados representativos demuestran la eficacia de la metodología presentada para controlar y organizar la formación de redes neuronales a escala de micras. Las células PC12 cargadas con MNP siguieron siendo viables y se transformaron en unidades sensibles magnéticas que fueron atraídas por las fuerzas magnéticas de los electrodos fm a sitios específicos. Esto se demuestra mejor en la Figura 5C,donde las celdas se adhirieron preferentemente a los vértices más grandes de los he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Israel y por la Fundación Israelí para la Ciencia (569/16).
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 15710 | |
| 6-well cell culture plate | FALCON | 353846 | |
| 96-well cell culture plate | SPL life sciences | 30096 | |
| Amphotericin B solution | Biological Industries | 03-028-1B | |
| AZ 1514H photoresist | MicroChemicals GmbH | ||
| AZ 351 B developer | MicroChemicals GmbH | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Biological Industries | 03-010-1B | |
| Cell and Tissue cultur flask | Biofil | TCF002250 | 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One | 627-160 | 35 mm |
| Cell Proliferation Kit (XTT-based) | Biological Industries | 20-300-1000 | |
| Centrifuge tube | Biofil | CFT021500 | 50 mL |
| Co80Fe20 at% sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Collagen type I | Corning Inc. | 354236 | Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-165-152 | |
| DAPI fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Disposable needle | KDL | 23 G | |
| Disposable syringe | Medispo | 1160227640 | 10 mL |
| Donor horse serum | Biological Industries | 04-124-1A | |
| ELISA reader | Merk Millipore | BioTek synergy 4 hybrid microplate reader | |
| Ethanol 70% | ROMICAL LTD | 19-009102-80 | |
| Ethanol absolute (Dehydrated) | Biolab-chemicals | 52505 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| Fresh murine β-NGF | Peprotech | 450-34 | |
| GMW C-frame electromagnet . | Buckley systems LTD | 3470, 45 mm | |
| Hydrochloric acid 32% | DAEJUNG CHEMICAL & METALS | 4170-4100 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health, Bethesda | NeuronJ plugin | |
| Inductively coupled plasma (ICP) | Ametek Spectro | SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma | |
| Keithley source-measure | Keithley | 2400 | |
| Keithley switching system | Keithley | 3700 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Light microscope | Leica | DMIL LED | |
| Maskless photolithography | Heidelberg Inst. | MLA150 | |
| Microscope Slides | BAR-NAOR | BN1042000C | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 438073 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Sigma | D9663 | |
| PBS 10x | hylabs | BP507/1LD | |
| PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
| Pd sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Penicillin-streptomycin nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| PrestoBlue cell viability reagent | Molecular probes | A-13261 | resazurin-based |
| Rabbit antibody to α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | ||
| RF magnetron sputtering system | Orion AJA Int. | Orion 8 | |
| RPMI 1640 with l-glutamine | Biological Industries | 01-100-1A | |
| Sonication bath | KUDOS | SK3210HP | Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W |
| SQUID magnetometer | Quantum Design, CA | ||
| Triton X-100 | CHEM-IMPEX INTERNATIONAL | 1279 | non-ionic surfactant |
| XTT cell viability reagent |
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