Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تصنيع منصات مغناطيسية لتنظيم Micron-Scale للخلايا العصبية المترابطة

Published: July 14, 2021 doi: 10.3791/62013
Automatic Translation
1,4, 2,4, 2,4, 1,4, 2,4, 2,4, 3,4, 2,4, 1,4
1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

Summary

يقدم هذا العمل نهجا من أسفل إلى أعلى لهندسة القوى المغناطيسية المحلية للسيطرة على تنظيم الخلايا العصبية. الخلايا العصبية مثل محملة الجسيمات النانوية المغناطيسية (MNPs) مطلية فوق وتسيطر عليها منصة صغيرة منقوشة مع المغناطيسية عمودي. كما وصفها هي التوصيف المغناطيسي، امتصاص MNP الخلوية، وقابلية الخلية، والتحليل الإحصائي.

Abstract

القدرة على توجيه الخلايا العصبية إلى الشبكات العصبية المنظمة له آثار كبيرة على الطب التجديدي، وهندسة الأنسجة، والربط البيولوجي. وقد استهدفت العديد من الدراسات في توجيه الخلايا العصبية باستخدام الإشارات الكيميائية والتضاروبوغرافية. ومع ذلك، فإن التقارير عن الرقابة التنظيمية على نطاق ميكرون على مساحات واسعة نادرة. هنا، وقد وصفت طريقة فعالة لوضع الخلايا العصبية في مواقع محددة مسبقا وتوجيه نمو الخلايا العصبية مع دقة على نطاق ميكرون، وذلك باستخدام منصات مغناطيسية جزءا لا يتجزأ من العناصر المغناطيسية المنقوشة الدقيقة. وقد ثبت أن تحميل الخلايا العصبية مع الجسيمات النانوية المغناطيسية (MNPs) يحولها إلى وحدات مغناطيسية حساسة يمكن أن تتأثر بالتدرجات المغناطيسية. بعد هذا النهج، تم تصنيع منصة مغناطيسية فريدة من نوعها على خلايا PC12، نموذج مشترك يشبه الخلايا العصبية، كانت مطلية ومحملة بالجسيمات النانوية المغناطيسية الفائقة. تم إيداع أفلام رقيقة من الطبقات المتعددة المغناطيسية الحديدية (FM) مع مغناطيسية عمودية مستقرة لتوفير قوى جذب فعالة نحو الأنماط المغناطيسية. هذه الخلايا PC12 MNP محملة، مطلية ومتمايزة فوق المنصات المغناطيسية، كانت مرتبطة بشكل تفضيلي إلى الأنماط المغناطيسية، وكان نمو neurite تتماشى بشكل جيد مع شكل نمط، وتشكيل الشبكات الموجهة. يتم عرض طرق التوصيف الكمي للخصائص المغناطيسية ، وامتصاص MNP الخلوي ، وقابلية الخلية ، والتحليل الإحصائي للنتائج. هذا النهج يمكن من السيطرة على تشكيل الشبكة العصبية ويحسن واجهة الخلايا العصبية إلى القطب الكهربائي من خلال التلاعب القوى المغناطيسية، والتي يمكن أن تكون أداة فعالة للدراسات المختبرية للشبكات، ويمكن أن تقدم اتجاهات جديدة العلاجية biointerfacing.

Introduction

Micropatterning من الخلايا العصبية يحمل إمكانات كبيرة لتجديد الأنسجة1،2،3،4،5 وتطوير الأجهزة العصبية الإلكترونية6،7،8. ومع ذلك ، فإن تحديد المواقع على نطاق ميكرون من الخلايا العصبية في قرار المكانية عالية ، كما هو الحال في الأنسجة البيولوجية ، يشكل تحديا كبيرا. يتطلب تشكيل هياكل مصممة مسبقا على هذا النطاق توجيه عمليات الخلايا العصبية من خلال التحكم محليا في حركة سوما و النمو المحوري. وقد اقترحت الدراسات السابقة استخدام الإشارات الكيميائية والفيزيائية9,10,11,12 لتوجيه نمو الخلايا العصبية. هنا، يركز نهج جديد على التحكم في تحديد مواقع الخلايا من خلال تدرجات المجال المغناطيسي13و14و15و16و17،وتحويل الخلايا المحملة بال MNPs إلى وحدات حساسة مغناطيسيا، والتي يمكن التلاعب بها عن بعد.

Kunze وآخرون، الذين يتميزون القوة اللازمة للحث على الاستجابات الخلوية باستخدام رقاقة المغناطيسي و MNP الخلايا المحملة، أثبتت أن استطالة أكسنال في وقت مبكر يمكن أن يكون سببها التوتر الميكانيكي داخل الخلايا18. وأكد تاي وآخرون أن الركائز الدقيقة المصنعة مع تدرجات المجال المغناطيسي المحسنة تسمح بالتحفيز اللاسلكي للدوائر العصبية التي يتم غمرها بال MNPs باستخدام أصباغ مؤشر الكالسيوم19. وعلاوة على ذلك، Tseng وآخرون تجمع الجسيمات النانوية داخل الخلايا، مما أدى إلى القوى المترجمة بوساطة الجسيمات النانوية التي اقتربت من التوتر الخلوي20. وأدى ذلك إلى تصنيع أنماط محددة من الركائز المغناطيسية الدقيقة التي ساعدت على دراسة الاستجابة الخلوية للقوى الميكانيكية. تم تحقيق التوتر الخلوي الناشئ عن تطبيق القوات المترجمة بوساطة الجسيمات النانوية عن طريق تجميع الجسيمات النانوية داخل الخلايا20. تم تطوير نظام هجين مكمل لأكسيد المعادن (CMOS) - microfluidic من قبل Lee وآخرون الذين دمجوا مجموعة من المغناطيسات الكهربائية الدقيقة في رقاقة CMOS للتحكم في حركة الخلايا الفردية الموسومة بالخرز المغناطيسي21.

استخدم ألون وآخرون منصات مغناطيسية على نطاق صغير، مبرمجة مسبقا، ك "نقاط ساخنة" مغناطيسية لتحديد موقع الخلايا22. ويمكن أيضا تحفيز نشاط محدد داخل الخلايا باستخدام صفائف مغناطيسية صغيرة النقش لترجمة الجسيمات النانوية في مواقع محددة دون الخلوية23. وقد ثبت امتصاص MNP الخلوية بنجاح في الخلايا العصبية الأولية اللخش, الفئران, والفأر24,25,26. هنا، وقد ثبت هذا على خط الخلية PC12 الفئران pheochromocytoma، والتي تم الإبلاغ عنها سابقا لإظهار امتصاص عالية من MNPs27. في السنوات الأخيرة ، كانت هناك تطبيقات طبية مختلفة من أعضاء البرلمان ، بما في ذلك تسليم الأدوية والعلاج الحراري في علاجات السرطان28،29،30،31. على وجه التحديد، تتناول الدراسات تطبيق MNPs وشبكات الخلايا العصبية32،33،34،35. ومع ذلك ، فإن التنظيم المغناطيسي للخلايا العصبية باستخدام MNPs على مستوى خلية واحدة يستحق المزيد من التحقيق.

في هذا العمل، تم وصف نهج من أسفل إلى أعلى لهندسة القوى المغناطيسية المحلية عبر منصات مصممة مسبقا للسيطرة على ترتيب الخلايا العصبية. وقد تم تقديم تلفيق أنماط ميكرون على نطاق متعدد FM. هذا فريدة من نوعها, FM هيكل متعدد الطبقات يخلق المغناطيسية عمودي مستقرة أن يؤدي إلى قوى الجذب فعالة نحو جميع الأنماط المغناطيسية. عن طريق الحضانة، تم تحميل MNPs في خلايا PC12، وتحويلها إلى وحدات حساسة مغناطيسية. وكانت الخلايا المحملة بال MNP، المطلية والمتمايزة فوق المنصات المغناطيسية، مرتبطة بشكل تفضيلي بالأنماط المغناطيسية، وكان نمو النيوريت متوافقا بشكل جيد مع شكل النمط، مما شكل شبكات موجهة. وقد وصفت عدة طرق لوصف الخصائص المغناطيسية للمتعددة الطبقات FM وNPs, وقدمت أيضا تقنيات لامتصاص MNP الخلوية و المقايسات صلاحية الخلية. بالإضافة إلى ذلك، يتم تفصيل المعلمات المورفومترية لنمو الخلايا العصبية والتحليل الإحصائي للنتائج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: إجراء كافة التفاعلات البيولوجية في خزانة السلامة الحيوية.

1. تصنيع منصة مغناطيسية

  1. الطباعة الحجرية
    1. قطع الشرائح الزجاجية إلى 2 × 2 سم2 باستخدام قلم الكتبة. تنظيف الشرائح الزجاجية في الأسيتون ثم isopropanol لمدة 5 دقائق لكل منهما في حمام سونيكيشن فائقة. جاف مع النقاء العالي جدا (UHP) النيتروجين.
    2. معطف الزجاج مع فوتوريستر باستخدام تدور طلاء في 6000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية، لتحقيق سمك 1.5 ميكرومتر، وخبز في 100 درجة مئوية لمدة 60 ثانية. يعرض العينة لمصدر ضوء، باستخدام طول موجي مناسب لأخصائي التصوير الضوئي، مع النمط المطلوب، باستخدام قناع ضوئي أو رسم مطبوع أقل قناعا.
    3. تطوير لمدة 40 ق في المطور، المخفف في الماء المقطر (DW) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة؛ يغسل في DW لمدة 45 ثانية، وجافة مع غاز النيتروجين UHP. فحص النمط تحت المجهر البصري.
  2. ترسب سبوتر
    1. أدخل العينة في الغرفة الرئيسية لنظام الترسب وانتظر الضغط الأساسي (~ 5 × 10-8 تور). فتح تدفق الغاز؛ تعيين تدفق الأرجون لsputtering القياسية (28 sccm [سم مكعب قياسي لكل دقيقة) هنا. إشعال أهداف البصق، ثم تعيين ضغط البصق إلى 3 mTorr.
    2. زيادة القوة على كل هدف حتى يتم تحقيق المعدل المطلوب.
      ملاحظة: معدل Pd: 0.62 A/s = 1.0 نانومتر في 16 ثانية؛ Co80Fe20 Rate: 0.32 A/s, 0.2 نانومتر في 6.25 ثانية.
    3. تشغيل التدوير. إيداع متعدد الطبقات FM, بالتناوب بين أهداف Co80Fe20 و Pd, عن طريق فتح وإغلاق مصاريع الهدف, على التوالي. إيداع 14 طبقة ثنائية من Co80Fe20 (0.2 نانومتر) / Pd (1.0 نانومتر) ، وتنتهي بطبقة إضافية 2 نانومتر Pd.
    4. الإقلاع: نقع العينة في الأسيتون لمدة 30 دقيقة، وشطف مع ايزوبروبانول. ثم، الجافة مع النيتروجين UHP، والحفاظ على العينة في بيئة نظيفة وجافة حتى الاستخدام.

2. توصيف الجهاز المغناطيسي عن طريق قياسات النقل

  1. استخدم شريحة ركيزة أو زجاج Si مع شريط مغناطيسي على شكل صليب بعرض 100 ميكرومتر، يتم إيداعه مع طبقات FM متعددة الطبقات (انظر الشكل 1C inset). إرفاق العينة إلى حامل باستخدام الشريط على الوجهين.
  2. باستخدام سلك المستعبدين، السندات 4 أسلاك للعينة، واحد على كل ساق من القطب الصليب. تعيين حامل العينة والعينة داخل نظام قياس النقل مع مجال مغناطيسي بحيث يكون المجال المغناطيسي عموديا على العينة. إجراء القياسات في درجة حرارة الغرفة.
  3. أداء الجهد العرضي (VT)قياس الجهاز. اتبع العلامات في الشكل 1C (inset): تطبيق تيار من 1 mA بين جهات الاتصال 1 و 3; قياس VT بين الاتصالات 2 و 4؛ ثم، تطبيق التيار بين 2 و 4، وقياس الجهد بين 1 و 3. وأخيرا، حساب الفرق بين الفولتية من كل من القياسات وتقسيمها على 2 للحصول على VT. استخدم نظام تبديل للتغيير تلقائيا بين تكويني القياس.
  4. تمشيط المجال المغناطيسي بين 0.4 T إلى -0.4 T في خطوات من 5 mT وقياسV T كدالة للحقل. رسم المقاومة العرضية (VT/ I) مقابل المجال المغناطيسي لتحديد إشارة القاعة الشاذة ، والتي تتناسب مع المغناطيسية المتعامدة في الفيلم.

3. توصيف MNPs والمغناطيسية متعدد الطبقات عن طريق قياس المغناطيسي

  1. قياس المغناطيسي لتعدد الطبقات FM
    1. إيداع متعدد الطبقات FM على الركيزة Si (انظر القسم 1.2). قطع العينة إلى 6 مربعات من 4 × 4 مم2 حجم. كومة عينات واحدة على رأس الآخر وترتيبها في كبسولة عمودي على اتجاه المجال المغناطيسي (انظر الشكل 1D inset).
    2. أدخل الكبسولة في مقياس المغنطيسية و قم بقياس المغنطة في درجة حرارة الغرفة. تمشيط المجال المغناطيسي بين -0.4 T و 0.4 T.
    3. حساب الحجم الإجمالي للمادة المغناطيسية، مع الأخذ بعين الاعتبار سمك الطبقة المغناطيسية، وحجم العينات، وعدد الركائز. تقسيم المغنطة من حيث الحجم الإجمالي للمادة المغناطيسية.
    4. رسم المغناطيسية (لكل وحدة حجم) مقابل المجال المغناطيسي. طرح الخلفية ثنائية المغناطيسية للركيزة من استجابة المجال المغناطيسي عالية واستقراء مغنطة التشبع من FM من الرسم البياني.
  2. قياس المغنطيسية ل MNPs
    1. إدراج كتلة معينة من MNPs في كبسولة البوليمر الاصطناعية. النظر في حجم أكبر إذا قياس قيم تشبع مغنطة صغيرة.
    2. إذا تم تعليق أعضاء البرلمان في المذيبات، وتجفيف أعضاء البرلمان عن طريق ترك الكبسولة مفتوحة بين عشية وضحاها. أدخل الكبسولة في مقياس المغنطيسية و قم بقياس المغنطة في درجة حرارة الغرفة. تمشيط المجال المغناطيسي بين -0.2 T و 0.2 T.
    3. حساب الكتلة الإجمالية لل MNPs بضرب الحجم المعين بتركيز الجسيمات. تطبيع النتائج إلى 1 غرام.
    4. رسم المغناطيسية تطبيع (لكل غرام) مقابل المجال المغناطيسي. استقراء تشبع المغنطة من MNPs من الرسم البياني.

4. بروتوكول طلاء الكولاجين

  1. طلاء الأطباق البلاستيكية
    1. إعداد 0.01 M HCl بإضافة 490 ميكرولتر من HCl إلى 500 مل من الماء المقطر المزدوج (DDW).
      ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة فقط في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
    2. تمييع الكولاجين نوع 1 (الحل من ذيل الفئران) 1:60-1:80 في 0.01 M HCl للحصول على تركيز العمل النهائي من 50 ميكروغرام / مل. ضع 1.5 مل من المحلول المخفف في طبق ثقافة 35 مم. اترك الطبق في غطاء محرك السيارة لمدة ساعة واحدة، مغطى.
    3. إزالة المحلول، وغسل 3x في المحلول الملحي المعقم 1x الفوسفات المخزنة (PBS). الطبق جاهز لزرع الخلايا.
  2. طلاء الشرائح الزجاجية
    1. تمييع الكولاجين نوع 1 (الحل من ذيل الفئران) 1:50 في 30٪ v/v الإيثانول. لطلاء طبق 35 ملم، أضف 20 ميكرولتر من الكولاجين إلى 1 مل من الإيثانول بنسبة 30٪.
    2. غطي الطبق بالمحلول، وانتظري حتى يتبخر كل المحلول، تاركا الطبق مكشوفا لبضع ساعات. غسل 3x في برنامج تلفزيوني 1x عقيمة; الشريحة الزجاجية جاهزة للبذر الخلية.

5. امتصاص MNP الخلوية وقابليتها للاستمرار

  1. امتصاص MNP الخلوي
    1. إعداد متوسط النمو الأساسي زراعة الخلايا PC12 بإضافة مصل الحصان 10٪ (HS)، 5٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين / العقدية، و 0.2٪ أمفوتريسين إلى معهد روزويل بارك الطبي (RPMI) المتوسطة، ومرشح باستخدام مرشح النايلون 0.22 ميكرومتر.
    2. إضافة 1٪ مصل الحصان (HS)، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين / العقدية، و 0.2٪ أمفوتريسين إلى RPMI المتوسطة لإعداد PC12 وسيط التمايز، ومرشح باستخدام مرشح النايلون 0.22 ميكرومتر.
    3. زراعة الخلايا في قارورة ثقافة غير المعالجة مع 10 مل من متوسط النمو الأساسي; إضافة 10 مل من متوسط النمو الأساسي إلى القارورة كل 2-3 أيام، والثقافة الفرعية الخلايا بعد 8 أيام.
    4. لامتصاص الخلوية، الطرد المركزي تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 200 × ز ودرجة حرارة الغرفة، والتخلص من supernatant.
    5. Resuspend الخلايا في 3 مل من متوسط النمو الأساسي الطازج. مرة أخرى، الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في 200 × ز ودرجة حرارة الغرفة، والتخلص من supernatant. Resuspend الخلايا في 3 مل من وسط التمايز الطازجة.
    6. يستنشق الخلايا 10x باستخدام حقنة وإبرة لتفريق مجموعات الخلايا. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم، والبذور 106 خلايا في طبق 35 ملم غير المصقول العادية.
    7. أضف إلى الطبق الحجم المحسوب لتعليق MNP وحجم التمايز المتوسط لتحقيق تركيز MNP المطلوب والحجم الإجمالي. خلط الخلايا، MNPs، والتمايز المتوسطة؛ احتضان الطبق في حاضنة 5٪ CO2 مرطب في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    8. الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في 200 × ز في درجة حرارة الغرفة، والتخلص من supernatant. Resuspend الخلايا في 1 مل من وسط التمايز الطازجة، وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
  2. تمايز الخلايا المحملة ب MNP
    1. تنفيذ بروتوكول الامتصاص (القسم 5.1). البذور 8 × 104 MNP محملة الخلايا على 35 ملم، طبق الكولاجين نوع L المغلفة في وجود وسيطة التمايز (انظر بروتوكول طلاء الكولاجين في القسم 4.1). بعد 24 ساعة، إضافة 1:100 جديد مورين بيتا الأعصاب عامل النمو (β-NGF) (التركيز النهائي 50 نانوغرام / مل).
    2. تجديد وسيط التمايز وإضافة مورين الطازجة β-NGF كل 2 أيام. صورة الخلايا كل يومين باستخدام المجهر البصري. بعد تشكيل الشبكة (6-8 أيام لخلايا PC12) ، صورة الخلايا باستخدام المجهر confocal ، ومراقبة مضان الجسيمات.
  3. اختبار قابلية البقاء للخلايا المحملة MNP: 2،3-bis-(2-methoxy-4-نيترو-5-سلفوفينيل)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) اختبار صلاحية الخلية.
    1. إعداد متوسط النمو الأساسي وفقا للخطوة 5.1.1. زراعة خلايا PC12 مع MNPs بتركيزات مختلفة (0.1 ملغم / مل، 0.25 ملغم / مل، و 0.5 ملغم / مل في متوسط النمو الأساسي) وأيضا بدون MNPs للسيطرة في ثلاثية في لوحة مسطحة 96 جيدا (الحجم الإجمالي 100 ميكرولتر / بئر). احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 5٪ CO2،حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية.
    2. إعداد آبار فارغة تحتوي على متوسطة بدون خلايا لتصحيح الخلفية. إذابة محلول كاشف XTT، ومحلول التفاعل الذي يحتوي على كبريتات الميثيل N-methyldibenzopyrazine) في حمام 37 درجة مئوية قبل الاستخدام مباشرة. دوامة بلطف حتى يتم الحصول على حلول واضحة.
    3. للحصول على لوحة واحدة من 96 بئرا، امزج 0.1 مل من محلول التنشيط مع 5 مل من كاشف XTT. إضافة 50 ميكرولتر من محلول رد الفعل على كل بئر، يهز قليلا لوحة لتوزيع حتى من الصبغة في الآبار، ومن ثم احتضان لوحة في حاضنة لمدة 5 ساعة.
    4. قياس امتصاص العينة ضد الآبار الفارغة باستخدام جهاز فحص مناعي مرتبط بالإنزيم (ELISA) القارئ على طول موجي يبلغ 450 نانومتر. قياس امتصاص المرجع باستخدام الطول الموجي من 630 نانومتر وطرحه من قياس 450 نانومتر.
    5. كما يحدث امتصاص عفوي طفيف في المتوسط ثقافة المحتضنة مع كاشف XTT في 450 نانومتر، طرح متوسط امتصاص الآبار الفارغة من أن من الآبار الأخرى. طرح قيم الإشارة من عينات متوازية من MNPs في نفس التركيزات المختبرة مثل عينات الخلية.
  4. اختبار الجدوى للخلايا المحملة MNP: اختبار صلاحية الخلية القائم على ريسازورين
    1. إعداد متوسط النمو الأساسي وفقا للخطوة 5.1.1. زراعة خلايا PC12 مع MNPs بتركيزات مختلفة (0.1 ملغ / مل، 0.25 ملغ / مل، و 0.5 ملغ / مل في متوسط النمو الأساسي) ودون MNPs كسيطرة في ثلاثية في لوحة مسطحة 96 جيدا لمدة 24 ساعة. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪ عند 37 درجة مئوية. إعداد آبار فارغة تحتوي على متوسطة بدون خلايا.
    2. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x. أضف الكاشف القائم على الريسازورين (10٪ ث/v) إلى الوسط واحتضنه لمدة 2 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية.
    3. ضع 150 ميكرولتر من الاقتباسات من العينات في قارئ ELISA ، وقياس الامتصاص عند طول موجي مثير قدره 560 نانومتر وطول موجي للانبعاثات قدره 590 نانومتر. طرح قيم الإشارة من العينات المتوازية من MNPs في نفس التركيزات المختبرة مثل عينات الخلية.

6. توصيف تركيز MNP داخل الخلايا باستخدام البلازما المقترنة بشكل استقرائي (ICP)

  1. إعداد متوسط النمو الأساسي وفقا للخطوة 5.1.1. زراعة خلايا PC12 مع MNPs بتركيزات مختلفة (0.1 ملغم / مل، 0.25 ملغم / مل، و 0.5 ملغم / مل في متوسط النمو الأساسي) وبدون MNPs كتحكم في ثلاثية البلورات في لوحة مسطحة 96 جيدا (الحجم الإجمالي 100 ميكرولتر / بئر). احتضان في 5٪ CO2،حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. نقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي (من كل بئر على حدة)، وخلايا الطرد المركزي في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة والتخلص من supernatant. Resuspend الخلايا في 1 مل من وسط التمايز الطازجة، وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
  3. Lyse الخلايا عن طريق العلاج مع 100 ميكرولتر من حمض النيتريك 70٪ لكل بئر على حدة لمدة 15 دقيقة على الأقل. إضافة 5 مل من DDW إلى الخلايا lysed وتصفية الحلول.
  4. قياس تركيز الحديد باستخدام برنامج المقارنات الدولية واستخدام عدد الخلايا لتسجيل تركيز Fe لكل خلية.

7. تمايز الخلايا والنمو على منصة مغناطيسية

  1. تنظيف الركيزة منقوشة مع 70٪ v/v/ الإيثانول ووضع الركيزة في طبق ثقافة 35 ملم في غطاء محرك السيارة. ضع مغناطيسا كبيرا (~1500 Oe) أسفل الركيزة المنقوشة لمدة دقيقة واحدة وأزل المغناطيس عن طريق تحريك الطبق أولا صعودا وبعيدا عن المغناطيس ، ثم أخرج المغناطيس من غطاء محرك السيارة. تشغيل الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
  2. معطف الركيزة مع نوع الكولاجين 1 وفقا للقسم 4.2. تعليق الخلايا بعد امتصاص MNP الخلوية (القسم 5.1)، البذور 105 خلايا في طبق ثقافة 35 ملم، وإضافة 2 مل من وسيط التمايز. احتضان الثقافة في 5٪ CO2،حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية.
  3. بعد 24 ساعة، إضافة 1:100 مورين الطازجة β-NGF (تركيز النهائي من 50 نانوغرام / مل). تجديد وسيط التمايز وإضافة مورين الطازجة β-NGF كل 2 أيام. تصوير الخلايا كل يومين باستخدام المجهر الخفيف، وبعد تكوين الشبكة، إجراء التلطخ المناعي على الخلايا (القسم 8.1).

8. MNP محملة تلطيخ الخلية

  1. توبولين مناعة
    1. إعداد 4٪ حل paraformaldehyde (PFA) عن طريق خلط 10 مل من محلول PFA 16٪ ث / v، 4 مل من برنامج تلفزيوني 10x، و 26 مل من DDW. إعداد 50 مل من 1٪ PBT بإضافة 500 ميكرولتر من السطحي غير الأيونية إلى 50 مل من برنامج تلفزيوني 1x. إعداد 50 مل من 0.5٪ PBT عن طريق خلط 25 مل من 1٪ PBT مع 25 مل من برنامج تلفزيوني 1x. إعداد حل حجب عن طريق خلط 1٪ الزلال مصل البقر و 1٪ مصل حمار طبيعي في 0.25٪ PBT.
      ملاحظة: استخدام PFA فقط داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية.
    2. إزالة المتوسطة الفائقة من الخلايا. إصلاح الخلايا المحملة MNP في 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية. غسل الخلايا المحملة MNP 3x في برنامج تلفزيوني 1x، 5 دقائق كل غسل، داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية.
    3. Permeabilize الخلايا المحملة MNP مع 0.5٪ PBT لمدة 10 دقيقة. احتضان الخلايا المحملة MNP أولا في حل حجب لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ومن ثم مع أرنب المضادة α توبولين الأجسام المضادة في حل حجب بين عشية وضحاها في 4 °C. غسل الخلايا المحملة MNP 3x في برنامج تلفزيوني 1x، 5 دقائق كل غسل.
    4. احتضان الخلايا المحملة MNP مع Cy2-المقترنة حمار المضادة للأرنب الأجسام المضادة الثانوية لمدة 45 دقيقة في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا المحملة MNP 3x في برنامج تلفزيوني 1x، 5 دقائق كل غسل.
    5. إجراء التصوير البؤري. لتوبولين, استخدام الطول الموجي من الإثارة 492 نانومتر وطول موجي انبعاث 510 نانومتر. بالنسبة ل MNPs (رودامين)، استخدم طول موجي مثير قدره 578 نانومتر وطول موجي للانبعاثات قدره 613 نانومتر.
  2. تلطيخ النووية مع 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI)
    1. غسل الخلايا المحملة MNP 3x في برنامج تلفزيوني 1x، 5 دقائق كل غسل. إزالة السائل الزائد حول العينة، إضافة 1 قطرة (~ 50 ميكرولتر) من المتوسطة المتصاعدة التي تحتوي على DAPI لتغطية مساحة 22 ملم × 22 ملم، واحتضان لمدة 5 دقائق في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة.
    2. غسل الخلايا المحملة MNP 3x في برنامج تلفزيوني 1x، 5 دقائق كل غسل. إجراء التصوير البؤري. بالنسبة ل DAPI ، استخدم طول موجي مثير قدره 358 نانومتر وطول موجي للانبعاثات قدره 461 نانومتر. بالنسبة ل MNPs (رودامين)، استخدم طول موجي مثير قدره 578 نانومتر وطول موجي للانبعاثات قدره 613 نانومتر.

9. القياسات والتحليل الإحصائي

  1. التحليل المورفومتري لتمايز الخلايا المحملة ب MNP
    1. لقياس عدد التقاطعات على مسافات مختلفة من جسم الخلية، والحصول على صور المرحلة من الخلايا المستزرعة تصل إلى 3 أيام بعد العلاج مع NGF.
      ملاحظة: إذا تم ذلك لاحقا، قد تقوم الخلايا بتطوير شبكات اتصال، مما يمنع قياسات دقة الخلية الواحدة.
      1. فتح الصور في برنامج معالجة الصور، ImageJ، واستخدام NeuronJ المكونات في، والتي تمكن من تتبع neurite شبه التلقائي وقياس طول36. باستخدام النيوريت التتبع المكونات في، تتبع neurites وتحويل البيانات إلى صور ثنائية. حدد مركز سوما.
      2. إجراء تحليل شول، المتاحة في NeuronJ المكونات في. حدد نصف القطر الأقصى. كرر التجربة ثلاث مرات. تحليل أكثر من 100 خلية في كل تجربة.
  2. تحليل توطين الخلايا
    1. لتحديد النسبة المئوية للخلايا المترجمة على المنطقة المغناطيسية بعد 3 أيام من الحضانة ، والحصول على الصور المجهرية confocal من الخلايا مع وبدون امتصاص MNP. استخدام تلطيخ DAPI (القسم 8.2).
    2. عد يدويا الخلايا فوق أو جزئيا فوق نمط (لمس الخلايا) والخلايا التي ليست كذلك. كرر لثلاث تجارب. تحليل أكثر من 400 خلية مع MNP ودون امتصاص.
    3. حساب النسبة النسبية للخلايا التي هي فوق الأنماط المغناطيسية من العدد الإجمالي للخلايا، مع وبدون MNPs. بالإضافة إلى ذلك، حساب النسبة المئوية للمنطقة الفعالة للنمط المغناطيسي عن طريق إضافة قطر جسم الخلية إلى عرض النمط لتحديد الاحتمال العشوائي للخلايا الهبوط على نمط مغناطيسي.
    4. إجراء عينة واحدة Z-اختبارلتحليل ما إذا كان توزيع الخلية نتيجة لهبوط الخلية متساوية الخواص, أو إذا كان هناك تحيز المفضل للنمط المغناطيسي.
  3. تحليل اتجاه النمو
    1. لقياس التأثير على اتجاه نمو نيوريت ، احصل على صور مجهرية كونفوجكال للخلايا مع وبدون علاج MNP بعد 8 أيام من الحضانة. إجراء تلطيخ المناعة (القسم 8.1).
    2. باستخدام برنامج ImageJ، قم بقياس الزاوية بين خلية neurite والمشارب المغناطيسية في كلا الشرطين.
      ملاحظة: تحليل neurites فقط التي تنشأ من سوماس تقع على المشارب المغناطيسية.
    3. رسم توزيع زوايا neurites 'نسبة إلى اتجاه المشارب (Δο). إجراء اختبار Chi-التربيعية لتوزيع Δο لإثبات أن التوزيع غير عادي أو موحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تصنيع منصات مغناطيسية بأشكال هندسية مختلفة(الشكل 1A). تم إيداع الأنماط المغناطيسية عن طريق التخبط: 14 طبقة متعددة من Co80Fe20 و Pd ، 0.2 نانومتر و 1 نانومتر ، على التوالي. كشف المجهر الإلكتروني الارتفاع الكلي للأنماط المغناطيسية ليكون ~ 18 نانومتر (الشكل 1B). هذا فريدة من نوعها ترسب متعدد الطبقات FM يخلق منصة مستقرة مع أنيسوتروبي المغناطيسية عمودي (PMA) بالنسبة للطائرة الركيزة التي تمكن من جذب الخلايا المحملة MNP نحو النمط المغناطيسي بأكمله وليس فقط إلى حواف22,37. وتميزت المعلمات من هيكل متعدد الطبقات FM من قبل قياسات النقل المغناطيسي الذي تم تصنيع جهاز على شكل صليب من الطبقات المتعددة FM(الشكل 1C inset), وتم قياس المغناطيسية عمودي على الركيزة عن طريق تأثير القاعة الشاذة (AHE)38, حيث مقاومة AHE يتناسب مع المغناطيسية عمودي. وأظهر قياس المجال المغناطيسي مقابل AHE حلقة الزنجة مؤشرا على مغناطيسات فيرومغناطيس PMA (الشكل 1C). كانت مغنطة بقايا الطبقات المتعددة FM (لحظة مغناطيسية في حقل صفر) مطابقة لتشبع المغناطيسية (MS)في الحقول العالية. وبالإضافة إلى ذلك، كان المجال القسري للمتعددة الطبقات FM ~ 500 Oe، والوصول إلى التشبع في 1200 Oe، والتي مكنت من سهولة ممغنطة الجهاز وضمان الاستقرار ضد تأثير الحقول المغناطيسية غير مقصودة. تم قياس قيمة MS للشرائح المتعددة باستخدام مقياس المغنطيسية(الشكل 1D)،كما هو موضح في القسم 3.1. وكان MS 270 الاتحاد الاقتصادي والنقدي / سم 3 ، وهو ما هو على قدمالمساواةمع القياسات السابقة من هياكل مماثلة.

أكسيد الحديد الفلوري (γ-Fe2O3) تم إعداد MNPs وفقا لنشرة سابقة39. تم تصنيعها من قبل أعضاء البرلمان النوى، بما في ذلك اقتران التكافؤ من ست طبقات رقيقة من الأفلام أكسيد الحديد إلى رودامين ايزوثيوسيانات والطلاء مع الألبومين مصل الإنسان. وكان حجم القطر الجاف من MNPs ~ 15 نانومتر مع إمكانات زيتا من -45، وفقا لقياس الإلكترون الإرسال المجهرية. وتبين القياسات المغناطيسية ل MNPs(الشكل 2A)أن منحنى المغنطة لم يكن به غشاء نجمي، مما يشير إلى السلوك المغناطيسي الفائق للنواب، وحقل تشبع منخفض من 500 Oe، وM S مرتفع نسبيا من 22 الاتحاد الاقتصادي والنقدي / ز. وللتحكم في توطين الخلايا باستخدام الأنماط المغناطيسية، تم احتضان خلايا PC12 في المتوسطة المختلطة مع MNPs الفلورية أكسيد الحديد لمدة 24 ساعة، وتحويلها إلى وحدات مغناطيسية. ويمكن أن يكون تركيز الشرطة الوطنية المتوسطة في الوسط متنوعا؛ كان 0.25 ملغم /مل في تجارب الطلاء. تم التقاط صور مجهرية Confocal بعد تلطيخ DAPI (الشكل 2B). تم استيعاب أعضاء البرلمان في سوما خلايا PC12 ، ولكن ليس في النواة ، والتي انعكست من خلال الظل المظلم في الوسط. وتبين النتائج أنه لم يكن هناك فلوروسيانس أحمر في النوى، مما يشير إلى أن أعضاء البرلمان لم يتم استيعابهم في النوى أو تعلقوا بالسطح الخارجي للخلايا. وباستخدام قياسات برنامج المقارنات الدولية، كان من الممكن تحديد كميات الأجهزة متعددة الأجهزة التي تم استيعابها في خلايا PC12. ازداد تركيز الحديد داخل الخلايا مع زيادة تركيز MNP في الوسط(الشكل 2C).

تم تقييم صلاحية خلايا PC12 المحملة من MNP لتركيزات مختلفة من MNPs باستخدام المقايسات المستندة إلى XTT و resazurin. الشكل 3A يظهر PC12 الخلايا بعد العلاج MNP، وتنمو وتميز فوق طبق من البلاستيك المغلفة بالكولاجين. لدراسة تأثير MNPs الداخلية على التمايز، تم إجراء قياس مورفولوجي شول. لم يلاحظ أي فرق كبير في مورفولوجيا الخلية بين الخلاياالمحملة MNP وخلايا التحكم ( t-test, p > 0.05, n = 3) (الشكل 3B). تم قياس النشاط الأيضي لخلايا PC12 باستخدام المقايسات المستندة إلى XTT و resazurin بعد حضانة الخلايا بتركيزات MNP مختلفة. تم تطبيع النتائج لقياس التحكم في خلايا PC12 دون MNPs. وأظهرت هذه التركيزات من MNPs أي سمية الخلايا كبيرة تجاه الخلايا, واضح في عدم وجود اختلافات كبيرة في قدرة الخلية على البقاء لأي من الاستعدادات (ر-اختبار, ع > 0.05, ن = 3) (الشكل 3C, D). تم تحديد آثار MNPs على طلاء الخلايا وتطويرها من خلال مقارنة الخلايا المحملة بال MNP بالخلايا غير المحملة ، المطلية والناضجة على ركائز مغناطيسية متطابقة. كانت الخلايا بذر وتركت لتلتصق بالركيزة. كل يومين، كانت الخلايا تعامل مع المتوسطة الطازجة وNGF كما هو موضح في القسم 7. ويبين الشكل 4 خلايا PC12 مع وبدون معالجة MNP، وتنمو وتتمايز على ركيزة مغناطيسية ذات خطوط عريضة 20 ميكرومتر وتباعد 100 ميكرومتر. بعد 3 أيام من النمو ، كانت الخلايا ملطخة بالمناعة ، ملطخة بال DAPI ، وتم التقاط الصور.

تم العثور على الخلايا المغنطيسية لإرفاق أنماط المغناطيسي وتنمو الفروع وفقا للأنماط، في حين نمت الخلايا دون علاج MNP مع أي تقارب مع الأجهزة المغناطيسية (الشكل 4A، B). ويعرض الشكل 4C تحديد مواقع الخلايا وتشكيل الشبكة على ركيزة ذات هندسة سداسية بطول جانبي قدره 200 ميكرومتر وعرض خط قدره 50 ميكرومتر. تم تصوير الخلايا بعد 6 أيام. كانت الخلايا المغنطة موجودة على النمط المغناطيسي ، مع تقارب مماثل للركائز المخططة. تم تحديد موقع الخلية عن طريق عد أجسام الخلايا الموجودة على الأنماط المغناطيسية أو المرتبطة بها. تم حساب النسبة النسبية للخلايا من إجمالي عدد الخلايا. وقد تم ذلك للخلايا مع وبدون علاج الشرطة الوطنية الليبرية. تم حساب المنطقة الفعالة للاستجابة المغناطيسية عن طريق إضافة قطر الخلايا (~ 10 ميكرومتر لخلايا PC12) إلى كلا حواف النمط المغناطيسي. بالنسبة لأنماط الشريط المغناطيسي ، كانت نسبة المنطقة المغناطيسية الفعالة 33٪ ، والتي تتوافق مع احتمال هبوط الخلايا بشكل عشوائي على المشارب المغناطيسية. وأظهرت النتائج أن 75٪ من أجسام الخلايا المحملة MNP كانت على اتصال مع المشارب المغناطيسية، في حين أن 35٪ فقط من الخلايا غير المغنطيسية كانت موجودة على المشارب (في اتفاق إحصائي مع توزيع غير متحيز)(الشكل 4D). وأشار التحليل الإحصائي إلى أن القياس لم يكن مستمدا من هبوط الخلايا التعسفي (عينة واحدة z-test، p < 10-6 ، n = 430).

وعلى النقيض من ذلك، كشف التحليل الإحصائي للسداسات المغناطيسية أن 92٪ من سوما الخلايا المحملة بال MNP كانت مرتبطة بالأنماط المغناطيسية، مقارنة ب 38٪ للخلايا التي لا يوجد بها علاج MNP (الشكل 4E). وكانت نسبة المساحة الفعالة من السداسي 32٪ من الركيزة. كما أشار التحليل الإحصائي للسداسات إلى أن القياس لم يكن مستمدا من هبوط الخلايا التعسفي (عينة واحدة z-test، p < 10-6 ، n = 370). وكشفت النتائج عن تفضيل واضح للخلايا المحملة بال MNP للنمط المغناطيسي، في حين التزمت الخلايا التي لا تحتوي على أعضاء البرلمان بشكل عشوائي بالركيزة بأكملها. بالإضافة إلى تأثير تحديد موقع الخلية ، تم العثور على هذه المنصات المغناطيسية للتحكم أيضا في اتجاه النيوريت المتنامي. الشكل 5A يظهر MNP محملة الخلايا مع neurites، محاذاة وفقا للتوجه المشارب. في المقابل، أظهر قياس التحكم في الخلايا بدون MNPs نمو النيوريت عبر المنصة بغض النظر عن الأنماط المغناطيسية.

لتقييم التأثير المغناطيسي على اتجاه نمو الخلايا العصبية، تم قياس الزاوية بين النيوريت والمشارب المغناطيسية. وكشفت البيانات أن 80٪ من النيوريت من الخلايا المحملة MNP أظهرت علاقة مع اتجاه المشارب المغناطيسية، داخل < 15 درجة بالنسبة لاتجاه المشارب. ومع ذلك، فقط 32٪ من neurites من الخلايا دون MNPs وضعت في هذا النطاق. وأظهرت الخلايا دون العلاج MNP أي ارتباط مع المشارب المغناطيسية ونمت وفقا لتوزيع زاوية موحدة(الشكل 5B). وكشف التحليل الإحصائي لتوزيع Δο أنه لم يكن طبيعيا أو موحدا (اختبار Chi-square، p < 0.001). وقد تجلى تأثير الهندسة سداسية على نمو neurite كذلك. يظهر الشكل 5C صورا مفلورة لتطوير الشبكة العصبية لخلايا PC12 ممغنطة وغير ممغنطة فوق نمط مغناطيسي من السداسي والدوائر الكبيرة بين الحواف. وكان طول الجانب من السداسي 200 ميكرومتر وعرض خطوط 10 ميكرومتر; وكان قطر الدائرة 30 ميكرومتر. وأظهرت سوماس الخلية تقارب عالية للدوائر وتطوير شبكة عصبية موجهة بشكل جيد على طول الخطوط العريضة سداسية. صورة تكبير يوضح الخلايا تعلق على دائرة مغناطيسية ونيوريتس تنمو على طول تلك الخطوط العريضة(الشكل 5D).

Figure 1
الشكل 1: توصيف الأجهزة المغناطيسية. (أ) الصور المجهرية البصرية للأجهزة المغناطيسية ذات الأشكال الهندسية المختلفة. شريط مقياس = 200 ميكرومتر (ب) المسح الضوئي صورة مجهرية إلكترونية من Co80Fe20/Pd متعدد الطبقات وتخطيطي للتعددية. يبلغ الارتفاع الإجمالي للأنماط المغناطيسية 18 نانومتر. شريط المقياس = 100 نانومتر. (ج) قياس تأثير القاعة الشاذة للجهاز المغناطيسي الذي يظهر المجالات المغناطيسية القسرية والبقايا ل FM. Inset: صورة الجهاز مع أقطاب كهربائية ملحوظة. (D) قياس المغناطيسية لجهاز متعدد الطبقات يظهر قيمة تشبع المغناطيسية محسوبة لكل وحدة تخزين. وقد تم تعديل هذا الرقم من ماركوس وآخرون37. الاختصارات: AHE = تأثير القاعة الشاذة؛ FM = المغناطيسي الحديدي; B = المجال المغناطيسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: PC12 امتصاص الخلية من MNPs. (أ) قياس المغناطيسية من MNPs في درجة حرارة الغرفة. (ب) صورة المجهر Confocal لامتصاص MNP من قبل خلايا PC12. Nuclei ملطخة DAPI; أعضاء البرلمان المسمى مع رودامين دخول الخلايا. مقياس الشريط = 10 ميكرومتر(C)قياس برنامج المقارنات الدولية من MNPs أكسيد الحديد استيعابها (pg) من قبل خلايا PC12 بعد 24 ساعة من الحضانة مع تركيزات MNP عدة. وقد تم تعديل هذا الرقم من ماركوس وآخرون37. المختصرات: MNPs = الجسيمات النانوية المغناطيسية؛ DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول; برنامج المقارنات الدولية = البلازما المقترنة بشكل استقرائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: MNP محملة PC12 صلاحية الخلية. (أ) صور مجهرية Confocal من خلايا PC12 المتمايزة المحتضنة مع MNPs. الأسهم تظهر neurites متفاوتة مع MNPs الداخلية. أشرطة مقياس = 50 نانومتر. (ب) تحليل شول من نمو نيوريت من خلايا PC12 بعد 3 أيام من التمايز. (ج) فحص قابلية XTT لقابلية البقاء لخلايا PC12 المعالجة بتركيزات متزايدة من MNPs بعد 24 ساعة من الحضانة. يتم تطبيع القياسات للتحكم. (د) Resazurin القائم على فحص الجدوى من خلايا PC12 تعامل مع تركيزات متزايدة من MNPs بعد 24 ساعة من الحضانة. يتم تطبيع القياسات للتحكم. ولا توجد أهمية إحصائية في كلا التحليلين. وقد تم تعديل هذا الرقم من ماركوس وآخرون37. المختصرات: MNPs = الجسيمات النانوية المغناطيسية؛ XTT = 2،3-bis-(2-ميثوكسي-4-نيترو-5-سلفوفينيل)-2H-tetrazolium-5-كاربوسانيلايد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: توطين الخلية فوق الأجهزة المغناطيسية. (أ) صور الفلورسنت من خلايا PC12 محملة MNPs المتزايد على المشارب المغناطيسية: (1) α-tubulin الوسم، (2) DAPI تلطيخ، و (3) صورة مدمجة. شريط مقياس = 100 ميكرومتر (ب) صور الفلورسنت من خلايا PC12 دون علاج MNP، وتنمو على رأس المشارب المغناطيسية كما هو الحال في (A). (C) صور مفلورة من خلايا PC12، مع وبدون MNPs، على النمط المغناطيسي سداسية. شريط المقياس = 200 ميكرومتر (D) النسبة المئوية لأجسام الخلايا ، مع وبدون MNPs ، وتقع على المشارب المغناطيسية. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. يمثل الخط المنقط احتمال هبوط الخلايا على المشارب المغناطيسية. (E) النسبة المئوية لأجسام الخلايا، مع وبدون MNPs، وتقع على السداسي المغناطيسي. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. يمثل الخط المنقط احتمال هبوط الخلايا على الأنماط المغناطيسية لتوزيع عشوائي. ولا توجد أهمية إحصائية في كلا التحليلين. وقد تم تعديل هذا الرقم من ماركوس وآخرون37. المختصرات: MNPs = الجسيمات النانوية المغناطيسية؛ DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5:اتجاه الشبكة العصبية. (أ) صور مجهرية Confocal من خلايا PC12 α-tubulin المسمى مع العلاج MNP (يسار) ودون علاج MNP (يمين), تنمو فوق المشارب المغناطيسية. تم وضع علامة على المشارب. (ب) تقدم المدرجات التكرارية القطبية تأثير اتجاهية النيوريت على خلايا PC12 (يسار) مع علاج MNP و (يمين) دون علاج MNP. يتم تعريف انحراف زاوية الاتجاه على أنه الفرق في الزاوية بين النيوريت واتجاه الشريط المغناطيسي (15 درجة صناديق). (ج) صور مفلورة لخلايا PC12 نمت فوق نمط سداسي مغناطيسي ، (يسار) مع علاج MNP و (يمين) دون علاج MNP. شريط مقياس = 200 ميكرومتر (D) صورة تكبير في خلية ممغنطة تطوير neurites وفقا لنمط المغناطيسي. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من ماركوس وآخرون37. اختصار: MNPs = الجسيمات النانوية المغناطيسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تظهر النتائج التمثيلية فعالية المنهجية المقدمة للتحكم في تكوين شبكة الخلايا العصبية وتنظيمها على نطاق ميكرون. وظلت خلايا PC12 المحملة من MNP قابلة للحياة وتحولت إلى وحدات حساسة مغناطيسية جذبتها القوى المغناطيسية من أقطاب FM إلى مواقع محددة. ويتجلى هذا أفضل في الشكل 5C، حيث انضمت الخلايا بشكل تفضيلي إلى القمم الأكبر من السداسي وليس الخطوط الرقيقة. وعلاوة على ذلك، التفريع من الخلايا وضعت أيضا بشكل إيجابي بعد الأنماط المغناطيسية. وأظهرت جميع تجارب التحكم بشكل لا لبس فيه أن القوى المغناطيسية وجهت توطين أجسام الخلايا وناتجاتها. على الرغم من أنه ثبت أن الإشارات الطبوغرافية يمكن استخدامها لتوجيه نمو النيوريت40،41، وهذا ليس هو الحال هنا ، حيث لم تظهر الخلايا بدون MNPs أي استجابة لشكل النمط.

واستخدم نهج من أسفل إلى أعلى لهندسة القوى المغناطيسية المحلية، باستخدام الترسبات القياسية للليثوغرافيا الضوئية والترسبات المبصقة المتاحة في العديد من مرافق البحوث، مما يسهل اعتماد هذه التقنيات من قبل العديد من الباحثين. يسمح النهج من أسفل إلى أعلى بالحرية في تصميم الأنماط والأشكال المعقدة وفقا لاحتياجات الباحثين ، مع دقة على نطاق ميكرون للمناطق التي يبلغ طولها سنتيمترا. على الرغم من أن النتائج أظهرت على الشرائح الزجاجية، من حيث المبدأ، فمن الممكن لإعداد الأجهزة فوق غيرها من المواد المتوافقة بيولوجيا التي هي مناسبة للتطبيقات العلاجية في الجسم الحي مثل صفائف القطب مرنة لتسجيل الخلايا العصبية والتحفيز42،43.

هذه المنصات PMA فريدة من نوعها، التي تحققت عن طريق ترسب متعدد الطبقات، وإنتاج حقل مغناطيسي قوي على طول النمط المغناطيسي بأكمله وليس فقط على حواف، كما لوحظ في وقت سابق22. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم FMs مع تشبع مغناطيسي كبير ، أي حتى عندما تتم إزالة المجال المغناطيسي الخارجي ، تظل الأقطاب الكهربائية ممغنطة بالكامل وتبقى تجذب الخلايا دون الحاجة إلى مغناطيس خارجي. ومع ذلك ، يمكن أن تساعد القوة المغناطيسية الخارجية في مغنطيسية أعضاء البرلمان بالكامل في الخلايا ، وبالتالي زيادة قوة الجذب والكفاءة أثناء الطلاء. وكان أحد الاعتبارات الهامة في تصميم FM هو عدد التكرارات. في حين أن المزيد من التكرار سيزيد من إجمالي اللحظة المغناطيسية ، وهو أمر إيجابي ، فإن إضافة العديد من الطبقات سيزيد أيضا من اختلاط الطبقة ، مما يسبب سلطة النقد الفلسطينية الأقل استقرارا ويؤدي في النهاية إلى مغناطيسية داخل الطائرة44،45 محورا سهلا وجذبا إلى حواف مختلفة من الأقطاب الكهربائية22،37. لذلك، فمن الضروري لتحسين عدد FM وتكوين الطبقات المتعددة لضمان PMA مستقرة مع المجالات المغناطيسية القصوى.

وأظهرت MNPs المقدمة في النتائج التمثيلية تقريبا أي سمية تجاه خلايا PC12 في تركيزات اختبارها، كما أنها لم تؤثر على السلوك الخلوي، على الرغم من أن تكون قادرة على دخول الخلايا ووجود لحظة مغناطيسية عالية نسبيا. تعتمد قوة الجذب على الخلية على عدد أعضاء البرلمان في الخلية ومغنطة كل من الشرطة الوطنية الليبرية. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن يكون كلاهما عاليا؛ ومع ذلك، قد يكون هناك مفاضلة بين الاثنين. مع بعض النواب التجارية، كانت صلاحية الخلية جيدة، ولكن اللحظة المغناطيسية كانت ضعيفة جدا. بالنسبة للجسيمات الأخرى المصنعة في المختبر ، كانت اللحظة المغناطيسية عالية ، ولكن MNPs تميل إلى التجميع وكانت صلاحية الخلية منخفضة. وبالتالي، من المهم اختبار صلاحية الخلية وتوصيف مغنطة عند اختيار أعضاء البرلمان. كما أن أعضاء البرلمان المستخدمين هنا هم أيضا من الفلورسنت، مما يجعل من السهل تتبع مواقعهم في الخلايا. تظهر النتائج تطور النيوريت وفقا لشكل النمط المغناطيسي ، ويشير الفلورسينس إلى وجود MNPs على طول النيوريت.

وقد سبق التحقيق في آلية استيعاب أعضاء البرلمان في الخلايا46. يحدث امتصاص الخلوية من MNPs عن طريق الغدد الصماء وفقا لحجمها وشكلها والكيمياء السطحية. درست الدراسات السابقة امتصاص أنواع مختلفة من أعضاء البرلمان في الخلايا العصبية24; وكان امتصاص الخلوية من النواب المغلفة أفضل من امتصاص الخلوية من أعضاء البرلمان غير المصقول. كما هو مبين في الشكل 3A، B، تم استيعاب أعضاء البرلمان في السيتوبلازم ، لكنهم ظلوا خارج النوى وتم نقلهم إلى neurites أثناء تطورها. بالإضافة إلى ذلك، تم استيعاب أعضاء البرلمان المترافقين مع NGF التي نشطت مسار إشارات NGF أيضا في الخلايا عبر الغدد الصماء47،48.

وفي الختام، تقدم هذه الورقة مجموعة أدوات فعالة للتلاعب المغناطيسي للبحوث التي تتطلب تنظيم العنصر البيولوجي. استخدام القوى المغناطيسية تمكن من تحديد المواقع من الخلايا، وتوجيه نمو neurite. تمكن هذه الطريقة من تصميم منصات ذات أشكال هندسية معقدة. يمكن هندسة قوى الجذب المغناطيسي للتلاعب بتكوين الشبكة العصبية عن بعد عن طريق تغيير مشهد القوة المغناطيسية بمرور الوقت. ويمكن توسيع نطاق هذه المنهجية برمتها بسهولة للسيطرة على عوامل أو مواد كيميائية أخرى يمكن أن تقترن بالنواط المتوسطة الحجم وإحضارها إلى نقاط الاهتمام المصممة مسبقا، وكل ذلك بدقة على نطاق ميكرون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا البحث من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا، إسرائيل، ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (569/16).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), London, England. 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , EP19990925247 (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 173، الجسيمات النانوية المغناطيسية، أنيسوتروبي المغناطيسي المغناطيسي (PMA)، تسليم الأدوية المستهدفة المغناطيسية، التلاعب بالخلايا المغناطيسية، الثقافة العصبية، الهندسة العصبية، التفاعل البيولوجي، التصوير الضوئي، الطبقات المتعددة المغناطيسية
تصنيع منصات مغناطيسية لتنظيم Micron-Scale للخلايا العصبية المترابطة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., … More

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter