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Bioengineering

Herstellung magnetischer Plattformen für die Organisation vernetzter Neuronen im Mikrometerbereich

Published: July 14, 2021
doi:
10.3791/62013
, , , , , , , ,
1Department of Physics,Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering,Bar-Ilan University, 3Department of chemistry,Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials,Bar-Ilan University

Summary

Diese Arbeit stellt einen Bottom-up-Ansatz zur Entwicklung lokaler magnetischer Kräfte zur Steuerung der neuronalen Organisation dar. Neuronenähnliche Zellen, die mit magnetischen Nanopartikeln (MNPs) beladen sind, werden auf einer mikrogemusterten Plattform mit senkrechter Magnetisierung plattiert und gesteuert. Ebenfalls beschrieben werden magnetische Charakterisierung, MNP-Zellaufnahme, Zelllebensfähigkeit und statistische Analyse.

Abstract

Die Fähigkeit, Neuronen in organisierte neuronale Netze zu leiten, hat große Auswirkungen auf die regenerative Medizin, das Tissue Engineering und die Bio-Schnittstelle. Viele Studien zielen darauf ab, Neuronen mit chemischen und topographischen Hinweisen zu lenken. Berichte über organisatorische Kontrolle im Mikrometerbereich über große Flächen sind jedoch rar. Hier wurde eine effektive Methode beschrieben, um Neuronen an voreingestellten Stellen zu platzieren und neuronales Auswachsen mit einer Auflösung im Mikrometerbereich zu leiten, wobei magnetische Plattformen mit mikrogemusterten, magnetischen Elementen eingebettet sind. Es wurde gezeigt, dass die Belastung von Neuronen mit magnetischen Nanopartikeln (MNPs) sie in empfindliche magnetische Einheiten umwandelt, die durch magnetische Gradienten beeinflusst werden können. Nach diesem Ansatz wurde eine einzigartige magnetische Plattform hergestellt, auf der PC12-Zellen, ein gängiges neuronenähnliches Modell, plattiert und mit superparamagnetischen Nanopartikeln beladen wurden. Dünne Schichten von ferromagnetischen (FM) Multischichten mit stabiler senkrechter Magnetisierung wurden abgeschieden, um effektive Anziehungskräfte auf die magnetischen Muster auszustrahlen. Diese MNP-geladenen PC12-Zellen, die auf den magnetischen Plattformen plattiert und differenziert wurden, wurden bevorzugt an den magnetischen Mustern befestigt, und das Auswachsen des Neuriten war gut auf die Musterform ausgerichtet und bildete orientierte Netzwerke. Quantitative Charakterisierungsmethoden der magnetischen Eigenschaften, der zellulären MNP-Aufnahme, der Zelllebensfähigkeit und der statistischen Analyse der Ergebnisse werden vorgestellt. Dieser Ansatz ermöglicht die Kontrolle der Bildung neuronaler Netzwerke und verbessert die Neuron-elektroden-Schnittstelle durch die Manipulation magnetischer Kräfte, die ein effektives Werkzeug für In-vitro-Studien von Netzwerken sein können und neuartige therapeutische Biointerfacing-Richtungen bieten können.

Introduction

Die Mikrostrukturierung von Neuronen birgt ein großes Potenzial für die Geweberegeneration1,2,3,4,5 und die Entwicklung neuroelektronischer Geräte6,7,8. Die mikrometerskalige Positionierung von Neuronen bei hoher räumlicher Auflösung, wie in biologischen Geweben, stellt jedoch eine erhebliche Herausforderung dar. Die Bildung von vorgefertigten Strukturen in dieser Größenordnung erfordert die Führung von Nervenzellprozessen durch lokale Kontrolle der Somamotilität und des axonalen Auswuchses. Frühere Studien haben die Verwendung von chemischen und physikalischen Hinweisen9,10,11,12 zur Steuerung des neuronalen Wachstums vorgeschlagen. Hier konzentriert sich ein neuartiger Ansatz auf die Steuerung der Zellpositionierung durch Magnetfeldgradienten13,14,15,16,17, wobei mit MNPs beladene Zellen in magnetisch empfindliche Einheiten umgewandelt werden, die aus der Ferne manipuliert werden können.

Kunze et al., die die Kraft charakterisierten, die benötigt wird, um zelluläre Reaktionen mit magnetischen Chip- und MNP-geladenen Zellen zu induzieren, bewiesen, dass eine frühe axonale Dehnung durch mechanische Spannung in Zellen ausgelöst werden kann18. Tay et al. bestätigten, dass mikrogefertigte Substrate mit verbesserten Magnetfeldgradienten eine drahtlose Stimulation neuronaler Schaltkreise ermöglichen, die mit MNPs unter Verwendung von Kalziumindikatorfarbstoffen dosiert wurden19. Darüber hinaus verschmolzen Tseng et al. Nanopartikel in Zellen, was zu lokalisierten Nanopartikel-vermittelten Kräften führte, die sich der zellulären Spannungnäherten 20. Dies führte zur Herstellung definierter Muster mikromagnetischer Substrate, die dazu beitrugen, die zelluläre Reaktion auf mechanische Kräfte zu untersuchen. Die zelluläre Spannung, die durch die Anwendung lokalisierter Nanopartikel-vermittelter Kräfte entsteht, wurde durch die Verschmelzung von Nanopartikeln innerhalb von Zellen erreicht20. Ein komplementäres Metalloxidhalbleiter (CMOS)-mikrofluidisches Hybridsystem wurde von Lee et al. entwickelt, die eine Reihe von Mikroelektromagneten in den CMOS-Chip eingebettet haben, um die Bewegung einzelner Zellen zu steuern, die mit magnetischen Perlen markiert sind21.

Alon et al. verwendeten mikroskalige, vorprogrammierte Magnetpads als magnetische “Hot Spots”, um Zellen zu lokalisieren22. Spezifische Aktivität könnte auch innerhalb von Zellen stimuliert werden, indem mikrogemusterte magnetische Arrays verwendet werden, um Nanopartikel an bestimmten subzellulären Stellen zu lokalisieren23. Die zelluläre MNP-Aufnahme wurde erfolgreich in den primären Neuronen24 , 25,26von Blutegel, Ratten undMäusennachgewiesen. Hier wurde dies an einer Phäochromozytom-Zelllinie der Ratte PC12 nachgewiesen, von der zuvor berichtet wurde, dass sie eine hohe Aufnahme von MNPs27zeigt. In den letzten Jahren gab es verschiedene medizinische Anwendungen von MNPs, einschließlich Medikamentenabgabe und Thermotherapie bei Krebsbehandlungen28,29,30,31. Konkret befassen sich Studien mit der Anwendung von MNPs und Neuronennetzwerken32,33,34,35. Die magnetische Organisation von Neuronen, die MNPs auf Einzelzellebene verwenden, verdient jedoch weitere Untersuchungen.

In dieser Arbeit wurde ein Bottom-up-Ansatz beschrieben, um lokale magnetische Kräfte über vorgefertigte Plattformen zur Kontrolle der neuronalen Anordnung zu entwickeln. Die Herstellung von Mustern im Mikrometerbereich von FM-Multilayern wurde vorgestellt. Diese einzigartige, mehrschichtige FM-Struktur erzeugt eine stabile senkrechte Magnetisierung, die zu effektiven Anziehungskräften für alle magnetischen Muster führt. Durch Inkubation wurden MNPs in PC12-Zellen geladen und in magnetisch empfindliche Einheiten umgewandelt. MNP-geladene Zellen, die auf den magnetischen Plattformen plattiert und differenziert wurden, wurden bevorzugt an den magnetischen Mustern befestigt, und das Neuritenwachstum war gut auf die Musterform ausgerichtet und bildete orientierte Netzwerke. Es wurden mehrere Methoden beschrieben, um die magnetischen Eigenschaften der FM-Multischichten und der MNPs zu charakterisieren, und es wurden auch Techniken für die zelluläre MNP-Aufnahme und Zelllebensfähigkeitstests vorgestellt. Zusätzlich werden morphometrische Parameter des neuronalen Wachstums und statistische Analyse der Ergebnisse detailliert beschrieben.

Protocol

HINWEIS: Führen Sie alle biologischen Reaktionen in einer Biosicherheitswerkbank durch. 1. Herstellung magnetischer Plattformen Lithographie Glasdias mit einem Schreibstift in 2 x 2 cm2 schneiden. Reinigen Sie die Glasobjektträger in Aceton und dann Isopropanol für jeweils 5 min in einem Ultraschallbad. Trocken mit ultrahochreinem (UHP) Stickstoff. Das Glas mit Fotolack mit Spin-Coating bei 6.000 U/min für 60 s beschichten, um eine Dicke von 1,5 μm …

Representative Results

Es wurden magnetische Plattformen mit unterschiedlichen geometrischen Formen hergestellt (Abbildung 1A). Magnetische Muster wurden durch Sputtern abgeschieden: 14 Multischichten Co80Fe20 und Pd, 0,2 nm bzw. 1 nm. Die Elektronenmikroskopie ergab, dass die Gesamthöhe der magnetischen Muster ~ 18 nm beträgt (Abbildung 1B). Diese einzigartige FM-Mehrschichtabscheidung schafft eine stabile Plattform mit senkrec…

Discussion

Die repräsentativen Ergebnisse belegen die Wirksamkeit der vorgestellten Methodik zur Steuerung und Organisation der neuronalen Netzwerkbildung auf der Mikrometerskala. Die MNP-geladenen PC12-Zellen blieben lebensfähig und wurden in magnetisch empfindliche Einheiten umgewandelt, die von den magnetischen Kräften der FM-Elektroden an bestimmte Stellen angezogen wurden. Dies wird am besten in Abbildung 5Cgezeigt, wo die Zellen bevorzugt an den größeren Scheitelpunkten der Sechsecke und nic…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Israel, und von der Israeli Science Foundation (569/16) unterstützt.

Materials

16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent
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References

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Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).
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